JP4475707B2 - Ｎ末端メチオニンの除去方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド（蛋白質を含む）またはその塩から酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下、効率よくＮ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方法；およびＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質が細胞内で生合成される際には、そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメチオニンから始まっていることが知られている。しかしながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによって取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例である。
遺伝子組換え技術の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、例えば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、本手法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存している例が見い出されている。例えば、大腸菌で発現させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加率はほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４０８（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにおいては５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２では、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニンではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端にさらにメチオニンの付加した（Ｎ末端にメチオニン残基を有する）分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認められている。
一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する方法としては、Dixon が、１９６４年に、ＤＬ−アラニルグリシンにグリオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応させるとアミノ基移転反応が起こり、ピルボイルグリシンが生成すること［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９２，６６１（１９６４）］、さらに、化合物にチオセミカルバジドを反応させるとアミド結合の解裂が起こり、グリシンを生成することを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.J），９０，２Ｃ（１９６４）］。次いで、この反応をチトクロームｃ−５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ−５５１）に応用し、Ｎ末端グルタミン酸が除去されることを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９４，４６３（１９６５）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
同じ蛋白質であっても、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありうるものと考えられる。従って、産業利用上の観点から、この開始コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確立することは意義あることと考えられる。
この課題を解決するため、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチオニンを取り除く方法が提案［サイエンス（Science），１９８，１０５６（１９７７）］されているが、この場合は所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しないことが前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法によっては、決して満足する結果は得られない。
Ｎ末端にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的かつ効率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去することを可能とする化学的な方法としては、特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）に記載の方法以外には全く知られていないが、このことは、最終生産物となるペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を除去しうる化学的な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられる。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に製造される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを目的とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオニンを除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性が低下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行させる必要があり、化学的な反応条件としては制限が多いので、良好な反応条件を見い出せないのが現状であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子工学的に製造されるペプチド（蛋白質を含む）におけるＮ末端のメチオニン残基のみを切断することによる、天然型のアミノ酸配列を有するペプチドの製造法を提供すべく鋭意研究したところ、下記のスキーム１に表されるとおり式（Ｉ）で表わされるＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドに、例えば、α-ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、塩基（例えばアミン類）であるピリジンを反応させて、アミノ基移転反応を行うことにより得られる該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドに塩基（例えばジアミン類）である３，４−ジアミノ安息香酸と、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム等の存在下に反応させて加水分解反応を行うことにより、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドからメチオニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去できることを見出した。すなわち、本発明者らはメチオニン残基を有するペプチドから、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基を除去し、その活性を低下させることなく、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドを予想外にも高収率で得る方法を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。
（スキーム１）
【化１】
［式（I）中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基または２以上の任意のアミノ酸数を有するペプチド鎖であればいずれでもよいが、実用的な面からは、遺伝子工学的に製造された蛋白質のＸに対応する部分のペプチド鎖が挙げられる。なお、本願明細書において、蛋白質あるいはペプチドと称する場合、複数のアミノ酸からなるペプチドまたは蛋白質は、非グリコシル化またはグリコシル化ペプチドまたは蛋白質のいずれであってもよい。］
本願明細書においては、上記スキーム１中、
一般式（Ｉ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチド」または「メチオニン残基を有するペプチド」；
一般式（Ｉ）において
【化２】
[式中、ｍは前記と同意義]
に代表される部分構造を「酸化されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残基」または「メチオニン」；
一般式（ＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド」または「メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド」；
一般式（ＩＩ）において
【化３】
[式中、ｍは前記と同意義]
に代表される部分構造を「酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または「メチオニン残基のジケトン体」；および、
一般式（ＩＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチド」または「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチド」
と、それぞれ称することがある。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（２）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（１）記載の方法、
（３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである前記（２）記載の方法、
（４）ペプチドが（i）成長ホルモン，(ii）ベータセルリン，(iii）インターロイキン−２，(iv）ニューロトロフィン−３または（v）アペリンである前記（１）記載の方法、
（５）ペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の方法、
（６）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（１）記載の方法、
（７）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（８）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（９）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（８）記載の製造法、
（１０）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（８）記載の製造法、
（１１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（１２）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキシル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法、
（１３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１４）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基のジケトン体を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１５）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、および、
（１６）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、に関する。
【０００６】
本明細書において、酸化されていてもよいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキシドおよびスルホン体が挙げられる。
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドとしては、式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。］で表されるペプチドが挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩としては、本発明の反応を阻害しないものであれば何れでもよいが、中でも薬学的に許容可能な塩が好ましく、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドは、遺伝子工学的に製造されたＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドであることが好ましい。
【０００７】
上記式中、ｍとしては０が好ましい。また、Ｘとしてはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖が好ましい。
本発明のペプチドとしては、アミノ酸数が５０未満のいわゆるペプチドあるいはアミノ酸数が５０以上のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。
このように、本願明細書において、「ペプチド」で示される用語は、アミノ酸数が５０未満の分子のみならず、アミノ酸数が５０以上の分子をも含むものであるが、なかでも、アミノ酸数が５０以上の分子（いわゆる蛋白質）が好ましく用いられる。
好ましいペプチドとしては、アミノ酸数が２ないし１０００であるペプチド、さらに好ましくはアミノ酸数が１５ないし５００であるペプチドが挙げられ、その具体例としては、成長ホルモン（ＧＨ）類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ベータセルリン（ＢＴＣ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インシュリン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、４または６、中枢神経成長因子、グリア成長因子、肺由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αまたはβ、血管内皮細胞成長因子、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベータ、ウロキナーゼ、プロテインＣ、トロンボモジュリン、骨形成因子、カルシトニン、インスリン様成長因子、インターフェロン−α、βまたはγ、インターロイキン−１（α、β）〜１２、顆粒コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ・コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、ＰＡＣＡＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、巨核球成長因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、モチリン、イムノトキシン、腫瘍壊死因子、ヒルジン、コルチコトロピン、アンジオテンシン、アンジオテンシン２およびそのペプチド性拮抗薬、アンジオテンシン３、ブラジキニン類、ブラジキニン増強因子、α、βまたはγエンドルフィン、エンケファリン、好球中走化性因子、ガストリン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、キョウトルフィン、カリジン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン、ニューロテンシン、トリプシンインヒビター、オキシトシン、プロインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ユビキチン、ウロガストロン、バソプレッシン類、キニン類、タフトシン、ソマトメジン、コルチコトロピン放出因子、インスリン様成長因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＰＴＨrＰ、ＶＩＰ、ＤＨＩ、インスリノトロピン、ＧＲＰ、ＣＣＫ−ＰＺ、Galanin（ガラニン）、アカトラムペプチド（Antrum Peptide）、ＰＰＹ、Pancreatic Polypeptide、ＰＳＰ、パンクレアスタチン、hＣＧ、hＣＳ、リラキシン、血清胸腺因子、サイモポイエチン、サイモシン、ファクターXIII、ファクターVIII、プロウロキナーゼ、ＳＯＤ、ファクターVIIａ、アンチトロンビン、アペリンなどの蛋白質およびそれらのムテイン（天然型の蛋白質に１つ以上のアミノ酸が置換、欠損または付加し、天然の蛋白質と同等またはそれ以上の生物学的または免疫学的活性を示すもの）など、あるいは化学合成などにより製造される公知または新規のペプチドなどが挙げられるが、なかでも、遺伝子工学的に製造されたペプチド（蛋白質を含む）、とりわけ、遺伝子工学的に製造された成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ニューロトロフィン−３、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン、インターロイキン−２、アペリンおよびそれらのムテイン，特に成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕およびそれらのムテイン、とりわけ成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕が好ましく用いられる。前記アペリンとしては、例えばBiochem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476 (1998)に記載のヒトアペリン−３６、ヒトアペリン−１３、アペリン−１３のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したペプチドなどがあげられ、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et al., Gene, 436, 355-359 (1993)）に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何なるものであっていてもよく、具体的には、例えば特願平１０−２７１６５４号に記載の「配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に結合能を有するポリペプチド」などが挙げられる。
上記したペプチド（天然型の蛋白質を含む）は、何れの動物種由来のものであってもよいが、実用的には、ヒト由来のペプチド（蛋白質を含む）が好ましく用いられる。
上記のペプチドは、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン（Ｍｅｔ）残基または該メチオニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるいは後にリフォールディング（活性化、再生化）を行うことができる。
【０００８】
