JP2000178297A - Ｎ末端メチオニンの除去方法 - Google Patents
Ｎ末端メチオニンの除去方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチ
ド、蛋白質またはその塩から選択特異的かつ効率的に該
メチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体
を化学的に除去し、高収率でＮ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケト
ン体が付加していないペプチド、蛋白質またはその塩る
方法を提供する。 【解決手段】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢
酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムま
たはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジア
ミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とす
る該メチオニン残基のジケトン体の除去方法。
あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチ
ド、蛋白質またはその塩から選択特異的かつ効率的に該
メチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体
を化学的に除去し、高収率でＮ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケト
ン体が付加していないペプチド、蛋白質またはその塩る
方法を提供する。 【解決手段】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢
酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムま
たはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジア
ミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とす
る該メチオニン残基のジケトン体の除去方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｎ末端に酸化され
ていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基
のジケトン体を有するペプチド（蛋白質を含む）または
その塩から酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸
ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下、
効率よくＮ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基
あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方
法；およびＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していな
いペプチドまたはその塩の製造法等に関する。
ていてもよいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基
のジケトン体を有するペプチド（蛋白質を含む）または
その塩から酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸
ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下、
効率よくＮ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基
あるいは該メチオニン残基のジケトン体を除去する方
法；およびＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有していな
いペプチドまたはその塩の製造法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質が細胞内で生合成される際には、
そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメ
チオニンから始まっていることが知られている。しかし
ながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによって
取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分子に
はもはや存在しないのが通例である。遺伝子組換え技術
の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、例え
ば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、本手
法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存
している例が見い出されている。例えば、大腸菌で発現
させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加率は
ほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４０８
（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにおいて
は５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサ
ーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８
１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２で
は、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニン
ではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端に
さらにメチオニンの付加した（Ｎ末端にメチオニン残基
を有する）分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認めら
れている。一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する
方法としては、Dixon が、１９６４年に、ＤＬ−アラニ
ルグリシンにグリオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応
させるとアミノ基移転反応が起こり、ピルボイルグリシ
ンが生成すること［バイオケミストリー・ジャーナル
（Biochem. J），９２，６６１（１９６４）］、さら
に、化合物にチオセミカルバジドを反応させるとアミド
結合の解裂が起こり、グリシンを生成することを報告し
ている［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.
J），９０，２Ｃ（１９６４）］。次いで、この反応を
チトクロームｃ−５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ
−５５１）に応用し、Ｎ末端グルタミン酸が除去される
ことを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル
（Biochem. J），９４，４６３（１９６５）］。
そのＮ末端は mＲＮＡの開始コドンＡＵＧに対応するメ
チオニンから始まっていることが知られている。しかし
ながらこのメチオニンは以後のプロセッシングによって
取り除かれてしまうため、完成された成熟蛋白質分子に
はもはや存在しないのが通例である。遺伝子組換え技術
の進歩により、有用な蛋白質を微生物や動物細胞、例え
ば大腸菌を用いて産生することが可能となったが、本手
法により産生される蛋白質には、上記メチオニンが残存
している例が見い出されている。例えば、大腸菌で発現
させたヒト成長ホルモンにおいてメチオニンの付加率は
ほぼ１００％［ネイチャー（Nature），２９３，４０８
（１９８１）］に達し、インターフェロン−αにおいて
は５０％［ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサ
ーチ（J. Interferon Res.），１，３８１（１９８
１）］、非グリコシル化ヒトインターロイキン−２で
は、天然型ヒトインターロイキン−２と同じくアラニン
ではじまる分子種（rＩＬ−２）に加え、アミノ末端に
さらにメチオニンの付加した（Ｎ末端にメチオニン残基
を有する）分子種（Ｍet−rＩＬ−２）の存在が認めら
れている。一方、Ｎ末端のアミノ酸を化学的に除去する
方法としては、Dixon が、１９６４年に、ＤＬ−アラニ
ルグリシンにグリオキシル酸、ピリジン、酢酸銅を反応
させるとアミノ基移転反応が起こり、ピルボイルグリシ
ンが生成すること［バイオケミストリー・ジャーナル
（Biochem. J），９２，６６１（１９６４）］、さら
に、化合物にチオセミカルバジドを反応させるとアミド
結合の解裂が起こり、グリシンを生成することを報告し
ている［バイオケミストリー・ジャーナル（Biochem.
J），９０，２Ｃ（１９６４）］。次いで、この反応を
チトクロームｃ−５５１（Pseudomonas cytochrome ｃ
−５５１）に応用し、Ｎ末端グルタミン酸が除去される
ことを報告している［バイオケミストリー・ジャーナル
（Biochem. J），９４，４６３（１９６５）］。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】同じ蛋白質であって
も、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうでない
分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定性が相互
に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ末端への
付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありうるものと
考えられる。従って、産業利用上の観点から、この開始
コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確立するこ
とは意義あることと考えられる。この課題を解決するた
め、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチオニンを
取り除く方法が提案［サイエンス（Science），１９
８，１０５６（１９７７）］されているが、この場合は
所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しないこと
が前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法
によっては、決して満足する結果は得られない。Ｎ末端
にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、
ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的かつ効
率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去することを可能
とする化学的な方法としては、特開平１０−７２４８９
号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）に記載の方法以外には
全く知られていないが、このことは、最終生産物となる
ペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マイルド
な条件下でＮ末端のメチオニン残基を除去しうる化学的
な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられ
る。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に製造
される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを目的
とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオニン
を除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性が低
下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から弱ア
ルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行させ
る必要があり、化学的な反応条件としては制限が多いの
で、良好な反応条件を見い出せないのが現状であった。
も、Ｎ末端にメチオニンの付加した分子種とそうでない
分子種とは蛋白質の高次構造、生物活性、安定性が相互
に異なる可能性があり、さらにメチオニンのＮ末端への
付加が抗原性の増加をもたらす可能性もありうるものと
考えられる。従って、産業利用上の観点から、この開始
コドンに対応するＮ末端メチオニン除去法を確立するこ
とは意義あることと考えられる。この課題を解決するた
め、臭化シアン（ＢrＣＮ）分解によってメチオニンを
取り除く方法が提案［サイエンス（Science），１９
８，１０５６（１９７７）］されているが、この場合は
所望の成熟蛋白質中にメチオニン残基が存在しないこと
が前提となる上、過酷な化学反応を蛋白質に付す該方法
によっては、決して満足する結果は得られない。Ｎ末端
にメチオニン残基を有するペプチドまたは蛋白質から、
ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、選択的かつ効
率的に、Ｎ末端のメチオニン残基を除去することを可能
とする化学的な方法としては、特開平１０−７２４８９
号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６号）に記載の方法以外には
全く知られていないが、このことは、最終生産物となる
ペプチドまたは蛋白質を変性させることなく、マイルド
な条件下でＮ末端のメチオニン残基を除去しうる化学的
な反応を見い出すことの困難性に起因すると考えられ
る。特に、分子量が比較的大きく、遺伝子工学的に製造
される蛋白質、なかでも、医薬として用いることを目的
とした蛋白質から、Ｎ末端に余分に付加したメチオニン
を除去する場合、メチオニン除去後に蛋白質の活性が低
下しないことが要求されるため、通常、弱酸性から弱ア
ルカリの水溶液中で加熱することなく、反応を進行させ
る必要があり、化学的な反応条件としては制限が多いの
で、良好な反応条件を見い出せないのが現状であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、遺伝子工
学的に製造されるペプチド（蛋白質を含む）におけるＮ
末端のメチオニン残基のみを切断することによる、天然
型のアミノ酸配列を有するペプチドの製造法を提供すべ
く鋭意研究したところ、下記のスキーム１に表されると
おり式（Ｉ）で表わされるＮ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基を有するペプチドに、例えば、α-ジ
ケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを供与
しうる硫酸銅、塩基（例えばアミン類）であるピリジン
を反応させて、アミノ基移転反応を行うことにより得ら
れる該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドに
塩基（例えばジアミン類）である３，４−ジアミノ安息
香酸と、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナ
トリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム等の存在下に
反応させて加水分解反応を行うことにより、該メチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチドからメチオニン残
基のジケトン体を予想外にも効率よく除去できることを
見出した。すなわち、本発明者らはメチオニン残基を有
するペプチドから、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチ
オニン残基を除去し、その活性を低下させることなく、
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有して
いないペプチドを予想外にも高収率で得る方法を見い出
し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。 （スキーム１）
学的に製造されるペプチド（蛋白質を含む）におけるＮ
末端のメチオニン残基のみを切断することによる、天然
型のアミノ酸配列を有するペプチドの製造法を提供すべ
く鋭意研究したところ、下記のスキーム１に表されると
おり式（Ｉ）で表わされるＮ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基を有するペプチドに、例えば、α-ジ
ケトン類であるグリオキシル酸、遷移金属イオンを供与
しうる硫酸銅、塩基（例えばアミン類）であるピリジン
を反応させて、アミノ基移転反応を行うことにより得ら
れる該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドに
塩基（例えばジアミン類）である３，４−ジアミノ安息
香酸と、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナ
トリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム等の存在下に
反応させて加水分解反応を行うことにより、該メチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチドからメチオニン残
基のジケトン体を予想外にも効率よく除去できることを
見出した。すなわち、本発明者らはメチオニン残基を有
するペプチドから、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチ
オニン残基を除去し、その活性を低下させることなく、
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有して
いないペプチドを予想外にも高収率で得る方法を見い出
し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。 （スキーム１）
【化１】 ［式（I）中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミ
ノ酸残基または２以上の任意のアミノ酸数を有するペプ
チド鎖であればいずれでもよいが、実用的な面からは、
遺伝子工学的に製造された蛋白質のＸに対応する部分の
ペプチド鎖が挙げられる。なお、本願明細書において、
蛋白質あるいはペプチドと称する場合、複数のアミノ酸
からなるペプチドまたは蛋白質は、非グリコシル化また
はグリコシル化ペプチドまたは蛋白質のいずれであって
もよい。］ 本願明細書においては、上記スキーム１中、一般式
（Ｉ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有するペプチド」または「メチ
オニン残基を有するペプチド」；一般式（Ｉ）において
ノ酸残基または２以上の任意のアミノ酸数を有するペプ
チド鎖であればいずれでもよいが、実用的な面からは、
遺伝子工学的に製造された蛋白質のＸに対応する部分の
ペプチド鎖が挙げられる。なお、本願明細書において、
蛋白質あるいはペプチドと称する場合、複数のアミノ酸
からなるペプチドまたは蛋白質は、非グリコシル化また
はグリコシル化ペプチドまたは蛋白質のいずれであって
もよい。］ 本願明細書においては、上記スキーム１中、一般式
（Ｉ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有するペプチド」または「メチ
オニン残基を有するペプチド」；一般式（Ｉ）において
【化２】 [式中、ｍは前記と同意義]に代表される部分構造を「酸
化されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」；一般式（ＩＩ）に代表され
る化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチド」または「メチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチド」；一般式（Ｉ
Ｉ）において
化されていてもよいメチオニン残基」、「メチオニン残
基」または「メチオニン」；一般式（ＩＩ）に代表され
る化合物を「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチド」または「メチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチド」；一般式（Ｉ
Ｉ）において
【化３】 [式中、ｍは前記と同意義]に代表される部分構造を「酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」また
は「メチオニン残基のジケトン体」；および、一般式
（ＩＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されて
いてもよいメチオニン残基を有していないペプチド」ま
たは「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基の
ジケトン体を有していないペプチド」と、それぞれ称す
ることがある。
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体」また
は「メチオニン残基のジケトン体」；および、一般式
（ＩＩＩ）に代表される化合物を「Ｎ末端に酸化されて
いてもよいメチオニン残基を有していないペプチド」ま
たは「Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基の
ジケトン体を有していないペプチド」と、それぞれ称す
ることがある。
【０００５】すなわち、本発明は、（１）Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有する
ペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、
ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリ
ウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩
と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケ
トン体の除去方法、（２）Ｎ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反
応させることにより得られるペプチドまたはその塩であ
る前記（１）記載の方法、（３）Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学
的に製造されたペプチドである前記（２）記載の方法、
（４）ペプチドが(i)成長ホルモン，(ii)ベータセルリ
ン，(iii)インターロイキン−２，(iv)ニュートロフィ
ン−３または(v)アペリンである前記（１）記載の方
法、（５）ペプチドが成長ホルモンである前記（１）記
載の方法、（６）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およ
びぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、
ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液と
して用いられることを特徴とする前記（１）記載の方
法、（７）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸
およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息
香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチ
オニン残基のジケトン体の除去方法、（８）Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
るペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウ
ム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナ
トリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはそ
の塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されて
いてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまた
はその塩の製造法、（９）Ｎ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反
応させることにより得られるペプチドまたはその塩であ
る前記（８）記載の製造法、（１０）酢酸およびぎ酸ナ
トリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および
酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし
８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前
記（８）記載の製造法、（１１）Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド
またはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に
３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させるこ
とを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していない
ペプチドまたはその塩の製造法、（１２）遺伝子工学的
に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキ
シル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に
反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸および
ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在
下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させ
ることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有してい
ないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法、（１３）
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する
ペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するた
めの、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸
ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと(ii)３，
４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、（１４）Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン
体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基の
ジケトン体を除去するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナト
リウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢
酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸または
その塩の使用、（１５）Ｎ末端に酸化されていてもよい
メチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しない
ペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およ
びぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ
酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息
香酸またはその塩の使用、および、（１６）Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
るペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプ
チドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およびぎ
酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸お
よび酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸
またはその塩の使用、に関する。
されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有する
ペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウム、
ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリ
ウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩
と反応させることを特徴とする該メチオニン残基のジケ
トン体の除去方法、（２）Ｎ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反
応させることにより得られるペプチドまたはその塩であ
る前記（１）記載の方法、（３）Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基を有するペプチドが遺伝子工学
的に製造されたペプチドである前記（２）記載の方法、
（４）ペプチドが(i)成長ホルモン，(ii)ベータセルリ
ン，(iii)インターロイキン−２，(iv)ニュートロフィ
ン−３または(v)アペリンである前記（１）記載の方
法、（５）ペプチドが成長ホルモンである前記（１）記
載の方法、（６）酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およ
びぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、
ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液と
して用いられることを特徴とする前記（１）記載の方
法、（７）Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢酸
およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息
