JPH09121886A - ニューロトロフィン３類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】遺伝子操作技術を用いて、原核細胞で生産した
不活性なＮＴ−３の封入体を、効率的に活性を回復さ
せ、天然源から単離されたＮＴ−３と同じ活性を有する
蛋白質を得る方法を提供する。 【解決手段】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
たＮＴ−３類をレドックスバッファー中でリフォールデ
ィングすることを特徴とする活性型ＮＴ−３類の製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は遺伝子操作技術を用
いて、原核細胞中にニューロトロフィン３（ＮＴ−３）
類を発現後、リフォールディングし、薬理的に活性なＮ
Ｔ−３類を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】異種蛋白質を原核細胞を用いて発現する
際に、しばしばこれらの蛋白質は宿主細胞中で不溶性の
不活性な封入体を形成し、更に封入体は宿主細胞の蛋白
質により不純化されている。そのような封入体の形成
は、発現の際に発生する細胞中の高い蛋白質濃度の結果
であると推測されている。細胞中で大量の蛋白質を形成
する際には、蛋白質の集合により不溶性の、大抵の場合
は不活性な粒子になることが知られている。それ故、そ
のような蛋白質を例えば治療の目的に使用できるように
する前に、それを精製しかつその活性型に変換しなけれ
ばならない。公知の方法によれば、不溶性の封入体を変
性剤、たとえば、グアニジン塩酸塩、または尿素を高濃
度で添加して可溶化した後、希釈あるいは透析により変
性剤の濃度を低減することにより活性型蛋白質を得てい
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】神経細胞の分化、維
持、成長に関与するニューロトロフィンファミリーの
内、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）についても、原
核細胞中にＮＴ−３を発現後、変性剤を用いて可溶化
し、活性化する方法は既に知られている（特表平６−５
０８０３６号）。しかしながら、この方法を用いると活
性型ＮＴ−３はごくわずかしか得られない。また、チャ
イニーズハムスター細胞（ＣＨＯ）、サル細胞（ＣＯＳ
−７等）等、真核細胞を宿主としてＮＴ−３を発現する
と活性型ＮＴ−３が得られる（ＥＰ４９９９９３、特開
平３−２０４８９７号）が、真核細胞用の培地は高価で
あり、得られた蛋白の精製工程が煩瑣である等工業的規
模での製造には適当とはいえない。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
欠点を解決すべく、原核細胞の高生産性を利用すると共
に、効率的な活性化方法（再生方法）を提供すべく鋭意
研究を重ねた結果、遺伝子操作技術を用いてＮＴ−３を
原核細胞において発現後、活性化する方法において、レ
ドックスバッファー中でリフォールディングすることに
よって、活性化が効率よく行なえることを見出し、本発
明を完成したものである。即ち、本発明は、遺伝子工学
的に原核細胞宿主中で発現させたＮＴ−３類をレドック
スバッファー中でリフォールディングすることを特徴と
する活性型ＮＴ−３類の製造方法に関するものである。

【０００５】ＮＴ−３は、神経成長因子（Nerve Growth
Factor）と同一の遺伝子ファミリーに属する蛋白質で
あり、ポリメラーゼ連鎖反応により１９９０年クローニ
ング〔フェブス・レターズ（FEBS Lett.266,187-191(19
90),サイエンス(Science)247,1446-1451(1990),ネイチ
ャー(Nature)344,339-341(1990)〕された神経栄養因子
である。ＮＴ−３は、筋肉、関節、皮膚などの感覚器の
レセプターからのシグナルを脊髄と脳に伝達する感覚神
経の存続と維持並びに感覚神経機能の保護に重要な役割
を果たすことが知られており、ヒトＮＴ−３は図１（配
列番号：１）の２〜１２０番目のアミノ酸配列を有する
蛋白である。

【０００６】本発明で用いられるＮＴ−３類は哺乳動物
由来のＮＴ−３や、そのＮ末端にＭｅｔが付加された蛋
白（以下、Ｍｅｔ−ＮＴ−３と称することもある）等が
挙げられ、中でも図１（配列番号：１）の２〜１２０番
目のアミノ酸配列を有するヒトＮＴ−３およびそのＮ末
端にＭｅｔが付加された図１（配列番号：１）の１〜１
２０番目のアミノ酸配列を有する蛋白等が好ましい。ま
た、ＮＴ−３類は塩として用いられてもよく、塩化水素
酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との
塩、酢酸、フタル酸、フマール酸、酒石酸、マレイン
酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トル
エンスルホン酸等の有機酸との塩、ナトリウム塩、カリ
ウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ
土類金属塩、アンモニウム塩等の薬学的に許容されうる
塩や水和物等が挙げられる。

【０００７】本発明で用いられる原核細胞としては、Es
cherichia coli（大腸菌）等のエシェリヒア属菌、Baci
llus subtilis（枯草菌）等のバチルス属菌、Serratia
marcescens（セラチア）等のセラチア属菌等が挙げら
れ、中でもEscherichia coliが好ましい。これらの原核
細胞の形質転換、培養等は常法に準じて行うことができ
る（特開平３−２０４８９７号参照）。例えば、本発明
方法におけるＮＴ−３類をコードする塩基配列を有する
ｃＤＮＡを含有する発現型ベクターは、例えば、（ｉ）
ＮＴ−３産生細胞からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）を分離し、（ii）該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、（ii
i）該相補ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組み込
み、（iv）得られた組み換えファージまたはプラスミド
で宿主を形質転換し、（v）得られた形質転換体を培養
後、形質転換体から適当な方法、例えばＮＴ−３の一部
をコードするＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーショ
ンにより、あるいは抗ＮＴ−３抗体を用いたイムノアッ
セイ法により目的とするＤＮＡを含有するファージある
いはプラスミドを単離し、（vi）その組み換えＤＮＡか
ら目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、（vii）該
クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクター中のプ
ロモーターの下流に連結する、ことにより製造すること
ができる。

