JP2001278893A - 新規ペプチド、その製造法及び用途 - Google Patents
新規ペプチド、その製造法及び用途Info
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Abstract
提供。 【解決手段】 黒酢を分画し、単離精製することによっ
て得られる次のジペプチド及びトリペプチド。 Ile-Tyr-Pro 、Phe-Phe 、Gln-Leu-Pro 、Asn-Pro アンジオテンシンIを変換酵素阻害活性を有し、高血圧
症の予防及び治療に有用である。このペプチドを有効成
分とするアンジオテンシンIを変換酵素阻害剤及び黒酢
からこのペプチドを製造する方法。
Description
ンシンI変換酵素阻害ペプチド、このペプチドを黒酢か
ら製造する方法及びそのペプチドの用途に関する。
肺に多く含まれ、血管壁、脳、腎臓などにも存在し、ア
ンジオテンシンI に作用してこれをアンジオテンシンII
に変換する酵素である。アンジオテンシンI は血圧上昇
作用を示さないが、アンジオテンシンIIは抹消血管を収
縮し、血圧を大きく上昇させることが知られている。ま
た、血漿に含まれるキニノーゲンにタンパク質分解酵素
カリクレインが作用して、血管を拡張して血圧を下げる
働きを有するブラジキニンを生じるが、ACE はこのブラ
ジキニンを分解し、不活性化してしまう。このようにAC
E は血圧に大きく作用する酵素である。したがって、前
記のようなACE の作用を阻害すれば、血圧の上昇を抑え
ることができ、高血圧症を予防、治療することができる
と考えられる。特に最近カプトプリルが合成され、その
高血圧抑制効果が確認されてから、ACE 阻害物質の研究
が盛んに行われるようになった。現在、天然タンパク質
由来の、あるいは合成による各種のペプチド類がACE
阻害効果を有することが報告されている。例えば、天然
蛋白質由来のACE阻害ペプチドとしては、マムシ、牛
乳カゼイン、魚類タンパク質、トウモロコシ、小麦グル
テンに由来するものなどが知られている。例えば特開平
4-66594 号公報には、小麦グルテンのプロテアーゼ処理
物からIle-Ala-Pro が、特開平4-139195号公報にはカツ
オブシのサーモライシン加水分解物からLeu-Tyr-Pro
が、特開平4-69396 号公報はハカツオブシのサーモライ
シン加水分解物からIle-Lys-Pro がそれぞれ記載されて
いる。また特開平5-306295号公報にはカツオ内臓の自己
液化物から Ile-Arg-Proが記載されている。
ドの代表的な例としてカプトプリルが挙げられるが、カ
プトプリルは強力な血圧降下作用を有するが高価であ
り、また、発疹や味覚障害の副作用が懸念されている。
一方、天然蛋白質に由来するものは、食品から得られる
ものは経験的に低毒性で (副作用が少ない) 安全性の高
い物であることが窺える。しかし、前記の天然蛋白質に
由来するものは、その原料が特殊であったり、製造工程
が非常に煩雑であったり、あるいは充分なACE阻害効
果が得られない等の問題がある。
安価に入手でき、製造が容易であり、安全性の高いAC
Eの阻害剤が求められている。本発明は長年にわたり黒
酢の成分と薬理作用との関係について探究していたとこ
ろ、黒酢のジペプチドあるいはトリペプチドがACE阻
害活性を呈することを見出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明の目的は、天然物から、安全性が
高く、優れたACE阻害活性を有する新規ペプチドを得
ることにある。また本発明の目的はこのようなペプチド
を有効成分とするACE阻害剤を提供することにある。
本発明のさらなる他の目的は黒酢からこのようなペプチ
ドを製造する方法を提供することにある。
の式で示されるアンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチ
ド又はその塩に関する。 Ile-Tyr-Pro 、Phe-Phe 、Gln-Leu-Pro 又はAsn-Pro 。 また本発明は、前記ジペプチド、トリペプチドまたはそ
の塩を有効成分とするアンジオテンシンI 変換酵素阻害
剤に関する。
て活性炭非吸着成分を酸性において酢酸エチルで抽出
し、抽出残存水層からペプチドを単離精製することより
なる黒酢から、Gln-Leu-Pro 、Asn-Pro またはその塩を
製造する方法に関する。また、本発明は、黒酢を活性炭
で処理して活性炭吸着成分をエタノールで溶出し、これ
を酸性において酢酸エチルで抽出し、抽出液または抽出
残存水層からペプチドを単離精製することよりなるIle-
Tyr-Pro 、Phe-Phe 又はその塩の製造方法に関する。本