香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メチ
オニン残基のジケトン体の除去方法、（８）Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
るペプチドまたはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウ
ム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナ
トリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息香酸またはそ
の塩と反応させることを特徴とするＮ末端に酸化されて
いてもよいメチオニン残基を有していないペプチドまた
はその塩の製造法、（９）Ｎ末端に酸化されていてもよ
いメチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩が、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残
基を有するペプチドまたはその塩をα−ジケトン類と反
応させることにより得られるペプチドまたはその塩であ
る前記（８）記載の製造法、（１０）酢酸およびぎ酸ナ
トリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および
酢酸ナトリウムが、ｐＨ約２ないし９で約０．１ないし
８mol/Lの緩衝液として用いられることを特徴とする前
記（８）記載の製造法、（１１）Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド
またはその塩を、酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に
３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させるこ
とを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有していない
ペプチドまたはその塩の製造法、（１２）遺伝子工学的
に製造され、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するヒト成長ホルモンまたはその塩をグリオキ
シル酸またはその塩と硫酸銅およびピリジンの存在下に
反応させた後、酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸および
ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在
下に３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩と反応させ
ることを特徴とするＮ末端にメチオニン残基を有してい
ないヒト成長ホルモンまたはその塩の製造法、（１３）
Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有する
ペプチドまたはその塩の該メチオニン残基を除去するた
めの、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸
ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムと(ii)３，
４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用、（１４）Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジケトン
体を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残基の
ジケトン体を除去するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナト
リウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢
酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸または
その塩の使用、（１５）Ｎ末端に酸化されていてもよい
メチオニン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有しない
ペプチドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およ
びぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ
酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息
香酸またはその塩の使用、および、（１６）Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基のジケトン体を有す
るペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基のジケトン体を有していないペプ
チドまたはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およびぎ
酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸お
よび酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸
またはその塩の使用、に関する。
【０００６】本明細書において、酸化されていてもよい
メチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体
を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキ
シドおよびスルホン体が挙げられる。Ｎ末端に酸化され
ていてもよいメチオニン残基を有するペプチドとして
は、式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ［式中、ｍは０
ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチ
ド鎖を示す。］で表されるペプチドが挙げられ、これら
は塩を形成してもよく、塩としては、本発明の反応を阻
害しないものであれば何れでもよいが、中でも薬学的に
許容可能な塩が好ましく、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫
酸、リン酸など無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル
酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタン
スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との
塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム
塩などが挙げられる。Ｎ末端に酸化されていてもよいメ
チオニン残基を有するペプチドは、遺伝子工学的に製造
されたＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を
有するペプチドであることが好ましい。
メチオニン残基は、メチオニン残基またはそのＳ酸化体
を示し、メチオニン残基のＳ酸化体としては、スルホキ
シドおよびスルホン体が挙げられる。Ｎ末端に酸化され
ていてもよいメチオニン残基を有するペプチドとして
は、式CH3-S(O)m-(CH2)2-CH(NH2)-CO-Ｘ［式中、ｍは０
ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基またはペプチ
ド鎖を示す。］で表されるペプチドが挙げられ、これら
は塩を形成してもよく、塩としては、本発明の反応を阻
害しないものであれば何れでもよいが、中でも薬学的に
許容可能な塩が好ましく、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫
酸、リン酸など無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル
酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタン
スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との
塩、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、
カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アンモニウム
塩などが挙げられる。Ｎ末端に酸化されていてもよいメ
チオニン残基を有するペプチドは、遺伝子工学的に製造
されたＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を
有するペプチドであることが好ましい。
【０００７】上記式中、ｍとしては０が好ましい。ま
た、Ｘとしてはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖が好
ましい。本発明のペプチドとしては、アミノ酸数が５０
未満のいわゆるペプチドあるいはアミノ酸数が５０以上
のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。このように、
本願明細書において、「ペプチド」で示される用語は、
アミノ酸数が５０未満の分子のみならず、アミノ酸数が
５０以上の分子をも含むものであるが、なかでも、アミ
ノ酸数が５０以上の分子（いわゆる蛋白質）が好ましく
用いられる。好ましいペプチドとしては、アミノ酸数が
２ないし１０００であるペプチド、さらに好ましくはア
ミノ酸数が１５ないし５００であるペプチドが挙げら
れ、その具体例としては、成長ホルモン（ＧＨ）類〔例
えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧ
Ｈ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ベータセルリン（Ｂ
ＴＣ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インシュリン、
神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因
子、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−
３、４または６、中枢神経成長因子、グリア成長因子、
肺由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成
長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成
長因子αまたはβ、血管内皮細胞成長因子、ティッシュ
・プラスミノーゲン・アクチベータ、ウロキナーゼ、プ
ロテインＣ、トロンボモジュリン、骨形成因子、カルシ
トニン、インスリン様成長因子、インターフェロン−
α、βまたはγ、インターロイキン−１（α、β）〜１
２、顆粒コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ・コロ
ニー刺激因子、顆粒マクロファージ刺激因子、トロンボ
ポエチン、エリスロポイエチン、ＰＡＣＡＰ、心房性ナ
トリウム利尿ペプチド、エンドセリン、巨核球成長因
子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、モチリン、
イムノトキシン、腫瘍壊死因子、ヒルジン、コルチコト
ロピン、アンジオテンシン、アンジオテンシン２および
そのペプチド性拮抗薬、アンジオテンシン３、ブラジキ
ニン類、ブラジキニン増強因子、α、βまたはγエンド
ルフィン、エンケファリン、好球中走化性因子、ガスト
リン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、キョウトル
フィン、カリジン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、肥
満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン、ニ
ューロテンシン、トリプシンインヒビター、オキシトシ
ン、プロインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、ソマ
トスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ユビキ
チン、ウロガストロン、バソプレッシン類、キニン類、
タフトシン、ソマトメジン、コルチコトロピン放出因
子、インスリン様成長因子、カルシトニン遺伝子関連ペ
プチド、ＰＴＨrＰ、ＶＩＰ、ＤＨＩ、インスリノトロ
ピン、ＧＲＰ、ＣＣＫ−ＰＺ、Galanin（ガラニン）、
アカトラムペプチド（Antrum Peptide）、ＰＰＹ、Panc
reatic Polypeptide、ＰＳＰ、パンクレアスタチン、h
ＣＧ、hＣＳ、リラキシン、血清胸腺因子、サイモポイ
エチン、サイモシン、ファクターXIII、ファクターVII
I、プロウロキナーゼ、ＳＯＤ、ファクターVIIａ、アン
チトロンビン、アペリンなどの蛋白質およびそれらのム
テイン（天然型の蛋白質に１つ以上のアミノ酸が置換、
欠損または付加し、天然の蛋白質と同等またはそれ以上
の生物学的または免疫学的活性を示すもの）など、ある
いは化学合成などにより製造される公知または新規のペ
プチドなどが挙げられるが、なかでも、遺伝子工学的に
製造されたペプチド（蛋白質を含む）、とりわけ、遺伝
子工学的に製造された成長ホルモン類〔例えば、ヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−
ｈＧＨなど）など〕、ニューロトロフィン−３、ベータ
セルリン、副甲状腺ホルモン、インターロイキン−２、
アペリンおよびそれらのムテイン，特に成長ホルモン類
〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−
ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕およびそれらのム
テイン、とりわけ成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧ
Ｈなど）など〕が好ましく用いられる。前記アペリンと
しては、例えばBiochem. Biophys. Res. Commun.,251,
471-476 (1998)に記載のヒトアペリン−３６、ヒトアペ
リン−１３、アペリン−１３のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌ
ｎ）がピログルタミン酸化したペプチドなどがあげら
れ、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et al., Gene, 436, 355-3
59 (1993)）に対し、リガンド活性を有するペプチドで
あれば、如何なるものであっていてもよく、具体的に
は、例えば特願平１０−２７１６５４号に記載の「配列
番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に結
合能を有するポリペプチド」などが挙げられる。上記し
たペプチド（天然型の蛋白質を含む）は、何れの動物種
由来のものであってもよいが、実用的には、ヒト由来の
ペプチド（蛋白質を含む）が好ましく用いられる。上記
のペプチドは、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニ
ン（Ｍｅｔ）残基または該メチオニン残基のジケトン体
の除去工程に付す前あるいは後にリフォールディング
（活性化、再生化）を行うことができる。
た、Ｘとしてはアミノ酸の数が２以上のペプチド鎖が好
ましい。本発明のペプチドとしては、アミノ酸数が５０
未満のいわゆるペプチドあるいはアミノ酸数が５０以上
のいわゆる蛋白質の何れであってもよい。このように、
本願明細書において、「ペプチド」で示される用語は、
アミノ酸数が５０未満の分子のみならず、アミノ酸数が
５０以上の分子をも含むものであるが、なかでも、アミ
ノ酸数が５０以上の分子（いわゆる蛋白質）が好ましく
用いられる。好ましいペプチドとしては、アミノ酸数が
２ないし１０００であるペプチド、さらに好ましくはア
ミノ酸数が１５ないし５００であるペプチドが挙げら
れ、その具体例としては、成長ホルモン（ＧＨ）類〔例
えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧ
Ｈ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕、ベータセルリン（Ｂ
ＴＣ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、インシュリン、
神経成長因子、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因
子、グリア由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−
３、４または６、中枢神経成長因子、グリア成長因子、
肺由来神経栄養因子、上皮細胞成長因子、繊維芽細胞成
長因子、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成
長因子αまたはβ、血管内皮細胞成長因子、ティッシュ
・プラスミノーゲン・アクチベータ、ウロキナーゼ、プ
ロテインＣ、トロンボモジュリン、骨形成因子、カルシ
トニン、インスリン様成長因子、インターフェロン−
α、βまたはγ、インターロイキン−１（α、β）〜１
２、顆粒コロニー刺激因子、顆粒マクロファージ・コロ
ニー刺激因子、顆粒マクロファージ刺激因子、トロンボ
ポエチン、エリスロポイエチン、ＰＡＣＡＰ、心房性ナ
トリウム利尿ペプチド、エンドセリン、巨核球成長因
子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、モチリン、
イムノトキシン、腫瘍壊死因子、ヒルジン、コルチコト
ロピン、アンジオテンシン、アンジオテンシン２および
そのペプチド性拮抗薬、アンジオテンシン３、ブラジキ
ニン類、ブラジキニン増強因子、α、βまたはγエンド
ルフィン、エンケファリン、好球中走化性因子、ガスト
リン、グルカゴン、成長ホルモン放出因子、キョウトル
フィン、カリジン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、肥
満細胞脱顆粒ペプチド、メラニン細胞刺激ホルモン、ニ
ューロテンシン、トリプシンインヒビター、オキシトシ
ン、プロインシュリンＣ−ペプチド、セクレチン、ソマ
トスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、ユビキ
チン、ウロガストロン、バソプレッシン類、キニン類、
タフトシン、ソマトメジン、コルチコトロピン放出因
子、インスリン様成長因子、カルシトニン遺伝子関連ペ
プチド、ＰＴＨrＰ、ＶＩＰ、ＤＨＩ、インスリノトロ
ピン、ＧＲＰ、ＣＣＫ−ＰＺ、Galanin（ガラニン）、
アカトラムペプチド（Antrum Peptide）、ＰＰＹ、Panc
reatic Polypeptide、ＰＳＰ、パンクレアスタチン、h
ＣＧ、hＣＳ、リラキシン、血清胸腺因子、サイモポイ
エチン、サイモシン、ファクターXIII、ファクターVII
I、プロウロキナーゼ、ＳＯＤ、ファクターVIIａ、アン
チトロンビン、アペリンなどの蛋白質およびそれらのム
テイン（天然型の蛋白質に１つ以上のアミノ酸が置換、
欠損または付加し、天然の蛋白質と同等またはそれ以上
の生物学的または免疫学的活性を示すもの）など、ある
いは化学合成などにより製造される公知または新規のペ
プチドなどが挙げられるが、なかでも、遺伝子工学的に
製造されたペプチド（蛋白質を含む）、とりわけ、遺伝
子工学的に製造された成長ホルモン類〔例えば、ヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−
ｈＧＨなど）など〕、ニューロトロフィン−３、ベータ
セルリン、副甲状腺ホルモン、インターロイキン−２、
アペリンおよびそれらのムテイン，特に成長ホルモン類
〔例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−
ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧＨなど）など〕およびそれらのム
テイン、とりわけ成長ホルモン類〔例えば、ヒト成長ホ
ルモン（ｈＧＨ）（例、２０Ｋ−ｈＧＨ、２２Ｋ−ｈＧ
Ｈなど）など〕が好ましく用いられる。前記アペリンと
しては、例えばBiochem. Biophys. Res. Commun.,251,
471-476 (1998)に記載のヒトアペリン−３６、ヒトアペ
リン−１３、アペリン−１３のＮ末端のアミノ酸（Ｇｌ
ｎ）がピログルタミン酸化したペプチドなどがあげら
れ、ＡＰＪ（O'Dowd. B.F., et al., Gene, 436, 355-3
59 (1993)）に対し、リガンド活性を有するペプチドで
あれば、如何なるものであっていてもよく、具体的に
は、例えば特願平１０−２７１６５４号に記載の「配列
番号：３で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
に同一のアミノ酸配列を含有するレセプター蛋白質に結
合能を有するポリペプチド」などが挙げられる。上記し
たペプチド（天然型の蛋白質を含む）は、何れの動物種
由来のものであってもよいが、実用的には、ヒト由来の
ペプチド（蛋白質を含む）が好ましく用いられる。上記
のペプチドは、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニ
ン（Ｍｅｔ）残基または該メチオニン残基のジケトン体
の除去工程に付す前あるいは後にリフォールディング
（活性化、再生化）を行うことができる。
【０００８】本明細書において、Ｎ末端に酸化されてい
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド
またはその塩とは、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式
中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基ま
たはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩
を示す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
のジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、化学反
応または酵素反応等各種反応により得ることができる。
例えば、化学反応により得る方法としては、N末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドま
たはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基移転
反応により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を得る
ことができる（特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−
８１２８５６号））。本明細書において、α−ジケトン
類は、上記したペプチドまたはその塩のアミノ基移転反
応を進行させうるものであれば何れでもよく、例えば式
Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ1は水素またはカルボ
キシル基で置換されていてもよい低級アルキルもしくは
フェニル基（好ましくは水素またはメチル、さらに好ま
しくは水素）を示し、Ｒ2は水酸基、低級アルコキシ基
または低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基
（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合物また
はその塩などが挙げられる。上記式中、Ｒ1で示される
低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、
ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、
ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキル基な
どが挙げられ、Ｒ2で示される低級アルコキシ基として
は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロポキ
シ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−
ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ基な
どが挙げられる。また、Ｒ2で示される低級アルキルで
置換されていてもよいアミノ基としては、前記したＲ1
で示される低級アルキル基を１ないし２個有していても
よいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩としては、
上記したＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するペプチドの塩と同様なものが挙げられる。α−
ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビ
ン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オ
キソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グリオ
キシル酸が好ましく用いられる。α−ジケトン類は塩を
形成していてもよく、ナトリウム塩、カリウム塩などの
アルカリ金属塩、塩酸塩などの無機酸の塩などがあげら
れる。
てもよいメチオニン残基のジケトン体を有するペプチド
またはその塩とは、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式
中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基ま
たはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩
を示す。Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
のジケトン体を有するペプチドまたはその塩は、化学反
応または酵素反応等各種反応により得ることができる。
例えば、化学反応により得る方法としては、N末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチドま
たはその塩をα−ジケトン類と反応させるアミノ基移転
反応により、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を得る
ことができる（特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−
８１２８５６号））。本明細書において、α−ジケトン
類は、上記したペプチドまたはその塩のアミノ基移転反
応を進行させうるものであれば何れでもよく、例えば式
Ｒ1−ＣＯ−ＣＯ−Ｒ2［式中、Ｒ1は水素またはカルボ
キシル基で置換されていてもよい低級アルキルもしくは
フェニル基（好ましくは水素またはメチル、さらに好ま
しくは水素）を示し、Ｒ2は水酸基、低級アルコキシ基
または低級アルキルで置換されていてもよいアミノ基
（好ましくは水酸基）を示す。］で表される化合物また
はその塩などが挙げられる。上記式中、Ｒ1で示される
低級アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、
ｉ−プロピル、ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、
ｔ−ブチルなどの炭素数１ないし６程度のアルキル基な
どが挙げられ、Ｒ2で示される低級アルコキシ基として
は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉ−プロポキ
シ、ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−
ブトキシなどの炭素数１ないし６程度のアルコキシ基な
どが挙げられる。また、Ｒ2で示される低級アルキルで
置換されていてもよいアミノ基としては、前記したＲ1
で示される低級アルキル基を１ないし２個有していても
よいアミノ基などが挙げられる。さらに、塩としては、
上記したＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するペプチドの塩と同様なものが挙げられる。α−
ジケトン類の具体例としては、グリオキシル酸、ピルビ
ン酸、オキサル酢酸、フェニルグリオキシル酸、２−オ
キソグルタル酸などが挙げられるが、なかでも、グリオ
キシル酸が好ましく用いられる。α−ジケトン類は塩を
形成していてもよく、ナトリウム塩、カリウム塩などの
アルカリ金属塩、塩酸塩などの無機酸の塩などがあげら
れる。
【０００９】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類と
のアミノ基転移反応は、通常、ペプチドまたはその塩１
モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００
ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０な
いし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１０
分ないし５時間（好ましくは約２０分ないし２時間）反
応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻
害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよい
が、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。ま
た、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ない
し７、とりわけ、約５ないし６に調整して反応を進行さ
せるのがよい。該アミノ基転移反応を促進するため、遷
移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させるこ
とが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、
０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし
０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ま
しい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu
+，Cu2+）、コバルトイオン（Co2+，Co3+）、ニッケル
イオン（Ni2+，Ni3+）、鉄イオン（Fe2+，Fe3+）、亜鉛
イオン（Zn2+）、アルミニウムイオン（Al3+）、マンガ
ンイオン（Mn2+など）、ガリウムイオン（Ga3+）、イン
ジウムイオン（In3+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、
カルシウムイオン（Ca2+）などを用いることができる
が、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわ
け、銅イオン（Cu2+）が好ましく用いられる。これらの
遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸
などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、
炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加するこ
とができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸
銅が好ましく用いられる。
残基を有するペプチドまたはその塩とα−ジケトン類と
のアミノ基転移反応は、通常、ペプチドまたはその塩１
モルに対して、１ないし１万モル（好ましくは２０００
ないし４０００モル）程度のα−ジケトン類を、約０な
いし７０℃（好ましくは約２０ないし４０℃）で約１０
分ないし５時間（好ましくは約２０分ないし２時間）反
応させるのが好ましい。上記したアミノ基転移反応を阻
害しないものであれば何れの緩衝液（例、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液など）を用いてもよい
が、なかでも、酢酸緩衝液が好ましく用いられる。ま
た、反応のｐＨは、約２ないし９、なかでも、約４ない
し７、とりわけ、約５ないし６に調整して反応を進行さ
せるのがよい。該アミノ基転移反応を促進するため、遷
移金属イオンの存在下にα−ジケトン類を反応させるこ
とが好ましく、通常、α−ジケトン類１モルに対して、
０.００１ないし０.１モル（好ましくは０.０１ないし
０.０５モル）程度の遷移金属イオンを用いるのが好ま
しい。遷移金属イオンとしては、例えば、銅イオン（Cu
+，Cu2+）、コバルトイオン（Co2+，Co3+）、ニッケル
イオン（Ni2+，Ni3+）、鉄イオン（Fe2+，Fe3+）、亜鉛
イオン（Zn2+）、アルミニウムイオン（Al3+）、マンガ
ンイオン（Mn2+など）、ガリウムイオン（Ga3+）、イン
ジウムイオン（In3+）、マグネシウムイオン（Mg2+）、
カルシウムイオン（Ca2+）などを用いることができる
が、なかでも、銅イオン、コバルトイオンなど、とりわ
け、銅イオン（Cu2+）が好ましく用いられる。これらの
遷移金属イオンは、通常、硫酸、硝酸、塩酸、過塩素酸
などの無機酸との塩または酢酸、シュウ酸、クエン酸、
炭酸などの有機酸との塩として、反応溶媒に添加するこ
とができ、なかでも、硫酸銅、酢酸銅、とりわけ、硫酸
銅が好ましく用いられる。
【００１０】また、塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モル
に対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ない
し１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミ
ノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転位反応の際に、Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチ
ドまたはその塩、および該ペプチドまたはその塩のアミ
ノ基転位反応で得られるメチオニン残基のジケトン体を
有するペプチドまたはその塩の沈殿防止などを目的とし
て、該ペプチド，メチオニン残基のジケトン体を有する
ペプチドまたはその塩の種類に応じて、アミノ基転位反
応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。
例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を好まし
くは約１ないし８Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの
濃度になるよう添加することが好ましい。
応させることが好ましく、通常、α−ジケトン類１モル
に対して、０.１ないし２０モル（好ましくは０.５ない
し１０モル）程度の塩基を用いるのが好ましい。塩基と
しては、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン
などのアルキルアミン類、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、
ピリジン、ルチジン、コリジン、４−（ジメチルアミ
ノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香族アミン類など
を用いることができるが、なかでも、ピリジンが好まし
く用いられる。また、アミノ基転位反応の際に、Ｎ末端
に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペプチ
ドまたはその塩、および該ペプチドまたはその塩のアミ
ノ基転位反応で得られるメチオニン残基のジケトン体を
有するペプチドまたはその塩の沈殿防止などを目的とし
て、該ペプチド，メチオニン残基のジケトン体を有する
ペプチドまたはその塩の種類に応じて、アミノ基転位反
応のための緩衝液中に尿素を添加することが好ましい。
例えば、ｈＧＨを用いる場合、緩衝液中に尿素を好まし
くは約１ないし８Ｍ、より好ましくは約３ないし６Ｍの
濃度になるよう添加することが好ましい。
【００１１】さらに、上記したアミノ基転移反応は、遷
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混
合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加
して、アミノ基転移反応を進行させる。該アミノ基転移
反応により得られ、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式
中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基ま
たはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩
（メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩）は、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例
えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィー
などにより、反応溶液から単離・精製することもできる
が、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。ア
ミノ基転移反応で得られたメチオニンのジケトン体を有
するペプチドまたはその塩は、通常、塩基による加水分
解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオ
ニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有し
ていないアミノ酸、ペプチドまたはその塩に変換するこ
とができる。
移金属イオンおよび塩基の存在下にα−ジケトン類を反
応させることが好ましく、実用的には、遷移金属イオ
ン、塩基およびα−ジケトン類の３成分（例えば、硫酸
銅、ピリジンおよびグリオキシル酸など）を含有する混
合液を、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基
を有するペプチドまたはその塩を含有する水溶液に添加
して、アミノ基転移反応を進行させる。該アミノ基転移
反応により得られ、式 CH3-S(O)m-(CH2)2-CO-CO-Ｘ［式
中、ｍは０ないし２の整数を示し、Ｘはアミノ酸残基ま
たはペプチド鎖を示す。]で表される化合物またはその塩
（メチオニン残基のジケトン体を有するペプチドまたは
その塩）は、ペプチドまたは蛋白質の公知精製手段、例
えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィー
などにより、反応溶液から単離・精製することもできる
が、そのまま次の加水分解反応に付すこともできる。ア
ミノ基転移反応で得られたメチオニンのジケトン体を有
するペプチドまたはその塩は、通常、塩基による加水分
解反応に付して、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオ
ニン残基あるいは該メチオニン残基のジケトン体を有し
ていないアミノ酸、ペプチドまたはその塩に変換するこ
とができる。
【００１２】加水分解反応に用いる塩基としては、例え
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−
（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、ト
リレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸
およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フ
ェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニ
レンジアミンなど）、２,３−ジアミノフェノール、４
−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類
（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジ
アミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例え
ば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エ
チル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル
−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
３,４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するペプチドの塩と同様のものなどがあげられ
る。
ば、システアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミ
ンなどのアルキルアミン類またはその塩、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、ピリジン、ルチジン、コリジン、４−
（ジメチルアミノ）ピリジン、イミダゾールなどの芳香
族アミン類またはその塩、ｏ−フェニレンジアミン、ト
リレン−３，４−ジアミン、３,４−ジアミノ安息香酸
およびそのＮ−アルキル置換体（例えば、Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エチル−１，２−フ
ェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル−１，２−フェニ
レンジアミンなど）、２,３−ジアミノフェノール、４
−クロロ−ｏ−フェニレンジアミンなどのジアミン類
（好ましくは芳香族ジアミン類、なかでも、３，４−ジ
アミノ安息香酸およびそのＮ−アルキル置換体（例え
ば、Ｎ−メチル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−エ
チル−１，２−フェニレンジアミン、Ｎ−イソプロピル
−１，２−フェニレンジアミンなど）またはそれらの塩
など、チオセミカルバジド、アセトンチオセミカルバジ
ド、フェニルチオセミカルバジドなどのチオセミカルバ
ジド類、セレノセミカルバジド、アセトンセレノセミカ
ルバジドなどのセレノセミカルバジド類などのアミン類
またはその塩などを用いることができるが、なかでも、
アミン類、とりわけ、ジアミン類またはチオセミカルバ
ジド類またはそれらの塩が好ましく用いられ、特に、
３,４−ジアミノ安息香酸またはその塩が好ましく用い
られる。加水分解反応に用いられる塩基の塩としては、
例えば上記のＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するペプチドの塩と同様のものなどがあげられ
る。
【００１３】塩基の量は、通常、メチオニン残基のジケ
トン体を有するペプチドまたはその塩１モルに対して約
１ないし１万モル、好ましくは約２００ないし３０００
モル、より好ましくは約５００ないし３０００モルであ
る。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好まし
くは約２０ないし４０℃）で約１時間ないし７日間（好
ましくは約１０時間ないし５日間）で進行させるのが好
ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好
ましく、緩衝液としては、例えば、ぎ酸系緩衝液（例え
ば、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ
酸−酢酸ナトリウムなど）などが挙げられる。上記した
加水分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を
用いてもよいが、なかでも、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ
酸−ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸−酢酸ナトリウム緩衝液
が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ない
し９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし
６に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩
衝液は、好ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましく
は約０．５〜６mol/L用いられる。また、加水分解の際
に、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有するペプチドまたはその塩および加水分解
反応により生成する該メチオニン残基を有していないア
ミノ酸，ペプチドまたはその塩の沈殿防止等を目的とし
て、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド、
該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドま
たはその塩の種類に応じて、加水分解反応のための緩衝
液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨ
を用いる場合、緩衝液中に尿素を、好ましくは約１ない
し６Ｍ、より好ましくは約２ないし５Ｍの濃度になるよ
う添加することが好ましい。このようにして得られるア
ミノ酸、ペプチドまたはその塩は、公知の精製手段、例
えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィー
などにより、反応溶液から単離・精製することもできる
が、好ましい例として、例えば、ＳＰ−セファロース
（ファルマシア バイオテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ
−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換クロマトグ
ラフィーなどによる精製法が挙げられる。
トン体を有するペプチドまたはその塩１モルに対して約
１ないし１万モル、好ましくは約２００ないし３０００
モル、より好ましくは約５００ないし３０００モルであ
る。加水分解反応は、通常、約０ないし７０℃（好まし
くは約２０ないし４０℃）で約１時間ないし７日間（好
ましくは約１０時間ないし５日間）で進行させるのが好
ましい。反応には、緩衝液を溶媒として用いることが好
ましく、緩衝液としては、例えば、ぎ酸系緩衝液（例え
ば、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ
酸−酢酸ナトリウムなど）などが挙げられる。上記した
加水分解反応を阻害しないものであれば何れの緩衝液を
用いてもよいが、なかでも、酢酸−ぎ酸ナトリウム、ぎ
酸−ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸−酢酸ナトリウム緩衝液
が好ましく用いられる。また、反応のｐＨは、約２ない
し９、なかでも、約３ないし７、とりわけ、約４ないし
６に調整して、反応を進行させるのがよい。これらの緩
衝液は、好ましくは約０．１〜８mol/L、より好ましく
は約０．５〜６mol/L用いられる。また、加水分解の際
に、Ｎ末端の酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有するペプチドまたはその塩および加水分解
反応により生成する該メチオニン残基を有していないア
ミノ酸，ペプチドまたはその塩の沈殿防止等を目的とし
て、該メチオニン残基のジケトン体を有するペプチド、
該メチオニン残基を有していないアミノ酸，ペプチドま
たはその塩の種類に応じて、加水分解反応のための緩衝
液中に尿素を添加することが好ましい。例えば、ｈＧＨ
を用いる場合、緩衝液中に尿素を、好ましくは約１ない
し６Ｍ、より好ましくは約２ないし５Ｍの濃度になるよ
う添加することが好ましい。このようにして得られるア
ミノ酸、ペプチドまたはその塩は、公知の精製手段、例
えば、抽出、塩析、分配、再結晶、クロマトグラフィー
などにより、反応溶液から単離・精製することもできる
が、好ましい例として、例えば、ＳＰ−セファロース
（ファルマシア バイオテク(株)）あるいは、ＤＥＡＥ
−５ＰＷ（東ソー(株)）を介したイオン交換クロマトグ
ラフィーなどによる精製法が挙げられる。
【００１４】本発明により製造されるペプチドはそのＮ
末端にメチオニンを有さず、また目的とする生理活性ペ
プチド（例えば、天然の生理活性ポリペプチド）と同一
のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、目的
とするペプチド（例えば、天然のポリペプチド）と同様
の活性を有し低毒性で安全に医薬品や診断用薬剤として
使用できる。本発明により、Ｎ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケト
ン体を有するペプチドからＮ末端のメチオニン残基ある
いは該メチオニン残基のジケトン体を特異的に除去する
ことができる。本発明の明細書および図面においてアミ
ノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性
がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
末端にメチオニンを有さず、また目的とする生理活性ペ
プチド（例えば、天然の生理活性ポリペプチド）と同一
のアミノ酸配列を有するものとして得られるので、目的
とするペプチド（例えば、天然のポリペプチド）と同様
の活性を有し低毒性で安全に医薬品や診断用薬剤として
使用できる。本発明により、Ｎ末端に酸化されていても
よいメチオニン残基あるいは該メチオニン残基のジケト
ン体を有するペプチドからＮ末端のメチオニン残基ある
いは該メチオニン残基のジケトン体を特異的に除去する
ことができる。本発明の明細書および図面においてアミ
ノ酸等の略号で表示する場合には、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commission on Biochemical Nomenclature による略号
あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下に示す。またアミノ酸に関して光学異性
がある場合は、特に明示しなければＬ−体を示す。
【００１５】ＳＤＳ ： ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly ： グリシン Ａla ： アラニン Ｖal ： バリン Ｌeu ： ロイシン Ｉle ： イソロイシン Ｓer ： セリン Ｔhr ： スレオニン Ｃys ： システイン Ｍet ： メチオニン Ｇlu ： グルタミン酸 Ｇln ： グルタミン Ａsp ： アスパラギン酸 Ａsn ： アスパラギン Ｌys ： リジン Ａrg ： アルギニン Ｈis ： ヒスチジン Ｐhe ： フェニルアラニン Ｔyr ： チロシン Ｔrp ： トリプトファン Ｐro ： プロリン Ａsx ： Ａsp ＋ Ａsn Ｇlx ： Ｇlu ＋ Ｇln
【００１６】
【発明の実施の形態】以下の参考例および実施例によっ
て本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに
制限されるものではない。
て本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに
制限されるものではない。
【００１７】
【実施例】参考例１（Ｔ７プロモーターを用いたヒト成
長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築） ｈＧＨの構造遺伝子は、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
より、構造遺伝子の開始コドン上流に隣接してＮｄｅ
Ｉ切断部位を持つプライマー、及び始終コドン下流に隣
接してＢａｍＨＩ切断部位を持つプライマーを用いて、
ＰＣＲで増幅して回収した。これにより得られた両端に
制限酵素認識部位が付加したｈＧＨ酵素遺伝子を、ｐＴ
７ＢｌｕｅのＴ−クローニング部位に連結して（ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒ．２、宝酒造株式会
社製）ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した。これを、大腸菌
ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクト
シダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。一
方、以下の方法で発現ベクターを構築した。ｐＢＲ３２
２をＮｄｅ Ｉで切断、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ
ＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ．宝酒造株式会社製）
で末端を平滑化し、再度連結することによって、Ｎｄｅ
Ｉ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作製し
た。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌ II−ＥｃｏＲＶで切断し、約
０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅのＳｃａ
Ｉ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅを作
製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈ
ａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｐＢＲ
３２２のＢａｍ ＨＩ認識部位を欠損させたｐＢＲ３２
２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍ
のＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅ
ｓＮｄｅのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片と連結してテ
トラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣを作製した。テ
トラサイクリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの向きが
逆のものをｐＴＣ１、同じものをｐＴＣ２とした。ｐＴ
７ＨＧＨ−ＮａをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断し
てｈＧＨ構造遺伝子を回収し、ｐＴＣ１のＮｄｅ Ｉ−
Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導
入してアンピシリン耐性で形質転換体を選択、その株よ
り再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＨ
ＧＨ−Ｎａとした。大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージ
のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組換えられているラムダ
ファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その
後、ｈＧＨ発現ベクターｐＴＣＨＧＨ−Ｎａをこの大腸
菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａを得た。なお、ｈＧＨ
の塩基配列は、ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した時点でＡ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＡＤＮＡシーケンサーによっ
て確認した。
長ホルモン（ｈＧＨ）発現ベクターの構築） ｈＧＨの構造遺伝子は、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリ
ー（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ，ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）
より、構造遺伝子の開始コドン上流に隣接してＮｄｅ
Ｉ切断部位を持つプライマー、及び始終コドン下流に隣
接してＢａｍＨＩ切断部位を持つプライマーを用いて、
ＰＣＲで増幅して回収した。これにより得られた両端に
制限酵素認識部位が付加したｈＧＨ酵素遺伝子を、ｐＴ
７ＢｌｕｅのＴ−クローニング部位に連結して（ＤＮＡ
Ｌｉｇａｔｉｏｎ ＫｉｔＶｅｒ．２、宝酒造株式会
社製）ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した。これを、大腸菌
ＪＭ１０９に導入し、アンピシリン耐性とβ−ガラクト
シダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。一
方、以下の方法で発現ベクターを構築した。ｐＢＲ３２
２をＮｄｅ Ｉで切断、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ
ＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ．宝酒造株式会社製）
で末端を平滑化し、再度連結することによって、Ｎｄｅ
Ｉ認識部位を欠損させたｐＢＲｄｅｓＮｄｅを作製し
た。ｐＥＴ３ｃをＢｇｌ II−ＥｃｏＲＶで切断し、約
０．２６ｋｂｐの断片を回収した後、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで末端を平滑化し、ｐＢＲｄｅｓＮｄｅのＳｃａ
Ｉ断片と連結して、ｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅｓＮｄｅを作
製した。また、部位特異的変異導入（Ｑｕｉｃｋ Ｃｈ
ａｎｇｅ，ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により、ｐＢＲ
３２２のＢａｍ ＨＩ認識部位を欠損させたｐＢＲ３２
２ｄｅｓＢａｍを作製した。ｐＢＲ３２２ｄｅｓＢａｍ
のＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片をｐＢＲ／Ｔ７ ｄｅ
ｓＮｄｅのＳｐｈ Ｉ−Ｅｃｏ ＲＶ断片と連結してテ
トラサイクリン耐性発現ベクターｐＴＣを作製した。テ
トラサイクリン耐性遺伝子とＴ７プロモーターの向きが
逆のものをｐＴＣ１、同じものをｐＴＣ２とした。ｐＴ
７ＨＧＨ−ＮａをＮｄｅ Ｉ及びＢａｍ ＨＩで切断し
てｈＧＨ構造遺伝子を回収し、ｐＴＣ１のＮｄｅ Ｉ−
Ｂａｍ ＨＩ断片と連結した後、大腸菌ＪＭ１０９に導
入してアンピシリン耐性で形質転換体を選択、その株よ
り再度プラスミドを回収して、発現プラスミドｐＴＣＨ
ＧＨ−Ｎａとした。大腸菌ＭＭ２９４を、Ｔ７ファージ
のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組換えられているラムダ
ファージ（スチュディエ、スプラ）で溶原化した。その
後、ｈＧＨ発現ベクターｐＴＣＨＧＨ−Ｎａをこの大腸
菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａを得た。なお、ｈＧＨ
の塩基配列は、ｐＴ７ＨＧＨ−Ｎａを作製した時点でＡ
ＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＡＤＮＡシーケンサーによっ
て確認した。
【００１８】参考例２（大腸菌でのメチオニン残基を有
するｈＧＨ（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）の発現） 参考例１で得た形質転換細胞を、５ｍｇ／Ｌのテトラサ
イクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母
エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２
リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養し
た。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−
６２５（消泡剤：三洋化成工業製）および５ｍｇ／Ｌの
テトラサイクリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込
んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間
通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発
酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％
リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、
０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウ
ム、０．０５％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００
５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、３．０％ハイケ
ースアミノ、１．０％酵母エキス）を仕込んだ５００リ
ットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開
始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になっ
た時点で１７．８５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＱ）を添加し、さら
に２４リットルの３０％ブドウ糖を添加しながら培養を
続け、５時間後に培養液を遠心分離して、約１２．３ｋ
ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。上記の形質
転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎ
ａ）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５４６として平成
９年１２月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６８８８として平成１１年９月２４日に国際寄
