WO2011074731A1 - 혈압저하능을 가진 펩타이드 - Google Patents

혈압저하능을 가진 펩타이드 Download PDF

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WO2011074731A1
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peptide
seq
treating
oyster
composition
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공재열
최영준
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    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
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    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/0817—Tripeptides with the first amino acid being basic the first amino acid being Arg
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having a blood pressure lowering ability, and more particularly, to a peptide capable of inhibiting angiotensin converting enzyme (ACE) and lowering blood pressure.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Peptides derived from food proteins in food components have been reported to exhibit a wide range of physiological activities, such as anticancer, lowering blood pressure, lowering serum cholesterol, enhancing immunity and promoting calcium absorption.
  • opioid peptides which are involved in the contraction of smooth muscles such as analgesic, anesthesia, intestine, and appetite control in vivo, phagocytosis peptides for immunopotentiation, and angiotensin-I converting enzyme (ACE) Peptides that belong to antithrombotic peptides that inhibit platelet aggregation.
  • smooth muscles such as analgesic, anesthesia, intestine, and appetite control in vivo
  • phagocytosis peptides for immunopotentiation phagocytosis peptides for immunopotentiation
  • ACE angiotensin-I converting enzyme
  • Angiotensin converting enzymes are dicarboxy peptides found in the proximal tubules of the blood vessels and kidneys, endothelial, heart, lung, activated macrophages, and brain tissues. Activated angiotensin I from an angiotensinogen is converted to angiotensin II. Angiotensin II acts on four types of AT receptors in the adrenal glands, vascular smooth muscle cells, kidneys, heart, etc., which cause vasoconstriction, release of aldosterone and vasopressin, absorption of tubules by sodium, and decreased blood flow to the kidneys. It has been reported that this can lead to various lesions in the cardiovascular, renal and central nervous areas.
  • angiotensin converting enzyme inhibitors or angiotensin converting enzyme inhibitors are reported to be able to treat or prevent cardiovascular diseases such as hypertension, heart disease, arteriosclerosis, or cerebral hemorrhage or kidney disease, and many studies have been conducted. It's going on. Specifically, the results of various clinical studies and clinical trials confirming that it can effectively reduce chronic kidney disease, arteriosclerosis, heart attack and death thereof are reported.
  • angiotensin converting enzyme inhibitor derived from a natural substance which does not cause side effects and ensures safety.
  • an angiotensin converting enzyme inhibitor derived from a natural substance used as a food what is obtained from food protein hydrolyzate or food protein hydrolyzate is reported.
  • angiotensin converting enzyme inhibitory activity was generally found to have a high effect on low molecular peptides of 3,000 Da or less.
  • peptides having excellent angiotensin converting enzyme inhibitory activity derived from food proteins have a high molecular weight. It was confirmed that it was 1,000 Da or less.
  • the number of amino acid residues is required to be less than 5 because they may undergo hydrolysis by enteric enzymes without being absorbed into a circular structure upon oral administration.
  • food-derived angiotensin converting enzyme inhibitors satisfying all of the above conditions have not been reported.
  • the present invention can inhibit angiotensin converting enzyme (ACE), has a blood pressure lowering ability, food-derived side effects are not a problem, safety peptides
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • the present invention provides a novel peptide derived from oysters that can inhibit angiotensin converting enzyme (ACE).
  • the peptide may be a peptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or acid addition salts thereof.
  • the present invention provides a composition for the treatment or improvement of cardiovascular disease or hyperlipidemia comprising the peptide as an active ingredient in order to achieve the above object.
  • the present invention also provides a nucleotide encoding the peptide to achieve the above object.
  • the present invention provides a vector comprising a nucleotide encoding the peptide to achieve the above object.
  • the present invention also provides a method for preparing a composition for treating or preventing cardiovascular disease.
  • the inventors of the present invention while studying a food-derived angiotensin converting enzyme inhibitor, confirmed that the peptide of the present invention obtained by enzymatic treatment of oysters has a very good angiotensin converting enzyme inhibitory effect, and furthermore, by administering the peptide to experimental animals As a result, it was confirmed that the blood pressure lowering ability was excellent, and thus, the present invention was completed.
  • the present invention relates to a novel peptide derived from oysters that can inhibit angiotensin converting enzyme (ACE).
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • the angiotensin converting enzyme is mainly present in the pulmonary capillaries and induces vasoconstriction by decomposing two terminal amino acids of angiotensin I in an inactive state in the bloodstream, and induces aldosterone secretion to increase body fluids to increase blood pressure.
  • Angiotensin II is an enzyme that converts into angiotensin II, which is capable of raising blood pressure, and the angiotensin converting enzyme inhibitor inhibits the angiotensin converting enzyme and exhibits a vasodilation effect.
  • the peptide is preferably a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or acid addition salts thereof, for example, a peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or acid addition salts thereof Can be.
  • the peptide may be present in isolated or substantially pure form.
  • the peptide may be a substance derived from a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the acid addition salt may be a pharmaceutically acceptable acid addition salt, and the pharmaceutically acceptable acid addition salt refers to a salt that maintains the biological activity of the peptide and minimizes side effects such as an unwanted toxin effect.
  • the acid addition salt may be a pharmaceutically acceptable inorganic acid addition salt or organic acid addition salt, and for example, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, acetate, benzoate, maleate, fumarate, succinate, tartarate, citrate, Oxalate, methanesulfonate, toluenesulfonate, aspartate or glutamate.
  • the present invention may also be a nucleotide encoding a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide may be an isolated nucleotide.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleotide.
  • the type of the vector may be changed depending on the host and the expression condition to be transformed using the vector. If the vector contains the nucleotide, other conditions are not limited.
  • the present invention also provides a composition for treating or improving cardiovascular disease comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 may preferably be a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the cardiovascular disease may be any one selected from the group consisting of hypertension, heart disease, stroke, thrombosis, angina pectoris, heart failure, myocardial infarction, atherosclerosis, and arteriosclerosis, preferably hypertension.
  • the hypertension is a blood vessel-related disease, and means arterial hypertension with high arterial pressure.
  • the hypertension may cause arteriosclerosis or hypertensive heart disease.
  • the atherosclerosis refers to a disease in which the walls of the arteries become thick and the elasticity of the arteries is reduced. When the atherosclerosis develops, the blood supply to the organs that received the blood from the hardened arteries is reduced, so that additional diseases may develop.
  • An example of a typical disease related to this is coronary artery disease in which atherosclerosis changes in the coronary arteries that supply blood to the muscles of the heart.
  • composition comprising the peptide as an active ingredient may include one or more of a pharmaceutical diluent selected from saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol and ethanol, diluent is not limited thereto.
