JP3187201B2 - Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 - Google Patents
Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法Info
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- C07K14/57527—Calcitonin gene related peptide
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- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＣ末端にプロリンアミド
を有するペプチドの製法に関する。
を有するペプチドの製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】真核細胞由来のある種のペプチドホルモ
ンや各種成長因子などの蛋白質（以下、単に「ペプチ
ド」という。）は、そのペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残
基α‐カルボキシル基がアミド化されており、酸アミド
（−ＣＯＮＨ2 ）が形成されている。そして、この酸ア
ミド基はこれらのペプチドの生理活性作用発現に必須で
あることが知られている（Experimentaria 32: 246,
(1976) ）。
ンや各種成長因子などの蛋白質（以下、単に「ペプチ
ド」という。）は、そのペプチド鎖のＣ末端アミノ酸残
基α‐カルボキシル基がアミド化されており、酸アミド
（−ＣＯＮＨ2 ）が形成されている。そして、この酸ア
ミド基はこれらのペプチドの生理活性作用発現に必須で
あることが知られている（Experimentaria 32: 246,
(1976) ）。
【０００３】これらのペプチドは、各種の疾病の治療薬
としての有用性が期待されているが、元来これらの物質
は生体内では微量成分として存在しているため、相当量
を生体より直接調製することは極めて困難であり、特に
ヒト型の取得は不可能であった。近年の遺伝子工学の発
展は、これらのペプチドを組換え型として大量に生産さ
せることを可能にした。
としての有用性が期待されているが、元来これらの物質
は生体内では微量成分として存在しているため、相当量
を生体より直接調製することは極めて困難であり、特に
ヒト型の取得は不可能であった。近年の遺伝子工学の発
展は、これらのペプチドを組換え型として大量に生産さ
せることを可能にした。
【０００４】しかしながら、先に述べたようなＣ末端酸
アミドをもつペプチドを組換え型として得る場合、大腸
菌のような原核細胞にはＣ末端アミド化反応機構は存在
しないので、産生されたペプチド鎖のＣ末端カルボキシ
ル基はアミド化されていない。従って、目的とする生理
活性ペプチドを得るために、生産させたペプチド鎖を前
駆体として、Ｃ末端α‐カルボキシル基のアミド化反応
を行なわなければならない。
アミドをもつペプチドを組換え型として得る場合、大腸
菌のような原核細胞にはＣ末端アミド化反応機構は存在
しないので、産生されたペプチド鎖のＣ末端カルボキシ
ル基はアミド化されていない。従って、目的とする生理
活性ペプチドを得るために、生産させたペプチド鎖を前
駆体として、Ｃ末端α‐カルボキシル基のアミド化反応
を行なわなければならない。
【０００５】Ｃ末端プロリンアミドを有するペプチドの
Ｃ末端アミド化反応として、本発明者らはイースト由来
酵素カルボキシペプチダーゼＹを使用した新しいＣ末端
アミド化方法を開発した（特開 昭６２−２９９９７
号、Ｔａｍａｏｋｉ、Ｈ．等： Ａｎｎ Ｒｅｐ．Ｓａ
ｎｋｙｏ Ｒｅｓ．Ｌａｂ．：３８ ７３（１９８
６））。この方法は、使用する酵素を酵素源イーストよ
り容易にかつ大量に供給できるという利点がある。カル
ボキシペプチダーゼＹを使用したＣ末端アミド化方法
は、アミド化をしようとするプロリンのα‐カルボキシ
ル基側にロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルア
ラニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸残基の一種が
結合したペプチド（前駆体ペプチド）に、求核試薬であ
るアンモニアの高濃度での存在下で酵素を作用させてＣ
末端プロリンアミドを有するペプチドを生成させるもの
である。
Ｃ末端アミド化反応として、本発明者らはイースト由来
酵素カルボキシペプチダーゼＹを使用した新しいＣ末端
アミド化方法を開発した（特開 昭６２−２９９９７
号、Ｔａｍａｏｋｉ、Ｈ．等： Ａｎｎ Ｒｅｐ．Ｓａ
ｎｋｙｏ Ｒｅｓ．Ｌａｂ．：３８ ７３（１９８
６））。この方法は、使用する酵素を酵素源イーストよ
り容易にかつ大量に供給できるという利点がある。カル
ボキシペプチダーゼＹを使用したＣ末端アミド化方法
は、アミド化をしようとするプロリンのα‐カルボキシ
ル基側にロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルア
ラニン及びアラニンから選ばれたアミノ酸残基の一種が
結合したペプチド（前駆体ペプチド）に、求核試薬であ
るアンモニアの高濃度での存在下で酵素を作用させてＣ
末端プロリンアミドを有するペプチドを生成させるもの
である。
【０００６】カルボキシペプチダーゼＹは、 ペプチド鎖上、Ｃ末端側から順次アミノ酸残基を遊離
させるペプチダーゼ活性、 Ｃ末端のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基またはペプ
チドと置き換えるペプチド交換活性、 の二つの活性を併せ持つ酵素である。
させるペプチダーゼ活性、 Ｃ末端のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基またはペプ
チドと置き換えるペプチド交換活性、 の二つの活性を併せ持つ酵素である。
【０００７】のペプチダ−ゼ活性は、至適ｐＨが中性
付近であり、また、その特異性は極めて低いことが知ら
れている。
付近であり、また、その特異性は極めて低いことが知ら
れている。
【０００８】のペプチド交換活性は、１ ｍＭ 程度
の上記前駆体ペプチドを基質とし、１Ｍ以上のアミノ酸
又はペプチドなどの求核試薬の存在下、アルカリ側ｐＨ
において至適領域を示す。
の上記前駆体ペプチドを基質とし、１Ｍ以上のアミノ酸
又はペプチドなどの求核試薬の存在下、アルカリ側ｐＨ
において至適領域を示す。
【０００９】したがって、上記のＣ末端アミド化方法
は、このうちの活性のみを利用していることに特徴づ
けられている。
は、このうちの活性のみを利用していることに特徴づ
けられている。
【００１０】一方、遺伝子工学の技術によるペプチドの
生産においてペプチドの分子量が比較的小さい場合は、
化学構造が安定な状態で発現させるために、他の蛋白質
と連結させた分子量の大きい融合蛋白質として発現さ
せ、その融合蛋白質を切断することにより切り出す方法
が一般的である。目的ペプチドを融合蛋白質から切り出
す手段には一般的にある種のプロテアーゼを用いたペプ