【０００８】ＮＴ−３をコードするｍＲＮＡは、種々の
ＮＴ−３産生細胞、例えば睾丸ライディッヒ細胞や卵巣
莢膜細胞、顆粒膜細胞、黄体細胞および間質細胞等の生
殖細胞などから得ることができる。ＮＴ−３産生細胞か
らｍＲＮＡを調製する方法としては、グアニジンチオシ
アネート法〔(ジェー・エム・チルグウィン(J.M.Chirgwi
n)ら、バイオケミストリー（Bio-chemistry),18,5294(1
979)〕などが挙げられる。このようにして得られたｍＲ
ＮＡを鋳型とし、逆転写酵素を用いて、例えば岡山(H.O
kayama)らの方法〔モレキュラ−・アンド・セルラ−・
バイオロジ−（Molecular and Cellular Biology）2,16
1(1982)および同誌 3, 280(1983)〕に従いcＤＮＡを合
成し、得られたcＤＮＡをプラスミドに組み込む。cＤＮ
Ａを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由来
のpＢＲ322〔ジ−ン（gene),2,95(1977)〕,pＢＲ325
〔ジーン,4,121(1978)〕,pＵＣ12〔ジーン,19,,259(198
2)〕,pＵＣ13〔ジーン,19,259(1982)〕、枯草菌由来のp
ＵＢ110〔バイオケミカル・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーョン(Biochemical and Biophysical R
esearch Communication),112,678(1983)〕などが挙げら
れるが、その他のものであっても、宿主内で複製増殖さ
れるものであれば、いずれを用いることもできる。また
ｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、たとえ
ばλgt11〔ヤング及びデーヴィス(Young, R., and Davi
s, R.,)プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユー・エス
・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A.),80,1194(198
3)〕などが挙げられるが、その他のものであっても宿主
内で増殖できるものであれば用いることができる。プラ
スミドに組み込む方法としては、たとえば、ティー・マ
ニアティス(T.Maniatis)ら，モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning) コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory),
第239頁(1982)に記載の方法などが挙げられる。またフ
ァージベクターにｃＤＮＡを組み込む方法としては、た
とえばヒューン（Hyunh,T.V.)らの方法〔ディー・エヌ・
エー クローニング,ア プラクティカル アプローチ(DNA
Cloning, A Practical Approach)１，49(1985)〕など
が挙げられる。

【０００９】このようにして得られたプラスミドは、適
当な宿主たとえばエシェリヒア(Escherichia)属菌，バ
チルス(Bacillus)属菌などに導入する。上記エシェリヒ
ア属菌の例としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia
coli)Ｋ12ＤＨ1〔プロシージング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A.)60,160(1968)〕,Ｍ103〔ヌクレイック・
アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9,309(1
981)〕,ＪＡ221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,120,517
(1978)〕，ＨＢ101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー41,459(1969)〕,Ｃ600〔ジェネティック
ス(Genetics),39,440(1954)〕などが挙げられる。上記
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチリス(B
acillus subtilis)ＭＩ114〔ジーン，24,255(1983)〕,
207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Jour
nal of Biochemistry)95,87(1984)〕などが挙げられ
る。プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、た
とえばティー・マニアティス(T．Maniatis)ら，モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning),コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbo
r Laboratory)，第249頁(1982)に記載のカルシウムクロ
ライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビジウムク
ロライド法などが挙げられる。またファージ・ベクター
を用いる場合には、たとえば増殖させた大腸菌にインビ
トロパッケージング法を用いて導入することができる。
ＮＴ−３ｃＤＮＡを含有するＮＴ−３・ｃＤＮＡライブ
ラリーは上記の方法などで得ることが出来るが、市販品
として購入することも可能である。

【００１０】このようにしてクローン化されたＮＴ−３
ｃＤＮＡは必要があればプラスミド、例えばpBR322, pU
C12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118,pUC119などにサブ
クローニングしてＮＴ−３ｃＤＮＡを得ることができ
る。このようにして得られたｃＤＮＡの塩基配列を、た
とえばマキサム・ギルバート(Maxam-Gilbert)法〔Maxa
m, A. M. and Gilbert, w.,プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci.,U.
S.A.),74,560(1977)〕あるいはジデオキシ法〔Messing,
J. ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic A
cids Research)9,309(1981)〕によって決定し、既知の
アミノ酸配列との比較からＮＴ−３ｃＤＮＡの存在が確
認できる。上記のようにして、ＮＴ−３をコードするｃ
ＤＮＡが得られる。上記のようにしてクローン化された
ＮＴ−３をコードするｃＤＮＡは目的によりそのまま、
または所望により制限酵素やエキソヌクレアーゼで消化
して使用することが出来る。

【００１１】次に、クローン化されたｃＤＮＡから発現
させたい領域を切り出し、発現に適したビークル（ベク
ター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベクタ
ーを得ることができる。該ｃＤＮＡはその５’末端に翻
訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端には
翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを
有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止
コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加す
ることもできる。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその
上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては、上
記の大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢ
Ｒ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３），枯草菌由来プラ
スミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）な
どが挙げられる。

【００１２】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際
の宿主がエシェリキア属菌である場合は、Ｔ７プロモー
ター，ｔｒｐプロモーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅ
ｃＡプロモーター，λＰＬプロモーター，ｌｐｐプロモ
ーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ
Ｏ１プロモーター，ＳＰＯ２プロモーター，ｐｅｎＰプ
ロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエシェリキ
ア属菌でプロモーターがＴ７プロモーター，ｔｒｐプロ
モーターまたはλＰＬプロモーターであることが好まし
い。なお、発現にエンハンサーの利用も効果的である。
このようにして構築されたＮＴ−３の成熟ペプチドをコ
ードするｃＤＮＡを含有するベクターを用いて、原核細
胞の形質転換体を製造する。

