JPS62187489A - リゾチ−ム由来のペプチド - Google Patents

リゾチ−ム由来のペプチド

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JPS62187489A
JPS62187489A JP61295696A JP29569686A JPS62187489A JP S62187489 A JPS62187489 A JP S62187489A JP 61295696 A JP61295696 A JP 61295696A JP 29569686 A JP29569686 A JP 29569686A JP S62187489 A JPS62187489 A JP S62187489A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は鶏卵リゾチームに由来するペプチド、その製造
方法及びかかるペプチドを含有する薬剤に関する。
ニワトリ卵白より抽出されたリゾチームは、その正体及
び配列順序が正確に知られている129のアミノ酸残基
からなる小さな球状のタンパク質である。
リシン及びアルギニンの含有量が多いことから、リゾチ
ームは等電点が約10.5乃至11であり、多くの無機
及び有機酸、特に塩酸と水溶性の塩を生成する等の明ら
かな基本的特徴を有する。
リゾチーム分子はそれ自身折りたたまれており、4つの
ジスルフィド架橋によりかかるコンフォメーションが安
定化されている。リゾチームの安定性が中性から大巾に
かけはなれたPH(特に酸性側)で比較的高温の溶液中
でも比較的高いのは、主としてかかる構造によるもので
ある。しかしながら1分子のwk密なフンフォメーショ
ンは、リゾチームがその代表的な酵素作用を行うために
基体が接触しなければならない活性部位である側腔(5
ide cavit7 )により阻害”J’L6.lJ
ゾ+−ムは、加水分解機構により、細菌細胞の膜の基本
的構成成分であるN−7セチルムラミン酸及びムコ多糖
のN−7セチルグルコサミンの間のβ−グルコシド結合
(1→4)を選択的に切断するため、その作用範囲が比
較的限られてはいるものの有効な溶菌作用がある0作用
の機構と部位を考慮すると、リゾチームの抗菌作用は、
その構造の集束性(三次元的に考えても)によることは
明らがであり、ある意味では1分子の状態の混乱は細菌
の膜のムコ多糖の基体の接近や直接の付着を防げるもの
ではない。
上記のムラミダーゼの第1の特徴とは別に、リゾチーム
は他の!iWな薬物生物学的及び治療上の作用があり、
その生物学的多面性により、臨床の分野で非常に多く用
いられていることが知られている。実際リゾチームは、
きわだった抗菌作用を有しており、長い間庖疹性ビール
スの感染の治療に用いられている。また、B−リンパ球
、ヘルパー及びサプレッサーニー9フ2球及びマクロフ
ァージ等の様々な免疫システムの構成要素の相互作用を
通して転形剤(modulating agent)と
して免疫反応を防たげ、それらの連続的な平衡状態を条
件ずけることができる。更に、膜の改変の抑制、とりわ
け悪性形質転換に関する改変の抑制に既にはっきりとし
た役割をはたしている。更にリゾチームは、炎症部位に
於ける多形核白血球の増大を抑制することができ、かか
る症状に於けるモジュレータ−の役割を果たすものであ
る。リゾチームは、実験的〔マウスやラットにおける刺
激物で誘発された腹部の収縮を抑え、又は足の痛みの域
値(painful threshold of pa
w)を上げる)及び臨床的に証明されている明らかな調
性作用があり、ガンの症状における苦痛の緩和に特に有
用である。リゾチーム鎖のフラグメントとして表わすこ
とのできる一連のペプチドが、リゾチームそれ自体が有
するよりも高い重要な生物学的、治療的特性を有するこ
とがわかった。
本発明に係るペプチドは、少くとも3以上の7Asp−
G l y−9s r−Th r−Asp−T2 r−
COOHを有するペプチドであって、Yは存在しなくて
チームの39乃至45番目及び46乃至53番目の位置
の配列順序を示すことを特徴とするペプチドである0本
発明で特に重要なペプチドは、リゾチーム分子の39乃
至53番目の位置のL−アミノ酸からなる以下の構造: NO3−Asr+−Thr−Gin−^1a−Th r
−Ag+>−Arg−Asn−Th r−Asp−Gl
y−5er−Thr−Asp−T2r−COOH(1)
を有するペンタデカペプチドである。
本発明の生成物は、選択的フラグメンテーション又は、
簡単な合成経路により得ることできる。活性ペプチドを
得るためのフラグメンテーションは、リゾチームはペプ
シン又は、トリプシン及びキモトリプシンのような酵素
物質によって引起される加水分解にかけるか又は、双方
の酵素系を連続する加水分解にかけて行えば良い、いず
れの場合も胃液や腸液の作用による生体内の加水分解プ
ロセスに似るようにそれぞれ反応条件を制御して行なう
、かくして得られたペプチド混合物は、その生物学的観
点から、そのまま使用しても良く、又は、適当な精製及
び分別の後、又はそれら混合物から本発明のペプチドを
純粋な状態で単離することにより使用しても良い、精製
、分別をしたペプチド混合物及び単離したペプチドは、
予めペプシンによる加水分解をした後に得られた場合に
は、更にトリプシン及び/又はキモトリプシンにより加
水分解をした後分別しても良い0本発明のペプチドは逐
次合成による合成経路によっても有効に生成できる。
上記のペプチド混合物及びペプチド(I)を製造するフ
ラグメンテーションの詳細ヲ述べる。リゾチームを1例
えば、塩酸を添加することにより得られる明らかな酸性
側(PH1−2,5)で、結局、無機塩酸、例えば、塩
化ナトリウムが存在するが、ペプシン(リゾチームの重
量の20%まで)にって処理する。加水分解は35乃至
45℃、通常は37乃至40℃で数時間行う、中性化後
、不溶物質を濾過し、溶液を蒸発により乾燥又は凍結乾
燥させて、全体としてペプチドの複雑な混合物の形態の
ペプチド氷解物を得る。かかる氷解物は、乾燥又は凍結
乾燥させる代りにア七トンで沈澱させ、エチルアルコー
ルで精製(任t) l。
た後、沈澱を予めシリカゲルクロマトグラフィー(溶離
剤:水、その後10乃至20%までの酢酸水溶液)にか
け、しかる後、弱カチオン性樹脂、例えばアンバーライ
トCG −50(Amberlfta CG−50)(
溶離剤二本)のクロマトグラフィーにかけ、反応式1に
示すように種々の部分的に精製したペプチド混合物とと
もに目的とするペプチド(I)を得ることができる。存
在する少量の無機塩(例えばNaCJ1)から分離する
には、セファデックスG I O(Sepradex 
G 10 )等の分子篩のクロマトグラフィーにより行
えば良い。
他の生物学的に重要なペプチドは、それぞれリゾチーム
の45乃至53番目及び39乃至45番目のL−アミノ
酸からなり、以下の構造を有する。
(II) (m) 化合物(II)及び(III)は、上記のペプチド(I
)をトリプシン又はキモトリプシン−トリプシン(ペプ
チドCI)の重量の5%まで)を使用し、アンモニア又
は適当な緩衝液を加えることにより、中性又は弱塩基性
側(PH7〜8.5)で加水分解することにより製造す
ることができる。
約37℃で数時間加水分解を行い、溶液を冷却し、少量
になるまで濃縮し、クロマトグラフィーにかけて、2成
分、(■)及び(m)に分離する0例えば、シリカゲル
カラムクロマトグラフィーCft1fa剤:エチルアル
コール/アンモニア)でペプチド(■)を得、しかる後
水洗してペプチド(m)を単離する。
上記の化合物は、一般的なペプチドについての文献に報