発明のこれらのジペプチドあるいはトリペプチドは、黒
酢より得ることができる。そして、これらのペプチドの
塩としては、そのC末端カルボキシル基をナトリウム
塩、カリウム塩、アンモニウム塩等で置換したり、ある
いはN末端のアミノ基等に塩酸、カルボン酸等の酸を付
加して塩とすることができる。これらの塩は通常の塩の
形成方法によって容易に得ることができる。また、これ
らのペプチドまたはその塩は化学合成法で得ることもで
きる。
に並べた醸造用カメに、米、こうじ等を天然の湧水で仕
込み、太陽エネルギーで長時間かけて熟成して作られる
ものである。黒酢には、脂質代謝改善作用、赤血球変形
能改善作用、血圧降下作用等があることが知られてい
る。本発明の黒酢は、このような黒酢ばかりではなく通
常黒酢として製造販売されているものからも製造するこ
とができる。黒酢からペプチドを得る方法は、実施例に
おいて具体的に説明するが、一般的には、黒酢を、吸着
剤 (例えば、活性炭) で処理し、黒酢中のペプチドを吸
着させるかあるいは吸着させず、吸着剤あるいは吸着剤
透過液をエタノール、蟻酸などの溶剤で溶出処理し、溶
出された成分を酸性又はアルカリ性において酢酸エチル
などの溶剤で抽出する。抽出液あるいは抽出残存水層を
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いてペ
プチドを分離精製する。本発明のペプチドは、このよう
にして得られるが、この方法のみに限定されず、黒酢か
ら周知のペプチドの単離方法であればどのような方法で
も用いられ、高純度、高収率でさらには低コストに生理
活性の高いペプチドを得ることができる。
成法により、例えば、固相法または液相法を用いて製造
することができる。この場合、ペプチド合成機を用いて
行えば一連の反応操作が自動的に行われるので便利であ
る。
換酵素(ACE) 阻害作用を有する。したがって、高血圧の
治療薬として有用である。ヒト及び種々の動物に投与で
き、少量の投与によって顕著な血圧低下効果があられ
る。高血圧の症状にもよるが、投与量は成人の高血圧症
の場合、1 日1〜10mgを数回に分けて投与するとよい。
投与方法は、経口投与、非経口投与 (注射、塗布、貼付
等) のいずれにも使用できる。また、投与形態は、錠
剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水溶液、注射剤等
の任意の形態が可能である。
的に説明する。
ー(RP-HPLC) を次の条件で行った。 (1) RP-HPLC 条件1 装置: Waters社 600 Controller Waters社 717 Autosampler Waters社 486 Detector カラム: Waters社 BONDASPHERE 5μ C18100 Å(3.9×150mm) カラム温度: 40℃ 測定波長: 220nm 流速: 0.5ml/min バッファー液: A液 5mM リン酸カリウムバッファー(pH6.0) B液 A液にアセトニトリルを60%含有させた混合液 0〜5分はA液を 100%、B液は0%、5〜40分までは
A液を30%、B液は70%になるように濃度勾配をかけて
溶出し溶出画分を分取した。
記RP-HPLC 条件1と同じ条件で、バッファー液は次のも
のを用いた。 バッファー液:A液 0.1 %トリフルオロ酢酸 B液 A液にアセトニトリルを60%含有させた混合液 0〜5分はA液を 100%、B液は0%、5〜40分までは
A液を30%、B液は70%になるように濃度勾配をかけて
溶出し溶出画分を分取した。
た。ACE阻害活性は、Lieberman の方法を改良した山
本らの方法 (日胸疾会誌、18(5) p297〜303 、1980) で
行った。すなわち、試料に25mUのACEを50μl 加え、
37℃で10分間反応させた後、12.5mM Hip-His-Leu溶液
(ホウ酸緩衝液−1.0MNaCl、pH8.3)を50μl 加え、37℃
で60分間反応させた。0.5N HClを 125μl 加えて10分間
放置して反応を停止させた後、 750μl の酢酸エチルに
て馬尿酸を抽出し、そのうちの 250μl を採り遠心エバ
ポレーターで減圧乾固した。これを、1500μl の1.0M
NaCl溶液に溶解し、228nm における吸光度を測定した。
各試料のACE阻害活性は、カプトプリルで完全に阻害
しているものを 100%とした時の相対活性 (%) で表し
た。なお、ACE及びカプトプリルはシグマ社製、 Hip
-His-Leu はペプチド研究所製のものを用いた。 Hip
は、hippurylを示す。
たペプチドをミリポア社製のWaters社 PICO-TAG ワーク