【００１３】上記エシェリキア属菌を形質転換するに
は、たとえばプロシージング・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA),69,2110(1972)やジーン（Gene）,17,107(1982)など
に記載の方法に従って行なわれる。バチルス属菌を形質
転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネ
ラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetic
s）,168,111(1979)などに記載の方法に従って行われ
る。このようにして、ＮＴ−３をコードするｃＤＮＡを
含有する発現ベクターで形質転換された原核細胞の形質
転換体が得られる。宿主としてエシェリヒア属菌を、プ
ロモーターとしてＴ７プロモーターを用いる場合、Ｔ７
プロモーターの発現効率の向上を目的として、ＮＴ−３
をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターに加え、
Ｔ７リゾチーム発現プラスミドを共存させてもよい。

【００１４】宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌で
ある形質転換体を培養する際、培養に使用される培地と
しては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せ
しめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デ
キストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源として
は、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチ
ープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆
粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機
物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナト
リウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵
母、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。
培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を
培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミ
ノ酸を含むＭ９培地［ミラー(Miller),ジャーナル・オブ
・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),4
31−433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 19
72］、ＬＢ培地等が好ましい。ここに必要によりプロモ
ーターを効率よく働かせるために、たとえばイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、３
β−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えること
ができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常
約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通
気や攪拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の
場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行な
い、必要により通気や攪拌を加えることもできる。

【００１５】培養後、遠心分離等の方法により集菌した
後、細胞を破砕し、封入体を変性剤を用いて可溶化する
ことによって、ＮＴ−３類を抽出することができる。細
胞の破砕は、常法で、たとえば超音波により実施でき
る。懸濁媒体として中性付近のｐＨ値（ｐＨ６．５〜
７．５）に調整した好適な緩衝液（例えばリン酸緩衝液
等）を用いることが好ましい。この際、細胞の破砕を促
進させるためＥＤＴＡを添加してもよい。このようにし
て細胞を破砕した後に、不溶成分（封入体）を任意の方
法で、遠心分離するか、濾過することにより分取する。
異種の蛋白質をできる限り除去するため、たとえば水、
リン酸緩衝液を用いて洗浄することが好ましいが、場合
により４Ｍ程度の尿素で洗浄してもよい。得られた沈殿
（ペレット）を変性剤を用いて可溶化するが、変性剤と
しては、公知の変性剤、特にグアニジンまたは尿素を使
用することができる。この可溶化に当っての変性剤の濃
度は、グアニジンでは４〜８モル／リットル、好ましく
は約６モル／リットル、尿素では５〜９モル／リット
ル、好ましくは約８モル／リットルである。グアニジン
は通常グアニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩とし
て用いられる。

【００１６】上記のようにして封入体の可溶化を行った
後、遠心分離等で不純物を除去し、得られた上澄液を必
要により精製工程やＮ末端Ｍｅｔの除去工程に付した
後、ＮＴ−３類のリフォールディング（活性化、再生
化）を行うことができる。リフォールディングは、精製
したＮＴ−３類にレドックスバッファーを添加するか、
あるいはＮＴ−３類を含有する上澄液をレドックスバッ
ファーで希釈することにより行われる。この際、メルカ
プト基を有さないアミノ酸をレドックスバッファーに含
有させておくことが好ましい。ＮＴ−３類を含有する上
澄液をレドックスバッファーで希釈する場合、変性剤の
濃度を活性化に適した中性ｐＨにおいて不作用濃度まで
希釈することが必要であり、グアジニンでは０〜２．０
モル／リットル、好ましくは約１モル／リットル以下ま
で、尿素では０〜４．０モル／リットル、好ましくは約
２モル／リットル以下まで希釈する。

【００１７】リフォールディングに際してレドックスバ
ッファーに添加されるメルカプト基を有さないアミノ酸
としては、メルカプト基を有さないアミノ酸であればい
ずれのものでもよいが、アルギニン、アスパラギン酸、
バリン、リジン、アラニン、シトルリン等が好ましく、
アルギニン、シトルリンが活性反応における収率の点で
特に好ましく、該アミノ酸の濃度は、０．１〜１．０モ
ル／リットル、好ましくは０．２〜０．５モル／リット
ルである。レドックスバッファーとしては、酸化型グル
タチオン（ＧＳＳＧ）および還元型グルタチオン（ＧＳ
Ｈ）、システインおよびシスチン、またはシステアミン
およびシスタミンを含有する緩衝液（例、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液）が好ましいものとし
て挙げられ、中でもＧＳＳＧおよびＧＳＨを含有するリ
ン酸緩衝液が好ましい。ＧＳＳＧおよびＧＳＨを用いる
場合、ＧＳＳＧの濃度は０．１〜１０ミリモル／リット
ル、好ましくは０．１〜１．０ミリモル／リットル、Ｇ
ＳＨの濃度は０．１〜１０ミリモル／リットル、好まし
くは０．１〜１．０ミリモル／リットルである。該リフ
ォールディングに当っての温度は０〜３０℃、好ましく
は５〜１５℃、ｐＨは７〜９、好ましくはｐＨ７．５〜
８．５である。リフォールディングに要する時間は通常
１〜１０週間、好ましくは４〜６週間である。

