JPH0570433B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＣ末端にプロリンアミドを有するペプ
チドの製法に関する。生体内に存在するある種の
蛋白質やホルモンは、そのペプチド鎖のＣ末端ア
ミノ酸のα−カルボキシル基がアミド化されてお
り、酸アミドが形成されている。そして、この酸
アミド基は、一般にその蛋白質やホルモンの活性
発現に重要な役割を行なつている。生体内におけ
るこのようなＣ末端酸アミド基の形成は、ペプチ
ド鎖が生合成された後、酵素的に行なわれと言わ
れている（A.F.Bradbury et al.：Nature，298，
686（1982））。 一方、近年遺伝子工学的手法により、蛋白質や
ペプチドが生産されるようになつたが、Ｃ末端酸
アミドをもつペプチドを得る場合、ペプチド鎖が
合成された後に、人為的にＣ末端α−カルボキシ
ル基のアミド化反応を行なわなければならない。
したがつて生産工程の中で、このアミド化反応は
重要な位置をしめるのである。アミド化反応にお
いて化学合成による方法は種々の副反応をともな
うこと、また過激な反応により蛋白質やペプチド
のもつ生理活性が消失する可能性がある等の欠点
を有する。一方、酵素を利用した方法も知られて
おり、例えばブタ脳下垂体由来のアミド化酵素に
よる方法（A.F.Bradbury et al.：Nature，298，
686（1982））がある。 しかしながら、本反応は副反応のない反応であ
るが、酵素原料の入手が困難なこと、現在未だ完
全な精製品が得られていないこと、酵素が不安定
であり、取扱いにくいという欠点を有する。 他の酵素を利用したペプチドの合成法として
Breddamらの方法（K.Breddam et al.：
Carlsbery Res.Commun.46，121（1981））が知ら
れている。 本発明の方法はカルボキシペプチダーゼＹを使
用する。カルボキシペプチダーゼＹはイーストか
ら得られ、蛋白質やホルモンのペプチド鎖のＣ末
端ペプチド結合を切断し、Ｃ末端から順次アミノ
酸を遊離させる作用を有する。一方でペプチド結
合の合成能も有する（森原和之：蛋白質・核酸・
酵素、26，1979（1981））。 しかし、カルボキシペプチダーゼＹがペプチド
のＣ末端プロリンのα−カルボキシル基のアミド
化を行うことは未だ知られていない。 本発明者はカルボキシペプチダーゼＹがペプチ
ドのＣ末端プロリンに特定のアミノ酸が結合して
いる場合にのみ、Ｃ末端プロリンのα−カルボキ
シル基のアミド化を行うことを見出して本発明を
完成した。 本発明は化学合成による方法やブタ脳下垂体由
来のアミド化酵素による方法の欠点を解決し、か
つコスト面からも実用的な方法である。 本発明はＣ末端プロリンにロイシン、イソロイ
シン、バリン、フエニルアラニンおよびアラニン
から選ばれたアミノ酸の一種を有するペプチド
に、カルボキシペプチダーゼＹを作用させること
によりＣ末端にプロリンアミドを有するペプチド
の製法に関する。 即ち、一般式

【表】 （式中、Proはプロリン、Ｚはロイシン、イソ
ロイシン、バリン、フエニルアラニンおよびアラ
ニから選ばれたアミノ酸の一種を示す。各結合は
互にペプチド結合である。） で表わされる。 反応は基質にアンモニアの存在下でカルボキシ
ペプチダーゼＹを作用させることによつて達成さ
れる。 Ｃ末端プロリンアミド生成のためのペプチドの
アミド化反応は、あらかじめ調製した基質溶液、
カルボキシペプチダーゼＹ溶液およびアンモニア
溶液を混合して行なう。最初に基質水溶液を調製
する。基質が水に難溶の場合は、40％ジオキサン
水溶液で溶解することができる。また、基質が、
分子内にジスルフイド結合を有するペプチドであ
るの場合には、カルボキシペプチダーゼＹを作用