ステーションを用いて気相加水分解法によって加水分解
後、乾固した試料に用時調製した中和試薬10μl 加え再
び減圧乾固した。これに用時調製したPTC 化用試薬を20
μl 加えミキサーでよく振とう撹拌後、50℃、30分間反
応させた。次いで、Waters PICO-TAG ワークステーショ
ンを用いて試料を減圧乾固した。これに後述のアミノ酸
分析条件に示すA溶媒 100μl に溶解し、HPLCの分析に
供した。上記試薬としては、フェニルイソチオシアネー
ト(PITC)溶液は5%PITC-n- ヘプタン溶液を用いた。中
和試薬はメタノール:水:トリエチルアミン=2:2:
1の割合で混合した溶液を用いた。PTC 化用試薬は5%
PITC-n-ヘプタン溶液:トリエチルアミン:水:メタノ
ール=1:1:1:7の割合で混合した溶液を用いた。
試薬はすべて和光純薬のものを使用した。
た。 装置: Waters社 600 Controller Waters社 717 Autosampler Waters社 486 Detector カラム: YMC-GEL ODS-AM 120-S5 (4.0×150mm) カラム温度: 40℃ 測定波長: 254nm 流速: 1.0ml/min バッファー液:A溶媒 0.2%トリエチルアミン−0.14M 酢酸ナトリウム溶液 (pH6.05) B溶媒 60 %アセトニトリル水溶液 0分はA溶媒89%、B溶媒11%でバッファーライズし、
0〜2分はA溶媒を85%、B溶媒は15%、 2〜5.5 分ま
ではA溶媒を85%、B溶媒は15%、 5.5〜9.0分までは
A溶媒を55%、B溶媒は45%になるように濃度勾配をか
け、 9.0〜19.0分でA溶媒を0%、B溶媒は 100%にな
るように濃度勾配をかけて溶出した。
ント溶出条件として次の条件を用いた。
ノ酸配列は ChangらのDABITC/PITC ダブルカップリング
法を用いて決定した。すなわち、試料乾燥品に50%ピリ
ジンを80μl 加え、さらに DABITC を40μl加え55℃、3
0分反応させた後、フェニルイソチオシアネート(PITC)
を10μl 加え55℃、30分反応させた。これにn-ヘプタ
ン:酢酸エチル=2:1を 500μl 加え遠心し、上層と
下層が1:1になるまで上層を採取し捨てた。この操作
を3回繰り返した後、デシケーターに入れ減圧乾固させ
た。乾燥標品にトリフルオロ酢酸(TFA) 30μl を加え55
℃、10分反応させ、窒素ガスを吹き付けTFA を飛ばした
後、水50μl 加え、さらに酢酸ブチル 200μl 加え抽出
し、酢酸ブチル層を別チューブに移した。水層は減圧下
で乾燥させた後、2残基目以降の構造解析に使用した。
酢酸ブチル層は湯溶上で窒素ガスを吹き付け乾燥させ、
TFA 10μl と水10μl を加え55℃、15分反応させた。反
応終了後、デシケターに入れ乾燥させた。乾燥した試料
をエタノール 1μl で溶解し、ポリアミドシート上にス
ポットし、2 次元に展開し、展開後、シートに塩酸の蒸
気を吹きかけ、アミノ酸の同定を行った。
15g に通して黒酢中のペプチドを活性炭に吸着させ、該
活性炭をエタノールで溶出し、次いで蟻酸で溶出した。
黒酢は、活性炭を透過した成分A、エタノールで溶出さ
れた成分B、及び蟻酸で溶出された成分Cに分画され
た。成分A、B及びCのそれぞれについて、ロータリー
エバポレーターで濃縮した後、酸性において酢酸エチル
で抽出し、水層部分を希アンモニア水にてpH8.0 に調整
してアルカリ性において酢酸エチルで抽出した。つま
り、成分Aを酸性下で酢酸エチルで抽出した画分A1
と、アルカリ性下で酢酸エチルで抽出された画分A2
と、さらに残存した水層部分の画分A3 に分画した。成
分Bを、同様に画分B1 、画分B2 及び画分B3 に分画
し、成分Cを、画分C1 、画分C2 及び画分C3 に分画
した。各画分のACE阻害活性を後述の方法で測定し
た。その結果を表1に示す。表1からACE阻害活性
は、画分A3 、画分B1 及び画分B3 が高いことがわか
る。そこで、これらの3画分について、さらに分画して
高いACE阻害活性を示すペプチドがどのような構造を
有するものか分析を進めた。
件で逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。その結
果を図1に示す。図1における1〜9のピークを分取し
て濃縮乾固した。また、各ピークのACE阻害活性を測
定した。その結果を表2に示す。
00μl の水に溶解し、さらにRP-HPLC 条件2に示す条件
で逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。その結果
を図2に示す。ピークB1-5はピーク5-a,5-b を有したの
