JPH09262093A - 蛋白質の活性化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】遺伝子操作技術を用いて、原核細胞で生産した
不活性なＮＴ−３の封入体を、効率的に活性を回復さ
せ、天然源から単離されたＮＴ−３と同じ活性を有する
蛋白質を得る方法を提供する。 【解決手段】遺伝子操作技術を用いて、原核細胞中にＮ
Ｔ−３を発現後、細胞を破砕し、変性剤で可溶化した
後、次いで変性剤を除去し酢酸等の酸性溶液に置換した
のち、沈殿防止剤を添加し、次いでｐＨ約４ないし７で
金属塩を添加することを特徴とする蛋白質の活性化方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作技術を用
いて、原核細胞中に蛋白質、例えばニューロトロフィン
３（ＮＴ−３）を発現後、活性化する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】異種蛋白質を原核細胞を用いて発現する
際に、しばしばこれらの蛋白質は宿主細胞中で不溶性の
不活性な封入体を形成し、更に封入体は宿主細胞の蛋白
質により不純化されている。細胞中で大量の蛋白質を形
成する際に、蛋白質の集合により不溶性の、たいていの
場合は不活性な粒子になることが知られており、上記の
ような封入体の形成は、発現の際に発生する細胞中の高
い蛋白質濃度の結果であると推測される。それ故、その
ような蛋白質を例えば治療の目的に使用できるようにす
る前に、それを精製し且つその活性形に変換しなければ
ならない。公知の方法によれば、不溶性の封入体を変性
剤、例えば、グアニジン塩酸塩、または尿素を高濃度で
添加して可溶化した後、希釈あるいは透析により変性剤
の濃度を低減することにより活性な蛋白質を得ることが
できる。上記蛋白質の活性化の例として具体的には次の
ようなものが挙げられる。ＮＧＦ等の不溶性蛋白を変性
剤（ウレア、グアニジン塩酸塩）の存在下で酸性水溶液
（有機酸など）と接触させ、次いでアルカリ物質を加え
てｐＨを上昇させた後再度ｐＨを低下することを特徴と
する不溶性融合異種蛋白質の可溶化方法（特開平１−２
５７４９１号）、ＮＧＦ／ＢＤＮＦファミリーをレドッ
クスバッファー中でリフォールディングする方法（特開
平６−３１９５４９号）、還元剤を含まない溶液中でグ
アニジン塩酸塩、ウレアなどの変性剤を用いてＮＴを可
溶化させる方法（特表平６−５０８０３６号）、β−Ｎ
ＧＦをレドックスバッファー中でリフォールディングす
る方法（特開平６−３２７４８９号）、あるいは、アル
カリ性で金属イオン存在下でリフォールディングを行う
方法〔ジャーナル オブバイオロジカル ケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５１，６９３４（１９
７６）〕等が挙げられる。しかしながら今まで、酸性で
蛋白質の立体構造を復元した後、酸性から中性条件下で
金属イオンを用いて蛋白質が効率よく活性化する方法は
例がなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一方、神経細胞の分
化、維持、成長に関与するニューロトロフィンファミリ
ーの内、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）について
も、原核細胞中にＮＴ−３を発現後、変性剤を用いて可
溶化し、活性化する方法は既に知られており、特開平３
−２０４８９７号公報等に記載されている。しかしなが
ら、この方法を用いると活性なＮＴ−３はごくわずかし
か得られない。またＮＴ−３をウレアに溶解後スルホニ
ル化しスルホニル化体を単離精製した後ＰＥＧを添加し
てリフォールディングする方法（ＷＯ９５／３０６８６
号）があるが、この方法は煩雑である上に効率もよくな
い。更に、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）等、
真核細胞を宿主としてＮＴ−３を発現すると活性なＮＴ
−３は得られる（ＥＰ０４９９９３）が、真核細胞用の
培地は高価であり、得られた蛋白の精製工程が煩瑣であ
る等、工業的規模での製造には適当とはいえない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
欠点を解決すべく、原核細胞の高生産性を利用すると共
に、効率的な再生方法を提供すべく鋭意研究を重ねた結
果、遺伝子操作技術を用いてＮＴ−３等の蛋白質を原核
細胞において発現後、活性化する際に、細胞を破砕し、
変性剤により可溶化した後の活性化工程において、塩
酸、硫酸、りん酸、酢酸、ぎ酸、くえん酸等の酸性溶液
（ｐＨ１〜４、好ましくは２〜４）で変性剤を変性作用
を有しない濃度に低減或いは除去（ｐＨ１〜４の酸性溶
液に置換）した後に、更に不溶化を抑制する沈殿防止
剤、例えばブドウ糖、ショ糖、ポリエチレングリコール
２００またはアルギニン等を含む溶液で希釈し、更にｐ
Ｈ値を４〜７、好ましくは５．５〜６．５に調整した
後、この酸性領域においてＮＴ−３等の蛋白質の高次構
造を回復させ、次いで酸化触媒として硫酸銅等の金属塩
を添加することにより、活性化が効率よく行なえること
を見出し、本発明を完成したものである。即ち、本発明
は、（１）蛋白質を遺伝子工学的に原核細胞宿主中に発
現させて得られる封入体を変性剤で可溶化し、次いでゲ
ル濾過等により変性剤を除去し酸性溶液に置換したの
ち、沈殿防止剤を添加し、ｐＨ約４ないし７で金属塩を
添加することを特徴とする蛋白質の活性化方法、（２）
金属塩が硫酸銅である（１）記載の活性化方法、（３）
蛋白質を遺伝子工学的に原核細胞宿主中に発現させて得
られる封入体を変性剤で可溶化し、次いで変性剤を不作
用濃度まで酸性溶液で希釈したのち、沈殿防止剤を添加
し、次いでｐＨ約４ないし７で硫酸銅を添加することを
特徴とする蛋白質の活性化方法、（４）酸性溶液のｐＨ
が約１ないし４である（１）、（２）または（３）記載
の活性化方法、（５）変性剤が尿素またはグアニジン塩
酸塩である（１）、（２）、（３）または（４）記載の
活性化方法、（６）沈殿防止剤が糖、メルカプト基を有
しないアミノ酸またはポリエチレングリコールである請
求項１、２、３または４記載の活性化方法、（７）蛋白
質がＳ−Ｓ結合を有する蛋白質である（１）、（２）、
（３）または（４）記載の活性化方法、（８）蛋白質が
神経栄養因子である（１）、（２）、（３）または
（４）記載の活性化方法、および（９）神経栄養因子が
ニューロトロフィン３である（８）記載の活性化方法、
に関するものである。