  • the composition may be applied differently depending on the purpose of administration and the disease.
  • the amount of active ingredient administered substantially depends on a variety of related factors, such as the disease to be treated, the extent of the patient's condition, whether it is co-administered with other drugs (eg chemotactic drugs), the patient's age, gender, weight, food, time of administration, It should be determined in consideration of the route of administration and the ratio of the composition.
  • the composition may be adjusted according to the type and severity of the disease and the route of administration, and may be administered once or divided into 1 to 3 times a day, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration means administration of medications other than oral, ie rectal, intravenous, peritoneal and muscular, arterial, transdermal, nasal, inhaled, ocular, and subcutaneous.
  • the composition may be formulated in an oral dosage form, that is, in any form such as injectable solutions or topical formulations.
  • the formulation is preferably prepared for oral and injectable administration (true solution, suspension or emulsion), most preferably in oral form such as tablets, capsules, soft capsules, aqueous pharmaceuticals, pills, granules and the like. desirable.
  • the peptide of the present invention may be filled into a soft capsule without an excipient, and may be made into a suitable formulation after being mixed or diluted with the carrier.
  • suitable carriers include starch, water, saline, Ringer's solution, dextrose and the like.
  • the composition may be applied as a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the pharmaceutical composition may be directly applied to animals including humans.
  • the animal is a biological group corresponding to a plant, and mainly eats organic matter as nutrients, and means that digestion, excretion, and respiratory organs are differentiated, and preferably, vertebrates, more preferably mammals.
  • the mammal may be human, pig, cow or goat, etc., preferably human.
  • the pharmaceutical composition may include a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 alone as an active ingredient, and additional ingredients, pharmaceutically acceptable or nutritious according to the formulation, method of use and purpose of use. It may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or accessory.
  • the pharmaceutical composition may be further added to the nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, neutralizing agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, and stabilizers. It may further contain an agent, a preservative, glycerin, alcohol, a carbonation agent used in the carbonated beverage, and the like.
  • the carrier, excipient or diluent may be lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, ziitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose Selected from the group consisting of loose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, dextrin, calcium carbonate, propylene glycol, liquid paraffin, saline It may be one or more, but is not limited to any conventional carrier, excipient or diluent may be used.
  • the components may be added independently or in combination to the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 which is the active ingredient.
  • the pharmaceutical composition comprises 0.001% to 99.9% by weight, preferably 0.1% to 99% by weight, more preferably 1% of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 relative to the total weight of the composition % To 50% by weight.
  • the pharmaceutical composition may further include conventional fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers or preservatives when formulated, and oral or parenteral.
  • conventional fillers extenders, binders, disintegrants, surfactants, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers or preservatives when formulated, and oral or parenteral.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and the solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, water, or the like in the active ingredient. It may be prepared by mixing cross or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients may include, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives. have.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention may be in a preferred form depending on the method of use, in particular by adopting methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. It can be formulated. Examples of specific formulations include warnings, granules, lotions, linings, limonades, powders, syrups, ointments, liquids, aerosols, EXTRACTS, elixirs, ointments, liquid extracts, emulsions, Suspensions, premises, acupuncture, eye drops, tablets, suppositories, injections, spirits, capsules, creams, pills, soft or hard gelatin capsules.
  • compositions of the present invention are preferably formulated using appropriate methods known in the art or using the methods set forth in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA. Can be converted.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected by those skilled in the art in consideration of the method of administration, the age, sex, weight, severity of the disease, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered at 0.000001 mg / kg / day to 1000 mg / kg / day, based on the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention in addition to the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient, further comprising a compound having a known cardiovascular disease therapeutic effect, in particular, a natural-derived material used in foods And, it may be included in 5 parts by weight to 500 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the active ingredient.
  • the present invention also provides a food composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • a food composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • examples of the food composition of the present invention include food, food additives, beverages or beverage additives.
  • the food composition comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an active ingredient may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation thereof.
  • the term "food” means a natural product or a processed product containing one or more nutrients, and preferably means a state in which it can be directly eaten through a certain processing process. It is intended to include all foods, food additives, health functional foods and beverages, preferably gum or candy.
  • Examples of the food to which the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of the present invention can be added include various foods, beverages, gums, candy, tea, vitamin complexes, functional foods, and the like.
  • the food in the present invention includes special nutrition products, processed meat products, fish products, tofu, jelly, noodles, health supplements, seasoned foods, sauces, confectionery, dairy products, other processed foods, kimchi, pickles, beverages, fermented milk, Artificial seasonings, natural seasonings, vitamin complexes, alcoholic beverages, alcoholic beverages and other dietary supplements.
  • the food, beverage or food additives may be prepared by a conventional manufacturing method.
  • Functional food in the present invention is the control of biological defense rhythm, disease prevention and recovery of food groups or food compositions that have added value to the food by using physical, biochemical, biotechnological techniques, etc. It means a food that is designed and processed to fully express the gymnastic function related to the living body, preferably the functional food of the present invention is sufficient to express the gymnastic function related to the prevention or improvement of cardiovascular disease or hyperlipidemia to the living body. It means food that can.
  • the functional food may include food acceptable food additives, and may further include appropriate carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of functional foods.
  • the drink is a generic term for drinking to quench thirst or to enjoy the taste and is intended to include a functional drink.
  • the beverage contains, as an essential ingredient, a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 as an essential ingredient as an active ingredient, and there are no special restrictions on the other ingredients, and various flavors or Natural carbohydrates and the like may be included as additional components.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and other disaccharides such as maltose, sucrose and the like and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • Natural flavors and synthetic flavors can be used as flavors other than those mentioned above.
  • the proportion of the natural carbohydrate may generally be about 1 to 20 g, preferably 5 to 12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention may further contain a pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks, vegetable drinks.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the additive may be 0 to 100,000 parts by weight, preferably 0.00001 to 10,000 parts by weight, per 100 parts by weight of the peptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of the present invention, but is not limited thereto.
  • Functional beverage in the present invention is a biological defense rhythm control, disease prevention and the like having a beverage group or a beverage composition that has added value to the beverage by using physical, biochemical, biotechnological techniques, etc. to function and express the function of the beverage to a specific purpose Means a beverage that is designed and processed to fully express the gymnastics function related to recovery.
  • the functional beverage is not particularly limited in addition to the peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 of the present invention as an essential ingredient in the indicated ratio, and various flavors or Natural carbohydrates and the like may be included as additional components.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and other disaccharides such as maltose, sucrose and the like and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and xylitol Sugar alcohols such as sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents such as, tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used.