チド切断法が利用されるが、そのために目的ペプチドと
他の蛋白質との間に切断方法に対応した単一または複数
のアミノ酸残基がリンカー部分として挿入されている。
そして、融合蛋白質において、目的ペプチドのあとに他
の蛋白質が結合している場合は、切り出し反応後に、目
的ペプチドは、単一又は複数のアミノ酸残基がＣ末端側
に付加されたものとして得られてくる。
生産においてペプチドの分子量が比較的小さい場合は、
化学構造が安定な状態で発現させるために、他の蛋白質
と連結させた分子量の大きい融合蛋白質として発現さ
せ、その融合蛋白質を切断することにより切り出す方法
が一般的である。目的ペプチドを融合蛋白質から切り出
す手段には一般的にある種のプロテアーゼを用いたペプ
チド切断法が利用されるが、そのために目的ペプチドと
他の蛋白質との間に切断方法に対応した単一または複数
のアミノ酸残基がリンカー部分として挿入されている。
そして、融合蛋白質において、目的ペプチドのあとに他
の蛋白質が結合している場合は、切り出し反応後に、目
的ペプチドは、単一又は複数のアミノ酸残基がＣ末端側
に付加されたものとして得られてくる。
【００１１】したがって、前述の前駆体ペプチドを遺伝
子工学の手法で得る場合においても、切り出し反応後
は、前駆体ペプチドのＣ末端側に単一又は複数のアミノ
酸残基残基が付加したものが得られていた。
子工学の手法で得る場合においても、切り出し反応後
は、前駆体ペプチドのＣ末端側に単一又は複数のアミノ
酸残基残基が付加したものが得られていた。
【００１２】そして、従来は、これらのアミノ酸残基に
特異的なエキソ・ペプチダ−ゼを作用させ、前述の前駆
体ペプチドを得る以外に方法はなかった。
特異的なエキソ・ペプチダ−ゼを作用させ、前述の前駆
体ペプチドを得る以外に方法はなかった。
【００１３】例えば、前駆体ペプチド（Ｃ末端側アミノ
酸残基がロイシンであるものを例にする。）の融合蛋白
質からの切り出し反応にクロストリパインを使用した場
合、切り出し反応後得られるペプチドのＣ末端部分のア
ミノ酸配列はプロリルロイシルアルギニンである。この
場合、アミド化反応を行うために前駆体ペプチドを得る
べく、カルボキシペプチダーゼＢを用いてＣ末端アルギ
ニンを取り除く工程を経由しなければならない。
酸残基がロイシンであるものを例にする。）の融合蛋白
質からの切り出し反応にクロストリパインを使用した場
合、切り出し反応後得られるペプチドのＣ末端部分のア
ミノ酸配列はプロリルロイシルアルギニンである。この
場合、アミド化反応を行うために前駆体ペプチドを得る
べく、カルボキシペプチダーゼＢを用いてＣ末端アルギ
ニンを取り除く工程を経由しなければならない。
【００１４】また、切り出し反応にｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ Ｖ８プロテアーゼを使用す
る場合は、得られるペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配
列はプロリルロイシルグルタミン酸であり、アミド化反
応前駆体ペプチドを得るべくグルタミン酸のみを取り除
く方法はない。以上のように、従来は、Ｃ末端アミド化
反応を行なう前に、付加アミノ酸残基を除去する工程を
経る必要があった。
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ Ｖ８プロテアーゼを使用す
る場合は、得られるペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配
列はプロリルロイシルグルタミン酸であり、アミド化反
応前駆体ペプチドを得るべくグルタミン酸のみを取り除
く方法はない。以上のように、従来は、Ｃ末端アミド化
反応を行なう前に、付加アミノ酸残基を除去する工程を
経る必要があった。
【００１５】なお、前述したように、カルボキシペプチ
ダーゼＹもペプチダ−ゼ活性を有することは知られてい
たが、(イ) 中性付近のｐＨにおいて、該酵素のペプチダ
−ゼ活性は特異性が低いため、前述の前駆体ペプチドに
おいては、プロリンとロイシン等の間のペプチド結合
や、プロリンとさらにそのＮ末端側のアミノ酸残基との
ペプチド結合も切断するおそれが考えられ、(ロ) Ｃ末端
アミド化反応を行なうｐＨ領域においては、ペプチダー
ゼ活性自体は低い等の理由から、カルボキシペプチダー
ゼＹ自体をＣ末端側付加アミノ酸残基を除去する工程に
使用することは不適当と考えられていた。
ダーゼＹもペプチダ−ゼ活性を有することは知られてい
たが、(イ) 中性付近のｐＨにおいて、該酵素のペプチダ
−ゼ活性は特異性が低いため、前述の前駆体ペプチドに
おいては、プロリンとロイシン等の間のペプチド結合
や、プロリンとさらにそのＮ末端側のアミノ酸残基との
ペプチド結合も切断するおそれが考えられ、(ロ) Ｃ末端
アミド化反応を行なうｐＨ領域においては、ペプチダー
ゼ活性自体は低い等の理由から、カルボキシペプチダー
ゼＹ自体をＣ末端側付加アミノ酸残基を除去する工程に
使用することは不適当と考えられていた。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、(a) カ
ルボキシペプチダーゼＹは、Ｃ末端側アミド化反応を行
なう至適ｐＨ領域においても、相当のペプチダ−ゼ活性
を有すること、(b) しかるに、該ペプチダ−ゼ活性は、
同一の条件下にてプロリンのＣ末端側又はＮ末端側のペ
プチド結合については、僅かにしか切断しないこと、を
見出し、したがって、(c) アミド化しようとするプロリ
ンのαーカルボキシル基側にさらに単一又は複数のアミ
ノ酸残基が結合している場合においても、カルボキシペ
プチダーゼＹのみを用いても、最終的にＣ末端プロリン
アミドを有するペプチドが得られることを見出し、本発
明を完成した。
ルボキシペプチダーゼＹは、Ｃ末端側アミド化反応を行
なう至適ｐＨ領域においても、相当のペプチダ−ゼ活性
を有すること、(b) しかるに、該ペプチダ−ゼ活性は、
同一の条件下にてプロリンのＣ末端側又はＮ末端側のペ
プチド結合については、僅かにしか切断しないこと、を
見出し、したがって、(c) アミド化しようとするプロリ
ンのαーカルボキシル基側にさらに単一又は複数のアミ
ノ酸残基が結合している場合においても、カルボキシペ
プチダーゼＹのみを用いても、最終的にＣ末端プロリン
アミドを有するペプチドが得られることを見出し、本発
明を完成した。
【００１７】本発明によれば、前述したような、切り出
し反応後に得られる前駆体ペプチドに余分に結合してい
るアミノ酸残基を取り除く操作を経ることなく製造工程
が簡略化でき、より簡便に遺伝子操作法にてＣ末端プロ
リンアミドを有するペプチドを生産することができる。
し反応後に得られる前駆体ペプチドに余分に結合してい
るアミノ酸残基を取り除く操作を経ることなく製造工程
が簡略化でき、より簡便に遺伝子操作法にてＣ末端プロ
リンアミドを有するペプチドを生産することができる。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）Ｃ末端
プロリンにロイシン、イソロイシン、バリン、フエニル
アラニン及びアラニンから選ばれた一種のアミノ酸残基
が結合し、そのあとにさらに１個又は２個以上のアミノ