【０００５】本発明はいずれの蛋白質にも適用できるも
のであるが、ＮＴ−３に適用した場合に十分その効果が
発揮されるので、以下、蛋白質としてＮＴ−３を例に挙
げて本発明を説明する。ＮＴ−３は、神経栄養因子（Ne
rve Growth Factor）と同一の遺伝子ファミリーに属す
る蛋白質であり、ポリメラーゼ連鎖反応により１９９０
年クローニング〔フェブス・レターズ（FEBS Lett.266,
187-191(1990),サイエンス(Science)247,1446-1451(199
0),ネイチャー(Nature)344,339-341(1990)〕された神経
栄養因子である。ＮＴ−３は、筋肉、関節、皮膚などの
感覚器のレセプターからのシグナルを脊髄と脳に伝達す
る感覚神経の存続と維持並びに感覚神経機能の保護に重
要な役割を果たすことが知られており、図１（配列番
号：１）で示される構造を有する蛋白である。本発明で
用いられる原核細胞としては、Escherichia coli（大腸
菌）、Bacillus subtilis（枯草菌）、Serratia marces
cens（セラチア）等が挙げられ、かつ中でもEscherichi
a coliが好ましい。これらの原核細胞の形質転換、培養
等は常法に準じて行えばよい（特開平３−２０４８９７
号参照）。例えば、本発明方法におけるＮＴ−３をコー
ドする塩基配列を有するｃＤＮＡを含有する発現型ベク
ターは、例えば、（ｉ）ＮＴ−３産生細胞からメッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分離し、（ii）該ｍＲＮＡ
から単鎖の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖Ｄ
ＮＡを合成し、（iii）該相補ＤＮＡをファージまたは
プラスミドに組み込み、（iv）得られた組み換えファー
ジまたはプラスミドで宿主を形質転換し、（v）得られ
た形質転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、例
えばＮＴ−３の一部をコードするＤＮＡプローブとのハ
イブリダイゼーションにより、あるいは抗ＮＴ−３抗体
を用いたイムノアッセイ法により目的とするＤＮＡを含
有するファージあるいはプラスミドを単離し、（vi）そ
の組み換えＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切
り出し、（vii）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を
発現ベクター中のプロモーターの下流に連結する、こと
により製造することができる。ＮＴ−３をコードするｍ
ＲＮＡは、種々のＮＴ−３産生細胞、例えば睾丸ライデ
ィッヒ細胞や卵巣莢膜細胞、顆粒膜細胞、黄体細胞およ
び間質細胞等の生殖細胞などから得ることができる。Ｎ
Ｔ−３産生細胞からＲＮＡを調製する方法としては、グ
アニジンチオシアネート法〔(ジェー・エム・チルグウィ
ン(J.M..Chirgwin)ら、バイオケミストリー（Bio-chemi
stry),18,5294(1979)〕などが挙げられる。このように
して得られたｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用い
て、例えば岡山(H.Okayama)らの方法〔モレキュラ−・
アンド・セルラ−・バイオロジ−（Molecular and Cell
ular Biology）2,161(1982)および同誌 3, 280(1983)〕
に従いcＤＮＡを合成し、得られたcＤＮＡをプラスミド
に組み込む。cＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
たとえば大腸菌由来のpＢＲ322〔ジ−ン（gene),2,95(1
977)〕,pＢＲ325〔ジーン,4,121(1978)〕,pＵＣ12〔ジ
ーン,19,,259(1982)〕,pＵＣ13〔ジーン,19,259(198
2)〕、枯草菌由来のpＵＢ110〔バイオケミカル・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーョン(Biochemical
and Biophysical Research Communication),112,678(1
983)〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製増殖されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベク
ターとしては、たとえばλgt11〔ヤング及びデーヴィス
(Young, R., and Davis, R.,)プロシーディングズ・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・
オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A.),80,1194(1983)〕などが挙げられるが、その他
のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用い
ることができる。