させる前に、該ペプチドにＳ−スルホン酸化反応
を行うことにより、溶解度を増大させることがで
きる。次にカルボキシペプチダーゼＹ酵素標品水
溶液を調製する。 カルボキシペプチダーゼＹの使用量は1mM基
質に対して最終濃度5μMを使用する。これ以上
にカルボキシペプチダーゼＹの使用量を増加させ
た場合、アミド化生成物量は増加するが副反応も
多くなるので有効ではない。またカルボキシペプ
チダーゼＹの使用量を一定にして基質量を５倍に
増加させるとアミド化生成物量は２倍に増加する
が、収率は低下する。 アミド化反応を行なうPH領域は、8.5以上のア
ルカリ側であり、その最適PHは9.0〜9.5の範囲に
存在する。PH8.5以下ではカルボキシペプチダー
ゼＹのペプチダーゼ活性がアミド化反応活性より
も優先し、殆んどアミド化生成物を得ることがで
きない。 アミド化反応を効率よく行なうためには、より
高濃度アンモニア溶液を使用するのが好ましく、
その調製時に反応の目的PHも調整する。アンモニ
ア溶液の調製には、あらかじめ用意したアンモ
ニウム塩水溶液をアルカリでPH調整する方法と
アンモニア水を塩酸などの酸でPH調整する方法と
がある。前者の場合、各種のアンモニウム塩を使
用することができるが、特に塩化アンモニウムが
最適である。100mlの5M塩化アンモニウム水溶液
に8.1ｇの固形水酸化ナトリウムを添加しPHを9.2
に調整することにより、最終濃度4.5Mのアンモ
ニア溶液を得ることができる。また、同じ塩化ア
ンモニウム水溶液を27mlの25％アンモニア水でPH
9.2に調整すると、最終濃度7.1Mのアンモニア溶
液が得られる。一方、後者の調製法では、水で希
釈した25％アンモニア水を塩酸でPH9.2に調整す
ることにより、7M程度のアンモニア溶液が得ら
れる。 ここで、PH9.2の条件でアンモニウム溶液とし
て、4.5M塩化アンモニウム−水酸化ナトリウム
溶液と7.0Mアンモニア水・塩酸溶液を用いて、
実際にアミド化反応を行ない比較してみると、前
者の方がアンモニア濃度が低いのにもかからず、
アミド化生成物の収率は1.5倍程高い。これは、
塩化アンモニウム水溶液のPH調整に水酸化ナトリ
ウムのかわりに水酸化カリウムまたは水酸化リチ
ウムロを使しても同様結果を与える。アミド化反
応は基質溶液、酵素溶液及びアンモニア溶液を混
合して行なうので、4.5Mのアンモニア溶液を使
用したとき、反応溶液の最終アンモニア濃度は
3.6Mになつている。しかし基質溶液や酵素溶液
を使用する4.5Mアンモニア溶液で調製すること
もでき、この場合は最終アンモニア濃度は4.5M
であり、より高い収率で昭アミド化生成物を得る
ことができる。反応は基質溶液、カルボキシペプ
チダーゼＹ溶液およびアンモニア溶液を好ましく
は１：１：８の割合で混合し、37℃で３〜５時間
反応を実施する。この時、基質の最終濃度は
1mM程度、カルボキシペプチダーゼＹのそれは
5μM、アンモニアのそれは3.6M程度が好ましい。
アミド化反応の生成物の同定及び精製は、イオン
交換カラムクロマトグラフイーや高速液体クロマ
トグラフイーなどで行なうことができる。また反
応中、遊離アミノ酸の同定はアミノ酸自動分析計
を使用して行なうことができる。 次に実施例および参考例をあげて本発明の方法
をさらに詳細に説明する。 なお、実施例および参考例中、CBZ：カルボ
ベンゾキシ、Ala：アラニン、Leu：ロイシン、
lle：イソロイシン、Val：バリンワ、Phe：フエ
ニルアラニン、Gly：グリシンを示す。Proは前
述したものと同意義を示す。 実施例 １ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Leu−OH
を7.1mMになるように40％ジオキサン水溶液に