【００１８】なお、可溶化後かつリフォールディングの
前に、例えば抽出、塩析、透析、分配、結晶化、再結
晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等の公知で常用の精
製工程を導入することができ、好ましくは、たとえば
０．１モル／リットル リン酸緩衝液中セファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア バイオ
テク（株））にかけることにより精製することができ
る。変性剤の分離は場合により０．１モル／リットル
リン酸緩衝液に対して透析することによっても可能であ
る。精製工程はリフォールディングに続いて行うことも
できる。一般にそのような精製としては例えば抽出、塩
析、透析、分配、結晶化、再結晶、ゲルろ過、クロマト
グラフィー等が挙げられ、好ましい例として透析や、た
とえばＳＰ−セファロース（ファルマシア バイオテク
（株））あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（トーソー
（株））を介したイオン交換クロマトグラフィー等によ
る精製法が挙げられる。

【００１９】遺伝子工学的に原核細胞中で発現させて得
られるＮＴ−３類はＮ末端にＭｅｔが付加されていない
ＮＴ−３である場合もあるが、通常Ｎ末端にＭｅｔが付
加されたＭｅｔ−ＮＴ−３である。得られたＮＴ−３類
がＭｅｔ−ＮＴ−３である場合には、リフォールディン
グの前あるいは後に、Ｎ末端Ｍｅｔ残基の除去を行い、
Ｎ末端にＭｅｔが付加されていないＮＴ−３を得ること
もできる。Ｎ末端Ｍｅｔ残基の除去は、たとえばＭｅｔ
−ＮＴ−３とα−ジケトン類を反応させた後、加水分解
することにより行うことができる。α−ジケトン類は、
Ｍｅｔ−ＮＴ−３のアミノ基転移反応を進行させうるも
のであればいずれでもよく、例えば式Ｒ¹−ＣＯ−ＣＯ
−Ｒ²［式中、Ｒ¹は水素またはカルボキシル基で置換さ
れていてもよい低級アルキルもしくはフェニル基（好ま
しくは水素またはメチル、さらに好ましくは水素）を示
し、Ｒ²は水酸基、低級アルコキシ基または低級アルキ
ルで置換されていてもよいアミノ基（好ましくは水酸
基）を示す。］で表される化合物またはその塩等が挙げ
られる。上記式中、Ｒ¹で示される低級アルキル基とし
ては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチ
ル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル等の炭素
数１ないし６程度のアルキル基等が挙げられ、Ｒ²で示
される低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキ
シ、プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブト
キシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ等の炭素数１な
いし６程度のアルコキシ基等が挙げられる。また、Ｒ²
で示される低級アルキルで置換されていてもよいアミノ
基としては、前記したＲ¹で示される低級アルキル基を
１ないし２個有していてもよいアミノ基等が挙げられ
る。さらに、塩としては、上記したＮＴ−３類の塩と同
様な無機酸との塩、有機酸との塩、アルカリ金属塩、ア
ルカリ土類金属塩アンモニウム塩等が挙げられる。α−
ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビ
ン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オ
キソグルタル酸等が挙げられるが、中でも、グリオキシ
ル酸が好ましく用いられる。

【００２０】Ｍｅｔ−ＮＴ−３とα−ジケトン類とのア
ミノ基転移反応は、通常、Ｍｅｔ−ＮＴ−３、１モルに
対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００ないし
４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０ないし７
０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約５分ないし
２時間（好ましくは約１５分ないし１時間）反応させる
のが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻害しない
ものであればいずれの緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸
緩衝液、クエン酸緩衝液等）を用いてもよいが、中で
も、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐ
Ｈは、約２ないし９、中でも、約４ないし７、とりわけ
約５ないし６に調整して、Ｍｅｔ−ＮＴ−３が変性しな
い条件下で反応を進行させるのがよい。該アミノ基転移
反応を促進させるため、遷移金属イオンの存在下にα−
ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジ
ケトン類１モルに対して、０．００１ないし０．１モル
（好ましくは０．０１ないし０．０５モル）程度の遷移
金属イオンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとし
ては、たとえば、銅イオン、コバルトイオン、ニッケル
イオン、鉄イオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオン、
マンガンイオン、ガリウムイオン、インジウムイオン、
マグネシウムイオン、カルシウムイオン等を用いること
ができるが、中でも、銅イオン、コバルトイオン、ニッ
ケルイオン等、とりわけ銅イオンが好ましく用いられ
る。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩
化水素酸、臭化水素酸、炭酸、過塩素酸等の無機酸との
塩または酢酸、クエン酸等の有機酸との塩として、反応
溶媒に添加することができ、中でも、硫酸銅、酢酸銅、
とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。また、塩基の
存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、
通常、α−ジケトン類１モルに対して、０．１ないし２
モル（好ましくは０．５ないし１．０モル）程度の塩基
を用いるのが好ましい。塩基としては、例えば、トリエ
チルアミン、トリブチルアミン等のアルキルアミン類、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリ
ジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾール
等の芳香族アミン類等の有機塩基等を用いることができ
るが、なかでも、芳香族アミン類、とりわけ、ピリジン
が好ましく用いられる。さらに、上記したアミノ基転移
反応は、遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケ
トン類を反応させることが好ましく、実用的には、遷移
金属イオン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例え
ば、硫酸銅、ピリジンおよびグリオキシル酸等）を含有
する混合液を、Ｍｅｔ−ＮＴ−３を含有する、０〜４モ
ル／リットルの尿素を含有する水溶液に添加して、アミ
ノ基転移反応を進行させる。