本明細書において、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩とは、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩を示す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、化学反応または酵素反応等各種反応により得ることができる。例えば、化学反応により得る方法としては、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基移転反応により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を得ることができる（特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号））。
本明細書において、α−ジケトン類は、上記したペプチドまたはその塩のアミノ基移転反応を進行させうるものであれば何れでもよく、例えば式Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい低級アルキルもしくはフェニル基（好ましくは水素またはメチル、さらに好ましくは水素）を示し、Ｒ2は水酸基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合物またはその塩などが挙げられる。
上記式中、Ｒ1で示される低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキル基などが挙げられ、Ｒ2で示される低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ基などが挙げられる。また、Ｒ2で示される低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、前記したＲ1で示される低級アルキル基を１ないし２個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩としては、上記したＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドの塩と同様なものが挙げられる。
α−ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オキソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用いられる。
α−ジケトン類は塩を形成していてもよく、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩酸塩などの無機酸の塩などがあげられる。
【０００９】
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、ペプチドまたはその塩１モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１０分ないし５時間（好ましくは約２０分ないし２時間）反応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ないし７、とりわけ、約５ないし６に調整して反応を進行させるのがよい。
該アミノ基転移反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu+，Cu2+）、コバルトイオン（Co2+，Co3+）、ニッケルイオン（Ni2+，Ni3+）、鉄イオン（Fe2+，Fe3+）、亜鉛イオン（Zn2+）、アルミニウムイオン（Al3+）、マンガンイオン（Mn2+など）、ガリウムイオン（Ga3+）、インジウムイオン（In3+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、カルシウムイオン（Ca2+）などを用いることができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわけ、銅イオン（Cu2+）が好ましく用いられる。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
【００１０】
また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ないし１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類などを用いることができるが、なかでも、ピリジンが好ましく用いられる。
また、アミノ基転位反応の際に、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩、および該ペプチドまたはその塩のアミノ基転位反応で得られるメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の沈殿防止などを目的として、該ペプチド，メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の種類に応じて、アミノ基転位反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を好ましくは約１ないし８Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの濃度になるよう添加することが好ましい。
【００１１】
さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。
該アミノ基転移反応により得られ、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩（メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩）は、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。
アミノ基転移反応で得られたメチオニンのジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、通常、塩基による加水分解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していないアミノ酸、ペプチドまたはその塩に変換することができる。
【００１２】
加水分解反応に用いる塩基としては、例えば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、トリレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニレンジアミンなど）、２,３−ジアミノフェノール、４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジアミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類またはその塩などを用いることができるが、なかでも、アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、３,４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用いられる。
加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
【００１３】
塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩１モルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約２００ないし３０００モル、より好ましくは約５００ないし３０００モルである。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１時間ないし７日間（好ましくは約１０時間ないし５日間）で進行させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好ましく、緩衝液としては、例えば、ぎ酸系緩衝液（例えば、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−酢酸ナトリウムなど）などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なかでも、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸−酢酸ナトリウム緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし６に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝液は、好ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましくは約０．５〜６mol/L用いられる。
また、加水分解の際に、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩および加水分解反応により生成する該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドまたはその塩の沈殿防止等を目的として、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド、該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドまたはその塩の種類に応じて、加水分解反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を、好ましくは約１ないし６Ｍ、より好ましくは約２ないし５Ｍの濃度になるよう添加することが好ましい。
このようにして得られるアミノ酸、ペプチドまたはその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、好ましい例として、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア バイオテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が挙げられる。
【００１４】
本発明により製造されるペプチドはそのＮ末端にメチオニンを有さず、また目的とする生理活性ペプチド（例えば、天然の生理活性ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、目的とするペプチド（例えば、天然のポリペプチド）と同様の活性を有し低毒性で安全に医薬品や診断用薬剤として使用できる。
本発明により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドからＮ末端のメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を特異的に除去することができる。
本発明の明細書および図面においてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
【００１５】
ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇly ： グリシン
Ａla ： アラニン
Ｖal ： バリン
Ｌeu ： ロイシン
Ｉle ： イソロイシン
Ｓer ： セリン
Ｔhr ： スレオニン
Ｃys ： システイン
Ｍet ： メチオニン
Ｇlu ： グルタミン酸
Ｇln ： グルタミン
Ａsp ： アスパラギン酸
Ａsn ： アスパラギン
Ｌys ： リジン
Ａrg ： アルギニン
Ｈis ： ヒスチジン
Ｐhe ： フェニルアラニン
Ｔyr ： チロシン
Ｔrp ： トリプトファン
Ｐro ： プロリン
Ａsx ： Ａsp ＋ Ａsn
Ｇlx ： Ｇlu ＋ Ｇln
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００１７】
【実施例】
参考例１（Ｔ７プロモーターを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築）
ｈＧＨの構造遺伝子は、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より、構造遺伝子の開始コドン上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位を持つプライマー、及び始終コドン下流に隣接してＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅して回収した。これにより得られた両端に制限酵素認識部位が付加したｈＧＨ酵素遺伝子を、ｐＴ７ＢｌｕｅのＴ−クローニング部位に連結して（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、宝酒造株式会社製）ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した。これを、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。
一方、以下の方法で発現ベクターを構築した。ｐＢＲ３２２をＮｄｅ Ｉで切断、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ．宝酒造株式会社製）で末端を平滑化し、再度連結することによって、Ｎｄｅ Ｉ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作製した。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌ II−ＥｃｏＲＶで切断し、約０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅのＳｃａ Ｉ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅを作製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｐＢＲ３２２のＢａｍ ＨＩ認識部位を欠損させたｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片と連結してテトラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣを作製した。テトラサイクリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの向きが逆のものをｐＴＣ１、同じものをｐＴＣ２とした。
ｐＴ７ＨＧＨ−ＮａをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してｈＧＨ構造遺伝子を回収し、ｐＴＣ１のＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してアンピシリン耐性で形質転換体を選択、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＨＧＨ−Ｎａとした。
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、ｈＧＨ発現ベクターｐＴＣＨＧＨ−Ｎａをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａを得た。なお、ｈＧＨの塩基配列は、ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した時点でＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７Ａ ＤＮＡシーケンサーによって確認した。
【００１８】
参考例２（大腸菌でのメチオニン残基を有するｈＧＨ（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）の発現）
参考例１で得た形質転換細胞を、５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤：三洋化成工業製）および５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、３．０％ハイケースアミノ、１．０％酵母エキス）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になった時点で１７．８５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２４リットルの３０％ブドウ糖を添加しながら培養を続け、５時間後に培養液を遠心分離して、約１２．３ｋｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５４６として平成９年１２月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８８８として平成１１年９月２４日に国際寄託に移管された。また、上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＩＦＯ １６１２４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に平成９年１０月１６日に寄託されている。
【００１９】
実施例１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体２ｋｇに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）６リットルを加えて菌体を溶解してから超音波破砕器（ソニファイアー４５０、ブランソン社）を用いて破砕処理を行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）１８リットルを加えてｐＨ８．０に調整した後、４℃で４日間活性化を行った。
【００２０】
実施例２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの精製）
実施例１で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液５リットルに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて５０リットルに希釈後４℃に一晩静置した。ついで、連続遠心分離（ＪＣＦ−Ｚロータ、ベックマン社）を行い、得られた上清５０リットルに１０Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．１２に調整した後ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に置換後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）を行い上清を得た。ついでこの液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として９５リットルの溶出液を得た。さらに、この溶出液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換し、１２．２１グラムのＭｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００２１】
実施例３（Ｎ末端メチオニン残基（Ｎ末端Ｍｅｔ）の除去）