【０００６】プラスミドに組み込む方法としては、たと
えば、ティー・マニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning) コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harb
or La-boratory),第239頁(1982)に記載の方法などが挙
げられる。またファージベクターにｃＤＮＡを組み込む
方法としては、たとえばヒューン（Hyunh,T.V.)らの方
法〔ディー・エヌ・エークローニング,ア プラクティカル
アプローチ(DNA Cloning, A Practical Approach)１，
49(1985)〕などが挙げられる。このようにして得られた
プラスミドは、適当な宿主たとえばエシェリヒア(Esche
richia)属菌，バチルス(Bacillus)属菌などに導入す
る。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア
・コリ(Escherichia coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕,Ｍ
103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids
Research),9,309(1981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular
Biology)〕,120,517(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー41,459(1969)〕,Ｃ6
00〔ジェネティックス(Genetics),39,440(1954)〕ＭＭ2
94〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・
バイオエンジニアリング(Journal of Fermentation and
Boienginearing)74,67(1992)〕などが挙げられる。上
記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリス
(Bacillus subtilis)ＭＩ114〔ジーン，24,255(198
3)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(Journal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げら
れる。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、
たとえばティー・マニアティス(T．Maniatis)ら，モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning),コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Har
bor Laboratory)，第249頁(1982)に記載のカルシウムク
ロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビジウム
クロライド法などが挙げられる。またファージ・ベクタ
ーを用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌にイン
ビトロパッケージング法を用いて導入することができ
る。ＮＴ−３ｃＤＮＡを含有するＮＴ−３・ｃＤＮＡラ
イブラリーは上記の方法などで得ることが出来るが、市
販品として購入することも可能である。このようにして
クローン化されたＮＴ−３ｃＤＮＡは必要があればプラ
スミド、例えばpBR322, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19,
pUC118,pUC119などにサブクローニングしてＮＴ−３ｃ
ＤＮＡを得ることができる。このようにして得られたｃ
ＤＮＡの塩基配列を、たとえばマキサム・ギルバート(M
axam-Gilbert)法〔Maxam, A. M. and Gilbert, w.,プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc.
Natl. Acad. Sci.,U.S.A.),74,560(1977)〕あるいはジ
デオキシ法〔Messing, J. ら、ヌクレイック・アシッズ
・リサーチ(Nucleic Acids Research)9,309(1981)〕に
よって決定し、既知のアミノ酸配列との比較からＮＴ−
３ｃＤＮＡの存在を確認する。以上のようにして、ＮＴ
−３蛋白質をコードするｃＤＮＡが得られる。