  • the natural carbohydrate may be included in an amount of 0 to 20 parts by weight, preferably 1 to 18 parts by weight, more preferably 5 to 12 parts by weight, per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the amount of the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 is 0.00001% to 50% by weight of the total food weight It may be included, but is not limited thereto.
  • the present invention also relates to a therapeutic use of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 has an inhibitory ability against angiotensin converting enzyme, it can be used for the treatment of various diseases that can be treated by inhibiting angiotensin converting enzyme.
  • the various diseases may be cardiovascular disease or hyperlipidemia
  • the cardiovascular disease may be any one selected from the group consisting of hypertension, heart disease, stroke, thrombosis, angina pectoris, heart failure, myocardial infarction, atherosclerosis and arteriosclerosis, preferably It may be hypertension.
  • the present invention relates to the use for the treatment of hypertension of a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the use for treating hypertension may be for treating hypertension as well as preventing hypertension or improving hypertension.
  • the present invention also relates to a method for preparing a composition for treating or preventing cardiovascular disease.
  • the method may include treating transglutaminase in the oyster and treating proteolytic enzymes in the oyster treated with the transglutaminase.
  • the oyster may be poached in water, the temperature of the water may be from 80 to 150 °C, the duration of the blanch may be 10 seconds to 10 minutes or 30 seconds to 2 minutes.
  • the grinding of the oysters is performed by adding water corresponding to about 1 to 4 times or 1.5 times to 3 times the weight of the boiled oysters, and using a grinder for 30 seconds to 5 minutes or 1 minute to 3 minutes, It may be carried out under the conditions of 5,000 rpm or 1,000 rpm to 3,000 rpm.
  • the transglutaminase may be added 1 to 5% or 1.5 to 2.5% of the concentration of the oyster protein.
  • the reaction conditions and reaction time may be appropriately controlled by the type of enzyme, for example, the reaction may be carried out for 10 minutes to 120 minutes or 30 minutes to 90 minutes at 20 to 40 °C or 25 to 35 °C.
  • the transglutaminase By treatment of the transglutaminase, new covalent bonds between proteins can be formed.
  • the proteolytic enzyme treatment may be performed after inactivation of the transglutaminase by performing a heat treatment on the oyster ground treated with the transglutaminase.
  • the heat treatment may be performed at 50 to 150 ° C. or 80 to 120 ° C. for 10 minutes to 120 minutes or 30 minutes to 90 minutes.
  • the protease may be a conventional protease, for example Protamex or Neutrase.
  • the throughput of the protease may be 0.5 to 5% or 1 to 2% of the concentration of oyster protein, respectively.
  • the treatment of the protease may be performed by treating Neutrase after treating Protamex, and the reaction conditions, reaction time, and enzyme inactivation may be appropriately controlled by each enzyme type.
  • the reaction conditions may be carried out for 10 minutes to 120 minutes or 30 minutes to 90 minutes at 20 to 60 °C or 35 to 45 °C.
  • Heat treatment for inactivation of the protease may be carried out at 50 to 150 °C or 80 to 120 °C for 10 minutes to 120 minutes or 30 minutes to 90 minutes.
  • the production method is the step of adding ethanol such that the final concentration is 60% (v / v) to the enzyme treatment and left for 30 to 120 minutes or 45 minutes to 90 minutes in a low temperature room of 2 to 6 °C
  • the step of removing by centrifugation may be further performed.
  • the step of filtering the supernatant obtained by removing the precipitate may be further performed.
  • the present invention relates to a composition for treating or preventing cardiovascular diseases made by the method.
  • the cardiovascular disease treatment or prevention composition may include an oyster enzyme treatment as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for treating or preventing cardiovascular diseases comprising the oyster enzyme treatment as an active ingredient.
  • the cardiovascular disease may be preferably hypertension.
  • the present invention relates to a composition for improving or preventing cardiovascular diseases comprising the oyster enzyme treatment as an active ingredient.
  • the cardiovascular disease may be preferably hypertension.
  • the oyster enzyme treated product may be prepared according to a conventional manufacturing method for the production of seafood enzyme processed product, preferably the oyster treated with transglutaminase, and then treated with the transglutaminase It may be prepared by a method of treating proteolytic enzymes.
  • the oyster is a generic term for mollusks belonging to the cephalopod oyster family, for example, may be a oyster or oyster clam.
  • the oysters mainly inhabit the rocks of the intertidal zone, live on the rocks, are hermaphrodite, and are fed by plankton of seawater.
  • the oyster enzyme treatment may be the treatment of the enzyme in the oyster grinding.
  • the oyster grinds may be pulverized using a grinder after adding water to the oyster poached in boiling water.
  • the transglutaminase is, for example, an enzyme obtained by extracting from a culture of Streptoverticillium mobaraense, an enzyme used as an additive for food production, dissolved in water but not soluble in ethanol. Can be.
  • the protease may be a conventional protease, and for example, may be at least one selected from the group consisting of alkalase, preborame, protex, protamex, paratase and neutrase, preferably pro It may be Protamex or Neutrase.
  • the present invention is a peptide can inhibit angiotensin converting enzyme (ACE), thereby useful for the treatment, prevention or amelioration of cardiovascular disease, as well as having a blood pressure lowering ability, derived from oysters that are food Safety is guaranteed and side effects are not a problem.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a step of separating and purifying an active ingredient by performing chromatography on an oyster protein enzyme treatment according to an embodiment of the present invention and the result thereof, wherein TGPN is a transglutaminase and a protein.
  • TGPN is a transglutaminase and a protein.
  • Treated with hydrolase (Protamex and Neutrase) in order SX is size exclusion chromatography, RP is reversed phase chromatography and CX is the result of performing cation-exchange chromatography, respectively.
  • Figure 2 shows the active fraction of the result of the final fractionation method according to an embodiment of the present invention, a graph showing the results of RP17CX1RP5RP5RP3SX1 to RP17CX1RP5RP5RP3SX3.
  • Figure 3 shows the active fraction of the result of the final fractionation method according to an embodiment of the present invention, a graph showing the results of RP17CX3RP5RP2RP1SX1.
  • Figure 4 shows the active fraction of the result of the final fractionation method according to an embodiment of the present invention, a graph showing the results of RP17CX3RP5RP6RP1SX1.
  • Figure 5 shows the active fraction of the result of the final fractionation method according to an embodiment of the present invention, a graph showing the results of RP17CX4RP1RP1RP1SX1.
  • Figure 6 is a graph showing the mass spectrum results of analyzing the molecular weight of the peptide amino acid extracted from the active fraction of the result of the final fractionation method according to an embodiment of the present invention by electrospray ionization method using a mass spectrometer.