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１８００ミリリットルに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液４５０ミリリットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１２５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として４．２リットルの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０．８リットル中によく撹拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌しながら３日間反応させた。反応後、この溶液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で１４リットルに濃縮し、７リットルずつ２回に分けて２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５．２ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に６リットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分２０リットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、３２０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分５．８４リットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａＯＨ溶液を１６ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、８回に分けて高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）によるクロマトグラフィーを行った。所定量の濃縮液をＰＯＲＯＳ２０Ｒ１カラム（５ｃｍ×６０ｃｍ、日本パーセプティブ社）に通液吸着させた後、Ａ＝２５％ｎ−プロパノール＋７５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、Ｂ＝３５％ｎ−プロパノール＋６５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）とによる５０〜８５％Ｂの濃度勾配で、１５０分間、５０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分として３４．７リットルの溶出液を得た。この溶出液に蒸留水を加えて２００リットルに希釈してからペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で５リットルに濃縮後更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を３回に分けてＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（１０．８ｃｍ×２０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、８０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１６１６ミリリットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａＯＨ溶液を２ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、限外ろ過装置（オメガ膜、富士フィルター社）で濃縮し、濃縮液０．４リットルを得た。この濃縮液を蒸留水で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１．３ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に２リットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分を得た。更に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過し、ｈＧＨ溶液２３９１ミリリットル（４６３８ミリグラムのｈＧＨ）を得た。
【００２２】
実施例４（ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例３で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサンプルバッファ［Laemmli,Nature,227,680(1970)］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー(Coomassie Brilliant Blue)で染色した結果、約２２ＫＤａに単一のバンドが認められたことから、精製ｈＧＨは単一であることが確認された（図１）。
（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１）。
【表１】
（ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表２）。
【表２】
（ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。
【表３】
【００２３】
実施例５（ｈＧＨの活性測定）
実施例３で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対する増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショナル社、Temecula,California,USA）と同等であった。
【００２４】
実施例６（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリットルに希釈した。この希釈液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００２５】
実施例７（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリットルに希釈した。この希釈液に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍぎ酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００２６】
実施例８（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液４９．５ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３７℃でゆっくり攪拌しながら２４時間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１５０ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ［2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．７ｍｇのｈＧＨを得た。
【００２７】
実施例９（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を２Ｍぎ酸、１０Ｍぎ酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液１０ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌しながら３日間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１００ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．０ｍｇのｈＧＨを得た。
【００２８】
実施例１０（メチオニン残基を有する２０Ｋ−ｈＧＨ（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ）の活性化)
特開平１０−２３４３８６号の参考例２記載の方法で得られた菌体４０ｇにＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）１００ミリリットルを加えて懸濁した後、５分間、超音波破砕（ブランソン社）を行い菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）して上清を廃棄し、封入体を得た。この封入体に５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）２リットルを加えて封入体を溶解後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上清液２リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）２４リットルを加えて、４℃で１日間活性化を行った。
【００２９】
実施例１１（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨの精製）
実施例１０で活性化の終了した液をミニタン限外濾過システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）し、濃縮液の上清１５０ミリリットルを得た。ついでこの液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、０〜０．１８Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分として２８ミリリットルの溶出液を得た。さらにこの画分をセントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、濃縮液１５ミリリットルを得た。この液を再度、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭＭＥＳ[2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整し、セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリットルを得た。
【００３０】
実施例１２（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例１１によって得たＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ溶液６ミリリットルを２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分を集め、更に限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、２５ｍｍ、アミコン社）を使って２ミリリットルに濃縮した。この溶液に２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．５ミリリットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、メチオニン残基のジケトン体を有する２０Ｋ−ｈＧＨ画分として４ミリリットルの溶出液を集めた。この溶出液に１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０ミリリットルを加えよく撹拌した後３０℃で６５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシアバイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭ ＭＥＳ[２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸]、２.５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整した後、セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリットルを得た。
【００３１】
実施例１３（２０Ｋ−ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られた２０Ｋ−ｈＧｈのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定された２０Ｋ−ｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表４）。
【表４】
（ｂ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（システム６３００，ベックマン社）を用いて決定した。その結果、実施例１２で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのアミノ酸組成は２０Ｋ−ｈＧＨのｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表５）。
【表５】
【００３２】
実施例１４（２０Ｋ−ｈＧＨの活性測定）
実施例１２で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対する増殖促進効果のあることを確認した。
【００３３】
実施例１５
（メチオニン残基を有するヒトＢＴＣ（ヒトＭｅｔ−ＢＴＣ）の製造）
特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例４〜６、８および１３に記載の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣを製造した。
（大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコードする０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ１５１５から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’；５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６巻、１２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築した。
ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１０−１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５ＫｂＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１３参照）。
（大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴＣの発現）
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐＬｙｓＳをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌体に上記参考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６を得た。
この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、１００ｍｇ／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
この形質転換大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として平成４年４月２１日に通商産業省工業技術院生命工学工業研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １５２８２として平成４年４月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
上述の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトベータセルリン（Ｍｅｔ−ＢＴＣ）１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．２５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．２５ｇ、ピリジン ０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＢＴＣ画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ６．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＢＴＣ画分をプールした。さらに、ＢＴＣ画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml/分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約２．６ｍｇを得た。
【００３４】
実施例１６（ＢＴＣの特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１５で得られたＢＴＣをSample buffer［Laemmli, ネイチャー(Nature), 227, 680 (1970)］に懸濁し100℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図２）。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定したＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表６）。
【表６】
ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。
【表７】
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣはcＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表８）。
【表８】
ｅ)ＢＴＣの生物活性
精製品はモレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）に記載の方法により、BALB/C3T3 A31-714 クローン 4（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３（１９７３））を用いた活性測定を行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００３５】
実施例１７
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例５の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトインターロイキン−２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）５０ｍｇを４Ｍ尿素溶液４０ｍｌに溶解した後、１００ｍＭ硫酸銅２．５ｍｌ、グリオキシル酸 ２．５ｇ、ピリジン ５．０ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＩＬ−２画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＩＬ−２画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、３０〜８０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、１７．３ｍｇのＩＬ−２画分を得た。
【００３６】
実施例１８（ＩＬ−２の特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１７で得られたＩＬ−２をSample buffer［Laemmli,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図３）。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アプライドバイオシステム モデル477A)を用いて決定した。その結果、得られたＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したＩＬ−２のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表９）。
【表９】