【０００７】上記のようにしてクローン化されたＮＴ−
３蛋白質をコードするｃＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素で消化して使用することが出
来る。クローン化されたｃＤＮＡから発現させたい領域
を切り出し、発現に適したビークル（ベクター）中のプ
ロモーターの下流に連結して発現型ベクターを得ること
ができる。該ｃＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドン
としてのＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コド
ンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していても
よい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモ
ーターを接続する。 ベクターとしては、上記の大腸菌
由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，
ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラスミド
（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）などが挙
げられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、
遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモータ
ーであればいかなるものでもよい。形質転換する際の宿
主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ７プロモータ
ー，ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃ
Ａプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモー
ターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ
１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプロ
モーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキア
属菌でプロモーターがＴ７プロモーター，ｔｒｐプロモ
ーターまたはλＰＬプロモーターであることが好まし
い。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
このようにして構築されたＮＴ−３蛋白質の成熟ペプチ
ドをコードするｃＤＮＡを含有するベクターを用いて、
形質転換体を製造する。上記エシェリキア属菌を形質転
換するには、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA),69,2110(1972)やジーン,17,107(1982)など
に記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質
転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetic
s）,168,111(1979)などに記載の方法に従って行なわれ
る。このようにして、ＮＴ−３をコードするｃＤＮＡを
含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得
られる。

【０００８】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ
・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),4
31−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19
72〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、たとえばイソプロピル−β−Ｄ−
チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、３β−インドリ
ル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿
主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で
約３〜24時間行い、必要により、通気や攪拌を加えるこ
ともできる。細胞の破砕は、常法で、たとえば超音波に
より実施できる。懸濁媒体として中性付近のｐＨ値に調
整した好適な緩衝液中で実施する。このようにして細胞
を破砕した後に、不溶成分（封入体）を任意の方法で、
遠心分離するか、濾過することにより分離する。異種の
蛋白質をできる限り除去するため、たとえば水、リン酸
緩衝液を用いて、場合により４Ｍ尿素で洗浄する。得ら
れた沈殿（ペレット）を変性剤を用いて可溶化するが、
変性剤としては、公知の変性剤、特にグアジニン塩酸塩
または尿素を使用することができる。この可溶化に当っ
ての変性剤の濃度は、グアジニン塩酸塩では４〜８モル
／リットル、好ましくは約６モル／リットル、尿素では
５〜９モル／リットル、好ましくは約８モル／リットル
である。用いる変性剤溶液のｐＨは１〜６、好ましくは
２〜４であり、使用する酸は、塩酸、硫酸、りん酸等の
無機酸、酢酸、ぎ酸、くえん酸等の有機酸のいずれでも
よいが、くえん酸が好ましい。上記のようにして封入体
の可溶化を行った後、遠心分離等で不純物を除去し、そ
の上澄液について活性化を行なう。活性化に当っては、
変性剤の濃度をｐＨ１〜４、好ましくはｐＨ２〜４にお
いて不作用濃度まで希釈或いは低減させる。グアジニン
塩酸塩では０〜１．２モル／リットル、好ましくは約
０．１モル／リットル以下、尿素では０〜１．６モル／
リットル、好ましくは０．２モル／リットル以下まで低
減させる。ｐＨ値を１〜４、好ましは２〜４にするため
に使用する酸は、塩酸、硫酸、りん酸等の無機酸、酢
酸、ぎ酸、くえん酸等の有機酸のいずれでもよいが、酢
酸が最も好ましく、該酸の濃度は０．０５〜０．５モル
／リットル、好ましくは０．１〜０．２モル／リットル
である。酸溶液に置換した再活性化溶液は、０〜４０
℃、好ましくは４〜１０℃で０〜３０日、好ましくは２
〜５日間静置する。変性剤濃度の低減及び酸溶液に置換
する方法としては、置換しようとする酸溶液で希釈する
方法以外にも、一般に公知で常用の方法を用いることが
でき、例えば置換しようとする酸溶液で平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５（ファルマシア バイオテク
（株））に通液したり或いは置換しようとする酸溶液に
対して透析することにより行うことができる。酸溶液に
置換したのち希釈に用いる溶液は、蒸留水或いは適当な
緩衝液で良いが、好ましくは１〜５００ｍＭ（より好ま
しくは２０〜１００ｍＭ）のリン酸緩衝液（ｐＨ４〜
７）で希釈した後、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
等のアルカリあるいは塩酸、硫酸、リン酸などの酸でｐ
Ｈ値を４〜７、好ましくは５．５〜６．５、更に好まし
くは６．０に調整する。この時、不溶化、即ち沈殿を防
止する目的で、ブドウ糖、ショ糖等の糖、メルカプト基
を有さないアミノ酸（例、システイン以外の１９種類の
必須アミノ酸）、ポリエチレングリコールを単独で、或
いは組み合わせて添加してもよいが、ショ糖を用いるの
が好ましく、該濃度は５〜３０（Ｗ／Ｖ）％、好ましく
は５〜２０（Ｗ／Ｖ）％である。最後にＳ−Ｓ結合を形
成させるために添加する金属塩は、酸化触媒能を有する
遷移金属（例、銅、鉄、コバルト、ニッケル）の無機酸
（例、硫酸、硝酸、リン酸）や有機酸（例、くえん酸、
酢酸）との塩でよいが、好ましくは硫酸銅で、該濃度は
５〜１５μＭ、好ましくは１０μＭである。該活性化に
あたっての温度は０〜２５℃、好ましくは４〜１０℃で
ある。静置する期間は０〜２０日、好ましくは２〜１０
日である。再活性化工程に続いて行うもう一つの精製工
程は、透析或いは陽イオン交換体、たとえばＳＰ−セフ
ァロース（ファルマシア バイオテク（株））により行
なうことができる。