酸残基が結合しているペプチドを基質とし、アンモニア
存在下にてカルボキシペプチダーゼＹを作用させること
による、Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製
法（但し、上記結合している１個又は２個以上のアミノ
酸残基においてプロリンを除く。）、（２）（１）記載
のペプチドの製法において、カルボキシペプチダーゼＹ
が最終濃度１〜５ μM 存在下、かつ、Ｃ末端プロリン
にロイシン、イソロイシン、バリン、フエニルアラニン
及びアラニンから選ばれた一種のアミノ酸残基が結合
し、そのあとにさらに１個又は２個以上のアミノ酸残基
が結合しているペプチドが最終濃度０．１〜０．３ mM
存在下において実施することを特徴とする、ペプチド
の製法、（３）（１）又は（２）記載のペプチドの製法
において、ｐＨが8.0 以上で実施することを特徴とす
る、ペプチドの製法、（４）（１）、（２）又は（３）
記載のペプチドの製法において、温度が２５〜５５℃で
実施することを特徴とする、ペプチドの製法に関する。
プロリンにロイシン、イソロイシン、バリン、フエニル
アラニン及びアラニンから選ばれた一種のアミノ酸残基
が結合し、そのあとにさらに１個又は２個以上のアミノ
酸残基が結合しているペプチドを基質とし、アンモニア
存在下にてカルボキシペプチダーゼＹを作用させること
による、Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製
法（但し、上記結合している１個又は２個以上のアミノ
酸残基においてプロリンを除く。）、（２）（１）記載
のペプチドの製法において、カルボキシペプチダーゼＹ
が最終濃度１〜５ μM 存在下、かつ、Ｃ末端プロリン
にロイシン、イソロイシン、バリン、フエニルアラニン
及びアラニンから選ばれた一種のアミノ酸残基が結合
し、そのあとにさらに１個又は２個以上のアミノ酸残基
が結合しているペプチドが最終濃度０．１〜０．３ mM
存在下において実施することを特徴とする、ペプチド
の製法、（３）（１）又は（２）記載のペプチドの製法
において、ｐＨが8.0 以上で実施することを特徴とす
る、ペプチドの製法、（４）（１）、（２）又は（３）
記載のペプチドの製法において、温度が２５〜５５℃で
実施することを特徴とする、ペプチドの製法に関する。
【００１９】アミド化反応を行う至適ｐＨは、例えば、
温度４５℃では８．４〜 ８．５であり、温度３７℃で
は、８．９〜９．２である。ｐＨ８．０以下ではカルボ
キシペプチダーゼＹのペプチダーゼ活性がアミド化活性
より優先し殆どアミド化生成物を得ることができない。
アミド化反応温度は、２５〜５５℃でも行い得るが、４
５〜５０℃の時最も反応収率が高い。２５℃以下または
５５℃以上では、反応収率は低くなる。以上の条件のも
とに反応させた時の反応時間は、４５〜５０℃の温度で
反応させた場合は、０．５〜１時間が好ましく、これ以
上の反応時間の延長は生成物の分解が生じ、収率の低下
を招く。
温度４５℃では８．４〜 ８．５であり、温度３７℃で
は、８．９〜９．２である。ｐＨ８．０以下ではカルボ
キシペプチダーゼＹのペプチダーゼ活性がアミド化活性
より優先し殆どアミド化生成物を得ることができない。
アミド化反応温度は、２５〜５５℃でも行い得るが、４
５〜５０℃の時最も反応収率が高い。２５℃以下または
５５℃以上では、反応収率は低くなる。以上の条件のも
とに反応させた時の反応時間は、４５〜５０℃の温度で
反応させた場合は、０．５〜１時間が好ましく、これ以
上の反応時間の延長は生成物の分解が生じ、収率の低下
を招く。
【００２０】アミド化反応を効率良く行うためには、よ
り高濃度のアンモニア溶液を使用することが好ましく、
その調製時に目的ｐＨも調整する。高濃度アンモニア溶
液の好ましい調製法としては、基本的にはTamaoki の方
法（特開昭６２−２９９９７号）により行い得るが、他
に、以下のような方法を例示できる。
り高濃度のアンモニア溶液を使用することが好ましく、
その調製時に目的ｐＨも調整する。高濃度アンモニア溶
液の好ましい調製法としては、基本的にはTamaoki の方
法（特開昭６２−２９９９７号）により行い得るが、他
に、以下のような方法を例示できる。
【００２１】（１）あらかじめ濃アンモニア水（29% ）
を１０Ｍ程度に蒸留水で希釈した溶液に濃塩酸を少量づ
つ加え、以後２５℃に保ちながらｐＨ８．９に調整す
る。この調製液は４５℃でｐＨ ８．５を示し、６．５
Ｍ程度のアンモニア濃度になっている。
を１０Ｍ程度に蒸留水で希釈した溶液に濃塩酸を少量づ
つ加え、以後２５℃に保ちながらｐＨ８．９に調整す
る。この調製液は４５℃でｐＨ ８．５を示し、６．５
Ｍ程度のアンモニア濃度になっている。
【００２２】（２）あらかじめ６０℃程度に加温した６
３５ｍｌの蒸留水に３２６ｇの塩化アンモニウムを加え
撹拌する。完全に塩化アンモニウムが溶解した後に温度
を４５℃に下げ、撹拌を続けるとともに４５℃に保ちな
がら１３０ｍｌの２９％アンモニア水を少量づつ加え
る。この状態でｐＨ８．４〜８．５を示し、アンモニア
濃度は８．３Ｍになっている。この調製液は、温度が下
がると塩化アンモニウムが析出してくるので、保存する
場合は４５℃に保つ必要がある。
３５ｍｌの蒸留水に３２６ｇの塩化アンモニウムを加え
撹拌する。完全に塩化アンモニウムが溶解した後に温度
を４５℃に下げ、撹拌を続けるとともに４５℃に保ちな
がら１３０ｍｌの２９％アンモニア水を少量づつ加え
る。この状態でｐＨ８．４〜８．５を示し、アンモニア
濃度は８．３Ｍになっている。この調製液は、温度が下
がると塩化アンモニウムが析出してくるので、保存する
場合は４５℃に保つ必要がある。
【００２３】（３）５７８ｍｌの２９％アンモニア水に
４０ｍｌの蒸留水を加え混和、４５℃に加温し、４５
℃を保ちながら撹拌中５７１ｍｌの濃塩酸を少量づつ加
える。この状態でｐＨ８．４〜８．５を示し、アンモニ
ア濃度は８．２Ｍになっている。この調製液は、温度が
下がると塩化アンモニウム塩が析出してくるので、保存
する場合は４５℃に保つ必要がある。以上の方法によっ
て得られるいずれのアンモニア溶液もアミド化反応に使
用することができるが、反応は基質溶液、酵素溶液及び
アンモニア溶液を混合して行うので、反応溶液の最終ア
ンモニア濃度は使用前のそれより低下する。また、基質
溶液や酵素溶液を使用するアンモニア溶液で調製するこ
ともでき、この場合はより高いアンモニア濃度を保つこ
とができる。通常、反応は基質溶液、カルボキシペプチ
ダーゼＹ溶液及びアンモニア溶液を１：１：８の割合で
混合し行うが、基質溶液量や酵素溶液量を少なくしてア
ンモニア溶液量の割合を多くすることもできる。ただ
し、基質が析出しない液量比でなければならない。
４０ｍｌの蒸留水を加え混和、４５℃に加温し、４５
℃を保ちながら撹拌中５７１ｍｌの濃塩酸を少量づつ加
える。この状態でｐＨ８．４〜８．５を示し、アンモニ
ア濃度は８．２Ｍになっている。この調製液は、温度が
下がると塩化アンモニウム塩が析出してくるので、保存
する場合は４５℃に保つ必要がある。以上の方法によっ
て得られるいずれのアンモニア溶液もアミド化反応に使
用することができるが、反応は基質溶液、酵素溶液及び