ｃ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計(ベックマン システム6300E)を用いて決定した。その結果、ＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１０）。
【表１０】
ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計(ベックマン システム6300E)を用いて決定した。得られたＩＬ−２はcＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１１）。
【表１１】
ｅ)ＩＬ−２の生物活性
生物活性測定は、ＩＬ−２依存細胞を用いる日沼らの方法［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.),109,363(1982)]に従がって行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００３７】
実施例１９（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０ｍＭトリス／酢酸、１．０９ｍＭ還元型グルタチオン、０．０５５ｍＭ酸化型グルタチオン、１０９ｍＭアルギニン、４．３６Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化の終了した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）約２５リットルを加えながら電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）約３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３８】
実施例２０（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステイン塩酸塩一水和物、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化されたＭｅｔ−ｈＧＨの量は実施例１９の約１．２倍多く得られた。活性化の終了した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）２５リットルを加えながら電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３９】
実施例２１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭＮ−アセチル−L−システイン、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
【００４０】
実施例２２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステアミン塩酸塩、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
【００４１】
実施例２３
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例３記載の方法により、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）を製造した。
Ｎ末端にメチオニンの付加したヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）５０ｍｇを３Ｍ尿素溶液８ｍｌに溶解し、０．２Ｍ硫酸銅 ０．４ｍｌ、グリオキシル酸 ０．５ｇ、ピリジン １ｍｌの混合液を加え１０ｍにした後、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を４ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＮＴ−３画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）画分をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ５．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（21.5ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、５ｍｌ/分の流速で溶出した。ＮＴ−３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＮＴ−３の凍結乾燥粉末約５ｍｇを得た。
【００４２】
実施例２４（ＮＴ−３の特徴決定）
ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１２）。
【表１２】
b）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１３）。
【表１３】
ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１４）。
【表１４】
ｄ）ＮＴ−３の生物活性
実施例２３で得られたＮＴ−３についてＤＲＧ（ニワトリ有精卵をふ卵器で３７．５℃、８−１０日間揺卵して、胚発生を行った胎児から摘出した後神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ））を用いた生物活性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等の活性を有することを確認した。
【００４３】
実施例２５
実施例２で得られたＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１４．７５ｍｌを６Ｍ尿素溶液で６０ｍｌにした後、０．５Ｍ硫酸銅 １．２ｍｌ、グリオキシル酸 ３．７５ｇ、ピリジン ７．５ｍｌの混合液を加え７５ｍｌにした後、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ８.０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍＩＤ×６０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、３０℃で４日間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍＩＤ×８０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を３０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないｈＧＨ画分をプールした。プールしたｈＧＨ画分を、５０ｍＭトリス緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ４．０）の段階勾配で６０分間、１５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ約６０ｍｇを取得した。
【００４４】
実施例２６ ヒトアペリン−３６構造遺伝子の調製
図４に示す６種類のＤＮＡ断片（#1,#5：グライナー・ジャパン社、#2,#6：キコーテック社、#3,#4：アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアペリン−３６の構造遺伝子を調製した（図５）。
a)DNAオリゴマーのリン酸化
5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
b)DNAフラグメントの連結
上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
c)5'末端のリン酸化
沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）10 μLに溶解し、100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４５】
実施例２７ ヒトアペリン−３６発現プラスミドの調製
pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー、32巻、273頁）をXbaI及びAvaIで消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.4KbpのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解した。このpTB960-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製したヒトアペリン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。すなわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μLとヒトアペリン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、I液5 μLを加え、16℃、30分間反応させ、ライゲーションを行った。ライゲーション液10 μLを用いてE. coli JM109コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTB960-13を調製した。このヒトアペリン−３６構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル377ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プラスミドpTB960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）に形質転換を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリン−３６-ＣＳ２３融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を得た（図６）。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-13は受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1998年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵研究所（IFO）に寄託された。
【００４６】
実施例２８
実施例２７で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で凍結保存した。
【００４７】
実施例２９ ヒトアペリン−３６の取得
実施例２８で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋１ｍＭ(ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐＨ６．０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyopearl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−３６を得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６を画分を得た。このヒトアペリン−３６画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)に通液し、吸着、洗浄した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％TFA）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６凍結乾燥粉末を得た。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１５）。
【００４８】
【表１５】
【００４９】
b)Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＮ末端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１６）。
【００５０】
【表１６】
【００５１】
ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表１７）。
【表１７】
以上の結果から実施例２９で得られたヒトアペリン−３６は、そのＮ末端にメチオニン残基を有する分子種（Ｍｅｔ−ヒトアペリン−３６）であることがわかった。
【００５２】
実施例３０（生物活性測定）
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００５３】
実施例３1(Ｎ末端のメチオニン残基の除去)
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６ ４ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．０４６ｇ、ピリジン ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するヒトアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分に等量の ２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒトアペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml／分の流速で溶出した。ヒトアペリン−３６のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６を取得した。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１８）。
【００５４】
【表１８】
【００５５】
b)Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１９）。
【００５６】
【表１９】
【００５７】
ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表２０）。
【表２０】
【００５８】
実施例３２（生物活性測定）
実施例３１で取得したヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチド、蛋白質またはその塩から、該メチオニン残基のみを選択特異的かつ効率的に取り除き、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチド，蛋白質またはその塩を効率よく生産することができる。また、本発明の方法によれば、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、しかもマイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を化学的に除去することができるので、遺伝子工学的手法により製造されたメチオニン残基を有するペプチド，蛋白質またはその塩を原料にして、天然型のアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質を工業的に有利に製造することができる。
【００６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実施例４ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は精製ｈＧＨを示す。
【図２】は、実施例１６ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１５で得られたＢＴＣを示す。
【図３】は、実施例１８ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１７で得られたＩＬ−２を示す。
【図４】は、実施例２６で用いられたＤＮＡフラグメントを示す。
【図５】は、実施例２６で得られた２重鎖構成のヒトアペリン−３６を製造する模式図を示す。
【図６】は、実施例２７で得られたプラスミドｐTB９６０−１３の構築図を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド（蛋白質を含む）またはその塩から酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下、効率よくＮ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方法；およびＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質が細胞内で生合成される際には、そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメチオニンから始まっていることが知られている。しかしながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによって取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分子にはもはや存在しないのが通例である。
遺伝子組換え技術の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、例えば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、本手法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存している例が見い出されている。例えば、大腸菌で発現させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加率はほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４０８（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにおいては５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２では、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニンではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端にさらにメチオニンの付加した（Ｎ末端にメチオニン残基を有する）分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認められている。
一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する方法としては、Dixon が、１９６４年に、ＤＬ−アラニルグリシンにグリオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応させるとアミノ基移転反応が起こり、ピルボイルグリシンが生成すること［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９２，６６１（１９６４）］、さらに、化合物にチオセミカルバジドを反応させるとアミド結合の解裂が起こり、グリシンを生成することを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.J），９０，２Ｃ（１９６４）］。次いで、この反応をチトクロームｃ−５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ−５５１）に応用し、Ｎ末端グルタミン酸が除去されることを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem. J），９４，４６３（１９６５）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