【０００９】

【発明の実施の形態】常法に従い培養したＮＴ−３発現
原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ等）の培養液から遠心
分離により、ＮＴ−３の封入体を蓄積した菌体を集め、
−８０℃に凍結保存した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．０）中に上記の菌体を懸濁した後、超音波により細
胞を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、一時間）
を行った。得られたペレットを再度１０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．０）中に懸濁し、遠心分離を行いペレットの
洗浄を行った。同様の操作をもう一度繰り返し行い、再
度ペレットを洗浄した。洗浄したペレットを５０ｍＭト
リス塩酸／４Ｍ尿素／５ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ
８．０）でホモジナイズした後、遠心分離（１００００
ｒｐｍ、１時間）を行った。次にペレットを２０ｍＭク
エン酸／８Ｍ尿素（ｐＨ３．０）で溶解した後、遠心分
離（１００００ｒｐｍ、１時間）を行い、上澄液を得
た。得られた上澄液に１００ｍＭ酢酸溶液を加えて５倍
に希釈（ｐＨ３．５）し、よく撹拌した後、１００ｍＭ
酢酸溶液で十分に平衡化したセファデックスＧ−２５カ
ラムを用いて、尿素を除去すると共に１００ｍＭ酢酸溶
液に置換し、４℃で２日間静置した。次いで５０ｍＭリ
ン酸緩衝液／１２．５％ショ糖（ｐＨ６．８）を加えて
５倍に希釈しｐＨ値を６．０に調製した後、再度で４℃
に２日間静置した。静置後、１０μＭ濃度になるように
硫酸銅を加えて溶解し、更に４℃に２日間静置して活性
化を行った。

【００１０】

【実施例】以下の参考例および実施例によって本発明を
より具体的に説明するが、本発明はこれらに制限される
ものではない。 参考例１ （ＮＴ−３ ＤＮＡのクローニング） Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０にヒトグリオーマ由来のλｇ
ｔ １１ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を感染させたの
ち、約６×１０⁵個のファージをＮＺＣＹ培地（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｌｏｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２に記載）にま
き、３７℃で５時間培養した。次にナイロン膜をプレー
ト上にのせ、１分間放置後、プレートからはずした。こ
のナイロン膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、ついで１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ８．０に浸し、さらに２×ＳＳＣ〔Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 前掲 参照〕に浸し、風乾後、８０
℃で２時間放置した。ヒトβＮＧＦ〔ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ），３０３，８２１（１９８３）〕をコードす
るＤＮＡ（約０．３８ｋｂ）を化学合成し、ニックトラ
ンスレーションによって〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰでラベル
化することによってプローブを作製した。上記で得られ
たナイロン膜とプローブを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｌｏｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２に記載の方法に従ってハイブリ
ダイゼーションを行った。即ち、プローブを含むハイブ
リダイゼーション溶液にナイロン膜を浸し、６５℃で１
６時間保温した。該ナイロン膜を室温において２×ＳＳ
Ｃ−０．１％ＳＤＳで洗浄したのち、６０℃において１
×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄した。次にオートラジ
オグラフィーによって陽性クローンを得た。 このよう
にして得られたクローンλβＧＮ１３２１からＥｃｏＲ
ＩでｃＤＮＡを切り出し、プラスミドｐＵＣ１１８（宝
酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミ
ドｐＵＮＫ５を得た。