告されている手順にいくつかの変化をさしはさんだ固相
に於ける逐次合成によっても得ることができる0例えば
、ペプチド(n)を得るために、L−チロシン (’r
h r) (7)N 、 0−保:a誘導体の一つ、例
えばN−tert−ブトキシカルボニル(BOC) −
〇−ベンジルーL−チロシンを、好ましくはセシウムの
形で用い、スチレン−ジビニルベンゼンクロロメチレー
ト共重合体〔メリーフィールドのペプチド樹脂(Mer
rifields’peptide resjn ) 
: 1%架橋〕を、生成するペプチド、即ちL−チロシ
ンのカルボキシ−末端にくるようにエステル化する。生
成したBOC−〇−ベンジルーL−チロシン樹脂は、+
8!別し、洗浄してチロシン誘導体によるエステル化度
を樹脂1gに対するミリモルとして決定する。N−保護
基(BOC)はその後トリフルオロ酢酸(T F A)
処理により除かれ1次いで塩基をトリエチルアミンによ
り遊離させ、目的とする配列順序を構成する第2のアミ
ノ酸、即ち、L−アスパラギン酸(’Asp)の作用受
ける状態の0−ベンジル−L−チロシン樹脂からなる固
相を得る。
この第2の段階を進行させるため、前記のアミノ酸(T
yr)の様に、L−アスパラギン酸は。
官能基が反応に参画しないように保護した形態。
例えばBOC−L−アスパラギン酸4−ベンジルエステ
ルのような形態で使用する。2倍乃至4倍のモル量の過
剰の試薬をペプチド結合(Co−NH)形成用の縮合剤
として、例えばN、N′−ジクロロへキシルカルボジイ
ミド(DCCD) 、を使用すると、前記のようにトル
フルオロ酢酸により保護基(BOC)を除くことができ
る目的とするジペプチドを高収率で得ることができ、順
次縮合に適した(4−ベンジルエステル)Asp−(0
−ベンジル)Tyr−樹脂を得ることができる。
上記の通り、以下の充分に保護されたL−アミノ酸: BOC−0−ベンジル−L−トレオニンBOC−0−ベ
ンジル−L−セリン BOC−グリシン BOC−アスパラギン酸4−ベンジルエステルBOC−
0−ベンジル−L−)レオニンBOC−L−アスパラギ
ンp−ニトロフェニルエステル の縮合段階と、次の縮合に必要であるアミン基を遊離す
るN−脱保護段階を交互に連続して行うことにより、エ
ステルの形態で固相の樹脂に結合した所望の配列順序の
ペプチドに到達することができる。
一般に、最後のアミノ酸である、BOC−L−アスパラ
ギンp−ニトロフェニルニステルハ、縮合段階において
、ジクロロへキシルカルボジイミド(D CCD)の存
在を必要としない、と考えられている。これは、カルボ
キシル基が、既に、p−ニトロフェノールとのエステル
化によす活性化されているためである。しかしながら、
収率の面からみれば、触媒、例えば、試薬を、相当する
反応性の高いトリアゾールに変換することのできる、1
,2.4−トリアゾールの存在下に行うことが好都合と
いえる。
所望のペプチドの配列順序を得た後は、トリフルオロ酢
酸の中で、相当量のアニソールの存在下、固体の支持体
から切断すること及び残りの官能基の脱保護が必要であ
り、この脱保護は、ペプチド−樹脂の懸濁液の中でガス
状の臭化水素酸の作用により行うものである。樹脂を濾
過したのち、TFA中の溶液は、減圧下に濃縮し、残査
をアルカリ処理、例えば、トリエチルアミンによる処理
ののち、アミノ基を脱プロトン化するために精製し、目
的とするペプチド(■)を、無色で。
非常に水によく溶ける結晶状の固体として得た。
上記の樹脂からペプチドを切断する段階(及び、同時に
、官能基の脱保護の段階)は、オクタペプチド(n)−
樹脂の形成のあとのみならず。
はんの少数のアミドが縮合したあとであっても行うこと
ができ、その結果2本発明の目的の範囲内に入る以下の
構造を有する重要なリゾチーム分子のフラクションとし
ても表わされる。より短かいペプチドも得ることができ
る、ということに注意することが重要である。
ペプチド(DI)の製造に関してt4、一般に、上記の
ペプチド(r1)の手順に従うことが重要であるが、所
望の生成物に到達するためには、いくつかの重要な変更
を導入しなければならない、まず、ペプチド(I[[)
のカルボキシ末端の最初のアミノ酸であるアルギニン(
N−BOC−My −トシル−誘導体)のクロロメチル
樹脂への直接の結合は、既に述べた通り非常に安定であ
り、HBr/TFAによる処理では切断し難いものであ
り、この点は、最初のArg−樹脂エステルについても
最終生成物のペプチド(IIIr)−樹脂についても確
認されている。そこで1合成を、適当な、窓溝が保護さ
れているアミノ酸1例えば、セシウム塩の形態のBOC
−グリシンで、これは。
直接クロロメチル樹脂と直接エステル化されるものであ
るが、これにより合成を始め、合成の逐次サイクルに於
て、末端に切断することの容易なスベサーを形成する、
という第一の変更した方法が考え出されたのである。T
FAによるN−脱保護の後、以下に示す充分に保護され
たアミノ酸二BOC−Nw−トシル−L−フルギニンB
OC−L−アスパラギン−p−ニトロフェニルエステル BOC−0−ベンジル−L−トレオニンBOC−L−7
ラニン BOC−L−グルタミンpニトロフェニルエステル BOC−0−ベンジル−L−)レオニンBOC−L−ア
スパラギン−p−ニトロフェニルエステル の縮合を順番に行なうが、通常、縮合ごとに縮合したア
ミノ酸のα−7ミノ基を遊離させるのに適したTFAに
よるN−BOCの脱保護を交互に行なう。
既に述べたように、どの縮合段階も、アミノ酸のカルボ
キシル基が遊離している場合(Arg。
Thr、Ala)には、N、N′−ジクロロへキシルカ
ルボジイミド等の縮合剤の存在下に行なわなければなら
ないのに対し、p−ニトロフェニルの形態のアミノ酸(
Asn、Gin)を用いる堝て行なうことが望ましい。
一連の縮合段階の後、TFA中のHBrにより、ペプチ
ドを樹脂から分離すること及び官能基の部分的脱保護を
行うが、この後者の操作を液体アンモニア中のナトリウ
ムによりアルギニンのNw−)シル基を切断することに
より行い、以下の構造: (X) を有する。(m)−ctyペプチド化合物を得る。しか
る後、カルボキシル末端のアミノ酸を選択的に切断する
が1次のアミノ酸(A r sr)には、加水分解作用
をしないカルボキシペプチダーゼAを用いて、酵素加水
分解をすることによりグリシンを分離することができる
0次いで、加水分解混合物を、シリカゲルクロマトグラ
フィーで精製し、充分に純粋な、目的とするペプチド(
III)を得ることができる。
ペプチド(m)の製造については、望ましい、N−BO
C−Nw −)シル−アルギニン(セシウム塩)をクロ
ロメチル樹脂とエステル化する、第2の方法である直接
法がある。一連の交互のN−BOCの脱保護及び上記ア
ミノ酸の縮合の段階の後、最終的に生成したペプチドは
、容易に樹脂から切断することができ、かつ、液体のフ
ッ素化の作用により完全に脱保護することができ、HF
の減圧下での蒸発後、トリプルオロ酢酸により抽出し、
樹脂を濾過し、溶液を蒸発させて、ペプチド(m)を単
離できることがわかった。
このフッ化水素酸を用いることは、いろいろな意味で有
利である。まず、既に述べた、ペプチドと樹脂と間の「
スペーサー」 (例えば、aty)を使用する必要がな
いため、カルボキシペプチダーゼAにより最終的にスペ
ーサーを分離する必要がない、更に、フッ化水素酸は、
自然にNw−トシル基も切断し、同時にアルギニンの脱
保護をもすることになるので、次の余分を段階である液
体アンモニア中のナトリウムを使用する処理による脱保
護を省くことができる。また、他の保護されたアルギニ