同じ蛋白質であっても、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうでない分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定性が相互に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ末端への付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありうるものと考えられる。従って、産業利用上の観点から、この開始コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確立することは意義あることと考えられる。
この課題を解決するため、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチオニンを取り除く方法が提案［サイエンス（Science），１９８，１０５６（１９７７）］されているが、この場合は所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しないことが前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法によっては、決して満足する結果は得られない。
Ｎ末端にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的かつ効率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去することを可能とする化学的な方法としては、特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）に記載の方法以外には全く知られていないが、このことは、最終生産物となるペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を除去しうる化学的な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられる。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に製造される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを目的とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオニンを除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性が低下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から弱アルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行させる必要があり、化学的な反応条件としては制限が多いので、良好な反応条件を見い出せないのが現状であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子工学的に製造されるペプチド（蛋白質を含む）におけるＮ末端のメチオニン残基のみを切断することによる、天然型のアミノ酸配列を有するペプチドの製造法を提供すべく鋭意研究したところ、下記のスキーム１に表されるとおり式（Ｉ）で表わされるＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドに、例えば、α-ジケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを供与しうる硫酸銅、塩基（例えばアミン類）であるピリジンを反応させて、アミノ基移転反応を行うことにより得られる該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドに塩基（例えばジアミン類）である３，４−ジアミノ安息香酸と、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム等の存在下に反応させて加水分解反応を行うことにより、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドからメチオニン残基のジケトン体を予想外にも効率よく除去できることを見出した。すなわち、本発明者らはメチオニン残基を有するペプチドから、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基を除去し、その活性を低下させることなく、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドを予想外にも高収率で得る方法を見い出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。
（スキーム１）
【化１】
本願明細書においては、上記スキーム１中、
一般式（Ｉ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチド」または「メチオニン残基を有するペプチド」；
一般式（Ｉ）において
【化２】
に代表される部分構造を「酸化されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残基」または「メチオニン」；
一般式（ＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド」または「メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド」；
一般式（ＩＩ）において
【化３】
に代表される部分構造を「酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」または「メチオニン残基のジケトン体」；および、
一般式（ＩＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチド」または「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチド」
と、それぞれ称することがある。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（２）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（１）記載の方法、
（３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである前記（２）記載の方法、
（４）ペプチドが（i）成長ホルモン，(ii）ベータセルリン，(iii）インターロイキン−２，(iv）ニューロトロフィン−３または（v）アペリンである前記（１）記載の方法、
（５）ペプチドが成長ホルモンである前記（１）記載の方法、
（６）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（１）記載の方法、
（７）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法、
（８）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（９）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である前記（８）記載の製造法、
（１０）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前記（８）記載の製造法、
（１１）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法、
（１２）遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキシル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法、
（１３）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１４）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基のジケトン体を除去するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、
（１５）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、および、
（１６）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と（ii）３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、に関する。
【０００６】
本明細書において、酸化されていてもよいメチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキシドおよびスルホン体が挙げられる。
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドとしては、式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。］で表されるペプチドが挙げられ、これらは塩を形成してもよく、塩としては、本発明の反応を阻害しないものであれば何れでもよいが、中でも薬学的に許容可能な塩が好ましく、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドは、遺伝子工学的に製造されたＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドであることが好ましい。
【０００７】
上記式中、ｍとしては０が好ましい。また、Ｘとしてはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖が好ましい。
本発明のペプチドとしては、アミノ酸数が５０未満のいわゆるペプチドあるいはアミノ酸数が５０以上のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。
このように、本願明細書において、「ペプチド」で示される用語は、アミノ酸数が５０未満の分子のみならず、アミノ酸数が５０以上の分子をも含むものであるが、なかでも、アミノ酸数が５０以上の分子（いわゆる蛋白質）が好ましく用いられる。
好ましいペプチドとしては、アミノ酸数が２ないし１０００であるペプチド、さらに好ましくはアミノ酸数が１５ないし５００であるペプチドが挙げられ、その具体例としては、成長ホルモン（ＧＨ）類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ベータセルリン（ＢＴＣ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インシュリン、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、４または６、中枢神経成長因子、グリア成長因子、肺由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子αまたはβ、血管内皮細胞成長因子、ティッシュ・プラスミノーゲン・アクチベータ、ウロキナーゼ、プロテインＣ、トロンボモジュリン、骨形成因子、カルシトニン、インスリン様成長因子、インターフェロン−α、βまたはγ、インターロイキン−１（α、β）〜１２、顆粒コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ・コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、ＰＡＣＡＰ、心房性ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、巨核球成長因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、モチリン、イムノトキシン、腫瘍壊死因子、ヒルジン、コルチコトロピン、アンジオテンシン、アンジオテンシン２およびそのペプチド性拮抗薬、アンジオテンシン３、ブラジキニン類、ブラジキニン増強因子、α、βまたはγエンドルフィン、エンケファリン、好球中走化性因子、ガストリン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、キョウトルフィン、カリジン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン、ニューロテンシン、トリプシンインヒビター、オキシトシン、プロインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ユビキチン、ウロガストロン、バソプレッシン類、キニン類、タフトシン、ソマトメジン、コルチコトロピン放出因子、インスリン様成長因子、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＰＴＨrＰ、ＶＩＰ、ＤＨＩ、インスリノトロピン、ＧＲＰ、ＣＣＫ−ＰＺ、Galanin（ガラニン）、アカトラムペプチド（Antrum Peptide）、ＰＰＹ、Pancreatic Polypeptide、ＰＳＰ、パンクレアスタチン、hＣＧ、hＣＳ、リラキシン、血清胸腺因子、サイモポイエチン、サイモシン、ファクターXIII、ファクターVIII、プロウロキナーゼ、ＳＯＤ、ファクターVIIａ、アンチトロンビン、アペリンなどの蛋白質およびそれらのムテイン（天然型の蛋白質に１つ以上のアミノ酸が置換、欠損または付加し、天然の蛋白質と同等またはそれ以上の生物学的または免疫学的活性を示すもの）など、あるいは化学合成などにより製造される公知または新規のペプチドなどが挙げられるが、なかでも、遺伝子工学的に製造されたペプチド（蛋白質を含む）、とりわけ、遺伝子工学的に製造された成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ニューロトロフィン−３、ベータセルリン、副甲状腺ホルモン、インターロイキン−２、アペリンおよびそれらのムテイン，特に成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕およびそれらのムテイン、とりわけ成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕が好ましく用いられる。前記アペリンとしては、例えばBiochem. Biophys. Res. Commun., 251, 471-476 (1998)に記載のヒトアペリン−３６、ヒトアペリン−１３、アペリン−１３のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌｎ）がピログルタミン酸化したペプチドなどがあげられ、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et al., Gene, 436, 355-359 (1993)）に対し、リガンド活性を有するペプチドであれば、如何なるものであっていてもよく、具体的には、例えば特願平１０−２７１６５４号に記載の「配列番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に結合能を有するポリペプチド」などが挙げられる。
上記したペプチド（天然型の蛋白質を含む）は、何れの動物種由来のものであってもよいが、実用的には、ヒト由来のペプチド（蛋白質を含む）が好ましく用いられる。
上記のペプチドは、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン（Ｍｅｔ）残基または該メチオニン残基のジケトン体の除去工程に付す前あるいは後にリフォールディング（活性化、再生化）を行うことができる。
【０００８】
本明細書において、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩とは、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩を示す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、化学反応または酵素反応等各種反応により得ることができる。例えば、化学反応により得る方法としては、N末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基移転反応により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を得ることができる（特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号））。
本明細書において、α−ジケトン類は、上記したペプチドまたはその塩のアミノ基移転反応を進行させうるものであれば何れでもよく、例えば式Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ1は水素またはカルボキシル基で置換されていてもよい低級アルキルもしくはフェニル基（好ましくは水素またはメチル、さらに好ましくは水素）を示し、Ｒ2は水酸基、低級アルコキシ基または低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合物またはその塩などが挙げられる。
上記式中、Ｒ1で示される低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキル基などが挙げられ、Ｒ2で示される低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ基などが挙げられる。また、Ｒ2で示される低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基としては、前記したＲ1で示される低級アルキル基を１ないし２個有していてもよいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩としては、上記したＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドの塩と同様なものが挙げられる。
α−ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オキソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グリオキシル酸が好ましく用いられる。
α−ジケトン類は塩を形成していてもよく、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、塩酸塩などの無機酸の塩などがあげられる。
【０００９】
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類とのアミノ基転移反応は、通常、ペプチドまたはその塩１モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１０分ないし５時間（好ましくは約２０分ないし２時間）反応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよいが、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ないし７、とりわけ、約５ないし６に調整して反応を進行させるのがよい。
該アミノ基転移反応を促進するため、遷移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ましい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu+，Cu2+）、コバルトイオン（Co2+，Co3+）、ニッケルイオン（Ni2+，Ni3+）、鉄イオン（Fe2+，Fe3+）、亜鉛イオン（Zn2+）、アルミニウムイオン（Al3+）、マンガンイオン（Mn2+など）、ガリウムイオン（Ga3+）、インジウムイオン（In3+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、カルシウムイオン（Ca2+）などを用いることができるが、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわけ、銅イオン（Cu2+）が好ましく用いられる。これらの遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加することができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸銅が好ましく用いられる。