アンモニア溶液を混合して行うので、反応溶液の最終ア
ンモニア濃度は使用前のそれより低下する。また、基質
溶液や酵素溶液を使用するアンモニア溶液で調製するこ
ともでき、この場合はより高いアンモニア濃度を保つこ
とができる。通常、反応は基質溶液、カルボキシペプチ
ダーゼＹ溶液及びアンモニア溶液を１：１：８の割合で
混合し行うが、基質溶液量や酵素溶液量を少なくしてア
ンモニア溶液量の割合を多くすることもできる。ただ
し、基質が析出しない液量比でなければならない。
【００２４】アミド化反応の生成物の同定及び精製は、
イオン交換カラムクロマトグラフイーや高速液体クロマ
トグラフイーなど周知の精製法を用いて行うことができ
る。
イオン交換カラムクロマトグラフイーや高速液体クロマ
トグラフイーなど周知の精製法を用いて行うことができ
る。
【００２５】
【実施例】次に、実施例及び参考例をあげて本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
尚、実施例中、ＣＢＺ：カルボベンゾキシ、Ａｌａ：ア
ラニン、Ｐｒｏ：プロリン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｌｙ
ｓ：リジン、Ａｒｇ：アルギニン、を示す。
らに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
尚、実施例中、ＣＢＺ：カルボベンゾキシ、Ａｌａ：ア
ラニン、Ｐｒｏ：プロリン、Ｌｅｕ：ロイシン、Ｌｙ
ｓ：リジン、Ａｒｇ：アルギニン、を示す。
【００２６】実施例１ 合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−ＯＨを１．６ｍＭになるように４０％ジオキサン
水溶液に溶解した。本ペプチド基質は水難溶のために４
０％ジオキサン水溶液を使用したが、以下のアミド化反
応に於て影響はなかった。氷冷した１０Ｍのアンモニア
水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながらｐ
Ｈ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得た。
カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１．
７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように、上記アンモニ
ア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌのカ
ルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモニ
ア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液中
の基質の最終濃度は０．１６ｍＭであり、カルボキシペ
プチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニアの
それは５．１２Ｍである。その後、反応は１５０μｌの
濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えることに
より停止させた。反応停止後の最終容量は１１５５μｌ
になる。この溶液の５００μｌ及び基質溶液の３３μｌ
を逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤ
Ｓ−１２０Ｔ ７．８ｍｍ × ３０ ｃｍ）に付し、
１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニト
リル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配
で上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２
５ｎｍで検出することにより、基質は２３．２分に溶出
され、１１．３分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ、１
６．３分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２
２．２分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 を認めた。
以上から、初期基質量に対する各々の生成収率をクロマ
トグラム上の標準品に対する面積値から算出した結果、
アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 は４
３．５％、反応副産物であるＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
ＯＨは２８．０％、ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
ＯＨは１７．６％であった。
ｙｓ−ＯＨを１．６ｍＭになるように４０％ジオキサン
水溶液に溶解した。本ペプチド基質は水難溶のために４
０％ジオキサン水溶液を使用したが、以下のアミド化反
応に於て影響はなかった。氷冷した１０Ｍのアンモニア
水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながらｐ
Ｈ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得た。
カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１．
７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように、上記アンモニ
ア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌのカ
ルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモニ
ア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液中
の基質の最終濃度は０．１６ｍＭであり、カルボキシペ
プチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニアの
それは５．１２Ｍである。その後、反応は１５０μｌの
濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えることに
より停止させた。反応停止後の最終容量は１１５５μｌ
になる。この溶液の５００μｌ及び基質溶液の３３μｌ
を逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤ
Ｓ−１２０Ｔ ７．８ｍｍ × ３０ ｃｍ）に付し、
１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニト
リル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配
で上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２
