JP5275306B2 - 活性なβ−NGFを得るための方法 - Google Patents
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Description
Physiol. Rev. 60 (1980) 1284; Yankner, B. A., et al., Annu. Rev. Biochem. 51
(1982) 845)。更には、β−NGFは、中枢神経系のコリン作動性ニューロンの成長、分化及び活力を促進する(Hefti,
F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418)。組換えヒト神経成長因子についての可能性のある治療適用としては、末梢知覚神経障害、例えば、糖尿病に関連したもの又はAIDS療法において起こりうる副作用としてのものが挙げられる。組換えヒトβ−NGFについての他の適用としては、中枢神経障害、例えば、アルツハイマー病が挙げられる。この場合においては、記憶の喪失は、コリン作動性ニューロンの損失の結果である。
H., et al., J. Neurochem. 59 (1992) 1675; US 5,683,894)。
(1983) 821; SWISS-PROT protein sequence database No. P01138)又はその部分, 好ましくは完全なドメインを用いることができる。Suter et al. (EMBO
J. 10, 2395 (1991))は、COS-7細胞培養系における正しい分泌に基づいて、ネズミのβ−NGFのプロペプチドの生体内(in vivo)での機能についての詳細な研究を行った。この目的のために、プロ配列が5つの領域に分割された。これらの配列1個又はより多くを欠如した変異体が作成された。アミノ酸−52ないし−26(「ドメインI」)並びに−6ないし−1(「ドメインII」)を含む配列領域が、生物学的に活性のβ−NGFの発現と分泌に必須であることが見出された。ドメインIが発現に必須である一方、ドメインIIは、正しいタンパク質分解プロセシングに必要である。驚くべきことに、プロNGFは生体内でβ−NGF同様に活性を有することが示された。従って、プロNGFもまた、治療に用い得る。
(ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp.
57-99)。それは、好ましくは、0.1 mol/L トリス/塩酸等のような、中性又は弱酸性のpHに調節するのに適した、懸濁媒質として働く緩衝液中において行われる。細胞の破壊の後、不溶性成分(封入体)が、適した任意の仕方で、好ましくは遠心又は濾過によって取り出され、次いで、封入体を無傷で残すがしかしそれ以外の細胞タンパク質を可能な限り溶解させるもの、例えば、所望によりBrij(登録商標)のような緩和な洗剤を添加した水又はリン酸緩衝液等、による1回又はより多くの洗浄ステップに付される。その後、不溶性の画分(ペレット)を、可溶化及び再生のための、本発明に従った方法に付す。
(ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp.
57-99; 米国特許第5,683,894号)。
プロNGFをコードするcDNAの、E.
coli発現ベクターへのクローニング
プロNGF構築物のクローニングのために、NovagenのT7発現系を選択した(Studier, F. U., et al.,
J. Mol. Biol. 189 (1986) 113)。プロNGFをコードするDNA配列は、強いT7転写シグナルの制御下にある。宿主株として、E. coli BL21(DE3)を用いた。その染色体は、T7 RNAポリメラーゼの遺伝子を含む。このRNAポリメラーゼの発現は、従ってプロNGFの発現は、IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)によって誘導される。
MannheimのベクターpMGL-SIG-proNGF(PL
No. 1905)からのPCR増幅によって得られた。プロNGFをコードするそのDNA配列の5'末端にNdeI制限部位を及び3'末端にBamHI制限部位を、変異誘発プライマーを用いて導入した。PCR産物を、ベクターpET11a(Novagen)のマルチクローニング領域のNdeI/BamHI制限部位に挿入した(Fig.1)。
a) E. coli中におけるヒトプロNGFの発現
組換え細菌株の培養のために、終夜培養を準備した。この目的のため、適当な液量のLB培地に100μg/mLのアンピシリン及び50μg/mLのカナマイシンを加えた。
10g 酵母エキス
5g 塩化ナトリウム
10g 酵母エキス
5g 塩化ナトリウム
細菌細胞中では、組換えタンパク質は凝集体の形で存在する。これらの「封入体」の調製を、Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. In: Creighton, T. E.
(ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp.