  • Figure 7 according to an embodiment of the present invention, when the RP17CX1RP5RP5RP3SX1 fraction and the Cpep1 peptide (Pro-Asn) of the present invention was confirmed to have excellent angiotensin converting enzyme inhibitory ability to measure the blood pressure change of the experimental animal
  • ⁇ means a control (control) orally administered saline
  • ⁇ means a comparison group orally administered sardine peptides
  • ⁇ is oyster enzyme treatment oral Means Experimental Example 3 administered
  • ⁇ means Experimental Example 4 orally administered Cpep1 peptide (Pro-Asn) of the present invention.
  • hydrolyzate is Experimental Example 1 and proteolytic enzymes treated with transglutaminase (transglutaminase, TGase, Ajinomoto Co, Japan), Protamex (Novozyme-Korea, Korea) and Neutrase (Novozyme-Korea, Korea) Experimental Example 2 which was treated only with Protamex and Neutrase.
  • transglutaminase transglutaminase, TGase, Ajinomoto Co, Japan
  • Protamex Novozyme-Korea, Korea
  • Neutrase Novozyme-Korea, Korea
  • Experimental Example 2 was added to Protamex so as to have a concentration of 1% of the measured protein concentration in the oyster pulverization, the reaction was carried out for 1 hour at 40 °C, heat treatment at 100 °C for 1 hour to burn enzyme After activation, Protrax-treated enzyme treated Neutrase was added at a concentration of 1% relative to the measured protein concentration, and the reaction was performed at 50 ° C. for 1 hour, followed by heat treatment at 100 ° C. for 1 hour. Was inactivated. Experimental Example 2 was obtained by obtaining a supernatant of the enzyme treatment.
  • Ethanol was added to the obtained Experimental Example 1 and Experimental Example 2 to a final concentration of 60% (v / v), and left in a low temperature room at 4 °C for 1 hour to precipitate the ethanol insoluble matter and residual protein, then centrifuged Removal was carried out using separation (8000 ⁇ g, 25 min). The supernatant obtained by removing the precipitate was filtered through a membrane of 0.45 ⁇ m, dried by a method of evaporating ethanol at a temperature of 40 °C or less using a rotary vacuum evaporator (N-type, EYELA, Japan) of Experimental Example 1 The hydrolyzate and the hydrolyzate of Experimental Example 2 were prepared. The hydrolyzate was found to be about 29% (28.5 to 30.1%) of the oysters used at the beginning of the experiment, respectively, based on dry weight.
  • the method for confirming the blood pressure lowering ability of the hydrolyzate and the following active ingredients of Experimental Example 1 and Experimental Example 2 obtained in Example 1-1 was performed by measuring the angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory ability.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Example 1-1 The hydrolyzate of Experimental Example 1 and Experimental Example 2 obtained in Example 1-1 was diluted with distilled water and confirmed by adjusting the final concentration to 0.5 mg / ml. More specifically, ACE inhibition was performed based on the method of Wu et al (2002).
  • HHL hippuryl-His-Leu
  • ACE 0.25 m Unit ACE
  • 0.1 M borate buffer pH 8.3 containing 0.3 M NaCl.
  • 40 uL of sample and 150 uL of ACE were added to the Eppendorf tube. The reaction was stirred for 10 minutes in a 37 ° C. constant temperature water bath, and then 100 uL HHL was added and reacted for 30 minutes in a 37 ° C. constant temperature water bath. After completion of the reaction, 150 uL of 1 M HCl was added to stop the enzymatic reaction, and the supernatant was aliquoted by centrifugation at 10000 ⁇ g for 10 minutes.
  • the separated supernatant was measured by HPLC (Hitachi, Japan) to determine the content of the advantageous hippuric acid (HA).
  • HA advantageous hippuric acid
  • 40 uL of reaction stop solution was injected into a reversed phase column (Watchers 120 ODS-AP, 4.6 x 250 mm, 5 ⁇ m, Daiso, Japan).
  • solvent A H 2 O containing 0.1% TFA was used
  • solvent B 100% CH 3 CN containing 0.1% TFA was used.
  • Gradient measured absorbance at 228 nm linearly multiplying from 5% to 60% B solvent / 20 min.
  • 40 uL of solvent A was used instead of the sample, and the flow rate was eluted under a condition of 1 mL / min.
  • Enzyme inhibitory activity was calculated by the following formula 1, by measuring the ACE inhibitory activity for each sample concentration was linear regression analysis of the inhibitory activity by concentration.
  • the sample concentration required to inhibit 50% of the ACE inhibitory activity was defined as IC 50 .
  • ACE inhibition (%) (HA of Reference-HA of sample) / HA x 100 of Reference
  • Table 1 shows the results of confirming the inhibitory ability of the angiotensin converting enzyme before the sample treatment of blood pressure lowering ability according to the purification steps of the hydrolyzates of Experimental Example 1 and Experimental Example 2.
  • Example 1-1 The hydrolyzate of Experimental Example 2 obtained in Example 1-1 was dissolved in deionized water and then ultrafiltration was performed using an ultrafilter (8200, Amicon Co., USA) equipped with a 5 kDa membrane. After performing the ultrafiltration, the obtained supernatant and residue were vacuum-dried to prepare an active ingredient dry powder of each oyster hydrolyzate.
  • TGPN dry powder obtained in Example 1-3 was dissolved in 20% CH 3 CN and ultrafiltration with an ultrafilter (8200, Amicon Co., USA) equipped with a 1kDa membrane, followed by ultrafiltration (1 kDa).
  • TGPN and the filtrate (TGPN below 1 kDa) were separated, and the angiotensin converting enzyme inhibitory ability was measured using 10 ml of 10% CH 3 CN.
  • IC 50 of TGPN greater than 1 kDa was 4.5157 mg / ml
  • IC 50 of TGPN less than 1 kDa was 0.6142 mg / ml
  • TGPN of 1 kDa or less was excellent in inhibiting angiotensin converting enzyme.
  • the step of separating the active ingredient was performed.
  • the purification method performed to separate the active ingredient is as shown in Figure 1, in detail as follows.
  • a size exclusion column (Hiroad 16/60 superdex 30 pg, 16 ⁇ 600 mm, Pharmacia, Sweden) was used to separate the low-breaking TGPN (30.1298 mg / ml, 20 ml) by molecular weight.
  • the absorbance was analyzed at 226 nm, 20% CH 3 CN was used as the solvent, and the flow rate was performed at 1 ml / min.
  • the molecular weight of each 2 ml aliquot sample was calculated by preparing a standard curve through the elution volume of each standard protein under the same conditions. Angiotensin converting enzyme inhibitory ability was measured for each fraction divided by each molecular weight.