で各ピークのACE阻害活性を測定した。その結果を表
3に示す。その中でACE阻害活性が強かったピーク5-
b画分の精製ペプチドのアミノ酸の種類及び配列をPICO
-TAGアミノ酸分析システム (ミリポア社製) などを用い
て求めた。その結果、ピーク5-b の構成アミノ酸は Phe
で、そのアミノ酸配列はPhe-Phe であると決定された。
3 をRP-HPLC 条件1で逆相高速液体クロマトグラフィー
に供した。その結果を図3に示す。図3における1〜5
のピークを分取して濃縮乾固した。また、各ピークのA
CE阻害活性を測定し、その結果を表4に示す。
00μl の水に溶解し、さらにRP-HPLC 条件2で逆相高速
液体クロマトグラフィーに供した。その結果を図4に示
す。ピークA3-5はピーク5-a 画分を有し、ACE阻害活
性を測定した結果を表5に示す。
の種類及び配列をPICO-TAGアミノ酸分析システム (ミリ
ポア社製) などを用いて求めた。その結果、ピーク5-a
はGln 1, Pro 1, Leu 1 の組成を有し、そのアミノ酸配
列はGln-Leu-Pro であると決定された。
ークA3-3を 100μl の水に溶解し、さらにRP-HPLC 条件
2で逆相高速液体クロマトグラフィーに供した。その結
果を図5に示す。ピーク5A3-3はピーク3-a,3-b,3-c を
有した。それぞれのACE阻害活性を測定した結果を表
6に示す。その中でACE阻害活性が強かったピーク3-
a 画分の精製ペプチドのアミノ酸の種類及び配列をPICO
-TAGアミノ酸分析システム (ミリポア社製) などを用い
て求めた。その結果、ピーク3-a はAsn 1, Pro 1の組成
を有し、そのアミノ酸配列は Asn-Proであると決定され
た。
い、脱イオン水中でゲル濾過を行った。ゲル濾過パター
ンを図6に示す。ACE阻害活性の強い画分B3Cを RP-
PHLC条件1で逆相高速液体クロマトグラフィーに供し
た。その結果を図7に示す。図7に示すように多くのピ
ークが得られ、その殆どにアンジオテンシン変換酵素阻
害活性が認められた。そのち活性の強いピークのACE 阻
害活性を表7に示す。
含まれるペプチドの構造を調べるため、その精製を行っ
た。図7で得られたピークB3C-6 をTFA-MeCN系を用いて
RP-HPLC条件2で逆相高速液体クロマトグラフィーに供
した。得られたピークを図8に示す。このうちピーク6-
a のアミノ酸組成を分析した。その結果、Pro 1, Tyr1,
Ile 1 の組成を有し、そのアミノ酸配列はIle-Tyr-Pro
と決定された。
ペプチド 5mgを、乳糖50mg、マンニトール20mg及びぶど
う糖25mgと混合し、打錠を行って錠剤とした。この錠剤
を高血圧症の患者に1日1〜2錠投与する。
リペプチドが提供される。これらのペプチドは、新規で
あり、アンジオテンシンI変換酵素阻害活性を有し、次
のIC50を有するのでアンジオテンシンI変換酵素阻害
剤として、高血圧症の予防あるいは治療に用いられる。 Ile-Tyr-Pro 1.3 μM Phe-Phe 2.8 μM Asn-Pro 148 μM Gln-Leu-Pro 174 μM また、本発明によると黒酢からこれらのペプチドを効率
よく単離することができる。
チャートを示す。
示したピークB1-5をRP-HPLC 条件2で分離したチャート
を示す。
チャートを示す。
示したピークA3-5をRP-HPLC 条件2で分離したチャート
を示す。
示したピークA3-3をRP-HPLC 条件2で分離したチャート
を示す。
たチャートを示す。
示したピークB3C-6 をRP-HPLC条件2で分離したチャー
トを示す。
Claims (4)
- 【請求項1】 次の式で表されるアンジオテンシンI変
換酵素阻害ペプチド又はその塩。 Ile-Tyr-Pro 、Phe-Phe 、Gln-Leu-Pro 又はAsn-Pro 。 - 【請求項2】 請求項1記載のペプチドまたはその塩を
有効成分とするアンジオテンシンI変換酵素阻害剤。 - 【請求項3】 黒酢を活性炭で処理して活性炭非吸着成
分を酸性において酢酸エチルで抽出し、抽出残存水層か
らペプチドを単離精製することを特徴とする黒酢から、
Gln-Leu-Pro 、Asn-Pro またはその塩の製造法。 - 【請求項4】 黒酢を活性炭で処理して活性炭吸着成分
をエタノールで溶出し、これを酸性において酢酸エチル
で抽出し、抽出液または抽出残存水層からペプチドを単
離精製することを特徴とするIle-Tyr-Pro 、Phe-Phe ま
たはその塩の製造法。
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