【００２１】該アミノ基転移反応により得られたジケト
ン体［CH₃-S-(CH₂)₂-CO-CO-NT-3］は、ペプチドまたは
蛋白質の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結
晶、クロマトグラフィー等により、反応溶液から単離・
精製することもできるが、そのまま次の加水分解反応に
付すこともできる。加水分解反応に用いる塩基として
は、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン等の
アルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジ
ン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリ
ジン、イミダゾール等の芳香族アミン類、ｏ−フェニレ
ンジアミン、トリレン−３，４−ジアミン、３，４−ジ
アミノ安息香酸、２，３−ジアミノフェノール、４−ク
ロロ−ｏ−フェニレンジアミン等のジアミン類（好まし
くは芳香族ジアミン類、中でも、ｏ−フェニレンジアミ
ン類）、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバ
ジド、フェニルチオセミカルバジド等のチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジド等のセレノセミカルバジド類等を用いることが
できるが、中でも、ジアミン類またはチオセミカルバジ
ド類が好ましく用いられ、とくに、ｏ−フェニレンジア
ミンが好ましく用いられる。塩基の量は、通常、ジケト
ン体１モルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約
５００ないし２０００モルである。加水分解反応は、通
常、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０
℃）で約１ないし５０時間（好ましくは約１０ないし２
５時間）で進行させるのが好ましい。反応には、緩衝液
を溶媒として用いることが好ましく、緩衝液としては、
リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げら
れ、中でも、酢酸緩衝液が好ましい。反応のｐＨは、約
２ないし９、中でも、約３ないし７、とりわけ、約４な
いし６に調整して、得られるＮＴ−３が変性しない条件
下で反応を進行させるのがよい。

【００２２】このようにして得られるＮＴ−３は、公知
の精製手段、例えば、抽出、塩析、透析、分配、結晶
化、再結晶、ゲルろ過、クロマトグラフィー等により、
反応溶液から単離・精製することもできるが、好ましい
例として、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア
バイオテク（株））あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（ト
ーソー（株））を介したイオン交換クロマトグラフィー
等による精製法が挙げられる。

【００２３】

【発明の実施の形態】本発明明細書および図面におい
て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-
IUB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性
体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示す
ものとする。 ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ ：伝令リボ核酸 ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム ＤＴＴ ：ジチオスレイトール Ｇｌｙ（Ｇ）：グリシン Ａｌａ（Ａ）：アラニン Ｖａｌ（Ｖ）：バリン Ｌｅｕ（Ｌ）：ロイシン Ｉｌｅ（Ｉ）：イソロイシン Ｓｅｒ（Ｓ）：セリン Ｔｈｒ（Ｔ）：スレオニン Ｃｙｓ（Ｃ）：システイン Ｍｅｔ（Ｍ）：メチオニン Ｇｌｕ（Ｅ）：グルタミン酸 Ａｓｐ（Ｄ）：アスパラギン酸 Ｌｙｓ（Ｋ）：リジン Ａｒｇ（Ｒ）：アルギニン Ｈｉｓ（Ｈ）：ヒスチジン Ｐｈｅ（Ｆ）：フェニルアラニン Ｔｙｒ（Ｙ）：チロシン Ｔｒｐ（Ｗ）：トリプトファン Ｐｒｏ（Ｐ）：プロリン Ａｓｎ（Ｎ）：アスパラギン Ｇｌｎ（Ｑ）：グルタミン Ａｓｘ ：Ａｓｐ＋Ａｓｎ Ｇｌｘ ：Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ 以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではな
い。

【００２４】

【実施例】

参考例１ （ＮＴ−３ ＤＮＡのクローニング） Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０にヒトグリオーマ由来のλｇ
ｔ １１ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を感染させたの
ち、約６×１０⁵個のファージをＮＺＣＹ培地（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２に記載）にま
き、３７℃で５時間培養した。次にナイロン膜をプレー
ト上にのせ、１分間放置後、プレートからはずした。こ
のナイロン膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、ついで１．５Ｍ ＮａＣｌ−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ８．０に浸し、さらに２×ＳＳＣ〔Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ 前掲 参照〕に浸し、風乾後、８０
℃で２時間放置した。ヒトβＮＧＦ〔ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ），３０３，８２１（１９８３）〕をコードす
るＤＮＡ（約０．３８ｋｂ）を化学合成し、ニックトラ
ンスレーションによって〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰでラベル
化することによってプローブを作製した。上記で得られ
たナイロン膜とプローブを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，１９８２に記載の方法に従ってハイブリ
ダイゼーションを行った。即ち、プローブを含むハイブ
リダイゼーション溶液にナイロン膜を浸し、６５℃で１
６時間保温した。該ナイロン膜を室温において２×ＳＳ
Ｃ−０．１％ＳＤＳで洗浄したのち、６０℃において１
×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで洗浄した。次にオートラジ
オグラフィーによって陽性クローンを得た。 このよう
にして得られたクローンλβＧＮ１３２１からＥｃｏＲ
ＩでｃＤＮＡを切り出し、プラスミドｐＵＣ１１８（宝
酒造株式会社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミ
ドｐＵＮＫ５を得た。

【００２５】参考例２ （大腸菌用のＮＴ−３発現ベク
ターの構築） 参考例１で得られたプラスミドｐＵＮＫ５に挿入されて
いるＮＴ−３ｃＤＮＡには、ＮＴ−３のＮ末端の１１番
目のチロシン残基をコードする領域付近にＳｃａＩ部位
が、ＮＴ−３の終止コドンの５０塩基下流付近にＮｓｉ
Ｉ部位が存在する。そこでｐＵＮＫ５より０．３ｋｂ
ＳｃａＩ−ＮａｉＩ断片を単離し、これにアダプターＮ
ＧＦＴＥ−１（３５ｍｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−２（３３ｍ
ｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−３（７ｍｅｒ）、ＮＧＦＴＥ−４
（１５ｍｅｒ）をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち制
限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで処理し、０．３ｋｂ Ｎ
ｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を得た。該アダプターを次に示
す。 ＮＧＦＴＥ−１：5' TATGTACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGT 3' ３５ｍｅｒ（配 列番号：２） ＮＧＦＴＥ−２：5' ACTCCCCTCGGTGACTCTTATGCTCCGCGTACA 3' ３３ｍｅｒ（配 列番号：３） ＮＧＦＴＥ−３：5' TGCCAGG 3' ７ｍｅｒ ＮＧＦＴＥ−４：5' GATCCCTGGCATGCA 3' １５ｍｅｒ（配 列番号：４） 一方、Ｔ７プロモーターを有する発現ベクターｐＥＴ−
３Ｃ〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ジーン（Ｇ
ｅｎｅ），５６，１２５（１９８７）〕をＮｄｅＩとＢ
ａｍＨＩで切断し、４．４ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ
断片を単離した。上記で得られた４．４ｋｂ ＮｄｅＩ
−ＢａｍＨＩ断片と０．３ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１に導入し、得られたア
ンピシリン耐性の形質転換株〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＤＨ１／ｐＥＮＧＦＴ１０２〕から単離し
たプラスミドをｐＥＮＧＦＴ１０２と命名した。