  • the absorbance was analyzed at 254 nm using a reversed phase HPLC column (218TP510 Protein & peptide C18, 10 ⁇ 250 mm, 5 ⁇ m, Grace Vydac, USA).
  • solvent A H 2 O containing 0.1% TFA was used
  • solvent B CH 3 CN containing 0.1% TFA was used, and the concentration gradient was from 0 to 50% B solvent / 50min.
  • the flow rate was partially purified under the condition of 3 mL / min. Angiotensin inhibitory capacity of 1/65 of each fraction was measured.
  • absorbance was analyzed at 254 nm using a cation exchange HPLC column (TSK-gel SP-5PW, 7.5 ⁇ 7.5 mm, Tosoh, Japan).
  • 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) was used as the solvent A
  • 10 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 1M NaCl was used as the solvent.
  • the concentration gradient was linear gradient under the condition of 0 to 1.0M B solvent / 100min, and the flow rate was partially purified under the condition of 1 mL / min.
  • Angiotensin inhibitory capacity of 1/50 of each fraction was measured.
  • a fourth step an aliquot was collected using a reverse phase HPLC column (Watchers 120 ODS-AP, 4.6 ⁇ 250 mm, 5 ⁇ m, Daiso, Japan).
  • solvent A H 2 O containing 0.1% TFA was used.
  • solvent B CH 3 CN containing 0.1% TFA was used, and the absorbance was analyzed at 220 nm.
  • the concentration gradient was linear gradient under the condition of 0 to 20% B solvent / 60min, and the flow rate was partially purified under the condition of 1 mL / min.
  • Angiotensin inhibitory capacity of 1/25 of each fraction was measured.
  • the fifth step detection was performed at 220 nm absorbance using the same reversed phase HPLC column used in the fourth step. 12% CH3CN containing 0.1% TFA was used as a solvent and partially purified at a flow rate of 1 mL / min under isocratic conditions. Angiotensin inhibitory capacity of 1/25 of each fraction was measured.
  • the fraction obtained in the fifth step was partially purified using the same reversed phase HPLC column used in the fourth step under the same conditions. Angiotensin inhibitory capacity of 1/20 of each fraction was measured.
  • the seventh step was purified using a size exclusion FPLC column (Superdex Peptide HR 10/30, 10 ⁇ 300 mm, Pharmacia, Sweden), solvent was used with 12% CH 3 CN, detected at 226 nm absorbance, flow rate was It was performed at 0.5 ml / min conditions. Angiotensin inhibitory capacity of 1/10 of each fraction was measured.
  • Angiotensin converting enzyme inhibitory ability of each active fraction prepared in Example 1-4 was measured in the same manner as in Example 1-2.
  • the angiotensin converting enzyme inhibitory ability was confirmed that the IC 50 value of 4.5157 mg / ml at 1 kDa or more, and less than 1 kDa In the case of IC 50 value of 0.6142 mg / ml was confirmed that the active fraction of less than 1 kDa has a remarkably excellent inhibition.
  • each IC 50 value was found to be 0.2642 mg / ml, 0.0790 mg / ml and 0.1591 mg / ml.
  • the SX2 which was found to have the best IC 50 value, was concentrated using a rotary vacuum evaporator (N-1, EYELA, Japan), and the second fractionation method described in Examples 1-4 was performed, among which , Angiotensin converting enzyme fractions with excellent inhibitory activity, specifically fractions having more than 50% activity was isolated.
  • the separated fractions were named RP9 (9.5 min, 4-5% CH 3 CN) and RP17 (15.7 min, 10-11% CH 3 CN), respectively, with activity of 55.67% and 50.54%, respectively.
  • the RP9 and RP17 which were found to have excellent IC 50 values, were concentrated with a rotary vacuum evaporator, and the third fractionation method described in Examples 1-4 was carried out.
  • the RP9 was divided into eight fractions and the RP17 was five fractions. Aliquots were fractionated to determine the angiotensin converting enzyme inhibitory ability. Among them, those having excellent inhibition were named RP9CX1 (2.68 min, 10 mM NaCl), RP17CX1 (2.40 min, 8 mM NaCl), RP17CX3 (4.23 min, 26 mM NaCl), and RP17CX4 (5.09 min, 35 mM NaCl), respectively.
  • Activity was 54.58%, 76.11%, 72.68% and 70.20%, respectively.
  • Each of the active fractions confirmed to have excellent inhibitory ability was removed by volatilizing the solvent with a vacuum freeze drying apparatus (FDU-540, EYELA, Japan).
  • fractions from which the solvent was removed were subjected to the fourth fractionation method described in Examples 1-4, and in the case of RP9CX1, all fractions except the two fractions showed absorbances of 254 nm or 280 nm higher than those of 220 nm, and 2 of RP9CX1.
  • the fraction of dogs did not show angiotensin converting enzyme inhibition and was excluded from later experiments.
  • RP17CX1 was fractionated into 6 fractions
  • RP17CX3 was fractionated into 8 fractions
  • RP17CX1 was fractionated into 4 fractions to measure angiotensin converting enzyme inhibitory ability.
  • the excellent inhibitory activity RP17CX1RP1 (43.22min, 11-12% CH 3 CN), RP17CX1RP4 (46.72min, 12-13% CH 3 CN) and RP17CX1RP5 (47.68min, 13% CH 3 CN), respectively in each showed inhibition of 55.20%, 69.79% and 76.02%
  • RP17CX3RP4 44.13min, 12 % CH 3 CN
  • RP17CX3RP5 45.02min, 12% CH 3 CN
  • RP17CX3RP6 45.61min, 12% CH 3 CN
  • the fifth fractionation method described in Examples 1-4 was performed on the fractions, and the results are as follows. Specifically, RP17CX1RP1 was aliquoted into three fractions, RP17CX1RP4 was aliquoted into six fractions, RP17CX1RP5 was aliquoted into seven fractions, RP17CX3RP5 was aliquoted into six fractions, and RP17CX3RP6 was divided into three fractions. In the case of RP17CX4RP1, a single peak was detected. In the case of RP17CX4RP2, four fractions were fractionated to measure angiotensin converting enzyme inhibitory ability. In the case of RP17CX3RP4, all the fractions were found to have no angiotensin converting enzyme inhibitory ability.
  • RP17CX1RP1RP2 (8.80min) showed an inhibitory capacity of 58.65%, but it was confirmed that it is difficult to further distinguish the clear fraction.