託に移管された。また、上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２
９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号Ｉ
ＦＯ １６１２４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に平成９年１０月１６日に寄託されている。
するｈＧＨ（Ｍｅｔ−ｈＧＨ）の発現） 参考例１で得た形質転換細胞を、５ｍｇ／Ｌのテトラサ
イクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母
エキス、０．５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２
リットル容フラスコ中で３０℃、１６時間振とう培養し
た。得られた培養液を、０．０２％ニューポールＬＢ−
６２５（消泡剤：三洋化成工業製）および５ｍｇ／Ｌの
テトラサイクリンを含む２０リットルのＬＢ培地を仕込
んだ５０リットル容発酵槽へ移植して、３７℃、６時間
通気撹拌培養した。この培養液を３６０リットルの主発
酵培地（１．６８％リン酸一水素ナトリウム、０．３％
リン酸二水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、
０．０５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウ
ム、０．０５％ニューポールＬＢ−６２５、０．０００
５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、３．０％ハイケ
ースアミノ、１．０％酵母エキス）を仕込んだ５００リ
ットル容発酵槽に移植して、３７℃で通気撹拌培養を開
始した。培養液の濁度が約１２００クレット単位になっ
た時点で１７．８５ｍｇ／Ｌ分のイソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＱ）を添加し、さら
に２４リットルの３０％ブドウ糖を添加しながら培養を
続け、５時間後に培養液を遠心分離して、約１２．３ｋ
ｇの湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。上記の形質
転換大腸菌（ＭＭ２９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎ
ａ）は、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６５４６として平成
９年１２月１０日に通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６８８８として平成１１年９月２４日に国際寄
託に移管された。また、上記の形質転換大腸菌（ＭＭ２
９４（ＤＥ３），ｐＴＣＨＧＨ−Ｎａ）は、受託番号Ｉ
ＦＯ １６１２４として財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）
に平成９年１０月１６日に寄託されている。
【００１９】実施例１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化） 参考例２で得られた菌体２ｋｇに５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）６リット
ルを加えて菌体を溶解してから超音波破砕器（ソニファ
イアー４５０、ブランソン社）を用いて破砕処理を行っ
た後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行
った。得られた上澄液６リットルに５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．
７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）１８リットルを加えてｐ
Ｈ８．０に調整した後、４℃で４日間活性化を行った。
ｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）６リット
ルを加えて菌体を溶解してから超音波破砕器（ソニファ
イアー４５０、ブランソン社）を用いて破砕処理を行っ
た後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１２０分間）を行
った。得られた上澄液６リットルに５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、０．２８ｍＭＧＳＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．
７Ｍアルギニン（ｐＨ８．０）１８リットルを加えてｐ
Ｈ８．０に調整した後、４℃で４日間活性化を行った。
【００２０】実施例２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの精製） 実施例１で活性化の終了した再生液をペリコンカセット
システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら
電気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行っ
た後、得られた濃縮液５リットルに５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）を加えて５０リットルに希釈後４℃に
一晩静置した。ついで、連続遠心分離（ＪＣＦ−Ｚロー
タ、ベックマン社）を行い、得られた上清５０リットル
に１０Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．１２に調整
した後ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポ
ア社）で濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）に置換後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）
を行い上清を得た。ついでこの液を２０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｍカラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に
吸着させ、十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出を行
い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として９５リットルの溶出液を
得た。さらに、この溶出液をペリコンカセットシステム
（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、２０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換し、１
２．２１グラムのＭｅｔ−ｈＧＨを得た。
システム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら
電気伝導度が１０ｍＳ以下になるまで脱塩、濃縮を行っ
た後、得られた濃縮液５リットルに５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．０）を加えて５０リットルに希釈後４℃に
一晩静置した。ついで、連続遠心分離（ＪＣＦ−Ｚロー
タ、ベックマン社）を行い、得られた上清５０リットル
に１０Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ７．１２に調整
した後ペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポ
ア社）で濃縮し、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）に置換後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０分）
を行い上清を得た。ついでこの液を２０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール
６５０Ｍカラム（２０ｃｍφ×８４ｃｍ、東ソー社）に
吸着させ、十分に洗浄した後、２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）で溶出を行
い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として９５リットルの溶出液を
得た。さらに、この溶出液をペリコンカセットシステム
（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で濃縮、脱塩し、２０ｍＭ
トリス／ＨＣｌ、６Ｍ尿素（ｐＨ８．０）に置換し、１
２．２１グラムのＭｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００２１】実施例３（Ｎ末端メチオニン残基（Ｎ末端
Ｍｅｔ）の除去） 実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１８００ミリリット
ルに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％
ピリジン溶液４５０ミリリットルを加えよく撹拌した後
２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０ｍＭトリス
／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１２５
ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に３リットル／ｈの
流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メ
チオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として
４．２リットルの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ
酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４
８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０．８リットル
中によく撹拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌
しながら３日間反応させた。反応後、この溶液をペリコ
ンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で１４
リットルに濃縮し、７リットルずつ２回に分けて２０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡
化したセファデックスＧ−２５カラム（２５．２ｃｍφ
×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に６リットル
／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分２０リットルを集め
た。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰ
ＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、３２０ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨ画分５．８４リットルを得た。このｈＧＨ画
分に１０ＭＮａＯＨ溶液を１６ミリリットル加えてｐＨ
７．１に調整後、８回に分けて高速液体クロマトグラフ
法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）によるク
ロマトグラフィーを行った。所定量の濃縮液をＰＯＲＯ
Ｓ２０Ｒ１カラム（５ｃｍ×６０ｃｍ、日本パーセプテ
ィブ社）に通液吸着させた後、Ａ＝２５％ｎ−フ゜ロハ゜ノール
＋７５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、Ｂ＝
３５％ｎ−フ゜ロハ゜ノール＋６５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）とによる５０〜８５％Ｂの濃度勾配で、
１５０分間、５０ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨ画分として３４．７リットルの溶出液を得
た。この溶出液に蒸留水を加えて２００リットルに希釈
してからペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリ
ポア社）で５リットルに濃縮後更に、高速液体クロマト
グラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）に
より、この溶液を３回に分けてＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
（１０．８ｃｍ×２０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させ
た後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐ
Ｈ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリ
ノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）
とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、８０
ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１６
１６ミリリットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａ
ＯＨ溶液を２ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、
限外ろ過装置（オメガ膜、富士フィルター社）で濃縮
し、濃縮液０．４リットルを得た。この濃縮液を蒸留水
で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１．３
ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に２リ
ットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分を得た。更
に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過
し、ｈＧＨ溶液２３９１ミリリットル（４６３８ミリグ
ラムのｈＧＨ）を得た。
Ｍｅｔ）の除去） 実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１８００ミリリット
ルに２．５Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％
ピリジン溶液４５０ミリリットルを加えよく撹拌した後
２５℃で６０分間反応させた。次いで、２０ｍＭトリス
／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム（１１．３ｃｍφ×１２５
ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に３リットル／ｈの
流速で通液し、平衡化と同じ緩衝液を用いて展開し、メ
チオニン残基のジケトン体を有するｈＧＨ画分として
４．２リットルの溶出液を得た。この溶出液を１．２Ｍ
酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウム、３．６Ｍ尿素溶液、４
８ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液２０．８リットル
中によく撹拌しながら加えた後、３０℃でゆっくり攪拌
しながら３日間反応させた。反応後、この溶液をペリコ
ンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で１４
リットルに濃縮し、７リットルずつ２回に分けて２０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡
化したセファデックスＧ−２５カラム（２５．２ｃｍφ
×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に６リットル
／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分２０リットルを集め
た。ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰ
ＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡ
Ｅ−５ＰＷカラム（２１ｃｍ×３０ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、３２０ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨ画分５．８４リットルを得た。このｈＧＨ画
分に１０ＭＮａＯＨ溶液を１６ミリリットル加えてｐＨ
７．１に調整後、８回に分けて高速液体クロマトグラフ
法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）によるク
ロマトグラフィーを行った。所定量の濃縮液をＰＯＲＯ
Ｓ２０Ｒ１カラム（５ｃｍ×６０ｃｍ、日本パーセプテ
ィブ社）に通液吸着させた後、Ａ＝２５％ｎ−フ゜ロハ゜ノール
＋７５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、Ｂ＝
３５％ｎ−フ゜ロハ゜ノール＋６５％５０ｍＭトリス／ＨＣｌ
（ｐＨ８．５）とによる５０〜８５％Ｂの濃度勾配で、
１５０分間、５０ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨ画分として３４．７リットルの溶出液を得
た。この溶出液に蒸留水を加えて２００リットルに希釈
してからペリコンカセットシステム（ＰＴＧＣ膜、ミリ
ポア社）で５リットルに濃縮後更に、高速液体クロマト
グラフ法（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）に
より、この溶液を３回に分けてＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
（１０．８ｃｍ×２０ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させ
た後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐ
Ｈ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−モルホリ
ノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）
とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分間、８０
ミリリットル／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ画分１６
１６ミリリットルを得た。このｈＧＨ画分に１０ＭＮａ
ＯＨ溶液を２ミリリットル加えてｐＨ７．１に調整後、
限外ろ過装置（オメガ膜、富士フィルター社）で濃縮
し、濃縮液０．４リットルを得た。この濃縮液を蒸留水
で平衡化したセファクリルＳ−１００カラム（１１．３
ｃｍφ×５０ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に２リ
ットル／ｈの流速で通液、展開しｈＧＨ画分を得た。更
に、この溶液をミリパック６０（ミリポア社）でろ過
し、ｈＧＨ溶液２３９１ミリリットル（４６３８ミリグ
ラムのｈＧＨ）を得た。
【００２２】実施例４（ｈＧＨの特徴決定） （ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた
分析 実施例３で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサ
ンプルバッファ［Laemmli,Nature,227,680(1979)］を等
量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲ
ル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳
動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー(Coomass
ie Brilliant Blue)で染色した結果、約２２ＫＤａに単
一のバンドが認められたことから、精製ｈＧＨは単一で
あることが確認された（図１）。 （ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パ
ーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデ
ル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈ
ＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推
定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表
１）。
分析 実施例３で得られたｈＧＨに１００ｍＭＤＴＴを含むサ
ンプルバッファ［Laemmli,Nature,227,680(1979)］を等
量加えてよく撹拌し、９５℃で２分間加熱後、マルチゲ
ル１０／２０（第一化学薬品）で電気泳動を行った。泳
動後のゲルをクマシー・ブリリアント・ブルー(Coomass
ie Brilliant Blue)で染色した結果、約２２ＫＤａに単
一のバンドが認められたことから、精製ｈＧＨは単一で
あることが確認された（図１）。 （ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パ
ーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデ
ル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られたｈ
ＧＨのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配列から推
定されたｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表
１）。
【表１】 （ｃ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日
立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのア
ミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ
酸組成と一致した（表２）。
立）を用いて決定した。その結果、得られたｈＧＨのア
ミノ酸組成はｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ
酸組成と一致した（表２）。
【表２】 （ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（Ｌ−８５００Ａ，日
立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ
酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸
と一致した（表３）。
立）を用いて決定した。得られたｈＧＨのＣ末端アミノ
酸はｃＤＮＡの塩基配列から推定されたＣ末端アミノ酸
と一致した（表３）。
【表３】
【００２３】実施例５（ｈＧＨの活性測定） 実施例３で得られた精製ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・
メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対
する増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショ
ナル社、Temecula,California,USA）と同等であった。
ル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・
メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８０）］に対
する増殖促進効果は、標準品（ケミコンインターナショ
ナル社、Temecula,California,USA）と同等であった。
【００２４】実施例６（Ｎ末端Ｍｅｔの除去） 実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈ
ＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリット
ルに希釈した。この希釈液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸
ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した
後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２
０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×
３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。
ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣ
システム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−
５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨを得た。
ＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリット
ルに希釈した。この希釈液に等量の４Ｍ酢酸、４Ｍ酢酸
ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した
後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２
０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×
３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。
ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣ
システム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−
５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨを得た。
【００２５】実施例７（Ｎ末端Ｍｅｔの除去） 実施例３で得たメチオニン残基のジケトン体を有するｈ
ＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリット
ルに希釈した。この希釈液に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍぎ酸
ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した
後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２
０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×
３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。
ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣ
システム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−
５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨを得た。
ＧＨ画分０．４ミリリットルに２０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えて２ミリリット
ルに希釈した。この希釈液に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍぎ酸
ナトリウム、６Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ Ｎ−メチル−
１，２−フェニレンジアミン溶液を加え、よく攪拌した
後３０℃で２０時間反応させた。反応後、この溶液を２
０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１ｃｍφ×
３０ｃｍ、ファルマシア社）に６０ミリリットル／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１０ミリリットルを集めた。
ついで、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣ
システム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−
５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に
通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．
５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−
(Ｎ−モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素
（ｐＨ４．０）とによる７０〜８５％ＢのｐＨ勾配で、
７０分間、７．５ミリリットル／分の流速で溶出を行
い、ｈＧＨを得た。
【００２６】実施例８（Ｎ末端Ｍｅｔの除去) 実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５
Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶
液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間
反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化
と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケト
ン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得
た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウ
ム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息
香酸溶液４９．５ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、
３７℃でゆっくり攪拌しながら２４時間反応させた。反
応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ
８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク
社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１５
０ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法
（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、こ
の溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５
ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭト
リス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０
ｍＭ ＭＥＳ［2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸］＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０−８５％Ｂの
ｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を
行い、６．７ｍｇのｈＧＨを得た。
Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶
液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間
反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化
と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケト
ン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得
た。この溶出液を１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸ナトリウ
ム、３．６Ｍ尿素溶液、４８ｍＭ３，４−ジアミノ安息
香酸溶液４９．５ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、
３７℃でゆっくり攪拌しながら２４時間反応させた。反
応後、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ
８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（４．６ｃｍφ×６０ｃｍ、ファルマシアバイオテク
社）に５００ｍｌ／ｈの流速で通液し、ｈＧＨ画分１５
０ｍｌを集めた。ついで、高速液体クロマトグラフ法
（ギルソンＨＰＬＣシステム、ギルソン社）により、こ
の溶液をＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２．１５ｃｍ×１５
ｃｍ、東ソー社）に通液吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭト
リス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０
ｍＭ ＭＥＳ［2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸］＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ４．０）とによる７０−８５％Ｂの
ｐＨ勾配で、７０分間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を
行い、６．７ｍｇのｈＧＨを得た。
【００２７】実施例９（Ｎ末端Ｍｅｔの除去) 実施例２で得たＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１．８ｍｌに２．５
Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶
液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間
反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化
と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケト
ン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得
た。この溶出液を２Ｍぎ酸、１０Ｍぎ酸ナトリウム、６
Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液１
０ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３０℃でゆっく
り攪拌しながら３日間反応させた。反応後、２０ｍＭト
リス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０
ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１００ｍｌを集めた。つい
で、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシス
テム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液
吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ
尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−
モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ
４．０）とによる７０−８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分
間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．０ｍｇの
ｈＧＨを得た。
Ｍグリオキシル酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶
液０．４５ｍｌを加えよく攪拌した後２５℃で６０分間
反応させた。ついで、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４．０
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１．５ｃｍφ×３０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に１００ｍｌ／ｈの流速で通液し、平衡化
と同じ緩衝液を用いて展開し、メチオニン残基のジケト
ン体を有するｈＧＨ画分として１０ｍｌの溶出液を得
た。この溶出液を２Ｍぎ酸、１０Ｍぎ酸ナトリウム、６
Ｍ尿素溶液、８０ｍＭ３，４−ジアミノ安息香酸溶液１
０ｍｌ中によく攪拌しながら加えた後、３０℃でゆっく
り攪拌しながら３日間反応させた。反応後、２０ｍＭト
リス／ＨＣｌ、４．０Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化し
たセファデックスＧ−２５カラム（４．６ｃｍφ×６０
ｃｍ、ファルマシアバイオテク社）に５００ｍｌ／ｈの
流速で通液し、ｈＧＨ画分１００ｍｌを集めた。つい
で、高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨＰＬＣシス
テム、ギルソン社）により、この溶液をＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗカラム（２．１５ｃｍ×１５ｃｍ、東ソー社）に通液
吸着させた後、Ａ＝５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋２．５Ｍ
尿素（ｐＨ８．０）、Ｂ＝５０ｍＭＭＥＳ［２−(Ｎ−
モルホリノ)エタンスルホン酸］＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ
４．０）とによる７０−８５％ＢのｐＨ勾配で、７０分
間、７．５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、６．０ｍｇの
ｈＧＨを得た。
【００２８】実施例１０（メチオニン残基を有する２０
Ｋ−ｈＧＨ（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ）の活性化) 特開平１０−２３４３８６号の参考例２記載の方法で得
られた菌体４０ｇにＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）
１００ミリリットルを加えて懸濁した後、５分間、超音
波破砕（ブランソン社）を行い菌体を破砕した。菌体破
砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）して上
清を廃棄し、封入体を得た。この封入体に５０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）
２リットルを加えて封入体を溶解後、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上清液２
リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳ
ＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ
８．０）２４リットルを加えて、４℃で１日間活性化を
行った。
Ｋ−ｈＧＨ（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ）の活性化) 特開平１０−２３４３８６号の参考例２記載の方法で得
られた菌体４０ｇにＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）
１００ミリリットルを加えて懸濁した後、５分間、超音
波破砕（ブランソン社）を行い菌体を破砕した。菌体破
砕液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０分間）して上
清を廃棄し、封入体を得た。この封入体に５０ｍＭトリ
ス／ＨＣｌ、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．０）
２リットルを加えて封入体を溶解後、遠心分離（１００
００ｒｐｍ、１２０分間）を行った。得られた上清液２
リットルに５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．２８ｍＭＧＳ
ＳＧ、１．４ｍＭＧＳＨ、０．７Ｍアルギニン（ｐＨ
８．０）２４リットルを加えて、４℃で１日間活性化を
行った。
【００２９】実施例１１（Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨの精
製） 実施例１０で活性化の終了した液をミニタン限外濾過シ
ステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で２０ｍＭトリス／
ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気
伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下になるまで脱塩、濃縮を行
った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、２０分間）し、濃縮液の上清１５０ミリリットルを
得た。ついでこの液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５
Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化
したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ
10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十
分に洗浄した後、０〜０．１８Ｍ塩化ナトリウムの濃度
勾配により流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、
Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分として２８ミリリットルの
溶出液を得た。さらにこの画分をセントリプラス−１０
（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、濃縮液１５ミリリ
ットルを得た。この液を再度、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．
２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラ
ム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に
吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．
２）及びＢ＝５０ｍＭＭＥＳ[2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、
２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）と
による０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．
０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈ
ＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍト
リス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加え
てｐＨを７．２に調整し、セントリプラス−１０（ミリ
ポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリット
ルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperd
exTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・
バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢ
Ｓで溶出し、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリ
ットルを得た。
製） 実施例１０で活性化の終了した液をミニタン限外濾過シ
ステム（ＰＴＧＣ膜、ミリポア社）で２０ｍＭトリス／
ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）を加えながら電気
伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下になるまで脱塩、濃縮を行
った後、得られた濃縮液を遠心分離（１００００ｒｐ
ｍ、２０分間）し、濃縮液の上清１５０ミリリットルを
得た。ついでこの液を５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５
Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．２）で平衡化
したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ
10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に吸着させ、十
分に洗浄した後、０〜０．１８Ｍ塩化ナトリウムの濃度
勾配により流速３．０ミリリットル／分で溶出を行い、
Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分として２８ミリリットルの
溶出液を得た。さらにこの画分をセントリプラス−１０
（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、濃縮液１５ミリリ
ットルを得た。この液を再度、５０ｍＭトリス／ＨＣ
ｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニトリル（ｐＨ８．
２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose 16/10 HPカラ
ム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシア・バイオテク社）に
吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ８．
２）及びＢ＝５０ｍＭＭＥＳ[2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸]、
２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリル（ｐＨ４．０）と
による０〜１００％ＢのｐＨ勾配で６０分間、流速３．
０ミリリットル／分で溶出を行い、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈ
ＧＨ画分１２ミリリットルを得た。この溶出液に２Ｍト
リス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を０．６ミリリットル加え
てｐＨを７．２に調整し、セントリプラス−１０（ミリ
ポア社）で濃縮を行った。この濃縮液０．５ミリリット
ルを１０％エタノールを含むＰＢＳで平衡化したSuperd
exTM 75 HR 10/30（1.0 cmΦx 30 cm、ファルマシア・
バイオテク社）に添加し、１０％エタノールを含むＰＢ
Ｓで溶出し、Ｍｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画分７．５ミリリ
ットルを得た。
【００３０】実施例１２（Ｎ末端Ｍｅｔの除去） 実施例１１によって得たＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ溶液６
ミリリットルを２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（１０ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク
社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画
分を集め、更に限外濾過システム（ダイアフローメンブ
レンＹＭ１０、２５ｍｍ、アミコン社）を使って２ミリ
リットルに濃縮した。この溶液に２．５Ｍグリオキシル
酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．５ミリリ
ットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させ
た。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に通液し、メチオニン残基のジケトン体を
有する２０Ｋ−ｈＧＨ画分として４ミリリットルの溶出
液を集めた。この溶出液に１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸
ナトリウム、３．６Ｍ尿素、４８ｍＭ３，４−ジアミノ
安息香酸溶液２０ミリリットルを加えよく撹拌した後３
０℃で６５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５カラム（２０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファル
マシアバイオテク社）に通液し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分を
集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨ
ＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を５０
ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニト
リル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose
16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシアバイ
オテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリ
ル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭ ＭＥＳ[２−(Ｎ−
モルホリノ)エタンスルホン酸]、２.５Ｍ尿素、１０％
アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％Ｂ
のｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で
溶出を行い、２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得
た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を
０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整した後、
セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。
この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含
むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cm
Φx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、
１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、２０Ｋ−ｈＧ
Ｈ画分７．５ミリリットルを得た。
ミリリットルを２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、８Ｍ尿素（ｐ
Ｈ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（１０ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ、ファルマシアバイオテク
社）に通液し、溶出してきたＭｅｔ−２０Ｋ−ｈＧＨ画
分を集め、更に限外濾過システム（ダイアフローメンブ
レンＹＭ１０、２５ｍｍ、アミコン社）を使って２ミリ
リットルに濃縮した。この溶液に２．５Ｍグリオキシル
酸、４０ｍＭ硫酸銅、５０％ピリジン溶液０．５ミリリ
ットルを加えよく撹拌した後２５℃で６０分間反応させ
た。次いで、この反応液を２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、４
Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファルマシアバ
イオテク社）に通液し、メチオニン残基のジケトン体を
有する２０Ｋ−ｈＧＨ画分として４ミリリットルの溶出
液を集めた。この溶出液に１．２Ｍ酢酸、２．４Ｍぎ酸
ナトリウム、３．６Ｍ尿素、４８ｍＭ３，４−ジアミノ
安息香酸溶液２０ミリリットルを加えよく撹拌した後３
０℃で６５時間反応した。反応後、２０ｍＭトリス／Ｈ
Ｃｌ、４Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したセファデッ
クスＧ−２５カラム（２０ｍｍＩＤｘ４０ｃｍ、ファル
マシアバイオテク社）に通液し、２０Ｋ−ｈＧＨ画分を
集めた後、更に高速液体クロマトグラフ法（ギルソンＨ
ＰＬＣシステム、ギルソン社）により、この溶液を５０
ｍＭトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素／１０％アセトニト
リル（ｐＨ８．２）で平衡化したHiLoadTM Q Sepharose
16/10 HPカラム（1.6cmΦｘ10 cm、ファルマシアバイ
オテク社）に吸着させ、十分に洗浄した後、Ａ＝５０ｍ
Ｍトリス／ＨＣｌ、２．５Ｍ尿素、１０％アセトニトリ
ル（ｐＨ８．２）及びＢ＝５０ｍＭ ＭＥＳ[２−(Ｎ−
モルホリノ)エタンスルホン酸]、２.５Ｍ尿素、１０％
アセトニトリル（ｐＨ４．０）とによる０〜１００％Ｂ
のｐＨ勾配で６０分間、流速３．０ミリリットル／分で
溶出を行い、２０Ｋ−ｈＧＨ画分１２ミリリットルを得
た。この溶出液に２Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．８）を
０．６ミリリットル加えてｐＨを７．２に調整した後、
セントリプラス−１０（ミリポア社）で濃縮を行った。
この濃縮液０．５ミリリットルを１０％エタノールを含
むＰＢＳで平衡化したSuperdexTM 75 HR 10/30（1.0 cm
Φx 30 cm、ファルマシア・バイオテク社）に添加し、
１０％エタノールを含むＰＢＳで溶出し、２０Ｋ−ｈＧ
Ｈ画分７．５ミリリットルを得た。
【００３１】実施例１３（２０Ｋ−ｈＧＨの特徴決定） （ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（パ
ーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデ
ル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られた２
０Ｋ−ｈＧｈのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配
列から推定された２０Ｋ−ｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列
と一致した（表４）。
ーキンエルマー・アプライドバイオシステムズ社、モデ
ル４７７Ａ）を用いて決定した。その結果、得られた２
０Ｋ−ｈＧｈのＮ末端アミノ酸配列はｃＤＮＡの塩基配
列から推定された２０Ｋ−ｈＧＨのＮ末端アミノ酸配列
と一致した（表４）。
【表４】 （ｂ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（システム６３００，ベ
ックマン社）を用いて決定した。その結果、実施例１２
で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのアミノ酸組成は２０Ｋ−ｈ
ＧＨのｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成
と一致した（表５）。
ックマン社）を用いて決定した。その結果、実施例１２
で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのアミノ酸組成は２０Ｋ−ｈ
ＧＨのｃＤＮＡの塩基配列から推定されるアミノ酸組成
と一致した（表５）。
【表５】
【００３２】実施例１４（２０Ｋ−ｈＧＨの活性測定） 実施例１２で得られた２０Ｋ−ｈＧＨのＮｂ２細胞［ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・ア
ンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８
０）］に対する増殖促進効果のあることを確認した。
ャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・ア
ンド・メタボリズム、５１巻、１０５８頁（１９８
０）］に対する増殖促進効果のあることを確認した。
【００３３】実施例１５ （メチオニン残基を有するヒトＢＴＣ（ヒトＭｅｔ−Ｂ
ＴＣ）の製造）特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０
５５５７８５号）の実施例４〜６、８および１３に記載
の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣを製
造した。 （大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコード
する０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開
平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の
実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ１５１５から単離し
た。ＡＴＧ翻訳開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧ
Ｇ−３’；５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を
有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６
巻、１２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐ
ＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構
築した。ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８
７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１０−
１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）ま
で）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプ
ラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリ
ゴヌクレオチド（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡ
ＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用い
てＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。生
成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２．０％ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５Ｋ
ｂＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの
下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐ
ＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−
Ａ−０５５５７８５号）の図１３参照）。 （大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴＣの発現）大腸菌ＭＭ２
９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組
み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプ
ラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐＬｙｓＳをこ
の大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌体に上記参
考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、大
腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１
６を得た。この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フ
ラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培
養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一