【００２６】参考例３ （大腸菌用のＮＴ−３の生産） 参考例２で得られたＮＴ−３発現ベクターｐＥＮＧＦＴ
１０２およびＴ７リゾチーム発現ベクターｐＬｙｓＳを
用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＢＬ２１
（ＤＥ３）〔Ｇｅｎｅ，５６，１２５（１９８７）〕の
形質転換を行い、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＥＮＧＦＴ１０２（ＩＦＯ
１４９０３，ＦＥＲＭ ＢＰ−２５２９）を得た。形質
転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓ
Ｓ，ｐＥＮＧＦＴ１０２を５０μｇ／ｍｌのアンシピリ
ン、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、０．２％
グルコースを含むＬＢ培地〔１％トリプトン（Ｄｉｆｃ
ｏ），０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ〕で３７
℃、１６時間振とう下で培養した。得られた培養液１
２．５ｍｌを２５０ｍｌの培地を含む１リットル容エー
レンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに移
し、３０℃で３時間振とう下で培養すると培養液のＫＩ
ｅｔｔ値は１７０になった。この培養液にＩＰＴＧを最
終０．１ｍＭになるように添加し、さらに３０℃３時間
振とう下で培養した。ＮＴ−３の発現は特開平３−２０
４８９７号公報記載の方法に従い確認した。

【００２７】実施例１（ＮＴ−３の活性化） 参考例３に準じて調製した培養液２０リットルから遠心
分離により、ＮＴ−３の封入体を蓄積したＥ．ｃｏｌｉ
菌体３５０ｇを集め、−８０℃に凍結保存した。１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１００ｍｌ中に上記の菌体２０ｇを懸濁した後、超
音波により細胞を破砕し、遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、１時間）を行った。得られたペレットを用いて同様
の操作を２回行った。引き続きペレットを５０ｍＭ ト
リス／ＨＣ１、４Ｍ尿素、５ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．
０）６０ｍｌでホモジナイズした後、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、１時間）を行った。次にペレットを２０ｍ
Ｍ クエン酸、８Ｍ尿素（ｐＨ３．０）６０ｍｌで溶解
し、遠心分離（１００００ｒｐｍ）後、上澄液を１．８
Ｍ尿素、０．２Ｍ Ａｒｇ、０．２ｍＭ ＧＳＳＧ、
１．０ｍＭ ＧＳＨ、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
８．５０）で２０倍に希釈し、４℃で４週間リフォール
ディングを行った。

【００２８】実施例２（ＮＴ−３の精製） 実施例１でリフォールディングの終了した再生液をｐＨ
６．０に調整し、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳＰ−セファロースカラム（２２ｍｍ
ＩＤ×１２０ｍｍＬ）に吸着した後、４００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ／１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出
した。ＮＴ−３を含むフラクションをプールし、続いて
０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化したＯＤ
Ｐ−５０（２１．５ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、５μ）
（昭和電工（株））に吸着した後、０〜８０％Ｂ（Ｂ＝
アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で６０分
間、５ｍｌ／分の流速で溶出した。ＮＴ−３のフラクシ
ョンをプールした後、凍結乾燥を行い、約１０ｍｇのＮ
Ｔ−３の白色粉末を得た。

【００２９】実施例３（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法により、ペレットの溶解液を調製
し、１．８Ｍ尿素、０．２Ｍ シトルリン、０．５ｍＭ
ＧＳＳＧ、０．５ｍＭ ＧＳＨ、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．５０）で２０倍希釈を行い、４℃で４週
間リフォールディングを行った。リフォールディング
後、再生液をｐＨ６．０に調整し、実施例２と同様の方
法により精製を行い、約７ｍｇのＮＴ−３の白色粉末を
得た。

【００３０】実施例４（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法でアルギニンの代わりにアラニン
を用い４℃で４週間リフォールディングを行った。リフ
ォールディング後、再生液をｐＨ６．０に調整し、実施
例２と同様の方法により精製を行い、約３ｍｇのＮＴ−
３の白色粉末を得た。

【００３１】実施例５（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法でアルギニンの代わりにバリンを
用い４℃で４週間リフォールディングを行った。リフォ
ールディング後、再生液をｐＨ６．０に調整し、実施例
２と同様の方法により精製を行い、約３ｍｇのＮＴ−３
の白色粉末を得た。

【００３２】実施例６（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法でアルギニンの代わりにリジンを
用い４℃で４週間リフォールディングを行った。リフォ
ールディング後、再生液をｐＨ６．０に調整し、実施例
２と同様の方法により精製を行い、約４ｍｇのＮＴ−３
の白色粉末を得た。

【００３３】実施例７（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法でアルギニンの代わりにアスパラ
ギン酸を用い４℃で４週間リフォールディングを行っ
た。リフォールディング後、再生液をｐＨ６．０に調整
し、実施例２と同様の方法により精製を行い、約５ｍｇ
のＮＴ−３の白色粉末を得た。