  • RP17CX1RP4RP6 11.10min
  • RP17CX1RP5RP5 13.27min
  • RP17CX3RP5RP2 9.60min
  • RP17CX3RP5RP6 12. 53.53%
  • RP17CX3RP6RP4 (12.12min) showed 58.97% inhibition
  • single peak of RP17CX1RP1 (12.80min) showed 53.46% inhibition
  • RP17CX4RP2RP4 11.80min was fractionated from RP17CX4RP2 fraction. Among them, 59.60% of the inhibitory effect was shown.
  • the fractionation was carried out for the sixth fractionation described in Examples 1-4 and the results are as follows. Specifically, in the case of RP17CX1RP4RP6 it was confirmed that there is no angiotensin converting enzyme inhibitory ability in all fractions. From the results, it was determined that the fraction was separated into several fractions with low activity. Meanwhile, in the case of RP17CX1RP5RP5, a total of three fractions (RP17CX1RP5RP5RP1, RP17CX1RP5RP5RP2 and RP17CX1RP5RP5RP3) were divided, and among them, RP17CX1RP5RP5RP3 (15.60min) showed 15.60% of inhibition.
  • the amino acid sequence included in the fraction finally selected in Example 2 was analyzed.
  • the amino acid sequence analysis was performed by electrospray ion exchange (ESI) method using a QTOF2 (Micormass, UK) mass spectrometer to obtain the result of the amino acid sequence and the exact molecular weight, Edmnan method was performed to confirm the sequence Amino acid sequence analysis was performed with peptides that matched the results.
  • the analysis results are shown in FIG. 6 and Table 4 below.
  • the amino acids Cpep1 and Cpep2 contained in the fraction confirmed to have the best angiotensin inhibitory activity in Example 2 were found to have a mass of 215 Da and 381.43 Da, respectively, two and three.
  • IC 50 was measured at a concentration capable of inhibiting angiotensin converting enzyme by 50%, and the results are shown in the following table. 5 is shown.
  • the two peptides have an excellent inhibitory ability of angiotensin converting enzyme, in particular, Cpep1 (Pro-Asn) of SEQ ID NO: 1 inhibited 50% of angiotensin converting enzyme even at a content of 0.19 ⁇ M. Since it can be confirmed, it is expected that it can be used for various purposes, such as a therapeutic agent for cardiovascular diseases related to angiotensin converting enzyme.
  • Example 3 Cpep1 (Pro-Asn) of SEQ ID NO: 1, which was identified as having the best angiotensin inhibitory ability, was confirmed using an experimental animal in relation to whether the same blood pressure lowering ability could be obtained in the body.
  • the experimental animals used in this experiment were SHR (spontaneously hypertensive rat) male rats, a 12-week-old hypertensive animal model. Five-week-old male hypertensive male rats were distributed from the Korea Research Institute of Chemical Technology (Yoosung, South Korea), and fed a standard diet (AIN-76, Dytes Inc., USA). Used.
  • the experimental animals were divided into a control group, a comparative group, and an experimental group, and each of three animals were separated and bred.
  • the ventilation and temperature were all given the same conditions, and the light and dark conditions were given from 6 am to 6 pm, and the diet was Feed and drink can be freely consumed.
  • the sardine peptide (Val-Tyr, MW 280.3) used as a comparative group with Cpep1 (Pro-Asn, MW 229.2) of SEQ ID NO: 1 as a test substance was synthesized by Eigen Co., Ltd. (Korea), and used as an experimental group.
  • the oyster peptide extract sample As the oyster peptide extract sample, the RP17CX1RP5RP5RP3SX1 fraction was finally identified as having the best angiotensin converting enzyme inhibitory ability in Example 2.
  • Sardine peptides used in the comparison group is a peptide having a sequence of a peptide that has been previously confirmed to have a blood pressure lowering ability.
  • control group was orally administered at a content of 100 mg / kg (test substance / weight) in proportion to the weight of the test animal, and the positive control group was a sardine peptide (Val-Tyr). It was orally administered at a content of 100 mg / kg (test substance / weight) in proportion to the weight of the test animal.
  • Experimental Example 3 orally administered the RP17CX1RP5RP5RP3SX1 fraction in an amount of 200 mg / kg (test substance / weight) in proportion to the weight of the experimental animal
  • Experimental Example 4 is a synthetic peptide having the sequence of SEQ ID NO: 1 Cpep1, Pro-Asn) was orally administered at a content of 100 mg / kg (test substance / weight) in proportion to the weight of the test animal.
  • Blood pressure was measured for each of the experimental animals until 24 hours after the administration of the test substance. Specifically, the systolic blood pressure of the tail artery of the test animal was measured by the tail cuff method at 0, 3, 6, 9, 12, and 24 hours after the administration of the test substance.
  • the blood pressure measurement is more specifically, the test animal is warmed for 10 minutes in a thermal box at 37 to 38 °C fully expanded the tail artery, fixed to the restrainer, small animal non-vascular automatic blood pressure monitor (LE5001 pressure meter, LSI ETICA) , Spain) was measured five times, and then the average value of the systolic blood pressure was measured, and the results are shown in FIG. 7.
  • Experimental Example 4 administered with the peptide having the sequence of SEQ ID NO: 1 Pro-Asn decreased blood pressure in a time-dependent manner, the degree of blood pressure drop until the progress of 9 hours, the effect up to 12 hours or more
  • the control group was found to increase slightly as the blood pressure measurement time elapsed, whereas the control group administered the synthetic peptide synthesized with the sequence of the peptide confirmed to have an existing blood pressure lowering ability It was confirmed that the lowering capacity was not so great. That is, in Experimental Example 4, which was found to be the most effective, the blood pressure was lowered at the time of 9 hours, although the measured blood pressure was about 12 higher than that of the control group at the time of initial measurement.
  • the blood pressure corresponding to about 10% of the blood pressure before administration was found to be very excellent blood pressure lowering ability, and the result of measurement by oral administration to the experimental animals In practice, the effect is expected to be excellent.
  • Experimental Example 4 administered with the peptide of the present invention was confirmed to be superior to the comparison group administered the known peptide in terms of the degree of blood pressure drop and the maintenance time of blood pressure lowering ability.
  • peptides or acid addition salts may inhibit angiotensin converting enzyme (ACE), which is useful for the treatment, prevention or improvement of cardiovascular diseases, and is derived from oysters, which are foods, thereby ensuring safety. Side effects are not a problem.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • the production of the peptide has the advantage that the economic efficiency is superior to the conventional chemical artificial synthesis. Therefore, the peptide of the present invention can be widely used in the related industry in that it can replace an artificial substance for treating or ameliorating existing chemically produced cardiovascular disease.
  • Cpep1 Peptides with excellent angiotensin inhibitory ability and excellent blood pressure lowering ability of the present invention are named Cpep1 as peptides having a sequence of SEQ ID NO: 1, that is, a sequence having a sequence of Pro-Asn (PN), and a peptide named Cpep2.