【００１１】参考例２ （大腸菌用のＮＴ−３発現ベク
ターの構築） 参考例１で得られたプラスミドｐＵＮＫ５に挿入されて
いるＮＴ−３ｃＤＮＡには、ＮＴ−３のＮ末端の１１番
目のチロシン残基をコードする領域付近にＳｃａＩ部位
が、ＮＴ−３の終止コドンの５０塩基下流付近にＮｓｉ
Ｉ部位が存在する。そこでｐＵＮＫ５より０．３ｋｂ
ＳｃａＩ−ＮａｉＩ断片を単離し、これにアダプターＮ
ＧＦＴＥ−１（３５ｍｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−２（３３ｍ
ｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−３（７ｍｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−４
（１５ｍｅｒ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち制
限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、０．３ｋｂ Ｎ
ｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。該アダプターを次に示
す。 ＮＧＦＴＥ−１：5' TATGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT 3' ３５ｍｅｒ（配 列番号：２） ＮＧＦＴＥ−２：5' ACTCCCCTCGGTGACTCTTATGCTCCGCGTACA 3' ３３ｍｅｒ（配 列番号：３） ＮＧＦＴＥ−３：5' TGCCAGG 3' ７ｍｅｒ ＮＧＦＴＥ−４：5' GATCCCTGGCATGCA 3' １５ｍｅｒ（配 列番号：４） 一方、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−
３Ｃ〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ジーン（Ｇ
ｅｎｅ），５６，１２５（１９８７）〕をＮｄｅＩとＢ
ａｍＨＩで切断し、４．４ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ
断片を単離した。上記で得られた４．４ｋｂ ＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩ断片と０．３ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１に導入し、得られたア
ンピシリン耐性の形質転換株〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ１／ｐＥＮＧＦＴ１０２およびＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１／ｐＥＮＧＦＴ１
０３〕から単離したプラスミドをそれぞれｐＥＮＧＦＴ
１０２およびｐＥＮＧＦＴ１０３と命名した。

【００１２】参考例３ （大腸菌用のＮＴ−３の生産） 参考例２で得られたＮＴ−３発現ベクターｐＥＮＧＦＴ
１０３およびＴ７リゾチーム発現ベクターｐＬｙｓＳを
用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＭＭ２９４
（ＤＥ３）〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ，４，８６９（１９９０）〕の形質転換を行
い、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／
ｐＬｙｓＳ，ｐＥＮＧＦＴ１０３（ＩＦＯ １５９３
２，ＦＥＲＭ ＢＰ−５４８３）を得た。また、参考例
２で得られたＮＴ−３発現ベクターｐＥＮＧＦＴ１０２
およびＴ７リゾチーム発現ベクターｐＬｙｓＳを用い
て、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）〔Ｇｅｎｅ，５６，１２５（１９８７）〕の形質
転換を行い、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ
３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＮＧＦＴ１０２（ＩＦＯ １４
９０３，ＦＥＲＭ ＢＰ−２５２９）を得た。形質転換
体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，
ｐＥＮＧＦＴ１０３を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと
１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含ＬＢ培地
〔１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム〕１リットルを含む２リットル容フラスコで３
０℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を２０リ
ットルの主醗酵培地〔１．６８％リン酸一水素ナトリウ
ム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アン
モニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸
マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫
酸第１鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブド
ウ糖、１．５％カザミノ酸〕を仕込んだ５０リットル容
醗酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。
培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、
１００ｍｇ／ｌ分のイソプロピル−β−Ｄチオガラクト
ピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、
７時間後に培養を終了した。この培養終了液を遠心分離
して、約３４０ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存し
た。

【００１３】参考例４ （大腸菌用のＮＴ−３の生産） 形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬ
ｙｓＳ，ｐＥＮＧＦＴ１０３を５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む
ＬＢ培地〔１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５
％塩化ナトリウム〕１リットルを含む２リットル容フラ
スコで３０℃、１６．５時間振とう培養した。得られた
培養液を２０リットルのＬＢ培地〔０．０２％消泡剤、
５０μｍ／ｍｌのアンピシリン及び１５μｇ／ｍｌのク
ロラムフェニコールを含む〕を仕込んだ５０リットル容
醗酵槽へ移植して、３０℃、７時間通気撹拌培養した。
この培養液を３６０リットルの主醗酵培地〔１．６８％
リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウ
ム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリ
ウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡
剤、０．０００２５％硫酸第１鉄、０．０００５％塩酸
チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸〕を
仕込んだ５００リットル容醗酵槽へ移植して、３０℃で
通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレ
ット単位になった時点で、１００ｍｇ／ｌ分のイソプロ
ピル−β−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添
加し、さらに培養を続け、５．５時間後に培養終了液を
遠心分離して、約６ｋｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結
保存した。