５ｎｍで検出することにより、基質は２３．２分に溶出
され、１１．３分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＨ、１
６．３分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２
２．２分にＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 を認めた。
以上から、初期基質量に対する各々の生成収率をクロマ
トグラム上の標準品に対する面積値から算出した結果、
アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 は４
３．５％、反応副産物であるＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
ＯＨは２８．０％、ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
ＯＨは１７．６％であった。
【００２７】実施例２ 合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−ＯＨを１．６ｍＭになるように４０％ジオキサン
水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍのアンモニア水に濃
塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながらｐＨ８．
９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得た。カルボ
キシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１．７ｍｇ
／ｍｌ（２５μＭ）になるように、上記アンモニア溶液
に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌのカルボキ
シペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモニア溶液
を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液中の基質
の最終濃度は０．１６ｍＭであり、カルボキシペプチダ
ーゼＹのそれは２．５μＭ、アンモニアのそれは５．１
２Ｍである。その後、反応は１５０μｌの濃ぎ酸及び
０．３８ｇの尿素を加えることにより停止させた。反応
停止後の最終容量は１１５５μｌになる。この溶液の５
００μｌ及び基質溶液の３３μｌを逆相系高速液体クロ
マトカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ：７．８
ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、１０ｍＭ重炭酸アンモニ
ウム溶液をベースにアセトニトリル濃度を１５％から４
５％まで４０分の直線濃度勾配で上げ、２．５ｍｌ／分
の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで検出することに
より基質は２４．３分に溶出された。アミド化生成物Ｃ
ＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 は初期基質量に対し３
９．３％の反応収率で得られた。
ｒｇ−ＯＨを１．６ｍＭになるように４０％ジオキサン
水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍのアンモニア水に濃
塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながらｐＨ８．
９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得た。カルボ
キシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１．７ｍｇ
／ｍｌ（２５μＭ）になるように、上記アンモニア溶液
に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌのカルボキ
シペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモニア溶液
を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液中の基質
の最終濃度は０．１６ｍＭであり、カルボキシペプチダ
ーゼＹのそれは２．５μＭ、アンモニアのそれは５．１
２Ｍである。その後、反応は１５０μｌの濃ぎ酸及び
０．３８ｇの尿素を加えることにより停止させた。反応
停止後の最終容量は１１５５μｌになる。この溶液の５
００μｌ及び基質溶液の３３μｌを逆相系高速液体クロ
マトカラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−１２０Ｔ：７．８
ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、１０ｍＭ重炭酸アンモニ
ウム溶液をベースにアセトニトリル濃度を１５％から４
５％まで４０分の直線濃度勾配で上げ、２．５ｍｌ／分
の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで検出することに
より基質は２４．３分に溶出された。アミド化生成物Ｃ
ＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2 は初期基質量に対し３
９．３％の反応収率で得られた。
【００２８】実施例３ 合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
（Ａｌａ）3 −ＯＨを１．１ｍＭになるように４０％ジ
オキサン水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍアンモニア
水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃にたもちながら
ｐＨ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得
た。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を
１．７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように上記アンモ
ニア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌの
カルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモ
ニア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液
中の基質の最終濃度は０．１１ｍＭであり、カルボキシ
ペプチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニア
のそれは５．１２Ｍである。その後、反応は１５０μｌ
の濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えること
により停止させた。反応停止後の最終容量は１１５５μ
ｌになる。この溶液の５００μｌ及び基質溶液の３３μ
ｌを逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｏ
ＤＳ−１２０Ｔ７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、１
０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニトリ
ル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配で
上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２５
ｎｍで検出することにより、基質は１８．３分に溶出さ
れた。アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2
は初期基質量に対し３６．４％の反応収率で得られた。
（Ａｌａ）3 −ＯＨを１．１ｍＭになるように４０％ジ
オキサン水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍアンモニア
水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃にたもちながら
ｐＨ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得
た。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を
１．７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように上記アンモ
ニア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌの
カルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモ
ニア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液
中の基質の最終濃度は０．１１ｍＭであり、カルボキシ
ペプチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニア
のそれは５．１２Ｍである。その後、反応は１５０μｌ
の濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えること
により停止させた。反応停止後の最終容量は１１５５μ
ｌになる。この溶液の５００μｌ及び基質溶液の３３μ
ｌを逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｏ
ＤＳ−１２０Ｔ７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、１
０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニトリ
ル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配で
上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２５
ｎｍで検出することにより、基質は１８．３分に溶出さ
れた。アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ2
は初期基質量に対し３６．４％の反応収率で得られた。
【００２９】実施例４ 合成ペプチド基質ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−
（Ａｌａ）5 ーＯＨを１．０ｍＭになるように４０％ジ
オキサン水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍのアンモニ
ア水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながら
ｐＨ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得
た。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を
１．７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように上記アンモ
ニア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌの
カルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモ
ニア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液
中の基質の最終濃度は０．１０ｍＭであり、カルボキシ
ペプチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニア
のそれは５．１２Ｍである。その後、反応は １５０μ
ｌの濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えるこ
とにより停止させた。反応停止後の最終液量は１１５５
μｌになる。この溶液の５５０μｌ及び基質溶液の３３
μｌを逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ
ＯＤＳー１２０Ｔ７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、
１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニト
リル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配
で上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２
５ｎｍで検出することにより、基質は２０．１分に溶出
された。アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ
2は初期基質量に対し３０．３％の反応収率で得られ
た。
（Ａｌａ）5 ーＯＨを１．０ｍＭになるように４０％ジ
オキサン水溶液に溶解した。氷冷した１０Ｍのアンモニ
ア水に濃塩酸を少量ずつ加え、以後２５℃に保ちながら
ｐＨ８．９に調整し、６．４Ｍのアンモニア溶液を得
た。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を
１．７ｍｇ／ｍｌ（２５μＭ）になるように上記アンモ
ニア溶液に溶解した。７５μｌの基質溶液、７５μｌの
カルボキシペプチダーゼＹ溶液及び６００μｌのアンモ
ニア溶液を混和し、５０℃で３０分反応した。反応溶液
中の基質の最終濃度は０．１０ｍＭであり、カルボキシ