ンの誘導体、例えば、BOC−Nw−二トローL−フル
ギニンも、BOC−Nw−トシル誘導体の代りとして使
用でき、同様に樹脂から分離する間の一段階でNwの脱
保護ができる。
ペプチド(■)の合成の終りのところで既に述べたよう
に、ペプチド(m)の合成も1種々のアミノ酸を順番に
縮合する途中の段階で停止することができる。そのため
、スペーサーを使用する方法を進め、既に述べた適切な
操作の後、下記のオリゴペプチド: N)l、、 −Tllr−A!fi−^rg−Gly−
GOLIH(Xll )を得ることができ、これらより
、グリシンのカルボキシペプチダーゼAを用いた加水分
解による切断の後、相当するペプチド(X VI)〜(
XX):を得ることができる。
これに対し、直接、アルギニンを樹脂に縮合させる方法
の場合には、直接、上記のペプチド(X Vt)〜(X
 X)に至ることができる。
なお、上記のように数字はリゾチームの構造中のアミノ
酸の位置を示すものである。
更に、上記のペプチド(■)及び(f[[)の合成のふ
たつの手順を一つの連続した形にまとめた合成方法も可
能である。まず、上記の通り、ペプチド(IT)の合成
を行うが、通常のペプチド(11)のアミン−末端にあ
る最後の7ミノ!(リゾチーム分子の46番目にある、
Asnの縮合の後、ペプチドの樹脂からの分離及び官能
基の脱保護を行う代りに、ふたつの別の手順を受けるこ
とができる。ペプチド(m)のカルボキシ−末端にある
第1番目のアミノ酸(リゾチーム分子の45番目にある
)Argの縮合を直接行う、この場合、ペプチド(m)
の合成で、既に述べた以上の試薬と同じ手順を順番に進
めることにより、リゾチームそれ自身を出発物質として
酵素作用により、既に得られているペプチド(1)の中
に含まれている以下のペプチド: を得゛ることができることは明らかである。
一方、グリシンを、まず縮合させ、しかる後、アルギニ
ン及び他の上記のアミノ酸を縮合させ。
最終的に以下のペプチドを得ることも可能であ(XXW
) (XXW) (XXIX) (XXX) (XXXI) (XXX■) (X X X m) (X X X ff) 末端のアミノ酸に、リゾチームの蛋白鋼における位置の
番号をつけた。これらのペプチドは、明らかに1本発明
の目的及び内容の範囲に含まれるである。
当然、固相における合成ばかりでなく、遊離α−7ミノ
基、ベンジルエステルとして保護されたα−カルボキシ
ル基及び最終的に、適当に保護された側鎖の官能基(例
えば、ベンジルエーテルとして保護されたトレオニンの
水酸基又はチロシンのフェノール基、ベンジルエステル
として保護されたアスパラギン酸のβ−カルボキシル基
又はニトロ基により保護されたアルギニンのグアニジン
基)を有する所望のアミノ酸から始める均賀相における
伝統的な合成を行うことも可能である。
溶液(均質相)において、第1のアミノ酸を。
配列順序の第2番目のアミノ酸であって、保護されたア
ミノ酸(BOC等)、及び最終的に保護された側鎖の官
能基を有し、α−カルボキシル基は縮合剤(例えば、D
CCD)を使用することにょリ、ペプチド結合を形成す
るように、遊離しているか又活性のエステル(例えば、
p−ニトロフェニルエステル又はN−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル)の形態である。
得られた、完全に保護されたジペプチドを、単離し、精
製し、TFA/CHC12で、BOCの脱保護をし、ト
リエチルアミンで脱プロトン化をし、反応図のように第
3番目のアミノ酸、その他と合成の終りまで反応させる
単離及びBOCの脱保護の後、ペプチドを炭素状のパラ
ジウム(P d)で触媒水素添加を行い。
側鎖の保護基及び第1のアミノ酸のα位のカルボキシル
基を保護しているベンジルエステルを切断する。
次いで、完全に保護されたペプチドを、溶液を凍結乾燥
することにより、単離し、触媒を濾過したのち、適当な
精製を行う。
リゾチームの酵素加水分解により得られたペプチド混合
物の生物学的活性については、多くの、純粋な状態で単
離されたペプチド及び/又は合成により得られたペプチ
ドと同様、リゾチームの全体構造における典型的な溶菌
作用は示さず、それらのペプチド混合物は、重要な薬理
学上及び治療上の特性を示すことがわかった。このため
1例えば、多くのペプチドのきわ立った鎮痛作用を衆知
のランドールーセリト(Randall!3elitt
o ) (7)方法を使用して、それらのペプチドの実
験動物に及ぼす抗侵害効果(anti−nocicet
ive effect)を試験することによって証明す
ることができる。
5乃至10匹のラットのグループにおいて、刺戟物、例
えば、ビール酵母を足の裏の綻膜に投与(long/ラ
ット)することにより、足の痛覚過敏をひき起し、同時
に、上記生成物を異なる投与量で注射した。ひとつのグ
ループのラットは。
刺戟物のみで処理した。ときどき、とくに3時間後、水
腫のできた足の圧迫時の痛みのいき値、即ち、動物が急
に足を引いてしまう最少の圧力(g)を測定した。
結果は、刺戟物のみを投与(薬剤を投与しない)した場
合と比べ、上昇した痛みのいき値(th’resho 
Id )の平均値のパーセンテージで表わした。
一例として、単独のペプチド(I)、(■)及び(m)
のほかに、「分画P、2」と名付けられたクロマトグラ
フィー原液であ・ペプチドの混合物(反応図1参照)に
関するデータも示した。
L−ユ 同様な結果が、いろいろな刺戟物1例えば、カラジーナ
ン、カオリン及びアラキドン酸等を用いた実験において
、上記のペプチドを全身的経路、例えば、筋肉内、静脈
内又は経口により投与した場合にも得ることができた。
炎症を起した足におけるような局部投与と異り、全身的
経路により役瓦l−+ fl!^1士 1騎勤蜘に 1
士る力)に冬(の投与量、10乃至20 m g / 
k gを投与することができる。単一のペプチドについ
て言えば、リゾチームの酵素加水分解の生成物から単離
されたサンプル及び合成経路により得られた、それに相
当するペプチドの間には、完全な類似性があった。
更に他の例としては1本発明におけるペプチド混合物及
び単一ペプチドは、さまざまな場合に。
抗ビールス性の作用を示した。それらの単純ヘルペスビ
ールスは、単層細胞培地に感染し、プラークを形成する
能力に与える影響力を確認するため、さまざまな試験に
供した。このため、単純ヘルペス タイプlの菌株を、
適当な濃度で、Vero細胞(Flow)の単層に加え
た。1時間接触させた後、ビールスを除き、単層を洗い
次いで、新たな培地T199(Flow)で被い、最経
的に、適当量の試験用物質を加えた。
72時間の培養の後、培地をニュートラルレッドに染色
し、目に見えるプラークを数えた0本テストにおいて、
ペプシンを用い、リゾチームを加水分解することにより
得られた分画P、2(反応図エ参照)は、5 m g 
/ m文の遣度で菌のプラーク形成能力の95%を阻止
することがわかった。そのため、リゾチームそのもの(
同濃度で、75%の阻止率)よりもはるかに高い抗ヘル
ペス作用を実証したのである。同様の結果が、トリプシ
ン及びキモトリプシンでリゾチームを加水分解した後に
、同様の方法により単離したペプチドの分画についても
得られた。更に、清くべき結果がペプチドCI)又は(
m)等のペプチドについて得られた。これらのペプチド
は、同様のビールスプラーク形成単位胞の減少を、はる
かに低い濃度(0,1〜1mg/mJ1)においてもた
らした。
更に、これらのペプチドは、細胞のコロニー形成能力に
は影響せず、したがって、細胞障害作用がなかった。こ
のことは、それらのペプチドの抗ビールス作用を示す濃