水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．
１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、
０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．
０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミ
ン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込ん
だ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌
培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位
になった時点で、１００ｍｇ／リットル分のイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添
加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。
この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を
得、−８０℃に凍結保存した。この形質転換大腸菌ＭＭ
２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として平成４年４月２
１日に通商産業省工業技術院生命工学工業研究所（ＮＩ
ＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １５２８２と
して平成４年４月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託されている。上述の方法により取得したＮ末
端にメチオニン残基を有するヒトベータセルリン（Ｍｅ
ｔ−ＢＴＣ）１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した
後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．２５ｍｌ、グリオキシル酸
０．２５ｇ、ピリジン 0.５ｍｌの混合液を加え、２５
℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿
素＋５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液
し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、
メチオニン残基のジケトン体を有するＢＴＣ画分をプー
ルした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナ
トリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ
安息香酸を４０ｍＭ濃度になるよに添加して、脱気、窒
素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終
了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×60
0mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分
の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していない
ＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ
６．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ Ｎ
ａＣＬ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ
−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着し
た後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋
０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段
階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、Ｂ
ＴＣ画分をプールした。さらに、ＢＴＣ画分を０．１％
ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭
和電工（株））に吸着した後、２０−６０％Ｂ（Ｂ＝８
０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４
０分間、２ml/分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクシ
ョンをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約２．６
ｍｇを得た。
ＴＣ）の製造）特開平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０
５５５７８５号）の実施例４〜６、８および１３に記載
の方法に準じて、下記の方法でヒトＭｅｔ−ＢＴＣを製
造した。 （大腸菌のヒトＢＴＣｃＤＮＡ発現プラスミドの構築）
ヒト・プロＢＴＣ（１−１４７アミノ酸残基）をコード
する０．６ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、特開
平６−８７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の
実施例５に記載のプラスミドｐＴＢ１５１５から単離し
た。ＡＴＧ翻訳開始コドン（５’−ＴＡＴＧＧＡＴＧＧ
Ｇ−３’；５’−ＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡ−３’）を
有する合成アダプターを上記０．６Ｋｂ断片のＥｃｏＲ
Ｉ部位に連結した後、生成した０．６Ｋｂ ＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、Ｔ７プロモーター（Ｇｅｎｅ、５６
巻、１２５頁（１９８７年））を含有するプラスミドｐ
ＥＴ−３ｃ中へ挿入し、プラスミドｐＴＢ１５０５を構
築した。ヒトＢＴＣの８０アミノ酸残基（特開平６−８
７８９４号（ＥＰ−Ａ−０５５５７８５号）の図１０−
１〜図１０−２の１（Ａｓｐ）から８０（Ｔｙｒ）ま
で）をコードするＤＮＡ断片を得るため、鋳型としてプ
ラスミドｐＴＢ１５０５、プライマーとして２個のオリ
ゴヌクレオチド（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＣＡ−３’；５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡ
ＧＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＣＴＣＴ−３’）を用い
てＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行った。生
成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２．０％ア
ガロースゲル電気泳動で分画し、目的とする０．２５Ｋ
ｂＤＮＡ断片を単離した。この０．２５ＫｂＮｄｅＩ−
ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−３ｃのＴ７プロモーターの
下流にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結しプラスミドｐ
ＴＢ１５１６を得た（特開平６−８７８９４号（ＥＰ−
Ａ−０５５５７８５号）の図１３参照）。 （大腸菌でのヒトＭｅｔ−ＢＴＣの発現）大腸菌ＭＭ２
９４を、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子で組
み換えられているラムダファージ（スチュディエ、スプ
ラ）で溶原化した。その後、プラスミドｐＬｙｓＳをこ
の大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）へ導入し、大腸菌ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳを得た。この菌体に上記参
考例で得られたプラスミドｐＴＢ１５１６を導入し、大
腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１
６を得た。この形質転換細胞を、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンと１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含
むＬＢ培地（１％ペプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％塩化ナトリウム）１リットルを含む２リットル容フ
ラスコ中で３７℃、８時間振とう培養した。得られた培
養液を１９リットルの主発酵培地（１．６８％リン酸一
水素ナトリウム、０．３％リン酸二水素カリウム、０．
１％塩化アンモニウム、０．０５％塩化ナトリウム、
０．０５％硫酸マグネシウム、０．０２％消泡剤、０．
０００２５％硫酸第一鉄、０．０００５％塩酸チアミ
ン、１．５％ブドウ糖、１．５％カザミノ酸）を仕込ん
だ５０リットル容発酵槽へ移植して、３０℃で通気撹拌
培養を開始した。培養液の濁度が約５００クレット単位
になった時点で、１００ｍｇ／リットル分のイソプロピ
ル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添
加し、さらに培養を続け、７時間後に培養を終了した。
この培養終了液を遠心分離して、約３４０ｇの湿菌体を
得、−８０℃に凍結保存した。この形質転換大腸菌ＭＭ
２９４（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ，ｐＴＢ１５１６は、受
託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８３６として平成４年４月２
１日に通商産業省工業技術院生命工学工業研究所（ＮＩ
ＢＨ）に寄託され、また受託番号ＩＦＯ １５２８２と
して平成４年４月１６日に財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）に寄託されている。上述の方法により取得したＮ末
端にメチオニン残基を有するヒトベータセルリン（Ｍｅ
ｔ−ＢＴＣ）１０ｍｇを３Ｍ尿素溶液４ｍｌに溶解した
後、８０ｍＭ硫酸銅 ０．２５ｍｌ、グリオキシル酸
０．２５ｇ、ピリジン 0.５ｍｌの混合液を加え、２５
℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿
素＋５０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５カラム（25mmID×600mmL）に通液
し、平衡化に用いた溶液を６ｍｌ／分の流速で展開し、
メチオニン残基のジケトン体を有するＢＴＣ画分をプー
ルした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナ
トリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、３、４−ジアミノ
安息香酸を４０ｍＭ濃度になるよに添加して、脱気、窒
素ガスシールを行い、２５℃で５日間反応した。反応終
了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×60
0mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分
の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していない
ＢＴＣ画分をプールした。プールしたＢＴＣ画分をｐＨ
６．０に調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．１Ｍ Ｎ
ａＣＬ＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ
−５ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着し
た後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋
０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段
階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、Ｂ
ＴＣ画分をプールした。さらに、ＢＴＣ画分を０．１％
ＴＦＡで平衡化したＣ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭
和電工（株））に吸着した後、２０−６０％Ｂ（Ｂ＝８
０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４
０分間、２ml/分の流速で溶出した。ＢＴＣのフラクシ
ョンをプールした後、凍結乾燥を行い、ＢＴＣ約２．６
ｍｇを得た。
【００３４】実施例１６（ＢＴＣの特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分
析 実施例１５で得られたＢＴＣをSample buffer［Laemml
i,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１分
間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品
（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシ
ーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染
色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品は
ほぼ単一であった（図２）。 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アフ゜
ライト゛ハ゛イオシステム モテ゛ル477A)を用いて決定した。その結果、
得られたＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列から推定したＢＴ
ＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表６）。
析 実施例１５で得られたＢＴＣをSample buffer［Laemml
i,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１分
間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品
（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシ
ーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染
色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品は
ほぼ単一であった（図２）。 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アフ゜
ライト゛ハ゛イオシステム モテ゛ル477A)を用いて決定した。その結果、
得られたＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列から推定したＢＴ
ＣのＮ末端アミノ酸配列と一致した（表６）。
【表６】 ｃ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計(ヘ゛ックマン システム6300E)を用
いて決定した。その結果、ＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列
から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。
いて決定した。その結果、ＢＴＣのcＤＮＡの塩基配列
から推定したアミノ酸組成と一致した（表７）。
【表７】 ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計(ヘ゛ックマン システム6300E)を
用いて決定した。得られたＢＴＣはcＤＮＡの塩基配列
から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表８）。
用いて決定した。得られたＢＴＣはcＤＮＡの塩基配列
から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表８）。
【表８】 ｅ)ＢＴＣの生物活性 精製品はモレキュラー・セル・バイオロジー、８、５８
８（１９８８）に記載の方法により、BALB/C3T3 A31-71
4 クローン 4（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー、１２、４６３（１９７３）を用いた活性測定
を行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
８（１９８８）に記載の方法により、BALB/C3T3 A31-71
4 クローン 4（インターナショナル・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー、１２、４６３（１９７３）を用いた活性測定
を行い、標準品と同等の活性を有することを確認した。
【００３５】実施例１７ 特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６
号）の参考例５の方法により取得したＮ末端にメチオニ
ン残基を有するヒトインターロイキン−２（Ｍｅｔ−Ｉ
Ｌ−２）５０ｍｇを４Ｍ尿素溶液４０ｍｌに溶解した
後、１００ｍＭ硫酸銅２．５ｍｌ、グリオキシル酸
２．５ｇ、ピリジン ５．０ｍｌの混合液を加え、２５
℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリ
ン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化した
セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム
（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を１
０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン
体を有するＩＬ−２画分をプールした。続いてこの画分
に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液
を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度
になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、
２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）
に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速
で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＩＬ−
２画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を、２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳＰ−５
ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した
後、３０−８０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭりん酸緩衝液、ｐＨ
８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶
出を行い、１７．３ｍｇのＩＬ−２画分を得た。
号）の参考例５の方法により取得したＮ末端にメチオニ
ン残基を有するヒトインターロイキン−２（Ｍｅｔ−Ｉ
Ｌ−２）５０ｍｇを４Ｍ尿素溶液４０ｍｌに溶解した
後、１００ｍＭ硫酸銅２．５ｍｌ、グリオキシル酸
２．５ｇ、ピリジン ５．０ｍｌの混合液を加え、２５
℃で１時間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍＭリ
ン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化した
セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム
（46mmID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を１
０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン
体を有するＩＬ−２画分をプールした。続いてこの画分
に等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液
を加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度
になるように添加して、脱気、窒素ガスシールを行い、
２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応液を１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液＋２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラム（46mmID×600mmL）
に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍｌ／分の流速
で展開し、Ｎ末端にメチオニンの付加していないＩＬ−
２画分をプールした。プールしたＩＬ−２画分を、２５
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳＰ−５
ＰＷ（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した
後、３０−８０％Ｂ（Ｂ＝２５ｍＭりん酸緩衝液、ｐＨ
８．０）の段階勾配で６０分間、６ｍｌ／分の流速で溶
出を行い、１７．３ｍｇのＩＬ−２画分を得た。
【００３６】実施例１８（ＩＬ−２の特徴決定） ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた分
析 実施例１７で得られたＩＬ−２をSample buffer［Laemm
li,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１
分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品
（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシ
ーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染
色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品は
ほぼ単一であった（図３）。 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アフ゜
ライト゛ハ゛イオシステム モテ゛ル477A)を用いて決定した。その結果、
得られたＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したＩ
Ｌ−２のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表９）。
析 実施例１７で得られたＩＬ−２をSample buffer［Laemm
li,ネイチャー(Nature),227,680(1970)］に懸濁し100℃で１
分間加熱した後、マルチゲル１５／２５（第一化学薬品
（株））で電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシ
ーブリリアントブルー(Coomassie brilliant blue)で染
色したところ、単一バンドの蛋白が認められ、精製品は
ほぼ単一であった（図３）。 ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(アフ゜
ライト゛ハ゛イオシステム モテ゛ル477A)を用いて決定した。その結果、
得られたＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配列から推定したＩ
Ｌ−２のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表９）。
【表９】 ｃ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計(ヘ゛ックマン システム6300E)を用
いて決定した。その結果、ＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配
列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１０）。
いて決定した。その結果、ＩＬ−２のcＤＮＡの塩基配
列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１０）。
【表１０】 ｄ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計(ヘ゛ックマン システム6300E)を
用いて決定した。得られたＩＬ−２はcＤＮＡの塩基配
列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１１）。
用いて決定した。得られたＩＬ−２はcＤＮＡの塩基配
列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１１）。
【表１１】 ｅ)ＩＬ−２の生物活性 生物活性測定は、ＩＬ−２依存細胞を用いる日沼らの方
法［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.),1
09,363(1982)]に従がって行い、標準品と同等の活性を
有することを確認した。
法［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.Commun.),1
09,363(1982)]に従がって行い、標準品と同等の活性を
有することを確認した。
【００３７】実施例１９（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化） 参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢
酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リット
ルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０
ｍＭトリス／酢酸、１．０９ｍＭ還元型グルタチオン、
０．０５５ｍＭ酸化型グルタチオン、１０９ｍＭアルギ
ニン、４．３６Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットル
を加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化の終了
した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８
膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ
尿素溶液（ｐＨ８．０）約２５リットルを加えながら電
気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行っ
た。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）約
３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上
清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍ
φ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス
／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢
酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分
に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナ
トリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈ
ＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出
液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、
ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リット
ルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０
ｍＭトリス／酢酸、１．０９ｍＭ還元型グルタチオン、
０．０５５ｍＭ酸化型グルタチオン、１０９ｍＭアルギ
ニン、４．３６Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）４４リットル
を加えて、４℃で３日間活性化を行った。活性化の終了
した液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８
膜、ミリポア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ
尿素溶液（ｐＨ８．０）約２５リットルを加えながら電
気伝導度が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行っ
た。再度、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）約
３５リットルを加えながら脱塩を行った後、遠心分離
（１０，０００ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上
清液を２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍ
φ×６０ｃｍ、東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス
／酢酸溶液（ｐＨ８．０）および２０ｍＭトリス／酢
酸、２５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分
に洗浄した後、２０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナ
トリウム溶液（ｐＨ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈ
ＧＨ画分として５０リットルの溶出液を得た。この溶出
液をペリコンカセットシステム（バイオマックス８膜、
ミリポア社）で濃縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３８】実施例２０（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化） 参考例２で得られた菌体１ｋｇに５０ｍＭトリス／酢
酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リット
ルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０
ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステイン塩酸塩一水
和物、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐ
Ｈ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化
を行った。活性化されたＭｅｔ−ｈＧＨの量は実施例１
９の約１．２倍多く得られた。活性化の終了した液をペ
リコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポ
ア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液
（ｐＨ８．０）２５リットルを加えながら電気伝導度が
５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、
２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）３５リットル
を加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭ
トリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、
東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐ
Ｈ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２
０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５
０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセ
ットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃
縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）４リット
ルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約４リットルに５０
ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステイン塩酸塩一水
和物、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液（ｐ
Ｈ８．０）４４リットルを加えて、４℃で３日間活性化
を行った。活性化されたＭｅｔ−ｈＧＨの量は実施例１
９の約１．２倍多く得られた。活性化の終了した液をペ
リコンカセットシステム（バイオマックス８膜、ミリポ
ア社）で、２０ｍＭトリス／酢酸、２．５Ｍ尿素溶液
（ｐＨ８．０）２５リットルを加えながら電気伝導度が
５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで濃縮脱塩を行った。再度、
２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）３５リットル
を加えながら脱塩を行った後、遠心分離（１０，０００
ｒｐｍ）を行い上清を得た。ついで、上清液を２０ｍＭ
トリス／酢酸溶液（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ
−トヨパール６５０Ｍカラム(３０ｃｍφ×６０ｃｍ、
東ソー社）に吸着させ、２０ｍＭトリス／酢酸溶液（ｐ
Ｈ８．０）および２０ｍＭトリス／酢酸、２５ｍＭ塩化
ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で十分に洗浄した後、２
０ｍＭトリス／酢酸、５５ｍＭ塩化ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ８．０）で溶出を行い、Ｍｅｔ−ｈＧＨ画分として５
０リットルの溶出液を得た。この溶出液をペリコンカセ
ットシステム（バイオマックス８膜、ミリポア社）で濃
縮脱塩し、Ｍｅｔ−ｈＧＨを得た。
【００３９】実施例２１（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化） 参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／
酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリ
リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，
０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリッ
トルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭＮ−アセチ
ル−L−システイン、１０９ｍＭアルギニン、４．９１
Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、
４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩
酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭ
ｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリ
リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，
０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリッ
トルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭＮ−アセチ
ル−L−システイン、１０９ｍＭアルギニン、４．９１
Ｍ尿素溶液（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、
４℃で３日間活性化を行った。その結果、システイン塩
酸塩一水和物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭ
ｅｔ−ｈＧＨの活性化効率が認められた。
【００４０】実施例２２（Ｍｅｔ−ｈＧＨの活性化） 参考例２で得られた菌体１．２５ｇに５０ｍＭトリス／
酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリ
リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，
０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリッ
トルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステアミ
ン塩酸塩、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液
（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日
間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和
物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧ
Ｈの活性化効率が認められた。
酢酸、８Ｍグアニジン塩酸塩溶液（ｐＨ８．５）５ミリ
リットルを加えて菌体を溶解した後、遠心分離（１０，
０００ｒｐｍ）を行った。得られた上清液約５ミリリッ
トルに５０ｍＭトリス／酢酸、５．４５ｍＭシステアミ
ン塩酸塩、１０９ｍＭアルギニン、４．９１Ｍ尿素溶液
（ｐＨ８．０）５５ミリリットルを加えて、４℃で３日
間活性化を行った。その結果、システイン塩酸塩一水和
物を添加した場合（実施例２０）と同等のＭｅｔ−ｈＧ
Ｈの活性化効率が認められた。
【００４１】実施例２３ 特開平１０−７２４８９号（ＥＰ−Ａ−８１２８５６
号）の参考例３記載の方法により、Ｎ末端にメチオニン
残基を有するヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−Ｎ
Ｔ−３）を製造した。Ｎ末端にメチオニンの付加したヒ
トニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）５０ｍ
ｇを３Ｍ尿素溶液８ｍｌに溶解し、０．２Ｍ硫酸銅
０．４ｍｌ、グリオキシル酸 ０．５ｇ、ピリジン １ｍ
ｌの混合液を加え１０ｍにした後、２５℃で１時間反応
した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（25mmID×600mm
L）に通液し、平衡化に用いた溶液を４ｍｌ／分の流速
で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＮＴ−
３画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢
酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、
３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように
添加して、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応
液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mm
ID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍ
ｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有し
ていないヒトニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）画分
をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ５．０に
調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２ＭＮａＣｌ＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ
（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０
−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２Ｍ
ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）の段階勾配で６
０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分
をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡ
で平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（21.5ｍｍＩＤ×３００ｍ
ｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０−６０％Ｂ
（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階
勾配で４０分間、５ｍｌ/分の流速で溶出した。ＮＴ−
３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、Ｎ
Ｔ−３の凍結乾燥粉末約５ｍｇを得た。
号）の参考例３記載の方法により、Ｎ末端にメチオニン
残基を有するヒトニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−Ｎ
Ｔ−３）を製造した。Ｎ末端にメチオニンの付加したヒ
トニューロトロフィン−３（Ｍｅｔ−ＮＴ−３）５０ｍ
ｇを３Ｍ尿素溶液８ｍｌに溶解し、０．２Ｍ硫酸銅
０．４ｍｌ、グリオキシル酸 ０．５ｇ、ピリジン １ｍ
ｌの混合液を加え１０ｍにした後、２５℃で１時間反応
した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ６.０）で平衡化したセファデックス
（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（25mmID×600mm
L）に通液し、平衡化に用いた溶液を４ｍｌ／分の流速
で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有するＮＴ−
３画分をプールした。続いてこの画分に等量の２Ｍ酢
酸、４Ｍギ酸ナトリウム、３Ｍ尿素溶液を加えた後、
３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度になるように
添加して、２５℃で５日間反応した。反応終了後、反応
液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（46mm
ID×600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を１０ｍ
ｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有し
ていないヒトニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）画分
をプールした。プールしたＮＴ−３画分をｐＨ５．０に
調整後、５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２ＭＮａＣｌ＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ
（21.5mmID×150mmL、東ソー（株））に吸着した後、０
−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．２Ｍ
ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素、ｐＨ８．０）の段階勾配で６
０分間、６ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ＮＴ−３画分
をプールした。さらに、ＮＴ−３画分を０．１％ＴＦＡ
で平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（21.5ｍｍＩＤ×３００ｍ
ｍＬ、昭和電工（株））に吸着した後、２０−６０％Ｂ
（Ｂ＝８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階
勾配で４０分間、５ｍｌ/分の流速で溶出した。ＮＴ−
３のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、Ｎ
Ｔ−３の凍結乾燥粉末約５ｍｇを得た。
【００４２】実施例２４（ＮＴ−３の特徴決定） ａ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー(ア
プライドバイオシステムズモデル４７７Ａ)を用いて決
定した。その結果、cＤＮＡの塩基配列から推定したＮ
Ｔ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１２）。
プライドバイオシステムズモデル４７７Ａ)を用いて決
定した。その結果、cＤＮＡの塩基配列から推定したＮ
Ｔ−３のＮ末端アミノ酸配列と一致した（表１２）。
【表１２】 b）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計(ヘ゛ックマン システム6300E)を用
いて決定した。その結果、ＮＴ−３のcＤＮＡの塩基配
列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１３）。
いて決定した。その結果、ＮＴ−３のcＤＮＡの塩基配
列から推定したアミノ酸組成と一致した（表１３）。
【表１３】 d）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計(ベックマンシステム
６３００Ｅ)を用いて決定した。その結果cＤＮＡの塩基
配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１
４）。
６３００Ｅ)を用いて決定した。その結果cＤＮＡの塩基
配列から推定したＣ末端アミノ酸と一致した（表１
４）。
【表１４】 e)ＮＴ−３の生物活性 実施例２３で得られたＮＴ−３についてＤＲＧ（ニワト
リ有精卵をふ卵器で３７．５℃、８−１０日間揺卵し
て、胚発生を行った胎児から摘出した後神経節（Ｄｏｒ
ｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ））を用いた生物活
性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等
の活性を有することを確認した。
リ有精卵をふ卵器で３７．５℃、８−１０日間揺卵し
て、胚発生を行った胎児から摘出した後神経節（Ｄｏｒ
ｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ））を用いた生物活
性測定を行い、ＣＨＯ細胞より得られたＮＴ−３と同等
の活性を有することを確認した。
【００４３】実施例２５ 実施例２で得られたＭｅｔ−ｈＧＨ溶液１４．７５ｍｌ
を６Ｍ尿素溶液で６０ｍｌにした後、０．５Ｍ硫酸銅
１．２ｍｌ、グリオキシル酸 ３．７５ｇ、ピリジン
７．５ｍｌの混合液を加え７５ｍｌにした後、２５℃で
１時間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０
ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ８.０）で平衡化したセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍ
ＩＤ×６０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を１
０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン
体を有するｈＧＨ画分をプールした。続いてこの画分に
等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ尿素溶液を
加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度に
なるように添加して、３０℃で４日間反応した。反応終
了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（１１．３ｃｍＩＤ×８０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に
用いた緩衝液を３０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端に
メチオニン残基を有していないｈＧＨ画分をプールし
た。プールしたｈＧＨ画分を、５０ｍＭトリス緩衝液＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷ（５．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー（株））に
吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ＋
２．５Ｍ尿素、ｐＨ４．０）の段階勾配で６０分間、１
５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ約６０ｍｇを取
得した。
を６Ｍ尿素溶液で６０ｍｌにした後、０．５Ｍ硫酸銅
１．２ｍｌ、グリオキシル酸 ３．７５ｇ、ピリジン
７．５ｍｌの混合液を加え７５ｍｌにした後、２５℃で
１時間反応した。反応終了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０
ｍＭトリス緩衝液(ｐＨ８.０）で平衡化したセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（４．６ｃｍ
ＩＤ×６０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に用いた溶液を１
０ｍｌ／分の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン
体を有するｈＧＨ画分をプールした。続いてこの画分に
等量の２Ｍ酢酸、４Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ尿素溶液を
加えた後、３、４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃度に
なるように添加して、３０℃で４日間反応した。反応終
了後、反応液を４Ｍ尿素＋２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（１１．３ｃｍＩＤ×８０ｃｍＬ）に通液し、平衡化に
用いた緩衝液を３０ｍｌ／分の流速で展開し、Ｎ末端に
メチオニン残基を有していないｈＧＨ画分をプールし
た。プールしたｈＧＨ画分を、５０ｍＭトリス緩衝液＋
２．５Ｍ尿素（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−５
ＰＷ（５．５ｃｍＩＤ×２０ｃｍＬ、東ソー（株））に
吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ ＭＥＳ＋
２．５Ｍ尿素、ｐＨ４．０）の段階勾配で６０分間、１
５ｍｌ／分の流速で溶出を行い、ｈＧＨ約６０ｍｇを取
得した。
【００４４】実施例２６ ヒトアペリン−３６構造遺伝
子の調製 図４に示す６種類のＤＮＡ断片（#1,#5：グライナー・
ジャパン社、#2,#6：キコーテック社、#3,#4：アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアペリン−３
６の構造遺伝子を調製した（図５）。 a)DNAオリゴマーのリン酸化 5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー
各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (p
H7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mMジチオス
レイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、1
0ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジー
ン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を
行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍
量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDN
Aを沈殿させた。 b)DNAフラグメントの連結 上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2
各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10
分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。
TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてラ
イゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII
液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37
℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノ
ール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノール
を加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させ
た。 c)5'末端のリン酸化 沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液［50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジ
ーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２
倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心で
DNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。
子の調製 図４に示す６種類のＤＮＡ断片（#1,#5：グライナー・
ジャパン社、#2,#6：キコーテック社、#3,#4：アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテク）を用いてアペリン−３
６の構造遺伝子を調製した（図５）。 a)DNAオリゴマーのリン酸化 5'末端になるべき#1及び#6を除いた４種類のオリゴマー
各１μgを100 μLのリン酸化反応液［50mM Tris-HCl (p
H7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mMジチオス
レイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM ATP、1
0ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジー
ン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化を
行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２倍
量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心でDN
Aを沈殿させた。 b)DNAフラグメントの連結 上記a)で得られたリン酸化DNAフラグメントと#1及び#2
各１μgを合わせ120μLとした。この混合液を80℃で10
分間保った後、室温まで徐冷しアニーリングを行った。
TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2 （宝酒造）を用いてラ
イゲーション反応を行った。アニーリング液30 μLにII
液30 μLを加え良く混合した後、I液60 μLを加え、37
℃、１時間反応させ、ライゲーションを行った。フェノ
ール処理を行った後、水層を回収し２倍量のエタノール
を加え、−70℃に冷却した後、遠心でDNAを沈殿させ
た。 c)5'末端のリン酸化 沈殿をＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA）
10 μLに溶解し、100μLのリン酸化反応液［50mM Tris-
HCl (pH7.6), 10mM MgCl2, 1mM スペルミジン、10mM ジ
チオスレイトール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン、1mM
ATP、10ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジ
ーン）］中で37℃、1時間反応させ、5'末端のリン酸化
を行った。フェノール処理を行った後、水層を回収し２
倍量のエタノールを加え、−70℃に冷却した後、遠心で
DNAを沈殿させ、20μLのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４５】実施例２７ ヒトアペリン−３６発現プラ
スミドの調製 pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・
バイオテクノロジー、32巻、273頁）をXbaI及びAvaIで
消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.4KbpのDNA断
片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用
いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解した。このpTB96
0-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製したヒトアペリ
ン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligation Kit ver.
2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。す
なわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μLとヒトアペリ
ン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、I液5 μLを加
え、16℃、30分間反応させ、ライゲーションを行った。
ライゲーション液10 μLを用いてE. coli JM109コンピ
テントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg/mLのテトラ
サイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培
養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。
この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8 Mi
niprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTB960-1
3を調製した。このヒトアペリン−３６構造遺伝子部分
の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル377
ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プラスミドpT
B960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）に形質転換
を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培
地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリン−３６-Ｃ
Ｓ２３融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を得た
（図６）。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-13は
受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1998
年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵研
究所（IFO）に寄託された。
スミドの調製 pTB960-2（EP-A-499990：小山ら、ジャーナル・オブ・
バイオテクノロジー、32巻、273頁）をXbaI及びAvaIで
消化し、1％アガロース電気泳動を行い約4.4KbpのDNA断
片をQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社）を用
いて抽出し、25μLのＴＥ緩衝液に溶解した。このpTB96
0-2のXbaI, AvaI断片と上記により調製したヒトアペリ
ン−３６の構造遺伝子をTaKaRa DNA Ligation Kit ver.