57-99.に従って行った。
EDTAに再懸濁させた。その後、湿った細胞塊1gにつき1.5mgのリゾチームを添加し、4℃にて30分間インキュベートし、その後、Gaulin細胞破壊器を用いて細胞を破壊した。次いで、粗ホモジネートに3mMのMgCl2並びに10μg/mLのDNaseを加え、25℃にて30分間インキュベートした。DNase消化の後、0.5体積の60mM EDTA、6%Triton
X-100、1.5M NaCl pH7.0を加えて不溶性細胞成分を可溶化し、次いで4℃にて30分間インキュベートした。13000rpmにて10分間の遠心により封入体を収集した。その後、それらを、各100mLの100mMトリス/塩酸、pH7.0;20mM
EDTAで4回洗浄し、−20℃で保存した。
a) 封入体の可溶化
封入体ペレット400mgを、2mLの可溶化緩衝液(100mMトリス/塩酸、pH8.0;6mM 塩酸グアニジニウム;100mM DTT;10mM EDTA)に懸濁させ、25℃にて2時間インキュベートし、コールドルーム内で13,000rpmにて30分間遠心した。その後、上清を除去し1M塩酸でpH3〜4に調整した。可溶化された材料を、各300mLの6M 塩酸グアニジニウム、pH4.0、10mM EDTAに対して3回透析に付した。すなわち、25℃にて2時間づつ2回、そしてコールドルーム内で終夜(12℃、16〜18時間)である。次いで、Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248)の方法を用いて、タンパク質濃度を測定した。組換えヒトプロNGFの濃度は、40〜50mg/mLであった。
実施例3a)で調製した可溶化した材料から生物学的に活性な組換えヒトプロNGFを製造するために、それらを種々の再生緩衝液で希釈した。最適な折り畳み条件を決定するために、次のパラメーターを、掲げた順番に変化させた。
a) 温度及び時間
b) pH
c) アルギニン濃度
d) GSH/GSSG濃度
e) 塩酸グアニジニウム濃度
f) タンパク質濃度
組換えヒトプロNGFの折り畳みに際した最適な温度及び時間の決定。各再生サンプルのタンパク質濃度は50μg/mLであった。折り畳み緩衝液は、以下よりなるものであった。
100mM トリス/塩酸 pH9.5
1M L−アルギニン
5mM GSH
1mM GSSG
5mM EDTA
測定シリーズは数回実施され、指数関数を用いて当てはめを行った。2つの測定値の平均値が示されている
この表は、組換えヒトプロNGFの折り畳みに対する、種々の濃度のGSH/GSSG(GSH=還元型グルタチオン;GSSG=酸化型グルタチオン)の効果を示す。使用した再生緩衝液は以下よりなるものであった。
100 mMトリス/塩酸 pH9.5
1M L−アルギニン
5mM EDTA
折り畳み時間は、10℃にて3時間であった。表において、個々の折り畳みサンプルは、収率が低くなる順に提示されている。2つの測定シリーズの平均収率が示されている。
折り畳み緩衝液(100mM
トリス/塩酸 pH9.5;1M L−アルギニン;5mM GSH;0.5mM
GSSG;5mM EDTA)で希釈することにより、組換えヒトプロNGFを再生した。折り畳みは、タンパク質濃度50μg/mLで行われた。再生サンプルは、10℃にて3時間インキュベートした。
再生された材料を、10Lの50mMリン酸ナトリウム pH7.0;1mM EDTA(IEX緩衝液A)に対して透析し、そして20,000rpmで30分間遠心した。上清をPoros 20 HSカラムに載せ、塩勾配(IEX緩衝液B:50mMリン酸ナトリウムpH7.0、1M塩化ナトリウム、1mM EDTA)を用いて溶出させた。タンパク質は、980mM塩化ナトリウムで溶出された(Fig.3)。非天然型の組換えヒトプロNGFは、変性条件を用いることによってのみカラムから除去できた。
組換えヒトプロNGFの特徴付け
a) UV分光光度法による濃度及び分子量の測定
精製サンプル中の組換えヒトプロNGFの濃度を定量するために、50mMリン酸ナトリウムpH7.0、1mM EDTAに対して透析したサンプルについて、240から340nmのUVスペクトルをとった(Fig.5;スペクトルは、Beckman DU 640分光光度計を用いて得た)。サンプル中の組換えヒトプロNGF濃度は、280nmの吸収により測定した。評価は理論モル吸光係数25,680L/(mol×cm)(Gill, S. C., et al., Anal. Biochem.