溶解した。本ペプチド基質は水難溶のために40％
ジオキサン水溶液を使用した。以下のアミド化反
応において、この程度のジオキサン量は反応に影
響しなかつた。カルボキシペプチダーゼ（ペプチ
ド研究所製）3.5mg／ml（50μM）になるように水
に溶解した。5Mの塩化アンモニウム水溶液に固
形水酸化ナトリウムを加え、PH9.5に調製し、
4.5Mのアンモニア溶液を調製した。200μの基
質溶液、200μのカルボキシペプチダーゼＹ溶
液および1600μのアンモニア溶液を混和し（最
終アンモニア濃度は3.6M）、37℃で５時間放置し
た。反応終了後、300μの反応溶液に等量の酢
酸エチルを加え混和し、酢酸エチル層を減圧乾固
した。酢酸エチル抽出物を200μの50％メタノ
ル−0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、その100μ
をμBondapak C18カラム（（0.39×30cm）を用
いた高速液体クロマトグラフイーに付した。50％
メタノール−0.1％トリフルオロ酢酸を用いて１
ml／分の流速で溶出し、紫外部260nmで検出する
と４分にCBZ−Ala−Pro−NH₂を認めた。また
300μの反応溶液に60μの濃塩酸を加えPH２〜
３に調整し、その180μを酢酸エチルで抽出す
ることなく直接μBondapak C18カラム（0.39×
30cm）を用いた高速液体クロマトグラフイーに付
した。30％メタノール−0.1トリフルオロ酢酸で
１ml／分の流速で溶出し、紫外部260nmで検出す
ることにより、7.9分にCBZ−Ala−Pro−NH₂、
10分にCBZ−Ala−Pro−OH、20.7分にCBZ−
Ala−Pro−Leu−OHを認めた。 以上から、各々の生成量を高速液体クロマトグ
ラム上の標準品に対する面積の値から算出した結
果、アミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂の初
期基質に対する収率は35.1％、反応副産物CBZ−
Ala−Pro−OHのそれは19.5％、また残存基質量
は約45％であつた。一方10μの反応溶液をその
まま日立製835型高速アミノ酸分析計を用いてア
ミノ酸分析を行なつたところ、初期基質に対して
約55％の収率で遊離ロイシンを検出した。このロ
イシンの収率はアミド化生成物CBZ−Ala−Pro
−NH₂及び反応副産物CBZ−Ala−Pro−OHそ
れぞれの収率の和に等しかつた。 実施例 ２ 5Mの塩化アンモニウム水溶液に固形水酸化ナ
トリウム加え、PH9.2に調整し、4.5Mのアンモニ
ア溶液を調製した。合成ペプチド基質CBZ−Ala
−Pro−Leu−OHを7.1mMになるように40％ジ
オキサン−アンモニア溶液に溶解した。カルボキ
シペプチダーゼＹ（ペプチド研究所製）を3.5mg／
ml（50μM）になるようにアンモニア溶液で溶解
した。200μの基質溶液、200μのカルボキシ
ペプチダーゼＹ溶液および1600μのアンモニア
溶液を混和し（最終アンモニア濃度は4.32M）、
37℃で５時間放置した。反応終了後、反応溶液に
等量の酢酸エチルを加え混和し、酢酸エチル層を
減圧乾固した。酢酸エチル抽出物を１mlの50％メ
タノール−0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、
μBondapak C18カラム（0.36×30cm）を用いた
高速液体クロマトグラフイーに付した。50％メタ
ノール−0.1％トリフルオロ酢酸を用いて１ml／
分の流速で溶出し、精製を行なつた。初期基質に
対する収率43％アミド化生成物CBZ−Ala−Pro
−NH₂を得た。 実施例 ３ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Val−OH