度よりもはるかに高い場合にもそうであった。
他の本発明の化合物により見出された生物学上の効果は
、それらの化合物の典型作用(Modulat−ing
 act+an)による免疫系の阻害能力である。ある
ペプチドは、事実、この抗原をマウスに投与したのち、
牛の抗アルブミン抗体(bovine anti−al
buwen antibodies)の量を制御するこ
とができ、又は、小羊の赤血球を接種したマウスの評臓
の中の、羊の赤血球上のプラーク形成細胞の数を増すこ
とができる、ということがわかった、以下に製造例を示
すが、本発明を制限するものではない。
実゛施例1 リゾチームの酵素加水分解(ペプシン):予め40℃に
熱しておいた11の蒸留水に、攪拌下8gのペプシン及
び5gの塩化ナトリウムを加えた。37%の塩酸を加え
てpHを1.2にした。得られた溶液に50gの塩化リ
ゾチームを溶解した。PHを1.2とし、ゆっくりと攪
拌しながら恒温槽で40℃に1時間保った。30%の水
酸化ナトリウムでpHを7とし、生成した少量の沈殿物
を濾過して除き、溶液を減圧下で注意深く蒸発させるか
又は凍結乾燥により乾燥させた。
実施例2 リゾチームの酵素加水分解(トリプシンーキ士トリプシ
ン): 11の蒸留水に50gの塩化水素リゾチームを溶解させ
、希釈したアンモニアを加えpHを8とした後、5gの
トリプシン−キモトリプシン複合体を加え、pHを再び
8にした。得られた溶液を37℃に2時11i(類似の
結果が加熱を12時間まで延長した場合にも得られた)
保ち1次いで減圧下で注意深く蒸発させるか又は凍結乾
燥により乾燥させた。
実施例3 ペプシンによる加水分解によるペプチドの分別及びペプ
チド(lの単#(反応Sr):A)アセトンによる沈殿 実施例1の手順に従って最終的に得られた溶液(溶液p
−t、容積約1fL)を攪拌下に保ち、蒸発乾燥の前に
4Jlのアセトンで直接処理をした。
放置して生成した非常に濃厚な油状相を沈降させ、明澄
なアセトン水溶液は減圧下で濃縮し乾燥させ、ペプチド
の混合物であって実施例1の加水分解段階で使用したほ
とんど全部の塩化ナトリウムを含むものである分画3を
調製した。
濃厚な油状相を500mAのエチルアルコールで割り、
長時間の攪拌ののち結晶性の固体を濾取し、減圧下に4
0℃で乾燥して30gのペプチド混合物(分画2)を得
た。
B)シリカゲルクロマトグラフィー 得られた分画2を100m文の蒸留水に溶解し、450
gのシリカゲル60(70〜230メツシユ)のカラム
クロマトグラフィーに、蒸留水を第1の溶離剤として、
かけた、溶出液の紫外線(入w281nm)に於ける吸
収の制御及びシリカゲル60F254の薄層クロマトグ
ラフィー(溶離剤:n−ブタノール:水:酢酸=100
:30:10.検知剤(det ect o r):=
yヒドリン)により第1の分画を単離しくTLC。
Rf=0)、減圧下で蒸発させて乾燥し、約7gの分画
P、2/1を得た。水:酢酸=98 : 2の混合物を
使用するカラムクロマトグラフィーによる溶離を続け、
濃縮乾燥して7.5gのペプチド分画P 、2/2を得
た。一方、水;酢酸=90:lOの混合物で溶離して、
8gのペプチド混合物として分画P、2/3を回収した
。この後者の分画は先ず水により抽出して精製しく溶液
を濃縮して分画P、2/3Aを回収)1次いで塩酸で抽
出、精製(分画P 、273B)するのが好ましい。
C)7ンバーライトCG−50(Amber−1i t
 e  CG−50) ツクoマ)グラフィー水を使用
したシリカゲルクロマトグラフィーによる溶離によって
得た上記の分画P、2/1をさらに酸の状態の450g
のアンバーライトCG−50を使用したイオン交換樹脂
のクロマトグラフィーで精製した。蒸留水で溶離し、紫
外線(入=281nm)に於て吸収がピークである溶出
液(複数)を混ぜ、シリカゲル60F254の薄層クロ
マトグラフィー(溶離剤:n−ブタノール:水:酢酸=
100:30:10.検知剤:ニンヒドリン)により先
ず分画P、2/1.1 (Rf=0)を単離し、これを
蒸発により乾燥し、1.8gの化合物(I)(リゾチー
ムの39乃至53番目のペプチドを得、次いで他のペプ
チドとの混合物からなる分画P、2/1.2を得た。
分析:全加水分解後の分画P、2/1.1(ペプチド(
1)〕のアミノ酸 ミリモル Ala   Arg  Asp  Glu 
 Gly  Ser  Thr  丁yr  (NH3
)計算値 1 1 5 1 1 1 4 1  (4)
実測値 1.001.0! 4.921.021.03
0.970.991.01 (3,95)実施例4 ペプチド(lの酵素加水分解(トリプシン)及びペプチ
ド(■)及び(III)の単Ia:実施例3の手順によ
り単離されたペプチド(I)2gを400mjLの蒸留
水に溶解し、アンモニアで溶液のPHを8とした。40
mgのトリプシンを加え、37℃で2.5時間加熱した
。減圧下に注意深く濃縮して容積を約10w文とした。
シリカゲル60F254 (溶離剤:エタノール=20
%アンモニア=70 : 30、検知剤:ニンヒドリン
)により、ペプチド(I)(Rf=0.07)は認めら
れず、ペプチド(II)(Rf=0.3)及びペプチド
(m)(Rf=0.5)の特徴を示す新しい2つの点が
形成されていることが確認された。これら二つの生成物
は1例えばシリカゲル60 (70−230メツシユ)
のカラムクロマトグラフィーにより精製し1次で上記の
様に特に、TLCの制御により紫外線吸収(入=281
nm)を決定し溶離剤を溶出させることが好ましい。
しかる後、濃縮した加水分解溶滴を200gのシリカゲ
ルを含むカラムクロマトグラフィーにか(t、先fエタ
ノール:28%アンモニア=95:5の混合物で溶離し
、少量の不純物を除き、次いでエタノール=28%アン
モニア≠8:2の混合物で溶離し、溶出液を減圧下に濃
縮して640mgのペプチド(■)を得た。しかる後、
エタノール:28%アンモニア=7=3の混合物で溶離
した溶出液を廃で1次いで蒸留水により溶離してこの溶
出液のみを蒸発して乾燥し、460mgのペプチド([
n)を得た。
トリプシンがフルギニンのカルボキシル基と隣接するア
ミノ酸(アスパラギン)のアミンとの間のペプチド結合
を切断し、ペプチド(■)(リゾチームの46乃至53
番目のアミノ酸からなるペプチド)及びペプチド(■)
(リゾチームの39乃至45番目のアミノ酸からなるペ
プチド)を生成させるという仮説はそれらの溶出液を更
に検討することにより確認された。ペプチド(n)は2
81nmに於ける紫外線吸収を増大させ、ツクウリ試薬
によるTLCにより(チロシンの存在が)検知され、一
方、サカグチ試薬により(アルギニンが存在しないこと
が)確認された。ペプチド(m)は紫外線吸収及びTL
Cに於て反対の挙動を示し、アルギニンは含有していた
がチロシンは存在しなかった。これらのデータはアミノ
酸の分析により確認された。
全加水分解後のアミノ酸の分析 ミリモル      Ala   Arg  Asp 
 Glu  Gly  Ser  Thr  Tyr 
 (NH3)CH):Expec、:     、31
 1 2 1  (1)Found :       
2.98   0.99 1.022.01 1.00
  (0,98)(m): EX斧C,:  1  1
 2 1      2     (3)Found 
:  1.0G  1.02  +、98  Q、99
      2.01    (2,98)実施例5 ペプチド(ペプチド(■):固相)の逐次合成: A)チロシンによるクロロメチル樹脂のエステル化及び
BOCの脱保護 5gのスチレン−ジビニルベンゼンクロロメチル共重合