182 (1989) 319に従って計算した)及び単量体当たり24,869Daの分子量(ExPASy プログラム "pI/Mw"により計算し、3個のジスルフィド結合に関して修正した)に基づいて行った。スペクトルを用いて得た値は、Bradford法により決定された濃度に密接に相関した。分子量決定は、電子スプレー・マススペクトル法により行った。組換えプロNGFの理論質量は24,869Daである。実験により得られた値は24,871Daであった。
15%ポリアクリルアミドゲルを使用した。各サンプルは、1%(v/v)の2−メルカプトエタノールを含有した。SDSゲル中において、組換えヒトプロNGFは、予測したよりも僅かに高い見かけの分子量を示した。すなわち約30kDa(24.8kDaでなく)(Fig.2)。
24μg(0.48mg/mLの組換えヒトプロNGFを含有するサンプル50μL)のタンパク質を、50mMリン酸ナトリウムpH7.0;1mM EDTAで平衡化したPoros 20 HSカラム(125×4mm)に載せ、5mL/分の流速で、10分間かけた0から100%B(B=50mMリン酸ナトリウムpH7.0;2M塩化ナトリウム;1mM EDTA)の直線的グラジエントにより溶出した(Fig.6)。280nmの吸光度を検出に用いた(分析ソフトウェアChromeleonバージョン3.14を用いたGyncotek HPLCシステム)。
3.1μgの組換えヒトプロNGF(0.21mg/mLの組換えヒトプロNGF15μL)を、0.13%TFAで平衡化したPoros 10 R1カラム(100mm×4mm;Perseptive Biosystems)に載せた。タンパク質を、0.8mL/分の流速で、33分間かけた非直線的グラジエント(0〜4分:6%B;4〜9分:6〜30%B;9〜24分:30〜69%B;24〜25分:69〜100%B;25〜30分:100%B)により溶出させた。溶離液Bとして、80%アセトニトリル中の0.1%(v/v)TFAを用いた。220nmにおける吸光度を検出に用いた(分析ソフトウェア"Gold V
8.10"を用いたBeckman "Gold" HPLC システム)。天然型の組換えヒトプロNGFは、保持時間14.28分の位置に、単一ピークとして溶出された(Fig.7)。
N末端配列分析には、RP HPLCによってほぼ精製された、可溶化した封入体を用いた。N末端配列を、Applied Biosystems 476A タンパク質配列決定装置を用いて決定した。次のアミノ酸配列が得られた。
H2N-Met-Glu-Pro-His-Ser-Glu-Ser-Asn-Val
組換えヒトプロNGFの生理学的活性を、DRGアッセイ(後根神経節アッセイ)を用いて定量した(Levi-Montalcini, R., et al., Cancer Res. 14 (1954) 49; Varon, S., et
al., Meth. in Neurochemistry 3 (9172) 203)。このアッセイにおいては、7〜8日齢のヒヨコ胚の後根神経節から分離した知覚ニューロンの刺激及び生存が、神経突起形成によって測定される。組換えヒトプロNGFサンプルは、培地を用いて0.019ないし20.00ng/mLに調整した。試験サンプル当たり、15,000個のニューロンを用いた。37℃にて48時間のインキュベーションの後、生存細胞の数を測定した。既知濃度の組換えヒトβ−NGFの溶液を、参照サンプルとして用いた。定量的評価は、いわゆるEC50値に基づいて行った。すなわち、ニューロンの半数の生存を促進するNGFの濃度である。組換えヒトプロNGFについては、0.369ng/mLというEC50値が得られた。比較として、組換えヒトβ−NGFについて得られたEC50値は、0.106ng/mLであった。組換えヒトβ−NGFと組換えヒトプロNGFとの分子量の相違を考慮すると、成熟組換えヒトβ−NGFは、生物学的活性の高さが組換えヒトプロNGFの2倍である。
a) 組換えヒトプロNGFの限定的タンパク質分解による生物学的に活性な成熟組換えヒトβ−NGFの製造
ヒトプロNGFは、そのプロ配列の最後のアミノ酸としてアルギニン残基を含んでいる。従って、この前駆体から、トリプシンのような、適した基質特異性のプロテアーゼを用いた限定的タンパク質分解によって、試験管内(in vitro)で成熟組換えヒトβ−NGFを得ることができる。
PAGEにより分析した。トリプシン原液として、0.1μg/mL又は0.01μg/mLを、それぞれ用いた。大豆トリプシンインヒビター(STI)の濃度は1mg/mLとした。両タンパク質は、凍結乾燥粉末として提供され(メーカー:それぞれ、Boehringer Mannheim及びSigma)、上記緩衝液に溶解された。