ペプチダーゼＹのそれは２．５μＭであり、アンモニア
のそれは５．１２Ｍである。その後、反応は １５０μ
ｌの濃ぎ酸（９９％）及び０．３８ｇの尿素を加えるこ
とにより停止させた。反応停止後の最終液量は１１５５
μｌになる。この溶液の５５０μｌ及び基質溶液の３３
μｌを逆相系高速液体クロマトカラム（ＴＳＫｇｅｌ
ＯＤＳー１２０Ｔ７．８ｍｍ × ３０ｃｍ）に付し、
１０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニト
リル濃度を１５％から４５％まで４０分の直線濃度勾配
で上げ、２．５ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２
５ｎｍで検出することにより、基質は２０．１分に溶出
された。アミド化生成物ＣＢＺ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＮＨ
2は初期基質量に対し３０．３％の反応収率で得られ
た。
【００３０】実施例５ ヒトカルシトニンはＣ末端にＰｒｏ−ＮＨ2 を有する３
２個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモンであ
る。人工的にこれを生産する場合も本発明の方法に従っ
てＣ末端をアミド化することができる。
２個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモンであ
る。人工的にこれを生産する場合も本発明の方法に従っ
てＣ末端をアミド化することができる。
【００３１】ペプチド合成機（アプライド・バイオシス
テムズ・ジャパン社製 430 型）を用い、ヒトカルシト
ニンーＬｅｕ−Ａｒｇを化学合成法にて製造した。
テムズ・ジャパン社製 430 型）を用い、ヒトカルシト
ニンーＬｅｕ−Ａｒｇを化学合成法にて製造した。
【００３２】合成操作における支持担体としては、HMP
（4-hydroxymethylphenoxymethyl:４−ヒドロキシメチ
ルフェノキシメチル）レジン（アプライド・バイオシス
テムズ・ジャパン社製）を用い、合成手法として、Fmoc
HOBT/NMP 法を採用した。各工程のアミノ酸縮合収率の
平均値は 98.5% であった。
（4-hydroxymethylphenoxymethyl:４−ヒドロキシメチ
ルフェノキシメチル）レジン（アプライド・バイオシス
テムズ・ジャパン社製）を用い、合成手法として、Fmoc
HOBT/NMP 法を採用した。各工程のアミノ酸縮合収率の
平均値は 98.5% であった。
【００３３】合成終了後、同合成機上でピペリジン法に
よりアミノ末端の Fmoc 保護基をはずした後、ＴＦＡ：
エタンジチオール：アニソール：エチルメチルスルフィ
ド＝９３：１：３：３の溶液中で室温、３時間処理する
ことにより、脱保護及び支持担体からの切断を行った。
よりアミノ末端の Fmoc 保護基をはずした後、ＴＦＡ：
エタンジチオール：アニソール：エチルメチルスルフィ
ド＝９３：１：３：３の溶液中で室温、３時間処理する
ことにより、脱保護及び支持担体からの切断を行った。
【００３４】このものに７倍量のジエチルエーテル（氷
冷）を加えペプチドを沈殿せしめ、6 μm のメンブレン
・フィルター（東洋濾紙（株）製： RF060）でろ過して
回収した。
冷）を加えペプチドを沈殿せしめ、6 μm のメンブレン
・フィルター（東洋濾紙（株）製： RF060）でろ過して
回収した。
【００３５】残渣を 2ml ＴＦＡで溶解させて回収し、
100 倍量の蒸留水を加えた後に凍結乾燥した。この凍結
乾燥粉末を 0.1% ＴＦＡに溶解させ、その1/200 量をＨ
ＰＬＣカラムに供与し、以下の条件によりクロマトを行
った。
100 倍量の蒸留水を加えた後に凍結乾燥した。この凍結
乾燥粉末を 0.1% ＴＦＡに溶解させ、その1/200 量をＨ
ＰＬＣカラムに供与し、以下の条件によりクロマトを行
った。
【００３６】カラム：ＹＭＣ ＡＭ−３０１ （直径：
4.6 mm × 100 mm ） 溶媒：0.1% ＴＦＡ中において、アセトニトリル20%
（０分）より50% （１０分）の直線濃度勾配 流速： 2ml/ 分 保持時間：6.4 分にて溶出 ヒトカルシトニンーＬｅｕ−Ａｒｇは最終的に 1 mg 得
られた。
4.6 mm × 100 mm ） 溶媒：0.1% ＴＦＡ中において、アセトニトリル20%
（０分）より50% （１０分）の直線濃度勾配 流速： 2ml/ 分 保持時間：6.4 分にて溶出 ヒトカルシトニンーＬｅｕ−Ａｒｇは最終的に 1 mg 得
られた。
【００３７】上記の手法により得られたヒトカルシトニ
ンーＬｅｕ−Ａｒｇを、先ずＲ．Ｄａｖｉｄ．Ｃｏｌｅ
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏーｇ
ｙｖｏｌ. II 、Ｅｄ．ｂｙ Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．
Ｗ．、ｐｐ２０６（１９６７）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ）
に従って可逆的Ｓースルホン酸化を行った。このジスル
フイド結合のＳースルホン酸化は、反応液中での試料の
不溶化を防ぐためのものである。３２６ｇの塩化アンモ
ニウムを 635 ml の蒸留水に加温溶解後、温度を４５℃
に保ちながら１３０ｍｌの２９％アンモニア水を少量ず
つ添加しアンモニア溶液を調製した。この状態で、ｐＨ
８．４〜８．５を示しアンモニア濃度は８．３Ｍになっ
ている。この調製液は温度が下がると塩化アンモニウム
が析出するので４５℃の状態で保存した。Ｓ−スルホン
酸化ヒトカルシトニン−Ｌｅｕ−Ａｒｇを３ｍＭになる
ように５０％ジメチルスルホキシドに溶解した。カルボ
キシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１２．２ｍ
ｇ／ｍｌ（０．２ｍＭ）を蒸留水に溶解した。２０ｍｌ
の基質溶液と２００ｍｌの上記アンモニア溶液を混合
後、直ちに０．６ｍｌのカルボキシペプチダーゼＹ溶液
を添加し、４５℃で３０分反応した。反応溶液中の基質
の最終濃度は０．２７ｍＭであり、カルボキシペプチダ
ーゼＹのそれは５μＭであり、アンモニアのそれは７．
５Ｍであった。その後、反応は４４ｍｌ（９９％）の濃
ぎ酸及び１１０ｇの尿素を加えることにより停止させ
た。反応停止後の最終液量は３３０ｍｌになる。
ンーＬｅｕ−Ａｒｇを、先ずＲ．Ｄａｖｉｄ．Ｃｏｌｅ
の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏーｇ
ｙｖｏｌ. II 、Ｅｄ．ｂｙ Ｈｉｒｓ，Ｃ．Ｈ．
Ｗ．、ｐｐ２０６（１９６７）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ）
に従って可逆的Ｓースルホン酸化を行った。このジスル
フイド結合のＳースルホン酸化は、反応液中での試料の
不溶化を防ぐためのものである。３２６ｇの塩化アンモ
ニウムを 635 ml の蒸留水に加温溶解後、温度を４５℃
に保ちながら１３０ｍｌの２９％アンモニア水を少量ず
つ添加しアンモニア溶液を調製した。この状態で、ｐＨ