体(メリーフィールドによるペプチド合成用樹脂)を7
42mg (2mmo 1)のBOC−0−ベンジ7L
/−I、−チロシンで40mjLの酢酸エチルの中で4
5時間煮沸させた0、28mM (2mmo 1)のト
リエチルアミンの存在下にエステル化した。該樹脂を濾
取し、酢酸、エタノール及び水で十分に洗浄し、25℃
で減圧乾燥した。0.201mmol  Tyr/g樹
脂(7)エステル化度を有する5、375gのBOC−
0−ベンジル−L−チロシン−樹脂を得たが、これは、
反応及び洗浄溶剤中の遊離チロシン銹導体(非エステル
化)の276nmに於ける分光光度法による差により決
定された。
注:セシウム塩の状態のBOC−0−ベンジル−L−チ
ロシンを使用してジメチルホルムアミド中で50℃で2
4時間反応させた(トリエチルアミンは存在せず)、エ
ステル化度が約0.3mmol  Try/g樹脂のも
のを得た。
上記の様に単離された樹脂は、BOCの脱保護のため、
しかる後トリフルオロ酢酸:塩化メチレン=l:1の混
合物70mJlで30分間処理した0次で、濾過し、7
0m1の10%トリエチルアミンのクロロホルム溶液で
10分間処理してアミン基を遊離させた。濾過及び樹脂
のクロロホルム及び塩化メチレンによる処理の後、目的
とするO−ベンジル−L−チロシン−樹脂を得た。
B)アスパラギン酸との縮合及びBOCの脱保護 該樹脂を130mjLの塩化メチレンに懸濁し。
1050mg (3,24mmo 1)、即ちモル当量
の4−ベンジルエステルBOC−L−アスパラギン酸で
処理をした。10分間の攪拌後、縮合剤として670m
g (3,24mmo 1)(INN。
N′−ジシクロへキシルカルボジイミド(DCCD)を
30m1に溶解したものを加え、20℃で約120時間
反応させた。
樹脂を濾取し、塩化メチレン及びメタノールで洗浄し、
ニンヒドリンで縮合が完結したことを確認した(無呈色
)0次いでトリフルオロ酢酸との反応によりBOCの脱
保護をし、実施例5A)の手順に従いトリエチルアミン
で処理をし、(4−ベンジルエステル)Asp−(0−
ベンジル)Tyr−樹脂を1次の縮合に適した状態で得
た。
C)〜G)逐次縮合及びBOCの脱保護実施例5B)と
同様の手順で種々のDCCD存在下での縮合とBOCの
脱保護を、以下の保護されたアミノ酸の化学量の三倍蚤
を以下の順に使用して、交互に行なった。
C)BOC−0−ベンジル−L−)レオニンD)BOC
−0−ベンジル−L−セリンE)BOC−グリシン F)4−ベンジルエステルBOC−L−アスパラギン酸 G)BOC−0−<yジに−L−トLzオニ7:H)ア
スパラギンとの縮合及び樹脂からの全脱保護による切断 反応相G)によって生成し、BOCの脱保護された樹脂
(5,0g)を120mJlのジメチルホルムアミドに
懸濁し、1530mg (4,32mno 1)、即ち
4倍17)%ル当量のBOC−L−アスパラギンp−ニ
トロフェニルエステルで処理した。攪拌下に縮合反応を
室温で18時間続けた後、樹脂を濾取し、ジメチルホル
ムアミド及び塩化メチレンで洗浄し、減圧乾燥した。
注二手順の変形として、BOC−L−アスパラギンのp
−ニトロフェニルエステルを触媒1例えば1,2.4−
)リアゾールで活性化すると良い。
上記の様にして得られたペプチド−樹脂を。
4mJlのアニソールを含むトリフルオロ酢酸80mu
のに懸濁し、連続的に該懸濁液を通してガス状の臭化水
素酸を流すことにより、強固な保護をペプチドから切断
し、全官能基を脱保護した。
15℃で80分間ゆっくりと発泡させた後、樹脂を濾過
し、トリフルオロ酢酸で洗浄して濾液(溶液中に切断さ
れ、脱保護されたペプチドが含まれている)を再び集め
、濃厚な油状残査が得られるまで減圧乾燥した。続いて
、エタノールエチルエステル中のトリエチルアミンで1
時間処理することにより、白い結晶状の沈殿が直ちに生
成し、これを濾取し、減圧乾燥して実施例4で単離した
生成物と同じペプチド(■)612mg(全収量:最初
に縮合したアミノ酸に基き計算して65%)が得られた
実施例6 ペプチド(IT)〜(IK)の合成: 種々の調整は第1のアミノ酸でクロロメチル樹脂をエス
テル化により開始され、続いて、実施例5Aの手順に従
ってBOCの脱保護を行い、o−ベンジル−L−チロシ
ン−樹脂を得た。実施例5B〜5Gに記載されている1
以上の保護されたアミノ酸を所望の順序で縮合ため、最
後に縮合されたアミノ酸のBOCの脱保護という中間手
続がいる。
所望の最後のアミノ酸の縮合の後、樹脂からペプチド(
ff)〜(IX)を切断して実施例5Hの最終段階とし
て記載されている様に全脱保護をすることにより合成を
完結させた。
実施例7 固相に於けるペプチド(m)の逐次合成(スペーサーを
用いる方法): A)クロロメチル樹脂のグリシン(スペーサー)による
エステル化及びBOCの脱保護9.0gのスチレン−ジ
ビニルベンゼンクロロメチル共重合体(メリーフィール
ドのペプチド合成用樹脂の、75mJLのジメチルホル
ムアミドへの懸濁を、攪拌下50℃で24時間加熱して
行なうことにより2500mg (8,14mmo1)
のBOC−グリシンのセシウム塩でエステル化した。樹
脂を濾取し、ジメチルホルムアミド(DMF)、DMF
 :水=9:lの混合物及びエタノールで洗浄し、減圧
乾燥し、9.830gのBOC−グリシン−樹脂を得た
樹脂のアリコー) (250mg)を2.5gのピリジ
ンを用い100℃で1時間処理し、25m文の50%酢
酸により希釈し、残留塩素をフォルハルトによる滴定を
することにより。
0.785mmol  Gly/g樹脂に相当する該樹
脂のエステル化度を、クロロメチル樹脂の塩素の量の相
異により求めた。
BOC−グリシン−樹脂は、次いで、150m l (
7) T F A : CHCl 2−1 : 1の混
合物で処理し、懸濁液を室温で30分間攪拌してBOC
の脱保護をした。濾過及び塩化メチレンによる洗浄後、
該樹脂を150mJLの10%トリエチルアミンのクロ
ロホルム溶液で処理し、室温で10分間攪拌して塩の状
態のアミン基を遊離させ1次いで、濾過し、CHCl 
及びCH2O見、で洗浄し、減圧乾燥してGIF−樹脂
の定量的収率を得た。
B)アルギニンの縮合及びBOCの脱保護Gly−樹脂
を200m文の塩化メチレンに懸濁し、グリシンの3倍
量の第2のアミノ酸(所望の配列順序では第1のアミノ
酸)で処理するため60mJLのDMF:CHCJI2
=1:lの混合物に9 、85 g (23mmo 1
) (7)BOC−Nw−トシル−L−アルギニンが溶
解した溶液を加えた。10分間の攪拌ののち、30m文
の塩化メチレンに溶解した4、76g(23mmo1)
を加え、攪拌下室温で20時間放置した。樹脂を次いで
濾過し、CHC12及びエタノールで洗浄した後、減圧
乾燥して12.3gのBOC−Nw−)シルーL−アル
ギニンーグリシンー樹脂を得、ニンヒドリンにより遊f
aアミン基が存在しないことを確認した。
単離した樹脂を120mJlの TFA:CHC見、、−1:1の混合物に懸濁し、室温
で30分間攪拌することにより、BOCの脱保護を行っ
た。樹脂を濾過し、CH2O文。
で洗浄した後、通常通り10%トリエチルアミンのCH
Cl。(100m文)溶液での処理を。
10分間攪拌下で行い、目的とするNw−トシル−L−
アルギニン−樹脂を得た。
C)7スパラギンの縮合及びBOCの脱保護前記の様に
して得た樹脂を100mJLのジメチルホルムアミドに
懸濁し、10.9g(30,8mmo1)即ち4倍モル
当量のBOC−L−アスパラギンp−ニトロフェニルエ
ステルが40m Jl’ (F) D M Fに溶解し