トリプシン:組換えヒトプロNGFの質量比 a)1:40;b)1:100、及びc)1:250の消化サンプルを、N末端配列決定による更に詳細な分析に付した。13kDaのバンドが、数個の種を含んでいた(Fig.8):
N末端1:Met-104・・・・;
N末端2:Val-35・・・・;
N末端3:Ser1・・・・;(成熟組換えヒトβ−NGF)
N末端4:Gly10・・・・;
サンプルa):N末端2:N末端3:N末端4=4:5:2
サンプルb):N末端2:N末端3=1:1; N末端4は痕跡量。
サンプルc)は、RP C3 HPLCによって更に分析された(カラム:Nucleosil 500-5 C3-RPN; 125mm×4mm)。2つのピークが得られた:ピーク1(12.32分):N末端1;ピーク2(14.88分):N末端2及びN末端3の比率2:3。
Barnett,
J., et al., J. Neurochem. 57 (1991) 1052
Bradford,
M. M., Anal. Biochem. 72 (1976) 248
EP-A
0 544 293
Hefti,
F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418
Hill,
S. C. et al., Anal. Biochem. 182 (1989) 319
Laemmli,
U. K., Nature 227 (1970) 680
Levi-Montalcini,
R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49
Levi-Montalcini,
R., Science 237 (1987) 1154
Marston,
F.A., Biochem. J. 240 (1986) 1
Nesterenko,
M. V. et al., J. Biochem. Biophys. Methods 28 (1994) 239
Rudolph.
R. et al. (1997): Folding Proteins. In: Creighton, T.E. (ed.): Protein
function: A Practical Approach, pp. 57-99
Schmelzer,
C. H. et al., J. Neurochem. 59 (1992) 1675
Studier,
F.W. et al., J. Mol. Biol. 189 (1986) 113
Suter,
U. et al., EMBO J. 10 (1991) 2395
SWISS-PROT
Protein Sequence Database No. P01138
Thoenen,
H. et al., Physiol. Rev. 60 (1980) 1284
Ullrich,
A. et al., Nature 303 (1983) 821
米国特許第5,235,043号
米国特許第5,593,856号
米国特許第5,606,031号
米国特許第5,683,894号
Varon,
S. et al., Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203
国際公開WO 97/47735
Yankner,
B. A. et al., Annu. Rev. Biochem. 51 (1982) 845
配列番号3は、ヒトプロNGFのcDNAのヌクレオチド配列並びにその翻訳産物のアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、翻訳産物のアミノ酸配列を示す。
Claims (5)
- 活性成分として組換えヒトプロNGFを含んでなる薬剤であって、該組換えヒトプロNGFが、N末端に完全なプロ配列が連結したヒトβ−NGFであり、かつ、N末端に完全なプロ配列を有する該組換えヒトプロNGFが、生物学的又は生理学的活性を有するものである薬剤。
- 生物学的又は生理学的活性が、後根神経節アッセイで測定されるものである、請求項1の薬剤。
- 該組換えヒトプロNGFが、後根神経節アッセイにおいて,後根神経節の知覚ニューロンの生存を促進するものである,請求項1又は2の薬剤。
- 神経障害治療剤である、請求項1〜3の何れかの薬剤。
- 請求項1〜4の何れかの薬剤の製造のための組換えヒトプロNGFの使用。
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