【００３４】実施例８（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法により、ペレットの溶解液を調製
し、１．８Ｍ 尿素、０．２Ｍ アラニン、０．２ｍＭ
ＧＳＳＧ、１．０ｍＭ ＧＳＨ、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．５）で４０倍希釈を行い、４℃で４週間
リフォールディングを行った。リフォールディング後、
再生液をｐＨ６．０に調整し、実施例２と同様の方法に
より精製を行い、約１２ｍｇのＮＴ−３の白色粉末を得
た。

【００３５】実施例９（ＮＴ−３の活性化及び精製） 実施例１と同様の方法により、ペレットの溶解液を調製
し、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５（１１ｃｍ×４０ｃｍ）で
精製後、１．０Ｍ Ａｒｇ、０．２ｍＭ ＧＳＳＧ、
１．０ｍＭ ＧＳＨ、１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ
８．５０）で２０倍に希釈後、４℃で４週間リフォール
ディングを行った。リフォールディング後、再生液をｐ
Ｈ６．０に調製し、実施例２と同様の方法により精製を
行い、約５ｍｇのＮＴ−３の白色粉末を得た。

【００３６】実施例１０（ＮＴ−３の特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を用いた分析 実施例２で得られたＮＴ−３を１００ｍＭ ＤＴＴを加
えた Ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ ［Ｌａｅｍｍｌｉ，
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７
０）］に懸濁し１００℃で１分間加熱した後、４Ｍ濃度
になるように尿素を加えて溶解し、０．１％ＳＤＳおよ
び４Ｍ 尿素を含む１２．５％ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリ
アントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎ
ｔ ｂｌｕｅ）で染色したところ、単一バンドの蛋白が
認められ、精製品はほぼ単一であった（図２）。

【００３７】ｂ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）を用いた分析 ５μｇの実施例２で得られたＮＴ−３を０．１％ＴＦＡ
で平衡化したＡｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０（４．６
ｍｍＩＤ×１５０ｍｍＬ ５μ）カラムにかけ０〜８０
％Ｂ（Ｂ＝アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の濃度勾
配で３５分、０．５ｍｌ／分の流速で溶出した。２３５
ｎｍでの吸光度を検出した。図３の溶出曲線よりピーク
１（ＮＴ−３ ダイマー）及びピーク２（ＮＴ−３ モ
ノマー）［ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケ
ミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２２５，
９９５−１００３（１９９４）］以外は検出されず、精
製品はほぼ単一であった。

【００３８】ｃ）アミノ酸組成分析 実施例２で得られてＮＴ−３のアミノ酸組成をアミノ酸
分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定
した。その結果、Ｎ末端にメチオニンが付加されたＮＴ
−３のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と
一致した（表１）。

【００３９】

【表１】

【００４０】ｄ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 実施例２で得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列を気
相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム
ズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得
られたＮＴ−３のＮ末端にはＭｅｔが付加されているこ
とのほかはｃＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３の
Ｎ末端アミノ酸配列と一致した（表２）。

【００４１】

【表２】

【００４２】ｅ）Ｃ末端アミノ酸分析 実施例２で得られたＮＴ−３のＣ末端アミノ酸をアミノ
酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決
定した。得られたＮＴ−３はｃＤＮＡの塩基配列から推
定したＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。

【００４３】

【表３】

【００４４】以上の結果から、実施例２で得られたＮＴ
−３は、そのＮ末端にＭｅｔが付加したもの（Ｍｅｔ−
ＮＴ−３）であることがわかった。

【００４５】実施例１１（ＮＴ−３の生物活性の測定） ニワトリ有精卵を３７．５℃でふ卵器で８〜１０日間揺
卵して胚発生を行った胎児から後根神経節（Ｄｏｒｓａ
ｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ、以下ＤＲＧ）を摘出
した。ＤＲＧを０．１２５％トリプシン−Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）溶
液で３７℃ ２０分処理し、ピペッティングを行うこと
で、細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児血清−ダ
ルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシン
に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ₂存在下３〜４時間培養す
ることにより繊維芽細胞等を培養シャーレに付着させ、
非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８００
ｒｐｍ、５分）により集め、２０％牛胎児血清−ダルベ
ッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（混合比１：
１）−１μＭサイトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シグ
マ社、ＵＳＡ）−５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培
地に２００００細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、０．
５ｍｌ／ウェルずつ、ポリＤＬ−オルニチン及びマウス
ラミニンでコートした２４穴プレートに播種した。この
培地に実施例２で得られたＮＴ−３の溶液を０．５〜２
０μｌ加え、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で２日間培養
し、生存細胞数を計測すると、真核細胞由来のＮＴ−３
と同等のＤＲＧの生存を促進する活性が認められた（図
４）。図中●は実施例２で得られたＮＴ−３を、○はポ
ジティブコントロールとしてＣＨＯ細胞由来のＮＴ−３
（ＥＰ４９９９９３に従い、調製した）を示す。

【００４６】実施例１２（Ｎ末端Ｍｅｔの除去） 実施例２の方法で得られたＭｅｔ−ＮＴ−３ ４０ｍｇ
を４ｍｌの３Ｍ尿素で溶解し、グリオキシル酸２５０ｍ
ｇ、ピリジン５００μｌ、１００ｍＭ硫酸銅溶液５００
μｌの混合溶液を加え、静かに撹拌した後、室温で２時
間静置し反応させた。反応終了後、この反応液を２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．９）で平衡化したセファデックスＧ
−２５カラム（２．５ｃｍφ×５９ｃｍ）に通液し、Ｍ
ｅｔ−ＮＴ−３のジケトン体４０ｍｌを集めた。この溶
液にｏ−フェニレンジアミン１７３ｍｇを加えて、３７
℃で１５時間反応させた後、２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
９）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．
６ｃｍφ×６０ｃｍ）に通液し、得られたＮＴ−３画分
１２０ｍｌを、ＯＤＰ−５０カラム（２．１５ｃｍφ×
３０ｃｍ）を用いた（１）０．１％ＴＦＡと（２）０．
１％ＴＦＡ／８０％アセトニトリルによる濃度勾配溶出
法により、ＨＰＬＣで精製した後、得られたＮＴ−３画
分を凍結乾燥し、約３ｍｇのＮＴ−３の凍結乾燥粉末を
得た。