たもの及び2.13sr(30,8mmo1)の1.2
.4−トリアゾールが30mJlのDMFに溶解したも
のを加えた。
反応混合物を室温で120時間攪拌した後、樹脂を濾過
し、DMF 、CH2Cl2及びエタノールで洗浄し、
減圧乾燥してBOC−Asn(Nw−トシル)Arg−
Gly−樹脂を得た。ニンヒドリンより、生成物は遊離
アミンが無いことが確認された0次いでBOCの脱保護
を120mJlのTFA:CH2Cl2−1 : lの
混合物中で室温で30分間攪拌することにより行なった
。濾過及びCH2Cl2による洗浄後、樹脂をloom
lの10%トリエチルアミンのクロロホルム溶液に10
分間の攪拌下懸濁し、濾過し、CHC見、及びCHC1
,で洗浄し、減圧乾燥してほぼ定1的な収率でAsn−
(Nw−トリル)Arg−G17−樹脂を得た。
D)〜E)トレオニンの縮合及びアラニンとの縮合及に
それに関するBOCの脱保護 上記の単離した樹脂をBOC−0−ベンジル−L−)レ
オニンと縮合させ、BOCの脱保護した後、再びBOC
−L−アラニンと縮合させ、BOCの脱保護した。双方
の段階とも実施例7Bに報告されている様に行った。
F)グルタミンの縮合及びBOCの脱保護BOC−L−
グルタミンp−二トロフニトロフェニルエステル階に使
用し、縮合及び脱保護は。
実施例7Cに報告されている様に行った。
G)トレオニンの縮合及びBOCの脱保護BOC−0−
ベンジル−L−)レオニンヲ使用して縮合段階を行った
。縮合及び脱保護は、実施例7Bに報告されている様に
行った。
H)アスパラギンの縮合及び部分的に脱保護されている
樹脂の切断 実施例7Gの手順の最終段階に於いて、単離された樹脂
を更にBOC−L−アスパラギンp −二トロフェニル
エステルと縮合させる。llii合段階に関しては、実
施例7Cの手順と同じであり。
BOC−Asn −(0−ベンジル)Thr−Gln−
Ala−(0−ベンジル)Thr−Asn(Nw−トシ
ル)Arg−Gly−樹脂を得た。得られた樹脂を1通
常のBOCの脱保護を行わずに、4mjLのアニソール
を含むトリフルオロ酢酸150m見に懸濁させ、臭化水
素酸をゆっくりと吹き込んだ0反応は、始めはやや発熱
性であったが、約60分間で終った。
次いで、樹脂を濾取し、TFAで洗浄し、濾液は減圧下
40℃以下の温度で蒸発させ、殆んど乾燥するまで濃縮
した。油状の残査を、過剰のエタノール−エチルエステ
ル中のトリエチルアミンで処理し、速かに結晶状の沈殿
物を得、これを濾取し、乾燥させて4.46gのペプチ
ドNH2−Asn−Thr−Gln−Ala−Thr−
Asn−(Nw−トシル)Arg−cxy−COOHを
得た。
1)Nw−トシルの脱保護 上記の単離されたペプチドを、約450mJlの液体ア
ンモニアに、−33℃で溶解し、明澄な黄色い溶液を得
た。濃紺に呈色するように、4.2gの金属ナトリウム
を少量づつ加え、少なくとも60分間これを続けたのち
、過剰のナトリウムアミドを9.6gの塩化アンモニウ
ムを少しづつ加えて破壊した結果、溶液の色が消えた。
そして、アンモニアを蒸発させるため放置した。残査を
、90m文の水に溶解し、少量の不溶物質を濾別し、f
i塩酸でpHを7に調節した。得られた溶液を、200
g(7)セファデックス(Sephadex)G−10
を含むカラムクロマトグラフィーにかけ、水で溶出し、
塩素イオンを含まない、即ち、無機基を含まない分画を
回収して、遊離剤として、エタノール:28%アンモニ
ア!7:3の混合物を使用し、溶出液をシリカゲル薄層
クロマトグラフィーにかけた。得られた分画を減圧下で
濃縮し、3.3gのペプチド(III)−グリシン(構
造X)を得た。
(X)の全加水分解後のアミノ酸の分析ミリ%ルAla
   Arg  Asp  Glu  Gly  Th
r  (NH3)計算値 1 1 2 1 1 2  
(3)L)グリシンの切断 3mjL (75mJL)のカルボキシペプチダーゼA
の懸濁液(牛の膵臓からとったもの、ベーリンガー マ
ンハイム−〇oehringer Nannhei層)
を30m1に希釈し、2000rpmの速度で5分間遠
心分離を行った。澄んだ溶液を捨て、残査を6mJlの
1モルの炭酸アンモニウムに溶解した。
PHは、7.8であった。蒸留水を加え、30mfLと
した。この溶液を、300mJLの水に3.3gのペプ
チド(m)−グリシンが溶解した溶液で希釈したアンモ
ニアでpHを8.5としたものに加えた。得られた溶液
を、37℃に保ち、同時に撹拌下、PHを8.5で2.
5時間保ったのち、希塩酸でpHを6とし、減圧にし、
温度を下げて濃縮し、容積を30mJlまでとした0次
いで溶液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで、
溶剤として、エタノール:28%アンモニア!95:5
,90:10及び80 : 20の混合物を、この順に
使用し、溶出し、酵素加水分解の間に遊離したグリシン
を取り除いた。つづいて、水で溶離し、溶出液を減圧濃
縮して容積を小さくし、つづいて、200mJLのエタ
ノールで処理をし、沈殿物を得、これを濾取した。生成
物を更に120mjlの水の中で蒸留し、少量の不溶物
を濾別したのち、溶液をセファデックスG−10で濾過
した。
薄層クロマトグラフィーで処理され、塩素イオンがない
ことが確かめられた最初の分画を減圧下で濃縮し、20
0mJlのエタノールで再び処理し、白い結晶性の沈殿
を得、濾過し、乾燥して、実施例4で単離した生成物と
同じペプチド(m)2.5gを得た。
実施例8 固相に於けるペプチド(III)の逐次合r&(直接法
): A)アルギニンによるクロロメチル樹脂のエステル化及
びBOCの脱保護 メリーフィールド(Nerriffeld)のペプチド
合成用樹脂4.0gを、40mJlのジメチルホルムア
ミドに懸濁し、2000mg (3,57ミリモル)の
BOC−Nw−トシル−L−アルギニンセシウム塩での
処理を、攪拌下50℃で24時間保持して行った0次い
で、樹脂を濾過し、1)MF。
DMF:H20=9:lの混合物及びエタノールで洗浄
し、減圧乾燥して所望のBOC−Nw−)シルーArg
−樹脂で、エステル化度が0.75ミリモルArg/g
樹脂であるものを得た。
得られた樹脂を、室温で30分間攪拌下で50m fL
(7) T F A : CH2Cl −1: 1の混
合物に懸濁させる処理によってBOCの脱保護を行った
次いで、樹脂を濾取し、CH2CJ12で洗浄し。
50℃見の10%トリエチルアミンのCHCl3溶液で
処理し、10分間攪拌したのち濾過し、CHC見 及び
CI(C12で洗浄し、減圧乾燥してNw−)シルーL
−Arg樹脂を得た。
B−F)上記で得られた樹脂とアスパラギン、及びトレ
オニンとの縮合及び、それぞれに該当するBOCの脱i
llを実施例7C乃至7Gのそれぞれの場合と同じに行
なった。
G)アスパラギンの縮合及び樹脂からの全脱保護による
切断 上記の実施例8Fで得られたBOCの脱保護された樹脂
を、BOC−L−アスパラギンp−ニトロフェニルエス
テルで処理し、実施例7Hの手順に従って縮合段階を行
った。無水フッ化水素醜及び1mjLの7ニソールを用
いて18乃至20℃で、l#間無処理ることにより、樹
脂からの切断を行った0反応混合物からフッ化水素酸を
蒸留したのち、TFAで抽出することにより、ペプチド
を樹脂から分離し、濾過し、TFAで洗浄し、集めた濾
液を減圧下で濃縮した。残査を過剰のエタノール−エチ
ルエーテル中のトリエチルアミンで処理し、結晶性の固
体を得、濾過し、乾燥させた。得られた生成物は、全部
脱保護されており、実施例4及び実施例7で得られたペ
プチド1)と同じものであった。