2 （宝酒造）を用いてライゲーション反応を行った。す
なわちpTB960-2のXbaI, AvaI断片溶液1μLとヒトアペリ
ン−３６の構造遺伝子溶液4μLを混合し、I液5 μLを加
え、16℃、30分間反応させ、ライゲーションを行った。
ライゲーション液10 μLを用いてE. coli JM109コンピ
テントセル（東洋紡）を形質転換し、10μg/mLのテトラ
サイクリンを含むＬＢ寒天培地上に播き、37℃で1日培
養し、生じたテトラサイクリン耐性コロニーを選んだ。
この形質転換体をＬＢ培地で一晩培養し、QIAprep8 Mi
niprep Kit（キアゲン社）を用いてプラスミドpTB960-1
3を調製した。このヒトアペリン−３６構造遺伝子部分
の塩基配列をアプライドバイオシステムズ社モデル377
ＤＮＡシークエンサーを用いて確認した。プラスミドpT
B960-13を大腸菌BL21(DE3)株（Novagen社）に形質転換
を行い、10μg/mLのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天培
地上に播き、37℃で1日培養し、ヒトアペリン−３６-Ｃ
Ｓ２３融合蛋白質発現株BL21(DE3)/pTB960-13を得た
（図６）。この形質転換大腸菌BL21(DE3)/pTB960-13は
受託番号FERM BP-6590で1998年12月2日付で通産省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託された。また1998
年11月11日付で受託番号IFO16220として財団法人発酵研
究所（IFO）に寄託された。
【００４６】実施例２８ 実施例２７で得られた形質転換細胞を、５．０ｍｇ／Ｌ
のテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを
用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振と
う培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培
地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン
酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０
５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、
０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．
０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５
％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、
３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５
００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌ
になるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養
終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取
得し、−８０℃で凍結保存した。
のテトラサイクリンを含むＬＢ培地（１％ペプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）１Ｌを
用いて、２リットル容フラスコ中で３７℃、８時間振と
う培養した。得られた培養液を１９リットルの主発酵培
地（１．６８％リン酸１水素ナトリウム、０．３％リン
酸２水素カリウム、０．１％塩化アンモニウム、０．０
５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、
０．０２％消泡剤、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．
０００２５％塩酸チアミン、１．５％ブドウ糖、１．５
％カザミノ酸）を仕込んだ５０Ｌ容発酵槽へ移植して、
３０℃で通気撹拌培養を開始した。培養液の濁度が約５
００クレット単位になった時点で、イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシドの最終濃度が１２ｍｇ／Ｌ
になるように添加し、さらに４時間培養を行った。培養
終了後、培養液を遠心分離し、約６６０ｇの湿菌体を取
得し、−８０℃で凍結保存した。
【００４７】実施例２９ ヒトアペリン−３６の取得 実施例２８で得た菌体５５０ｇに１０ｍＭ ＥＤＴＡ＋
１ｍＭ(p-アミシ゛ノフェニル)メタンスルホニルフルオリト゛塩酸塩（ｐＨ６．
０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳ
ＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、
遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。
上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プ
ールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyop
earl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、
吸着、洗浄した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リ
ン酸緩衝液＋２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配
で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−３６−ＣＳ
２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコン
ミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えなが
ら濃縮を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タン
パク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度
６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−
ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５
ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、
反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液
し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速
で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−３６−Ｃ
Ｓ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコ
ンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒ
トアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を
得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添
加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛
性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了
後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−３６を
得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID
×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０−
４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ
＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒ
トアペリン−３６を画分を得た。このヒトアペリン−３
６画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で
平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)
に通液し、吸着、洗浄した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ：８
０％アセトニトリル／ ０．１％TFA）の段階勾配で溶出
を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした後、凍結
乾燥を行い、ヒトアペリン−３６凍結乾燥粉末を得た。 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトアペリン−３６の
ＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した
（表１５）。
１ｍＭ(p-アミシ゛ノフェニル)メタンスルホニルフルオリト゛塩酸塩（ｐＨ６．
０）溶液１５００ｍｌを加え、超音波処理（ＢＲＡＮＳ
ＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ＭＯＤＥＬ４５０）した後、
遠心分離（１００００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）を行った。
上澄液はプールし、沈殿は再び同様の操作を行った。プ
ールした上澄液はｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ リン
酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したAF-Heparin Toyop
earl 650Mカラム(30mmID×500mmL、東ソー)に通液し、
吸着、洗浄した後、０−１００％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リ
ン酸緩衝液＋２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）の段階勾配
で溶出を行い、５３０ｍｌのヒトアペリン−３６−ＣＳ
２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコン
ミニカセット（ミリポア社）で０．１Ｍ酢酸を加えなが
ら濃縮を行い、ヒトアペリン−３６−ＣＳ２３融合タン
パク質の０．１Ｍ酢酸溶液を得た。この溶液に最終濃度
６Ｍとなるように尿素を添加した後、１−シアノ−４−
ジメチルアミノピリジニウム塩（ＤＭＡＰ−ＣＮ）３５
ｍｇを加えて、室温で１５分間反応した。反応終了後、
反応液を１０％酢酸で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−２５カラム(46mmID×600mmL、ファルマシア)に通液
し、平衡化に用いた１０％酢酸を６ｍｌ／ｍｉｎの流速
で展開し、Ｓ−シアノ化されたヒトアペリン−３６−Ｃ
Ｓ２３融合タンパク質画分を得た。この溶出液をペリコ
ンミニカセット（ミリポア社）で濃縮・脱塩を行い、ヒ
トアペリン−３６−ＣＳ２３融合タンパク質の脱塩液を
得た。この脱塩液に最終濃度６Ｍとなるように尿素を添
加した後、さらに、０．０６Ｎ濃度となるように１Ｎ苛
性ソーダを加え、０℃で１５分間反応した。反応終了
後、酢酸でｐＨ６．０に調整し、ヒトアペリン−３６を
得た。この反応液を３Ｍ尿素を含む５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ６．５）で平衡化したＳＰ−５ＰＷ(21.5mmID
×150mmL、東ソー)に通液し、吸着、洗浄した後、０−
４０％Ｂ（Ｂ＝５０ｍＭ リン酸緩衝液＋１Ｍ ＮａＣｌ
＋３Ｍ尿素、ｐＨ６．５）の段階勾配で溶出を行い、ヒ
トアペリン−３６を画分を得た。このヒトアペリン−３
６画分を、さらに０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）で
平衡化したＣ４Ｐ−５０(21.5mmID×300mmL、昭和電工)
に通液し、吸着、洗浄した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ：８
０％アセトニトリル／ ０．１％TFA）の段階勾配で溶出
を行い、ヒトアペリン−３６画分をプールした後、凍結
乾燥を行い、ヒトアペリン−３６凍結乾燥粉末を得た。 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
Ｎ末端にメチオニン残基を有するヒトアペリン−３６の
ＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した
（表１５）。
【００４８】
【表１５】
【００４９】ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＮ
末端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表１６）。
プライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＮ
末端にはメチオニンが付加していることのほかはＤＮＡ
塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致した
（表１６）。
【００５０】
【表１６】
【００５１】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表１
７）。
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表１
７）。
【表１７】 以上の結果から実施例２９で得られたヒトアペリン−３
６は、そのＮ末端にメチオニン残基を有する分子種（Ｍ
ｅｔ−ヒトアペリン−３６）であることがわかった。
６は、そのＮ末端にメチオニン残基を有する分子種（Ｍ
ｅｔ−ヒトアペリン−３６）であることがわかった。
【００５２】実施例３０（生物活性測定） 実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６を用
いて、特願平10−271645号の実施例６に記載の方法（サ
イトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の
合成品と同等の活性を有することを確認した。
いて、特願平10−271645号の実施例６に記載の方法（サ
イトセンサー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の
合成品と同等の活性を有することを確認した。
【００５３】実施例３1(Ｎ末端のメチオニン残基の除
去) 実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６ ４
ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ
硫酸銅 ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．０４６ｇ、
ピリジン ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間
反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×25
0mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分
の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有する
ヒトアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分
に等量の ２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶
液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃
度になるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応
終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×
600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分
の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していな
いヒトアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒ
トアペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ
リン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐ
Ｈ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mm
L、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ
＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５
Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍ
ｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分を
プールした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％Ｔ
ＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭
和電工（株））に吸着した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ＝８
０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４
０分間、２ml/分の流速で溶出した。 ヒトアペリン−
３６のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、
ヒトアペリン−３６を取得した。 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組
成と一致した（表１８）。
去) 実施例２９で取得したＭｅｔ−ヒトアペリン−３６ ４
ｍｇを３Ｍ尿素溶液０．８ｍｌに溶解した後、８０ｍＭ
硫酸銅 ０．０５ｍｌ、グリオキシル酸 ０．０４６ｇ、
ピリジン ０．１ｍｌの混合液を加え、２５℃で１時間
反応した。反応終了後、反応液を２．５Ｍ尿素＋１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ５．５）で平衡化したセファデッ
クス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラム（10mmID×25
0mmL）に通液し、平衡化に用いた溶液を０．５ｍｌ／分
の流速で展開し、メチオニン残基のジケトン体を有する
ヒトアペリン−３６画分をプールした。続いてこの画分
に等量の ２Ｍギ酸ナトリウム、４Ｍ酢酸、３Ｍ尿素溶
液を加えた後、３，４−ジアミノ安息香酸を４０ｍＭ濃
度になるように添加し、３０℃で３日間反応した。反応
終了後、反応液を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）
で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（25mmID×
600mmL）に通液し、平衡化に用いた緩衝液を４ｍｌ／分
の流速で展開し、Ｎ末端にメチオニン残基を有していな
いヒトアペリン−３６画分をプールした。プールしたヒ
トアペリン−３６画分をｐＨ６．０に調整し、５０ｍＭ
リン酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５Ｍ尿素（ｐ
Ｈ５．０）で平衡化したＣＭ−５ＰＷ（7.5mmID×75mm
L、東ソー（株））に吸着した後、０−１００％Ｂ（Ｂ
＝５０ｍＭほう酸緩衝液＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋２．５
Ｍ尿素、ｐＨ９．０）の段階勾配で４０分間、０．８ｍ
ｌ／分の流速で溶出を行い、ヒトアペリン−３６画分を
プールした。さらに、ヒトアペリン−３６を０．１％Ｔ
ＦＡで平衡化した Ｃ４Ｐ−５０（10mmID×250mmL、昭
和電工（株））に吸着した後、１５−３０％Ｂ（Ｂ＝８
０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）の段階勾配で４
０分間、２ml/分の流速で溶出した。 ヒトアペリン−
３６のフラクションをプールした後、凍結乾燥を行い、
ヒトアペリン−３６を取得した。 ａ）アミノ酸組成分析 アミノ酸組成をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて決定した。その結果、
ｈＡ１０ＬのＤＮＡ塩基配列から予想されるアミノ酸組
成と一致した（表１８）。
【００５４】
【表１８】
【００５５】ｂ）Ｎ末端アミノ酸配列分析 Ｎ末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＤ
ＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致
した（表１９）。
プライドバイオシステムズ モデル４７７Ａ）を用いて
決定した。その結果、得られたヒトアペリン−３６のＤ
ＮＡ塩基配列から予想されるＮ末端アミノ酸配列と一致
した（表１９）。
【００５６】
【表１９】
【００５７】ｃ）Ｃ末端アミノ酸分析 Ｃ末端アミノ酸をアミノ酸分析計（日立Ｌ−８５００Ａ
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表２
０）。
Amino Acid Analyzer）を用いて分析した（表２
０）。
【表２０】
【００５８】実施例３２（生物活性測定） 実施例３１で取得したヒトアペリン−３６を用いて、特
願平10−271646号の実施例６に記載の方法（サイトセン
サー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と
同等の活性を有することを確認した。
願平10−271646号の実施例６に記載の方法（サイトセン
サー）で活性を測定し、ヒトアペリン−３６の合成品と
同等の活性を有することを確認した。
【００５９】
【発明の効果】本発明により、Ｎ末端に酸化されていて
もよいメチオニン残基を有するペプチド、蛋白質または
その塩から、該メチオニン残基のみを選択特異的かつ効
率的に取り除き、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオ
ニン残基を有していないペプチド，蛋白質またはその塩
を効率よく生産することができる。また、本発明の方法
によれば、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、し
かもマイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を化学
的に除去することができるので、遺伝子工学的手法によ
り製造されたメチオニン残基を有するペプチド，蛋白質
またはその塩を原料にして、天然型のアミノ酸配列を有
するペプチドまたは蛋白質を工業的に有利に製造するこ
とができる。
もよいメチオニン残基を有するペプチド、蛋白質または
その塩から、該メチオニン残基のみを選択特異的かつ効
率的に取り除き、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオ
ニン残基を有していないペプチド，蛋白質またはその塩
を効率よく生産することができる。また、本発明の方法
によれば、ペプチドまたは蛋白質の種類に拘わらず、し
かもマイルドな条件下でＮ末端のメチオニン残基を化学
的に除去することができるので、遺伝子工学的手法によ
り製造されたメチオニン残基を有するペプチド，蛋白質
またはその塩を原料にして、天然型のアミノ酸配列を有
するペプチドまたは蛋白質を工業的に有利に製造するこ
とができる。
【００６０】
【図１】は、実施例４ａ)で得られた電気泳動の結果を
示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レー
ン（Ｌａｎｅ）２は精製ｈＧＨを示す。
示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レー
ン（Ｌａｎｅ）２は精製ｈＧＨを示す。
【図２】は、実施例１６ａ)で得られた電気泳動の結果
を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レ
ーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１５で得られたＢＴＣを示
す。
を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レ
ーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１５で得られたＢＴＣを示
す。
【図３】は、実施例１８ａ)で得られた電気泳動の結果
を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レ
ーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１７で得られたＩＬ−２を
示す。
を示す。レーン（Ｌａｎｅ）１は分子量マーカーを、レ
ーン（Ｌａｎｅ）２は実施例１７で得られたＩＬ−２を
示す。
【図４】は、実施例２６で用いられたＤＮＡフラグメン
トを示す。
トを示す。
【図５】は、実施例２６で得られた２重鎖構成のヒトア
ペリン−３６を製造する模式図を示す。
ペリン−３６を製造する模式図を示す。
【図６】は、実施例２７で得られたプラスミドｐTB９６
０−１３の構築図を示す。
０−１３の構築図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大前 弘明 奈良県北葛城郡上牧町服部台２丁目５番２ 号 (72)発明者 奥谷 範雄 大阪府吹田市津雲台５丁目18番Ｄ−75− 106号
Claims (16)
- 【請求項１】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢
酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムま
たはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジア
ミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とす
る該メチオニン残基のジケトン体の除去方法。 - 【請求項２】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペ
プチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させること
により得られるペプチドまたはその塩である請求項１記
載の方法。 - 【請求項３】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基を有するペプチドが遺伝子工学的に製造されたペプ
チドである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】ペプチドが(i)成長ホルモン，(ii)ベータ
セルリン，(iii)インターロイキン−２，(iv)ニュート
ロフィン−３または(v)アペリンである請求項１記載の
方法。 - 【請求項５】ペプチドが成長ホルモンである請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ
酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐＨ
約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液として
用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項７】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢
酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安
息香酸またはその塩と反応させることを特徴とする該メ
チオニン残基のジケトン体の除去方法。 - 【請求項８】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、酢
酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムま
たはぎ酸および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジア
ミノ安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とす
るＮ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有し
ていないペプチドまたはその塩の製造法。 - 【請求項９】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン
残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩が、Ｎ
末端に酸化されていてもよいメチオニン残基を有するペ
プチドまたはその塩をα−ジケトン類と反応させること
により得られるペプチドまたはその塩である請求項８記
載の製造法。 - 【請求項１０】酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸および
ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウムが、ｐ
Ｈ約２ないし９で約０．１ないし８mol/Lの緩衝液とし
て用いられることを特徴とする請求項８記載の製造法。 - 【請求項１１】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩を、
酢酸およびぎ酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ
安息香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ
末端にメチオニン残基を有していないペプチドまたはそ
の塩の製造法。 - 【請求項１２】遺伝子工学的に製造され、Ｎ末端に酸化
されていてもよいメチオニン残基を有するヒト成長ホル
モンまたはその塩をグリオキシル酸またはその塩と硫酸
銅およびピリジンの存在下に反応させた後、酢酸および
ぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸
および酢酸ナトリウムの存在下に３，４−ジアミノ安息
香酸またはその塩と反応させることを特徴とするＮ末端
にメチオニン残基を有していないヒト成長ホルモンまた
はその塩の製造法。 - 【請求項１３】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基を有するペプチドまたはその塩の該メチオニン残
基を除去するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、
ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリ
ウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の
使用。 - 【請求項１４】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩の該
メチオニン残基のジケトン体を除去するための、(ｉ)酢
酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムま
たはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミ
ノ安息香酸またはその塩の使用。 - 【請求項１５】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基を有するペプチドまたはその塩から、Ｎ末端に酸
化されていてもよいメチオニン残基を有しないペプチド
またはその塩を製造するための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナ
トリウム、ぎ酸およびぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および
酢酸ナトリウム、と(ii)３，４−ジアミノ安息香酸また
はその塩の使用。 - 【請求項１６】Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニ
ン残基のジケトン体を有するペプチドまたはその塩か
ら、Ｎ末端に酸化されていてもよいメチオニン残基のジ
ケトン体を有していないペプチドまたはその塩を製造す
るための、(ｉ)酢酸およびぎ酸ナトリウム、ぎ酸および
ぎ酸ナトリウムまたはぎ酸および酢酸ナトリウム、と(i
i)３，４−ジアミノ安息香酸またはその塩の使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28401099A JP4475707B2 (ja) | 1998-10-05 | 1999-10-05 | Ｎ末端メチオニンの除去方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28247698 | 1998-10-05 | ||
| JP10-282476 | 1998-10-05 | ||
| JP28401099A JP4475707B2 (ja) | 1998-10-05 | 1999-10-05 | Ｎ末端メチオニンの除去方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000178297A true JP2000178297A (ja) | 2000-06-27 |
| JP2000178297A5 JP2000178297A5 (ja) | 2006-11-24 |
| JP4475707B2 JP4475707B2 (ja) | 2010-06-09 |
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ID=26554620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28401099A Expired - Fee Related JP4475707B2 (ja) | 1998-10-05 | 1999-10-05 | Ｎ末端メチオニンの除去方法 |
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- 1999-10-05 JP JP28401099A patent/JP4475707B2/ja not_active Expired - Fee Related
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