を7.1mMになるように40％ジオキサン水溶液に
溶解した。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド
研究所製）を3.5mg／ml（50μM）になるように水
に溶解した。5Mの塩化アンモニウム水溶液に固
形水酸化ナトリウムを加えPH9.5に調整し、4.5一
Ｍのアンモニア溶液を調製した。200μの基質
溶液、200μのカルボキシペプチダーゼＹ溶液
および1600μのアンモニア溶液を混和し（最終
アンモニア濃度は3.6M）、37℃で５時間放置し
た。反応終了後、300μの反応溶液に等量の酢
酸エチルを混和し、酢酸エチル層を減圧乾固し
た。酢酸エチル抽出物を200μの50％メタノー
ル−0.1％トリフルオロ酢酸に溶解し、その100μ
をμBondapak C18カラム（0.39×30cm）を用
いた高速液体クロマトグラフイーに付した。50％
メタノール−0.1％トリフルオロ酢酸で１ml／分
の流速で溶出し、紫外部260nmで検出すると、４
分にアミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂を得
た。生成収率は15.4％であつた。 実施例 ４ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Phe−OH
を7.1mMになるように40％ジオキサン水溶液に
溶解した。カルボキシペプチダーゼＹ（ペプチド
研究所製）を3.5mg／ml（50μM）になるように水
に溶解した。5Mの塩化アンモニウム水溶液に固
形水酸化ナトリウムを加えPH9.5に調製し、4.5M
のアンモニア溶液を調製した。200μの基質溶
液、200μのカルボキシペプチダーゼＹ溶液お
よび1600μのアンモニア溶液を混和し（最終ア
ンモニア濃度は3.6M）37℃で５時間放置した。
反応終了後、300μの反応溶液に等量の酢酸エ
チルを混和し、酢酸エチル層を減圧乾固した。酢
酸エチル抽出物を200μの50％メタノール−0.1
％トリフルオロ酢酸に溶解し、その100μを
μBondpak C18カラム（0.39×30cm）を用いた高
速液体クロマトグラフイーに付した。50％メタノ
ール−0.1％トリフルオロ酢酸で１ml／分の流速
で溶出し、紫外線260nmで検出すると、４分にア
ミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂を得た。生
成収率は13.4％であつた。 実施例 ５ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Ala−OH
を用いて、実施例１に準じて同様に実施したとこ
ろ、アミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂が得
られた。生成収率は8.0％であつた。 実施例 ６ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Ile−OH
を用いて、実施例１に準じて同様に実施したとこ
ろ、アミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂が得
られた。生成収率は22.6％であつた。 実施例 ７ ヒトカルシトニンはＣ末端にPro−NH₂を有す
る32個のアミノ酸から構成されるペプチドホルモ
ンである。人工的にこれを生産する場合も同方法
によりＣ末端をアミド化し、ヒトカルシトニン完
成品を得ることができた。 遺伝子工学的手法により得られたヒトカルシト
ニン・Leuペプチドを、先ずR.David，Coleの方
法（Methods in Enzymology vol.，Ed.by C.