【００１４】実施例１（ＮＴ−３の活性化） 参考例３で得た湿菌体のうち４０ｇを取り出し、この菌
体に１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）２４０ｍｌを加え
て懸濁した後、氷冷下でソニファイヤー４５０（ブラン
ソン社）を使って超音波により細胞を破砕し、遠心分離
（１００００ｒｐｍ、１時間）を行った。得られたペレ
ットを同様の操作を２回行って洗浄した。次いで、５０
ｍＭトリス塩酸／４Ｍ尿素／５ｍＭジチオトレイトール
（ＤＴＴ）（ｐＨ８．０）を１６０ｍｌ加えてホモジナ
イズした後遠心分離を行い、得られたペレットに２０ｍ
Ｍクエン酸／８Ｍ尿素（ｐＨ３．０）を１２０ｍｌ加え
て溶解後、遠心分離を行い、上澄液と沈殿物を分離し、
沈殿物に対して再度同様の操作を行い、得られた上澄液
と先に得られた上澄液を混合し２４０ｍｌのペレット溶
解液を得た。この溶解液に１００ｍＭ酢酸溶液を７６０
ｍｌ加えて希釈し、同じく１００ｍＭ酢酸で平衡化した
セファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×５
０）に通液し、尿素を除去した変性ＮＴ−３溶液１６４
６ｍｌを得た。この溶液を４℃で２日間静置した後、５
０ｍＭリン酸緩衝液／１２．５％ショ糖（ｐＨ６．８）
を加えて８．５ｌとし、５Ｍ水酸化ナトリウムおよび濃
リン酸を用いてｐＨ６．０に調整し、再び４℃で２日間
静置し活性化を行った。静置後２００ｍＭ硫酸銅を最終
濃度が１０μＭになるように加え、撹拌後、更に活性化
を継続するため、再度４℃に２日間静置した。

【００１５】実施例２（ＮＴ−３の精製） 実施例１で活性化を終了した溶液を１００ｍＭリン酸緩
衝液／０．１％３−〔（３−コールアミドプロピル）ジ
メチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート（ＣＨ
ＡＰＳ）（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ−セファロー
ス ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（２．５ｃｍφ×１２ｃ
ｍ、ファルマシア バイオテク社）に通液し、吸着後２
００ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液／０．１％ＣＨＡＰ
Ｓ／２００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）でカラム
を洗浄し、次いで１００ｍＭリン酸緩衝液／０．１％Ｃ
ＨＡＰＳ／４００ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）で
溶出し、ＮＴ−３を含む溶出液を得た。この溶出液をＲ
ｅｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣカラム（２ｃｍφ×３０ｃ
ｍ、ファルマシア バイオテク社）に吸着した後、１６
％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ−３６％アセトニト
リル／０．１％ＴＦＡの濃度勾配で溶出し、その溶出液
を凍結乾燥し、約２８ｍｇのＮＴ−３の白色粉末を得
た。

【００１６】実施例３（ＮＴ−３の特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を用いた分析 実施例２で得られたＮＴ−３を１００ｍＭ ＤＴＴを加
えた Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ ［Ｌａｅｍｍｌｉ，
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７
０）］に懸濁し１００℃で１分間加熱した後、４Ｍ濃度
になるように尿素を加えて溶解し、０．１％ＳＤＳおよ
び４Ｍ 尿素を含む１２．５％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリ
アントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎ
ｔ ｂｌｕｅ）で染色したところ、単一バンドの蛋白が
認められ、精製品はほぼ単一であった（図２）。 ｂ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた
分析 ５μｇのＮＴ−３を０．１％ＴＦＡで平衡化したＡｓａ
ｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍ
ｍＬ）カラムにかけ０−８０％Ｂ（Ｂ＝アセトニトリル
／０．１％ＴＦＡ）の濃度勾配で３５分、０．５ｍｌ／
分の流速で溶出した。２３５ｎｍでの吸光度を検出し
た。図３の溶出曲線よりピーク１（ＮＴ−３ ダイマ
ー）及びピーク２（ＮＴ−３ モノマー）［ヨーロピア
ン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２２５，９９５−１００３（１
９９４）］以外は検出されず、精製品はほぼ単一であっ
た。 ｃ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム
６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、Ｎ末端にメ
チオニンが付加されたＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列か
ら推定したアミノ酸組成と一致した（表１）。

【００１７】

【表１】

【００１８】ｄ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたＮＴ−３のＮ末端にはメ
チオニンが付加されていることのほかはｃＤＮＡの塩基
配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致
した（表２）。

【００１９】

【表２】

【００２０】ｅ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システ
ム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＮＴ−３は
ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致
した（表３）。