注:類似の結果が、実施例8Aに於けるエステル化の初
期段階で、代りにBOC−Nw−ニトロ−L−アルギニ
ンを使用した場合にも得られた。かかる代替は1種々の
縮合段階に影響せず。
樹脂からの切断の最終段階や、実施例8G中に報告され
ている全脱保護にも影響しない。
実施例9 ペプチド(XI)〜(XV) クロロメチル樹脂をBOC−グリシンでエステル化し、
実施例7Aに示すように、BOCの脱保護を行った。
実施例7B〜7Gに報告されているように。
1以上の保護されたアミノ酸を、所望の生成物に従い、
順番に縮合(及び、それぞれに続< BOCの脱係w1
)を続けた。
最後の所望のアミノ酸の縮合後、ペプチドを樹脂より切
断し、同時に、実施例7Hに示されるように1部分的に
脱保護をしたのち、実施例7Iに示されるように、アル
ギニンラジカルのNw−トシルの脱保護を行い、目的と
するペプチド(XI)〜(X V)を得た。
実施例10 ペプチド(XVt)〜(XX)の合成 実施例7Lに示される手順に従い、相当するペプチド(
XI)〜(XV)をカルボキシペプチダーゼAの作用に
よるグリシンの酵素的な切断にかけることにより製造を
行った。
または、実施例8に示すように、クロロメチル樹脂をア
ルギニン(実施例8A)でエステル化し、所望のアミノ
酸の順番に縮合させ、次いで。
ペプチドを樹脂から切断し、同時に、HF−TFA(実
施例8G)を全脱保護を行い、目的とするペプチド(X
 m)〜(X X)を得た。
実施例11 ペプチド(XXI)〜(X X m)及びペプチド(I
)の合成: 合成の方法は、上記で報告した手順から明らかなもので
ある。実施例5A〜5Gに示されるように、固相におけ
るペプチド(■)の逐次合成から始める。
実施例5Hに従い、アスパラギン(リゾチームアミノ酸
の46番目の位置)を縮合させたのち。
樹脂からの切断を進めるかわりに、更にアルギニン(リ
ゾチームアミノ酸の45番目の位W)及びペプチド(m
)の配列順序を構成する他のアミノ酸を実施例7B〜7
Hの順序に従い縮合させた。
製造は、ペプチドをレジンから切断し、同時に、2段階
で(実施例7H及び7I)又は1段階で(実施例8G)
、脱保護を行うことにより、終了した。
実施例12 ペプチド(XXW) 〜(xxXrV)(7)合成実施
例5A〜5Gに示すように、固相でペプチド(■)の逐
次合成を行った。
既に示されているように、BOC−グリシン及びDCC
Dを使用してグリシンの縮合を行い、アスパラギン及び
他のアミノ酸の縮合を実施例11に示すように、必要な
だけ続け、最終的に所望のペプチド(XXW)〜(X 
X X ff)を、得た。
実施例13 ペプチド(V)の均質相での合成: 20m1のジクロロメタンに溶解した2、0g(5,5
3ミリモル)のO−ベンジル−チロシンベンジルエステ
ルに、1.79g (5,53ミリモル)の4−ベンジ
ルエステル BOC−L−アスパラギン酸が、20+n
JlのCHC12に溶解したもの及び1.25g(6,
08ミリモル)のDCCDを加え、攪拌下に4℃で18
時間放置した。
生成したジシクロヘキシル尿素を濾別し、濾液を減圧下
で蒸発させ、エタノール−水から結晶化し、3.24g
 (4,87ミリモル、収率=88パーセント)の保護
されたジペプチド(IVa)であるBOC−(4−ベン
ジルエステル) A s p −(0−ベンジル)Ty
rベンジルエステル(TLC,Rf=0.95.CHC
u   :CH30H−95’:5)を得た。3.24
gのジペプチド(IVa)を、30m1(1)CHC1
:TFA−1:lの混合物で処理し、30分間室温で攪
拌した。溶剤を減圧下で蒸発させ、3.21g(4,7
2ミリモル、収率;97%)のジペプチドTFA@NH
2−(4−ベンジルエステル)Asp−(0−ベンジル
)Tyrベンジルエステル(xvb)を得た。
25mJlのDMFに溶解した3−21gのジペプチド
(IVb)、0.7m1(5ミリモル)のトリエチルア
ミン、20mjLのDMFに溶解した1、46g(4,
72ミリモル)のBOC−0−ベンジル−L−トレオニ
ン及び1.07g(5,19ミリモル)のDCCDを混
合し、Wl拌下、4℃で18時間保った。濾過ののち、
濾液の7に発及び結晶化による精製によって、3.32
g(3,87ミリモル)のBOC−(0−ベンジル)T
hr−(4−ベンジルエステル)Asp−(0−ベンジ
ル)Tyrベンジルエステルである保護されたトリペプ
チド(V a)を得た(収率:82%)、CI(C12
によるBOCの脱保護により、3.23g (3,71
ミリモル)のTFA−NH−2(0−ベンジル)Thr
 −(4−ベンジルエステル)Asp−、(0−ベンジ
ル)Tyrベンジルエステル(Wb)(収率=96%)
を得た。
側鎖の脱係;l:3.23g(7)(Wb)t”、80
%の酢酸水溶液に溶解し、10%の炭素状のパラジウム
(Pb)により室温で60分間、触媒水素添加を行った
。触媒を濾過したのち、濾液を凍結乾燥し、中和し、結
晶化して、1.19g(3,0ミリモル)のNH−Th
r−Asp −Tyr−COOHであるトリペプチド(
V)を得た(収率=81%)。
薄層クロマトグラフィーにおいて、ただひとつのニンヒ
ドリン及びパクリ試薬に対して陽性のスポットが111
1察された(Rf=0.63 、エタノール:28%ア
ンモニア=7o : 30)。
実施例14 ペプチド(XIK)の均質相に於ける合成2.6g(6
,+6ミリモル)のNw−ニトロ−L−フルゲニンベン
ジルエステル及び25m1のDMFに溶解した2、74
g(7,75mmo 1)のBOC−L−アスパラギン
p−二トロフェニルエステルを、4℃でta時間攪拌下
に保った。
溶剤を減圧下で蒸発し、B OC−A s n −(N
W−二トロ)Argベンジルエステルであるジペプチド
(XvIa)をシリカゲルクロマトグラフィー及び結晶
化(無水)(abs、、エタノール)によって精製し、
2.4g(4,72ミリモル、収率=73%)を得た。
薄層クロマトグラフィー(CHC文 :CH30H−9
:1)では明らかに、ただひとつのスボツ)(Rf−0
、27)が認められた。
2 、4gの(XWa)を、20mMのCHC見 : 
TFA悶l:1の混合物により1時間、室温で、攪拌下
でBOCの脱保護処理にかけた。溶液を減圧下で蒸発さ
せ、2.43K(4,64ミリモル、収率雪98.6%
)のTFA  II NH2−Asn  −(Nw  
−ニ ト 仁1 )Argベンジルエステルジペプチド
(xvrb)を得た。
30+nJlのDMFに溶解した2、43gのジペプチ
ド(X■b)1.:、0.7g(5ミリモル)ノトリメ
チルアミン及び20mJLのDMFに溶解した2、26
g(5,57ミリモル)のBOC−O−ベンジル−L−
)レオニンN−ヒドロキシサクシンイミドエステルを加
え、攪拌下に4℃で18時間放置した。溶剤の蒸発及び
エタノールからの結晶化ののち、2.65g (3,7
2ミリモル、収率=80%)のBOC−(0−ベンジル
)Thr−Asn−(Nw−二)口)Argベンジルエ
ステルである保護されたトリペプチド(X 111 a
 )を単離した。
薄層クロマトグラフィー(CHC13:CM  OH:
CH3CO0I(=90:8:2)では、ひとつのスポ
ット(Rf、0.37)が認められた。
CHCJI2による( X Na )の脱係、!t:T
F’Aにより、2.7g (3,71ミリモル)のTF
A @NH2−(0−ベンジJlz)Thr−Asn−
(Nw−ニトロ)Argベンジルエステル(x′qri
b)(収率=100%)を得た。
30mJLのDMFに溶解した2、70gの(X[b)
、056m1 (4、Oミリモル)のトリエチルアミン