H.W.Hirs.pp206（1967）、Academic Press，
New York and London）に従つて可逆的Ｓ−
スルホン酸化を行なつた。このジスルフイド結合
のＳ−スルホン酸化は、反応液中での試料の不溶
化を防ぐためのものである。5Mの塩化アンモニ
ウム水溶液に固形水酸化ナトリウムを加えPH9.5
に調整し、4.5Mのアンモニア溶液を調製した。
Ｓ−スルホン酸化ヒトカルシトニン・Leuペプチ
ドを1.7mMになるように40％ジメチルスルホキ
シド−アンモニア溶液に溶解した。ジメチルスル
ホキサイドは基質の溶解度を高めるために使用し
た。以下のアミド化反応において、この程度のジ
メチルスルホキサイド量は反応に影響しなかつ
た。カルボキシペプチダーゼ（ペプチド研究所
製）を3.5mg／ml（50μM）になるようにアンモニ
ア溶液に溶解した。50μの基質溶液、50μの
カルボキシペプチダーゼＹ溶液および400μの
アンモニア溶液を混和し（最終アンモニア濃度は
4.32M）、37℃で30分間放置した。反応は100μ
の濃ギ酸および1500μの8M尿尿素溶液を加え
停止させた。得られた反応溶液の210μをTSK
gel ODS−120T（4.6×250mm；東洋曹達工業(株)社
製）を用いた高速液体クロマトグラフイーに付し
た。溶媒Ａ：10mM重炭酸アンモニウム、溶媒
Ｂ：アセトニトリルによる溶媒Ｂの直線濃度勾配
法（０−10％（０〜４分）、10−55％（４〜60
分））を用いて0.8ml／分の流速で溶出し、紫外部
225nmで検出することにより、37.15分にアミド
化生成物、36.16分に未反応の基質、35.17分にア
ミド化されなかつた反応副産物を認めた。以上か
ら、各々の生成量を高速液体クロマトグラム上の
標準品に対する面積の値から算出した結果、アミ
ド化生成物Ｓ−スルホン酸化ヒトカルシトニンの
初期基質に対する収率は24.7％であり、残存基質
量は57％であり、反応産物は17.2％であつた。ア
ミド化生成物Ｓ−スルホン酸化ヒトカルシトニン
を2mM還元型グルタチオン、1mMエチレンジア
ミン二酢酸ナトリウムの存在下、10mM重炭酸ア
ンモニウム（PH7.9）中で室温で７時間反応する
ことにより、ヒトカルシトニンを得た。 実施例 ８ 10Mアンモニウム水溶液に塩酸を加え、PH9.0
に調製し、7.0Mのアンモニア溶液を調製した。
合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Leu−OHを
7.1mMになるように40％ジオキサン−アンモニ
ア溶液に溶解した。ＢカルボキシペプチダーゼＹ
（ペプチド研究所製）を3.5mg／ml（50μM）にな
るようにアンモニウム溶液で溶解した。200μ
の基質溶液、200μのカルボキシペプチダーゼ
Ｙ溶液および1600μのアンモニア溶液を混和し
（最終アンモニア濃度は5.5M）、37℃で３時間放
置した。反応終了後、反応溶液に等量の酢酸エチ
ルを加え混和し、酢酸エチル層を減圧乾固した。
酢酸エチル抽出物を１mlの50％メタノール−0.1
％トリフルオロ酢酸に溶解し、μBondapak C18
カラム（0.36×30cm）を用いた高速液体クロマト
グラフイーに付した。50％メタノール−0.1％ト
リフルオロ酢酸を用いて１ml／分の流速で溶出し
精製を行つた。初期基質に対する収率26％アミド
化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂を得た。 参考例 １ 合成ペプチド基質CBZ−Ala−Pro−Gly−OH
を用いて、実施例１に準じて同様に実施したとこ
ろ、アミド化生成物CBZ−Ala−Pro−NH₂は得
られなかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ Ｃ末端プロリンにロイシン、バリン、フエニ
   ルアラニンまたはアラニンから選ばれたアミノ酸
   の一種が結合したペプチドにアンモニアの存在
   下、カルボキシペプチダーゼＹを作用させるこを
   特徴とする、Ｃ末端にプロリンアミドを有するペ
   プチドの製法。 ２ 使用するアンモニア溶液が塩化アンモニウム
   −水酸化ナトリウム、塩化アンモニウム−水酸化
   カリウム、塩化アンモニウム−水酸化リチウムま
   たはアンモニア水−塩酸である請求項１記載の製
   法。 ３ 請求項１または２記載の方法において、Ｃ末
   端プロリンにロイシン、バリン、フエニルアラニ
   ンまたはアラニンから選ばれたアミノ酸の一種が
   結合したペプチドが、分子内にジスルフイド結合
   を有するペプチドである場合に、カルボキシペプ
   チダーゼＹを作用させる前に該ペプチドにＳ−ス
   ルホン酸化反応を行う製法。