【００１０】
また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ないし１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基としては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類などを用いることができるが、なかでも、ピリジンが好ましく用いられる。
また、アミノ基転位反応の際に、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩、および該ペプチドまたはその塩のアミノ基転位反応で得られるメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の沈殿防止などを目的として、該ペプチド，メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の種類に応じて、アミノ基転位反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を好ましくは約１ないし８Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの濃度になるよう添加することが好ましい。
【００１１】
さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加して、アミノ基転移反応を進行させる。
該アミノ基転移反応により得られ、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩（メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩）は、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。
アミノ基転移反応で得られたメチオニンのジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、通常、塩基による加水分解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していないアミノ酸、ペプチドまたはその塩に変換することができる。
【００１２】
加水分解反応に用いる塩基としては、例えば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、トリレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニレンジアミンなど）、２,３−ジアミノフェノール、４−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジアミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類またはその塩などを用いることができるが、なかでも、アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、３,４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用いられる。
加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
【００１３】
塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩１モルに対して約１ないし１万モル、好ましくは約２００ないし３０００モル、より好ましくは約５００ないし３０００モルである。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１時間ないし７日間（好ましくは約１０時間ないし５日間）で進行させるのが好ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好ましく、緩衝液としては、例えば、ぎ酸系緩衝液（例えば、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−酢酸ナトリウムなど）などが挙げられる。上記した加水分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を用いてもよいが、なかでも、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸−酢酸ナトリウム緩衝液が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし６に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩衝液は、好ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましくは約０．５〜６mol/L用いられる。
また、加水分解の際に、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩および加水分解反応により生成する該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドまたはその塩の沈殿防止等を目的として、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド、該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドまたはその塩の種類に応じて、加水分解反応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を、好ましくは約１ないし６Ｍ、より好ましくは約２ないし５Ｍの濃度になるよう添加することが好ましい。
このようにして得られるアミノ酸、ペプチドまたはその塩は、公知の精製手段、例えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィーなどにより、反応溶液から単離・精製することもできるが、好ましい例として、例えば、ＳＰ−セファロース（ファルマシア バイオテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法が挙げられる。
【００１４】
本発明により製造されるペプチドはそのＮ末端にメチオニンを有さず、また目的とする生理活性ペプチド（例えば、天然の生理活性ポリペプチド）と同一のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、目的とするペプチド（例えば、天然のポリペプチド）と同様の活性を有し低毒性で安全に医薬品や診断用薬剤として使用できる。
本発明により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドからＮ末端のメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を特異的に除去することができる。
本発明の明細書および図面においてアミノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
【００１５】
ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇly ： グリシン
Ａla ： アラニン
Ｖal ： バリン
Ｌeu ： ロイシン
Ｉle ： イソロイシン
Ｓer ： セリン
Ｔhr ： スレオニン
Ｃys ： システイン
Ｍet ： メチオニン
Ｇlu ： グルタミン酸
Ｇln ： グルタミン
Ａsp ： アスパラギン酸
Ａsn ： アスパラギン
Ｌys ： リジン
Ａrg ： アルギニン
Ｈis ： ヒスチジン
Ｐhe ： フェニルアラニン
Ｔyr ： チロシン
Ｔrp ： トリプトファン
Ｐro ： プロリン
Ａsx ： Ａsp ＋ Ａsn
Ｇlx ： Ｇlu ＋ Ｇln
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下の参考例および実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００１７】
【実施例】
参考例１（Ｔ７プロモーターを用いたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築）
ｈＧＨの構造遺伝子は、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）より、構造遺伝子の開始コドン上流に隣接してＮｄｅ Ｉ切断部位を持つプライマー、及び始終コドン下流に隣接してＢａｍ ＨＩ切断部位を持つプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅して回収した。これにより得られた両端に制限酵素認識部位が付加したｈＧＨ酵素遺伝子を、ｐＴ７ＢｌｕｅのＴ−クローニング部位に連結して（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、宝酒造株式会社製）ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した。これを、大腸菌ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。
一方、以下の方法で発現ベクターを構築した。ｐＢＲ３２２をＮｄｅ Ｉで切断、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ．宝酒造株式会社製）で末端を平滑化し、再度連結することによって、Ｎｄｅ Ｉ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作製した。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌ II−ＥｃｏＲＶで切断し、約０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅのＳｃａ Ｉ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅを作製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｐＢＲ３２２のＢａｍ ＨＩ認識部位を欠損させたｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片と連結してテトラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣを作製した。テトラサイクリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの向きが逆のものをｐＴＣ１、同じものをｐＴＣ２とした。
ｐＴ７ＨＧＨ−ＮａをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断してｈＧＨ構造遺伝子を回収し、ｐＴＣ１のＮｄｅ Ｉ−Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入してアンピシリン耐性で形質転換体を選択、その株より再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＨＧＨ−Ｎａとした。
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、ｈＧＨ発現ベクターｐＴＣＨＧＨ−Ｎａをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａを得た。なお、ｈＧＨの塩基配列は、ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した時点でＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７Ａ ＤＮＡシーケンサーによって確認した。
【００１８】
参考例２（大腸菌でのメチオニン残基を有するｈＧＨ（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）の発現）
参考例１で得た形質転換細胞を、５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−６２５（消泡剤：三洋化成工業製）および５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、３．０％ハイケースアミノ、１．０％酵母エキス）を仕込んだ５００リットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になった時点で１７．８５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２４リットルの３０％ブドウ糖を添加しながら培養を続け、５時間後に培養液を遠心分離して、約１２．３ｋｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５４６として平成９年１２月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６８８８として平成１１年９月２４日に国際寄託に移管された。また、上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号ＩＦＯ １６１２４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に平成９年１０月１６日に寄託されている。
【００１９】
実施例１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体２ｋｇに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）６リットルを加えて菌体を溶解してから超音波破砕器（ソニファイアー４５０、ブランソン社）を用いて破砕処理を行った後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上澄液６リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）１８リットルを加えてｐＨ８．０に調整した後、４℃で４日間活性化を行った。
【００２０】
実施例２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの精製）
実施例１で活性化の終了した再生液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液５リットルに５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えて５０リットルに希釈後４℃に一晩静置した。ついで、連続遠心分離（ＪＣＦ−Ｚロータ、ベックマン社）を行い、得られた上清５０リットルに１０Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．１２に調整した後ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に置換後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）を行い上清を得た。ついでこの液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として９５リットルの溶出液を得た。さらに、この溶出液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換し、１２．２１グラムのＭｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００２１】
実施例３（Ｎ末端メチオニン残基（Ｎ末端Ｍｅｔ）の除去）
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１８００ミリリットルに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液４５０ミリリットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１２５ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に３リットル／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として４．２リットルの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０．８リットル中によく撹拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌しながら３日間反応させた。反応後、この溶液をペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で１４リットルに濃縮し、７リットルずつ２回に分けて２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２５．２ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に６リットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分２０リットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、３２０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分５．８４リットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａＯＨ溶液を１６ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、８回に分けて高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）によるクロマトグラフィーを行った。所定量の濃縮液をＰＯＲＯＳ２０Ｒ１カラム（５ｃｍ×６０ｃｍ、日本パーセプティブ社）に通液吸着させた後、Ａ＝２５％ｎ−プロパノール＋７５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、Ｂ＝３５％ｎ−プロパノール＋６５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）とによる５０〜８５％Ｂの濃度勾配で、１５０分間、５０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分として３４．７リットルの溶出液を得た。この溶出液に蒸留水を加えて２００リットルに希釈してからペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で５リットルに濃縮後更に、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を３回に分けてＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（１０．８ｃｍ×２０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、８０ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１６１６ミリリットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａＯＨ溶液を２ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、限外ろ過装置（オメガ膜、富士フィルター社）で濃縮し、濃縮液０．４リットルを得た。この濃縮液を蒸留水で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１．３ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に２リットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分を得た。更に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過し、ｈＧＨ溶液２３９１ミリリットル（４６３８ミリグラムのｈＧＨ）を得た。