及び1.27g(4,45ミリモル)のBOC−L−ア
ラミンN−ヒドロキシーサクシンイミドエステルの混合
物を、攪拌下、4℃で18時間放置した。
無水エタノールからの結晶化ののちに、2.84g(3
,6tlミリモル、収率冨97.4%)のBOC−A 
l a −(0−ベンジル)Thr−Asn−(Nw−
ニトロ)Argベンジルエステルである保護されたテト
ラペプチド(XWa)を得た。薄層クロマトグラフィー
(CHCfL3 :CM30H=9 : 1)では、R
f−0,37であった。脱保護ののち、2.85g (
3,57ミリモル)のT F A 11N H2−A 
l a −(0−ベンジル) Th r−A s n 
−(Nw−二)口)Argベンジルエステルである(x
wb)が得られた(収率=98.9%)。
30 m l (7) D M Fに溶解した、2.8
5gf)(X[b)を0.56m1 (4,0mmo 
f)のトリエチルアミン及び20IIIlfLのDMF
に溶解した1、57gの(4,28mmo1)のBOC
−L−グルタミンpニトロフェニルエステルで処理し、
攪拌下4℃で36時間放置した。結晶化ののち、2.9
9g (3,27mmo l、収率=91.7%)の保
護されたペンタペプチド(XIXa)を単離した。薄層
りaマドグチフィー(CHCI  :CH30H=+9
:1)ではRf=0.17であった。BOCの脱保護の
のち、3゜03g(3,27ミリモル)のTFA−NH
2−Gln−Ala−(0−ベンジル)Thr−Asn
−(NW−ニトロ)Argベンジルエステル(XrKb
〕を得た(収率=100%)。
側Hノll1i!保護: 3.03g(1)(XIXb
) を、100m1の80%酢酸水溶液に溶解し、炭素
状の10%パラジウムにより触媒水素添加を室温で48
時間で行った。触媒を濾過により除去し。
濾液を凍結乾燥した。トリメチルアミンによる中和及び
結晶化による精製ののち、1.50gのNH2−Gln
−Ala−Thr−Asn −Arg−COOHである
ペンタペプチド(XDC)を単離した(収率=78%)
、薄層クロマトグラフィーでは、ニンヒドリン及びサカ
グチ試薬に対し陽性のスポットが、ただひとつのみ認め
られた(Rf=O,19、メタノール:28%アンモニ
ア=9 : 1) 。
【図面の簡単な説明】
第1図は1本発明の化合物を得るための反応経路を示す
ブロック図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)少なくとも3以上のアミノ酸からなり、以下の構造
    の配列順序: 【アミノ酸配列があります】 を有するペプチドであって、Yは存在しなくても、グリ
    シン残基であってもよく、アミノ酸【アミノ酸配列があ
    ります】及び【アミノ酸配列があります】はニワトリ卵
    白リゾチームの39乃至45番目及び46乃至53番目
    の位置の配列順序を示すことを特徴とするペプチド 2)他のペプチドとの混合物として存在する特許請求の
    範囲第1項記載のペプチド 3)■をカルボキシ−末端アミノ酸として有する特許請
    求の範囲第1項記載のペプチド 4)YがGlyであり、かつカルボキシ−末端アミノ酸
    である特許請求の範囲第1項記載のペプチド 5)■をカルボキシ−末端アミノ酸として有する特許請
    求の範囲第1項記載のペプチド 6)【アミノ酸配列があります】に於て、Yが存在しな
    い構造を有する特許請求の範囲第1項記載のペプチド 7)【アミノ酸配列があります】の構造を有する特許求
    の範囲第1項記載のペプチド 8)【アミノ酸配列があります】の構造を有する特許請
    求の範囲第1項記載のペプチド 9)【アミノ酸配列があります】の構造を有する特許請
    求の範囲第1項記載のペプチド 10)グリシン以外のアミノ酸が左旋体である特許請求
    の範囲第1項記載のペプチド 11)リゾチームがペプシン及び/又はトリプシン及び
    /又はキモトリプシンにより酵素的に加水分解されるこ
    とを特徴とする少くとも3以上のアミノ酸からなり、以
    下の構造の配列順序:【アミノ酸配列があります】を有
    するペプチドであって、Yは存在せず、アミノ酸【アミ
    ノ酸配列があります】及び【アミノ酸配列があります】
    はニワトリ卵白リゾチームの39乃至45番目及び46
    乃至53番目の位置の配列順序を示すペプチドの製造方
    法。 12)水解物を有機溶剤による処理及びシリカゲルクロ
    マトグラフィー及びイオン交換樹脂により分別すること
    を特徴とする特許請求の範囲第11項記載のペプチドの
    製造方法。 13)固相に於ける逐次合成による少くとも3以上のア
    ミノ酸からなり、以下の構造の配列順序: 【アミノ酸配列があります】 を有するペプチドであって、Yは存在しなくても、グリ
    シン残基であってもよく、アミノ酸【アミノ酸配列があ
    ります】及び【アミノ酸配列があります】はニワトリ卵
    白リゾチームの39乃至45番目及び46乃至53番目
    の位置の配列順序を示すペプチドの製造方法であって、
    カルボキシ−末端アミノ酸をスチレン−ジビニルベンゼ
    ンクロロメチレート共重合体でエステル化し、順次アミ
    ノ酸をアミンの窒素側に目的とする配列順序で縮合し、
    該樹脂からペプチドを分離することを特徴とするペプチ
    ドの製造方法 14)カルボキシ−末端アミノ酸がセシウム塩の形態で
    あり、他の官能基が保護されている特許請求の範囲第1
    3項記載の製造方法 15)アミノ基側に縮合するアミノ酸が縮合剤の効果に
    より又は予めp−ニトロフェノールによりエステル化す
    ることによりカルボニシル基の活性化を受けており、他
    の官能基が保護されている特許請求の範囲第13項記載
    の製造方法 16)ハロゲン化水素の作用により目的とするペプチド
    を樹脂から分離する特許請求の範囲第13項記載の製造
    方法 17)目的とするペプチドを構成するアミノ酸をトリフ
    ルオロ酢酸の作用により脱保護する特許請求の範囲第1
    4項又は15項記載の製造方法 18)均質相に於ける逐次合成による、少くとも3以上
    のアミノ酸からなり、以下の構造の配列順序: 【アミノ酸配列があります】 を有するペプチドであって、Yは存在しなくても、グリ
    シン残基であってもよく、アミノ酸【アミノ酸配列があ
    ります】及び【アミノ酸配列があります】はニワトリ卵
    白リゾチームの39乃至45番目及び46乃至53番目
    の位置の配列順序を示すペプチドの製造方法であって、
    カルボキシ−末端アミノ酸をベンジルエステルとして保
    護し、順次アミノ酸をアミンの窒素側に目的とする配列
    順序で縮合し、触媒水素添加によりベンジルエステルを
    切断することを特徴とするペプチドの製造方法 19)少くとも3以上のアミノ酸からなり、以下の構造
    の配列順序: 【アミノ酸配列があります】 を有するペプチドであって、Yは存在しなくても、グリ
    シン残基であってもよく、アミノ酸【アミノ酸配列があ
    ります】及び【アミノ酸配列があります】はニワトリ卵
    白リゾチームの39乃至45番目及び46乃至53番目
    の位置の配列順序を示すペプチドの少くとも1つを有効
    量含有する人間及び家畜の病気の治療に有効な鎮痛性、
    抗ウィルス性及び免疫モジュレーション作用のある薬剤
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