【００２１】

【表３】

【００２２】実施例４（ＮＴ−３の生物活性の測定） ニワトリ有精卵を３７．５℃でふ卵器で８〜１０日間揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節（Ｄｏｒｓａ
ｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ、以下ＤＲＧ）を摘出
した。ＤＲＧを０．１２５％トリプシン−Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｅｎ（ＰＢＳ）溶
液で３７℃ ２０分処理し、ピペッティングを行うこと
で、細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児血清−ダ
ルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシン
に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ₂存在下３〜４時間培養す
ることにより繊維芽細胞等を培養シャーレに付着させ、
非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８００
ｒｐｍ、５分）により集め、２０％牛胎児血清−ダルベ
ッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（混合比１：
１）−１μＭサイトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シグ
マ社、ＵＳＡ）−５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培
地に２００００細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、０．
５ｍｌ／ウェルずつ、ポリＤＬ−オルニチン及びマウス
ラミニンでコートした２４穴プレートに播種した。この
培地にＮＴ−３の溶液を０．５〜２０μｌ加え、３７
℃、５％ＣＯ₂存在下で２日間培養し、生存細胞数を計
測すると、真核細胞由来のＮＴ−３と同等のＤＲＧの生
存を促進する活性が認められた（図４）。図中●は実施
例２で得られたＮＴ−３を、○はポジティブコントロー
ルとしてＣＨＯ細胞由来のＮＴ−３（ＥＰ０４９９９３
に従い、調製した）を示す。このようにして得られたＮ
Ｔ−３は、細胞の分化、成長、増殖の促進、生存維持；
遺伝子発現の上昇；蛋白質、酵素の誘導等の機構を研究
するための試薬として有利に用いることができる。

【００２３】

【発明の効果】 本発明では遺伝子工学を用いて原核
細胞中に発現したＮＴ−３等の蛋白質の不活性体を効率
よく活性化でき、上記のような作用を有するＮＴ−３等
の蛋白質の活性体を大量に調製できるものである。

【００２４】

【配列表】 配列番号：1 配列の長さ：120 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg 20 25 30 Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro 35 40 45 Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val 50 55 60 Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys 85 90 95 Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala 100 105 110 Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115 120。

【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TATGTACGCG GAGCATAAGA GTCACCGAGG GGAGT 35。

【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACTCCCCTCG GTGACTCTTA TGCTCCGCGT ACA 33。

【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCCCTGGC ATGCA 15。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＴ−３の構造を示す（Ｎ末端にＭｅｔ付
加）。

【図２】ＮＴ−３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図３】ＮＴ−３のＨＰＬＣ分析チャートを示す。

【図４】ＮＴ−３のＤＲＧ細胞を用いた生物活性の測定
結果を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成８年８月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】ＮＴ−３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（電気泳
動）を示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＡＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ ＡＥＥ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/48 ＡＥＥ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】蛋白質を遺伝子工学的に原核細胞宿主中に
   発現させて得られる封入体を変性剤で可溶化し、次いで
   変性剤を除去し酸性溶液に置換したのち、沈殿防止剤を
   添加し、ｐＨ約４ないし７で金属塩を添加することを特
   徴とする蛋白質の活性化方法。
2. 【請求項２】金属塩が硫酸銅である請求項１記載の活性
   化方法。
3. 【請求項３】蛋白質を遺伝子工学的に原核細胞宿主中に
   発現させて得られる封入体を変性剤で可溶化し、次いで
   変性剤を不作用濃度まで酸性溶液で希釈したのち、沈殿
   防止剤を添加し、次いでｐＨ約４ないし７で硫酸銅を添
   加することを特徴とする蛋白質の活性化方法。
4. 【請求項４】酸性溶液のｐＨが約１ないし４である請求
   項１、２または３記載の活性化方法。
5. 【請求項５】変性剤が尿素またはグアニジン塩酸塩であ
   る請求項１、２、３または４記載の活性化方法。
6. 【請求項６】沈殿防止剤が糖、メルカプト基を有しない
   アミノ酸およびポリエチレングリコールの一種または二
   種以上である請求項１、２、３または４記載の活性化方
   法。
7. 【請求項７】蛋白質がＳ−Ｓ結合を有する蛋白質である
   請求項１、２、３または４記載の活性化方法。
8. 【請求項８】蛋白質が神経栄養因子である請求項１、
   ２、３または４記載の活性化方法。
9. 【請求項９】神経栄養因子がニューロトロフィン３であ
   る請求項８記載の活性化方法。