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Abstract

본 발명은 효소처리를 통하여 굴로부터 제조한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 혈압강하능이 우수한 펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 펩타이드는 안지오텐신 전환효소의 저해능이 우수하여 고혈압을 포함한 심혈관계 질환을 치료 또는 개선할 수 있고, 실제 동물실험에 의해 측정한 결과 혈압강하능이 우수한 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, 식품인 굴 유래의 것으로 안전성이 보장되고 부작용이 문제되지 아니하므로, 특히 기존의 화학적으로 제조된 심혈관계 질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭 넓게 이용될 수 있다.

Description

혈압저하능을 가진 펩타이드
본 발명은 혈압저하능을 가진 펩타이드로, 보다 상세하게는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 혈압을 저하시킬 수 있는 펩타이드에 관한 것이다.
식품성분 중 식품 단백질 유래의 펩타이드는 항암, 혈압강하, 혈청 콜레스테롤 강하, 면역증강 및 칼슘 흡수 촉진 등의 광범위한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 구체적으로, 생체 내에서 진통, 마취, 장관 등 평활근의 수축, 식욕조절 등에 관여하는 물질인 opioid peptides, 면역증강작용을 하는 phagocytosis peptides, 혈압강화작용을 하는 안지오텐신 전환효소(angiotensin-I converting enzyme, ACE) 저해 펩타이드, 혈소판 응집을 저해하는 antithrombotic peptides 등에 속하는 펩타이드 등이 있다.
안지오텐신 전환효소는 혈관과 신장의 근위세뇨관, 내피, 심장, 폐, 활성화된 대식세포, 뇌조직 등에서 발견되는 dicarboxy peptides의 하나로, 포유류의 혈압 및 수분균형 조절기구인 renin-angiotensin system에서 renin에 의해 안지오텐시노겐(angiotensinogen)으로부터 활성화된 안지오텐신I을 안지오텐신Ⅱ로 전환시킨다. 안지오텐신Ⅱ는 부신, 혈관평활근세포, 신장, 심장 등에 존재하는 4종의 AT 수용체(AT receptor)에 작용하며, 이들은 혈관수축, aldosterone과 vasopressin 방출, 세뇨관의 나트륨 흡수, 신장으로의 혈류량 감소 등을 유발함으로써 심혈관, 신장 및 중추신경 부위에 여러 가지 병변을 가져올 수 있는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 안지오텐신 전환효소의 저해물질 또는 안지오텐신 전환효소 저해제(ACE inhibitor)는 고혈압, 심장병, 동맥경화 또는 뇌출혈 등의 심혈관계 질환이나 신장병 등을 치료 또는 예방할 수 있는 것으로 보고 되고 있으며, 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 구체적으로, 만성신장병, 동맥경화, 심장발작과 그로 인한 사망 등을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 확인하여 주는 여러 임상연구 및 임상실험의 결과가 보고되고 있다.
현재 이러한 결과에 기초하여, 라미프릴(ramipril), 캅토프릴(captopril), 에날라프릴(enarapril), 리시노프릴(lisinopril), 포시노프릴(fosinoril)이나 스피라프릴(spirapril) 등과 같은 화학적으로 합성된 많은 안지오텐신 전환효소 저해제가 고혈압 치료제로 사용되고 있다. 그러나 이러한 화합물들은 약학적 투여 형태에서 쉽게 분해되어 즉, 안정성이 떨어질 뿐만 아니라 다른 세포에도 작용하여 전신에 힘이 빠지거나, 구토, 기침, 두통, 식욕부진 및 미각이상을 일으키는 등 부작용과 관련된 문제가 있는 것으로 보고되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 부작용이 문제되지 아니하고 안전성이 확보되는 천연물질 유래 안지오텐신 전환효소 저해제의 개발이 시급히 요구되고 있다. 특히, 식품으로 사용되는 천연물질 유래의 안지오텐신 전환효소 저해제의 경우, 식품 단백질 가수분해물 또는 식품 단백질 가수분해물로부터 수득한 것이 보고되고 있다.
이와 관련하여, 최근 연구보고에 의하면, 일반적으로 안지오텐신 전환효소 저해작용은 3,000 Da 이하의 저분자 펩타이드에서 높은 효과를 나타내는 것으로 확인되었고, 특히 식품 단백질로부터 유래한 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 펩타이드는 그 분자량이 1,000 Da 이하인 것으로 확인되었다. 또한, 아미노산 잔기 수가 5개 이상인 펩타이드의 경우, 경구 투여 시 원형의 구조로 흡수되지 않고 장내 효소에 의해 가수분해를 겪을 수 있기 때문에 아미노산 잔기 수가 5개 미만일 것이 요구되는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 상기와 같은 조건을 모두 만족하는 식품 유래 안지오텐신 전환효소 저해제는 아직 보고되지 않고 있다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 혈압저하능이 있으며, 식품 유래로 부작용이 문제되지 않고, 안전성이 확보되는 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있는 굴 유래 신규 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 구체적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 또는 고지혈증의 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은 식품 유래 안지오텐신 전환효소 저해제에 관하여 연구하던 중, 굴에 대하여 효소처리를 하여 수득된 본 발명의 펩타이드가 안지오텐신 전환효소 저해 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하였고, 나아가 상기 펩타이드를 실험동물에 투여하여 확인한 결과 혈압저하능이 우수한 것을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있는 굴 유래 신규 펩타이드에 관한 것이다.
상기 안지오텐신 전환효소는 주로 폐모세혈관에 존재하고, 혈류에 있는 불활성상태의 안지오텐신 Ⅰ의 말단아미노산 2개를 분해함으로써 혈관 수축을 유도하고, 알도스테론(aldosterone) 분비를 항진시켜 체액을 증가시켜 혈압을 상승시킬 수 있는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시켜, 최종적으로 혈압을 상승시키는 작용을 하는 효소이고, 상기 안지오텐신 전환효소 저해제는 상기 안지오텐신 전환효소를 저해하여 혈관 확장 효과를 나타낸다.
상기 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있으며, 일 예로 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산부가염일 수 있다. 상기 펩타이드는 분리된(isolated) 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재하는 것일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로부터 유도되는 물질일 수 있다.
상기 산 부가염이란 제약상 허용되는 산 부가염일 수 있고, 상기 제약상 허용되는 산 부가염이란 상기 펩타이드의 생물학적 활성을 유지하고 원하지 않는 독소 효과 등의 부작용을 최소화하는 염을 의미한다.