【００２２】
実施例４（ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例３で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサンプルバッファ［Laemmli,Nature,227,680(1970)］を等量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー(Coomassie Brilliant Blue)で染色した結果、約２２ＫＤａに単一のバンドが認められたことから、精製ｈＧＨは単一であることが確認された（図１）。
（ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１）。
【表１】
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのアミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表２）。
【表２】
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸と一致した（表３）。
【表３】
実施例５（ｈＧＨの活性測定）
実施例３で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対する増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショナル社、Temecula,California,USA）と同等であった。
【００２４】
実施例６（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリットルに希釈した。この希釈液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００２５】
実施例７（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリットルに希釈した。この希釈液に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍぎ酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨを得た。
【００２６】
実施例８（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液４９．５ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３７℃でゆっくり攪拌しながら２４時間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１５０ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ［2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．７ｍｇのｈＧＨを得た。
【００２７】
実施例９（Ｎ末端Ｍｅｔの除去)
実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得た。この溶出液を２Ｍぎ酸、１０Ｍぎ酸ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液１０ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌しながら３日間反応させた。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１００ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．０ｍｇのｈＧＨを得た。
【００２８】
実施例１０（メチオニン残基を有する２０Ｋ−ｈＧＨ（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ）の活性化)
特開平１０−２３４３８６号の参考例２記載の方法で得られた菌体４０ｇにＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）１００ミリリットルを加えて懸濁した後、５分間、超音波破砕（ブランソン社）を行い菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）して上清を廃棄し、封入体を得た。この封入体に５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）２リットルを加えて封入体を溶解後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上清液２リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）２４リットルを加えて、４℃で１日間活性化を行った。
【００２９】
実施例１１（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨの精製）
実施例１０で活性化の終了した液をミニタン限外濾過システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下になるまで脱塩、濃縮を行った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）し、濃縮液の上清１５０ミリリットルを得た。ついでこの液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、０〜０．１８Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配により流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分として２８ミリリットルの溶出液を得た。さらにこの画分をセントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、濃縮液１５ミリリットルを得た。この液を再度、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭＭＥＳ[2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整し、セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリットルを得た。
【００３０】
実施例１２（Ｎ末端Ｍｅｔの除去）
実施例１１によって得たＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ溶液６ミリリットルを２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分を集め、更に限外濾過システム（ダイアフローメンブレンＹＭ１０、２５ｍｍ、アミコン社）を使って２ミリリットルに濃縮した。この溶液に２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．５ミリリットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させた。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、メチオニン残基のジケトン体を有する２０Ｋ−ｈＧＨ画分として４ミリリットルの溶出液を集めた。この溶出液に１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０ミリリットルを加えよく撹拌した後３０℃で６５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に通液し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分を集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシアバイオテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭ ＭＥＳ[２−(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸]、２.５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整した後、セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリットルを得た。
【００３１】
実施例１３（２０Ｋ−ｈＧＨの特徴決定）
（ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られた２０Ｋ−ｈＧｈのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推定された２０Ｋ−ｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表４）。
【表４】
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（システム６３００，ベックマン社）を用いて決定した。その結果、実施例１２で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのアミノ酸組成は２０Ｋ−ｈＧＨのｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成と一致した（表５）。
【表５】
実施例１４（２０Ｋ−ｈＧＨの活性測定）
実施例１２で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対する増殖促進効果のあることを確認した。
【００３３】
実施例１５
（メチオニン残基を有するヒトＢＴＣ（ヒトＭｅｔ−ＢＴＣ）の製造）
特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例４〜６、８および１３に記載の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣを製造した。
（大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコードする０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ１５１５から単離した。ＡＴＧ翻訳開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’；５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲＩ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６巻、１２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構築した。
ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１０−１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）まで）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリゴヌクレオチド（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２．０％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５ＫｂＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１３参照）。
（大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴＣの発現）
大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐＬｙｓＳをこの大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌体に上記参考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６を得た。
この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、１００ｍｇ／リットル分のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。
この形質転換大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として平成４年４月２１日に通商産業省工業技術院生命工学工業研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １５２８２として平成４年４月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されている。
上述の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトベータセルリン（Ｍｅｔ−ＢＴＣ）１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．２５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．２５ｇ、ピリジン ０．５ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＢＴＣ画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ６．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＢＴＣ画分をプールした。さらに、ＢＴＣ画分を０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml/分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約２．６ｍｇを得た。
【００３４】
実施例１６（ＢＴＣの特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１５で得られたＢＴＣをSample buffer［Laemmli, ネイチャー(Nature), 227, 680 (1970)］に懸濁し100℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図２）。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステム モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたＢＴＣのｃＤＮＡの塩基配列から推定したＢＴＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表６）。
【表６】
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。
【表７】
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。得られたＢＴＣはcＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表８）。
【表８】
精製品はモレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８８（１９８８）に記載の方法により、BALB/C3T3 A31-714 クローン 4（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー、１２、４６３（１９７３））を用いた活性測定を行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００３５】
実施例１７
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例５の方法により取得したＮ末端にメチオニン残基を有するヒトインターロイキン−２（Ｍｅｔ−ＩＬ−２）５０ｍｇを４Ｍ尿素溶液４０ｍｌに溶解した後、１００ｍＭ硫酸銅２．５ｍｌ、グリオキシル酸 ２．５ｇ、ピリジン ５．０ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＩＬ−２画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＩＬ−２画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、３０〜８０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、１７．３ｍｇのＩＬ−２画分を得た。
【００３６】
実施例１８（ＩＬ−２の特徴決定）
ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分析
実施例１７で得られたＩＬ−２をSample buffer［Laemmli,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品はほぼ単一であった（図３）。
ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アプライドバイオシステム モデル477A)を用いて決定した。その結果、得られたＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したＩＬ−２のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表９）。
【表９】
アミノ酸組成をアミノ酸分析計(ベックマン システム6300E)を用いて決定した。その結果、ＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１０）。
【表１０】
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計(ベックマン システム6300E)を用いて決定した。得られたＩＬ−２はcＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１１）。
【表１１】
生物活性測定は、ＩＬ−２依存細胞を用いる日沼らの方法［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.),109,363(1982)]に従がって行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００３７】
実施例１９（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０ｍＭトリス／酢酸、１．０９ｍＭ還元型グルタチオン、０．０５５ｍＭ酸化型グルタチオン、１０９ｍＭアルギニン、４．３６Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化の終了した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）約２５リットルを加えながら電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）約３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３８】