【００４７】実施例１３（ＮＴ−３の特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分
析 実施例１２で得られたＮＴ−３を１００ｍＭ ＤＴＴを
含むＳａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ［Laemmli, ネイチャ
ー（Nature）, 227, 680 (1970)］に懸濁し１００℃で
１分間加熱した後、０．１％ＳＤＳを含む１２．５％ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後のゲ
ルをクーマシーブリリアントブルー（Coomassie brilli
ant blue）で染色したところ、単一バンドの蛋白が認め
られ、精製品はほぼ単一であった（図５）。

【００４８】ｂ）アミノ酸組成分析 実施例１２で得られたＮＴ−３のアミノ酸組成をアミノ
酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決
定した。その結果、ＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列から
推定したアミノ酸組成と一致した（表４）。

【００４９】

【表４】

【００５０】ｃ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 実施例１２で得られたＮＴ−３のＮ末端アミノ酸２０残
基の配列を実施例１０（ｄ）と同様にして気相プロテイ
ンシーケンサー（アプライドバイオシステムモデル４７
７Ａ）を用いて分析した。その結果、得られたＮＴ−３
はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＴｙｒ［図２（配列
番号：１）の２番目のアミノ酸］から始まるＮＴ−３の
Ｎ末端アミノ酸配列と一致した。

【００５１】ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 実施例１２で得られたＮＴ−３のＣ末端アミノ酸を実施
例１０（ｅ）と同様にしてアミノ酸分析計（ベックマン
システム６３００Ｅ）を用いて分析した。得られたＮ
Ｔ−３はｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ
酸（Ｔｈｒ）と一致した。

【００５２】以上の結果から、実施例１２で得られたＮ
Ｔ−３は、そのＮ末端にＭｅｔを有さないＮＴ−３の成
熟蛋白であることがわかった。

【００５３】実施例１４（ＮＴ−３の生物活性の測定） 実施例１２で得られたＮＴ−３を、実施例１１で示した
ＤＲＧを用いた生物活性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得
られたＮＴ−３と同等の活性を有することを確認した。

【００５４】

【発明の効果】このようにして得られた活性型ＮＴ−３
類は、細胞の分化、成長、増殖の促進、生存維持；遺伝
子発現の上昇；蛋白質、酵素の誘導等の機構を研究する
ための試薬として有利に用いることができる。本発明で
は遺伝子工学を用いて原核細胞中に発現したＮＴ−３類
の不活性体を効率よく活性化でき、上記のような作用を
有する薬理的に活性なＮＴ−３類を大量に調製できるも
のである。

【００５５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：120 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg 20 25 30 Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro 35 40 45 Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val 50 55 60 Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys 85 90 95 Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala 100 105 110 Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr 115 120。

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TATGTACGCG GAGCATAAGA GTCACCGAGG GGAGT 35。

【００５７】配列番号：３ 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACTCCCCTCG GTGACTCTTA TGCTCCGCGT ACA 33。

【００５８】配列番号：４ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GATCCCTGGC ATGCA 15。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＴ−３の構造を示す（Ｎ末端にＭｅｔ付
加）。

【図２】ＮＴ−３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（電気泳
動）を示す。

【図３】ＮＴ−３のＨＰＬＣ分析チャートを示す。

【図４】ＮＴ−３のＤＲＧ細胞を用いた生物活性の測定
結果を示す。

【図５】ＮＴ−３のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（電気泳
動）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】遺伝子工学的に原核細胞宿主中で発現させ
   たニューロトロフィン３類をレドックスバッファー中で
   リフォールディングすることを特徴とする活性型ニュー
   ロトロフィン３類の製造方法。
2. 【請求項２】レドックスバッファーが還元型グルタチオ
   ンおよび酸化型グルタチオン、システインおよびシスチ
   ン、またはシステアミンおよびシスタミンを含有する緩
   衝液である請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】レドックスバッファーが還元型グルタチオ
   ンおよび酸化型グルタチオンを含有する緩衝液である請
   求項１記載の製造方法。
4. 【請求項４】レドックスバッファーのｐＨが７ないし９
   である請求項１記載の製造方法。
5. 【請求項５】レドックスバッファーがメルカプト基を有
   さないアミノ酸を含有する請求項１記載の製造方法。
6. 【請求項６】メルカプト基を有さないアミノ酸が、アル
   ギニン、アスパラギン酸、バリン、リジン、アラニン又
   はシトルリンである請求項５記載の製造方法。
7. 【請求項７】メルカプト基を有さないアミノ酸がアルギ
   ニンである請求項５記載の製造方法。
8. 【請求項８】ニューロトロフィン３類を遺伝子工学的に
   原核細胞宿主中で発現させ、細胞を破砕後、変性剤で可
   溶化し、ついでメルカプト基を有さないアミノ酸を含有
   するｐＨ７〜９のレドックスバッファーで変性剤を不作
   用濃度まで希釈することを特徴とする請求項１記載の製
   造方法。
9. 【請求項９】変性剤が尿素またはグアニジンである請求
   項８記載の製造方法。
10. 【請求項１０】変性剤が尿素である請求項８記載の製造
    方法。