８．４〜８．５を示しアンモニア濃度は８．３Ｍになっ
ている。この調製液は温度が下がると塩化アンモニウム
が析出するので４５℃の状態で保存した。Ｓ−スルホン
酸化ヒトカルシトニン−Ｌｅｕ−Ａｒｇを３ｍＭになる
ように５０％ジメチルスルホキシドに溶解した。カルボ
キシペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を１２．２ｍ
ｇ／ｍｌ（０．２ｍＭ）を蒸留水に溶解した。２０ｍｌ
の基質溶液と２００ｍｌの上記アンモニア溶液を混合
後、直ちに０．６ｍｌのカルボキシペプチダーゼＹ溶液
を添加し、４５℃で３０分反応した。反応溶液中の基質
の最終濃度は０．２７ｍＭであり、カルボキシペプチダ
ーゼＹのそれは５μＭであり、アンモニアのそれは７．
５Ｍであった。その後、反応は４４ｍｌ（９９％）の濃
ぎ酸及び１１０ｇの尿素を加えることにより停止させ
た。反応停止後の最終液量は３３０ｍｌになる。
【００３８】先ず反応を確認するために、反応終了液の
２０μｌを分析用逆相系高速液体クロマトカラム（ＹＭ
Ｃ：ＡＭ３１２ ６ｍｍ × １５ｃｍ）に付し、１０
ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニトリル
濃度を２４％から２９％まで１６分の直線濃度勾配で上
げ、１ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで
検出することにより、アミド化生成物Ｓ−スルホン酸化
ヒトカルシトニンが１４．３分に、残存する基質が１
１．６分に溶出されることを認め、その他少量の反応副
産物の存在も認めた。各々の生成量を標準品に対する面
積値から算出した結果、アミド化生成物Ｓ−スルホン化
ヒトカルシトニンの初期基質に対する反応収率は４５．
５％であった。
２０μｌを分析用逆相系高速液体クロマトカラム（ＹＭ
Ｃ：ＡＭ３１２ ６ｍｍ × １５ｃｍ）に付し、１０
ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液をベースにアセトニトリル
濃度を２４％から２９％まで１６分の直線濃度勾配で上
げ、１ｍｌ／分の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで
検出することにより、アミド化生成物Ｓ−スルホン酸化
ヒトカルシトニンが１４．３分に、残存する基質が１
１．６分に溶出されることを認め、その他少量の反応副
産物の存在も認めた。各々の生成量を標準品に対する面
積値から算出した結果、アミド化生成物Ｓ−スルホン化
ヒトカルシトニンの初期基質に対する反応収率は４５．
５％であった。
【００３９】次に反応生成物を採取するために、上記反
応終了液の２５０ｍｌを分取用逆相系高速液体クロマト
カラム（ＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ−２３０−２０−ＳＭ
２０ｍｍ × ３００ｃｍ）に付し、１０ｍＭ重炭酸ア
ンモニウム溶液をベースにアセトニトリル濃度を２３％
から２８％まで３０分の直線濃度勾配で上げ、１６ｍｌ
／分の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで検出するこ
とにより２２．５分に溶出されるアミド化生成物Ｓ−ス
ルホン酸化ヒトカルシトニンの画分を集めた。さらに、
分画液に還元型グルタチオンを最終濃度２ｍＭ及びエチ
レンジアミン四酢酸を最終濃度１ｍＭになるように添加
し、２９％アンモニア水でｐＨ８．５に調整後、室温、
２時間の条件で脱Ｓ−スルホン酸化反応を行うことによ
り５５ｍｇのヒトカルシトニンを得た。
応終了液の２５０ｍｌを分取用逆相系高速液体クロマト
カラム（ＹＭＣｇｅｌ ＯＤＳ−２３０−２０−ＳＭ
２０ｍｍ × ３００ｃｍ）に付し、１０ｍＭ重炭酸ア
ンモニウム溶液をベースにアセトニトリル濃度を２３％
から２８％まで３０分の直線濃度勾配で上げ、１６ｍｌ
／分の流速で溶出した。紫外部２２５ｎｍで検出するこ
とにより２２．５分に溶出されるアミド化生成物Ｓ−ス
ルホン酸化ヒトカルシトニンの画分を集めた。さらに、
分画液に還元型グルタチオンを最終濃度２ｍＭ及びエチ
レンジアミン四酢酸を最終濃度１ｍＭになるように添加
し、２９％アンモニア水でｐＨ８．５に調整後、室温、
２時間の条件で脱Ｓ−スルホン酸化反応を行うことによ
り５５ｍｇのヒトカルシトニンを得た。
【００４０】
【発明の効果】以上のように、本発明により、アミド化
しようとするプロリンのα−カルボキシ側にさらに単一
又は複数のアミノ酸残基が結合している場合において
も、カルボキシペプチダ−ゼＹのみを用いて、最終的に
Ｃ末端プロリンアミドを有するペプチドを効率よく得る
ことが可能である。本発明の方法は、遺伝子操作の分野
において広く応用し得るものである。
しようとするプロリンのα−カルボキシ側にさらに単一
又は複数のアミノ酸残基が結合している場合において
も、カルボキシペプチダ−ゼＹのみを用いて、最終的に
Ｃ末端プロリンアミドを有するペプチドを効率よく得る
ことが可能である。本発明の方法は、遺伝子操作の分野
において広く応用し得るものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石川 裕一 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 川口 淳子 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (56)参考文献 特開 昭62−29997（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】Ｃ末端プロリンにロイシン、イソロイシ
ン、バリン、フエニルアラニン及びアラニンから選ばれ
た一種のアミノ酸残基が結合し、そのあとにさらに１個
又は２個以上のアミノ酸残基が結合しているペプチドを
基質とし、アンモニア存在下にてカルボキシペプチダー
ゼＹを作用させることによる、Ｃ末端にプロリンアミド
を有するペプチドの製法（但し、上記結合している１個
又は２個以上のアミノ酸残基中において、プロリンを除
く）。 - 【請求項２】請求項１記載のペプチドの製法において、
カルボキシペプチダーゼＹが最終濃度１〜５ μM 存在
下、かつ、Ｃ末端プロリンにロイシン、イソロイシン、
バリン、フエニルアラニン及びアラニンから選ばれた一
種のアミノ酸残基が結合し、そのあとにさらに１個又は
２個以上のアミノ酸残基が結合しているペプチドが最終
濃度０．１〜０．３ mM 存在下において実施すること
を特徴とする、ペプチドの製法。 - 【請求項３】請求項１又は２記載のペプチドの製法にお
いて、ｐＨが8.0 以上で実施することを特徴とする、ペ
プチドの製法。 - 【請求項４】請求項１、２又は３記載のペプチドの製法
において、温度が２５〜５５℃で実施することを特徴と
する、ペプチドの製法。
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| JP4-120959 | 1992-05-14 | ||
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