実施例２０（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステイン塩酸塩一水和物、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化されたＭｅｔ−ｈＧＨの量は実施例１９の約１．２倍多く得られた。活性化の終了した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）２５リットルを加えながら電気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３９】
実施例２１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭＮ−アセチル−L−システイン、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
【００４０】
実施例２２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化）
参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリリットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリットルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステアミン塩酸塩、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
【００４１】
実施例２３
特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）の参考例３記載の方法により、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）を製造した。
Ｎ末端にメチオニンの付加したヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）５０ｍｇを３Ｍ尿素溶液８ｍｌに溶解し、０．２Ｍ硫酸銅 ０．４ｍｌ、グリオキシル酸 ０．５ｇ、ピリジン １ｍｌの混合液を加え１０ｍにした後、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を４ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＮＴ−３画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）画分をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ５．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２ＭＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（21.5ｍｍＩＤ×３００ｍｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０〜６０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、５ｍｌ/分の流速で溶出した。ＮＴ−３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ＮＴ−３の凍結乾燥粉末約５ｍｇを得た。
【００４２】
実施例２４（ＮＴ−３の特徴決定）
ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズモデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＮＴ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１２）。
【表１２】
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（ベックマン システム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果、ＮＴ−３のｃＤＮＡの塩基配列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１３）。
【表１３】
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（ベックマンシステム６３００Ｅ）を用いて決定した。その結果ｃＤＮＡの塩基配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１４）。
【表１４】
実施例２３で得られたＮＴ−３についてＤＲＧ（ニワトリ有精卵をふ卵器で３７．５℃、８−１０日間揺卵して、胚発生を行った胎児から摘出した後神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ））を用いた生物活性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等の活性を有することを確認した。
【００４３】
実施例２５
実施例２で得られたＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１４．７５ｍｌを６Ｍ尿素溶液で６０ｍｌにした後、０．５Ｍ硫酸銅 １．２ｍｌ、グリオキシル酸 ３．７５ｇ、ピリジン ７．５ｍｌの混合液を加え７５ｍｌにした後、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ８.０）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍＩＤ×６０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を１０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加して、３０℃で４日間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍＩＤ×８０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を３０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないｈＧＨ画分をプールした。プールしたｈＧＨ画分を、５０ｍＭトリス緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ＰＷ（５．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ４．０）の段階勾配で６０分間、１５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ約６０ｍｇを取得した。
【００４４】
実施例２６ ヒトアペリン−３６構造遺伝子の調製
図４に示す６種類のＤＮＡ断片（#1,#5：グライナー・ジャパン社、#2,#6：キコーテック社、#3,#4：アマシャム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアペリン−３６の構造遺伝子を調製した（図５）。
a)DNAオリゴマーのリン酸化
5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
b)DNAフラグメントの連結
上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させた。
c)5'末端のリン酸化
沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）10 μLに溶解し、100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４５】
実施例２７ ヒトアペリン−３６発現プラスミドの調製
pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー、32巻、273頁）をXbaI及びAvaIで消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.4KbpのDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解した。このpTB960-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製したヒトアペリン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。すなわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μLとヒトアペリン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、I液5 μLを加え、16℃、30分間反応させ、ライゲーションを行った。ライゲーション液10 μLを用いてE. coli JM109コンピテントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8 Miniprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTB960-13を調製した。このヒトアペリン−３６構造遺伝子部分の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル377ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プラスミドpTB960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）に形質転換を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリン−３６-ＣＳ２３融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を得た（図６）。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-13は受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1998年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵研究所（IFO）に寄託された。
【００４６】
実施例２８
実施例２７で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の最終濃度が１２ｍｇ／Ｌになるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取得し、−８０℃で凍結保存した。
【００４７】
実施例２９ ヒトアペリン−３６の取得
実施例２８で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋１ｍＭ(ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド塩酸塩（ｐＨ６．０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyopearl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。
この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えながら濃縮を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−３６を得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０〜４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６を画分を得た。このヒトアペリン−３６画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)に通液し、吸着、洗浄した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％TFA）の段階勾配で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６凍結乾燥粉末を得た。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１５）。
【００４８】
【表１５】
b)Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＮ末端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１６）。
【００５０】
【表１６】
ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表１７）。
【表１７】
【００５２】
実施例３０（生物活性測定）
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００５３】
実施例３1(Ｎ末端のメチオニン残基の除去)
実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６ ４ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．０４６ｇ、ピリジン ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×250mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するヒトアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分に等量の ２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していないヒトアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒトアペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mmL、東ソー（株））に吸着した後、０〜１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％ＴＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭和電工（株））に吸着した後、１５〜３０％Ｂ（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４０分間、２ml／分の流速で溶出した。ヒトアペリン−３６のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、ヒトアペリン−３６を取得した。
ａ）アミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。
その結果、ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した（表１８）。
【００５４】
【表１８】
b)Ｎ末端アミノ酸配列分析
Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＤＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１９）。
【００５６】
【表１９】
ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析
Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表２０）。
【表２０】
実施例３２（生物活性測定）
実施例３１で取得したヒトアペリン−３６を用いて、特願平10−271645号（特開2000-159798）の実施例６に記載の方法（サイトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチド、蛋白質またはその塩から、該メチオニン残基のみを選択特異的かつ効率的に取り除き、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチド，蛋白質またはその塩を効率よく生産することができる。また、本発明の方法によれば、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、しかもマイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を化学的に除去することができるので、遺伝子工学的手法により製造されたメチオニン残基を有するペプチド，蛋白質またはその塩を原料にして、天然型のアミノ酸配列を有するペプチドまたは蛋白質を工業的に有利に製造することができる。
【００６０】
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実施例４ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は精製ｈＧＨを示す。
【図２】は、実施例１６ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１５で得られたＢＴＣを示す。
【図３】は、実施例１８ａ)で得られた電気泳動の結果を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１７で得られたＩＬ−２を示す。
【図４】は、実施例２６で用いられたＤＮＡフラグメントを示す。
【図５】は、実施例２６で得られた２重鎖構成のヒトアペリン−３６を製造する模式図を示す。
【図６】は、実施例２７で得られたプラスミドｐTB９６０−１３の構築図を示す。
Claims (16)
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である請求項１記載の方法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプチドである請求項２記載の方法。
- ペプチドが（i）成長ホルモン，(ii）ベータセルリン，(iii）インターロイキン−２，(iv）ニューロトロフィン−３または（v）アペリンである請求項１記載の方法。
- ペプチドが成長ホルモンである請求項１記載の方法。
- 酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケトン体の除去方法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させることにより得られるペプチドまたはその塩である請求項８記載の製造法。
- 酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする請求項８記載の製造法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないペプチドまたはその塩の製造法。
- 遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキシル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基のジケトン体を除去するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用。
- Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用。
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