상기 산부가염은 제약상 허용되는 무기산 부가염 또는 유기산 부가염일 수 있고, 일 예로 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 아세트산염, 벤조산염, 말레인산염, 푸말산염, 호박산염, 주석산염, 구연산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 톨루엔술폰산염, 아스파라긴산염 또는 글루타민산염 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화(coding)하는 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 분리된 뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터의 종류는 상기 벡터를 이용하여 형질전환을 수행할 대상 숙주(host)와 발현 조건에 따라서 변화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드를 포함하고 있으면, 다른 조건은 제한되지 아니한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드일 수 있다.
상기 심혈관 질환은 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 고혈압일 수 있다.
상기 고혈압은 혈관관련 질병으로, 주로 동맥의 협압이 높은 동맥성 고혈압을 의미한다. 상기 고혈압은 동맥경화나 고혈압심장병(hypertensive heart disease) 등을 유발할 수 있다.
상기 동맥경화는 동맥의 벽이 두터워지고 동맥의 탄력이 저하되는 질환을 의미한다. 상기 동맥경화가 발병되면 경화된 동맥으로부터 혈액을 공급받던 장기에 대한 혈액 공급이 감소하게 되어, 추가적인 질병이 발병될 수 있다. 이와 관련된 대표적인 질병의 예는 심장의 근육에 혈액을 공급하는 심장동맥에 동맥경화의 변화가 오는 심장동맥병 등이 있다.
상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤 및 에탄올에서 선택되는 약학적 희석제중 1종 이상 포함할 수 있으며, 희석제는 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 투여목적 및 질병에 따라 상이하게 적용될 수 있다. 실질적으로 투여되는 활성 성분의 양은 다양한 관련 요소, 즉 치료하고자 하는 질병, 환자상태의 정도, 다른 약제(예를 들어 주화성 약제)와 공동 투여여부, 환자의 나이 성별, 체중, 음식, 투여시간, 투여경로, 및 조성물의 투여비율(ratio)을 고려하여 결정하여야 한다. 상기 조성물은 투여량 및 투여경로가 질병의 형태 및 심각성에 따라 조절될 수 있으며, 하루에 한번 또는 1 내지 3번 나누어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 경구 이외의 투여경로, 즉 직장, 정맥, 복막 및 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구, 및 피하를 통한 약제 투여를 의미한다.
상기 조성물은 경구 투여 형태, 즉 주입 가능한 용액 또는 국소제제와 같은 어떠한 형태로도 제제화될 수 있다. 제제화는 경구 및 주입 가능한 투여(진용액(true solution), 현탁액 또는 에멀젼)에 적합하도록 제조되는 것이 바람직하며, 정제, 캡슐, 연질캡슐, 수성 약제, 환제, 과립 등과 같은 경구 형태로 제조되는 것이 가장 바람직하다.
상기 제제화에서 본 발명의 펩타이드는 부형제(excipient)없이 연질 캡슐에 충전될 수 있고, 담지체와 혼합되거나 희석된 후에 적당한 제제로 만들어질 수도 있다. 적합한 담지체의 예로는 전분, 물, 염수, 링거액, 덱스트로스 등이 있다.
상기 조성물은 약학 조성물 또는 식품 조성물로 응용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 직접 적용될 수 있다. 상기 동물은 식물에 대응하는 생물군으로 주로 유기물을 영양분으로 섭취하며, 소화나 배설 및 호흡기관이 분화되어 있는 것을 말하고, 바람직하게는 척추동물, 더욱 바람직하게는 포유류일 수 있다. 상기 포유류는 인간, 돼지, 소 또는 염소 등일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다. 상기 성분들은 상기 유효성분인 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
상기 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.
구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.
더 나아가 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 제시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 약학 조성물은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 기준으로 할 때, 0.000001 mg/kg/day 내지 1000 mg/kg/day로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은, 유효성분인 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 이외에 공지의 심혈관 질환 치료효과를 갖는 화합물, 특히 식품으로 사용되는 천연물 유래 물질을 더욱 포함할 수 있으며, 상기 유효성분 100 중량부에 대하여 각각 5 중량부 내지 500 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서에서 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이며, 바람직하게는 껌 또는 캔디일 수 있다.
본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품, 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류, 건강보조식품, 조미식품, 소스류, 과자류, 유가공품, 기타 가공식품, 김치, 절임식품, 음료, 발효유, 인공조미료, 천연조미료, 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 기능성 식품은 심혈관질환 또는 고지혈증의 예방 또는 개선에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현할 수 있는 식품을 의미한다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 100 중량부 당 0 내지 100,000 중량부, 바람직하게는 0.00001 내지 10,000 중량부 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 기능성음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 중량부 내지 20 중량부, 바람직하게는 1 중량부 내지 18 중량부, 더욱 바람직하게는 5 중량부 내지 12 중량부 포함될 수 있다.
또한, 심혈관질환 또는 고지혈증의 예방 또는 개선의 효과를 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.00001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 치료용 용도에 관한 것이다.
상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 안지오텐신 전환효소에 대한 저해능이 있으므로 안지오텐신 전환효소를 저해함으로써 치료할 수 있는 다양한 질병에 대한 치료용으로 사용될 수 있다.
상기 다양한 질병은 심혈관 질환 또는 고지혈증일 수 있으며, 상기 심혈관 질환은 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 고혈압일 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드의 고혈압 치료용 용도에 관한 것이다. 상기 고혈압 치료용 용도는 고혈압 치료뿐만 아니라 고혈압 예방 또는 고혈압 개선 용도일 수 있다.
또한, 본 발명은 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물 제조방법에 관한 것이다.
상기 방법은 굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
보다 상세하게는 굴을 마쇄하는 단계; 상기 마쇄된 굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 굴은 물에 데친 것일 수 있고, 상기 물의 온도는 80 내지 150℃일 수 있고, 상기 데치는 기간은 10초 내지 10분 또는 30초 내지 2분일 수 있다.
상기 굴을 마쇄하는 단계는 상기 데친 굴의 무게의 약 1 내지 4배 또는 1.5 배 내지 3배에 해당하는 물을 첨가하고, 분쇄기를 이용하여 30초 내지 5분 또는 1분 내지 3분 동안 500rpm 내지 5,000 rpm 또는 1,000 rpm 내지 3,000 rpm 의 조건에서 수행할 수 있다.
상기 트랜스글루타미나제는 상기 굴 단백질의 농도의 1 내지 5% 또는 1.5 내지 2.5% 첨가될 수 있다. 상기 반응조건 및 반응시간은 효소의 종류에 의해 적절하게 조절될 수 있으며, 일 예로 20 내지 40℃ 또는 25 내지 35℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 반응을 수행할 수 있다. 상기 트랜스글루타미나제의 처리에 의하여 단백질간의 새로운 공유결합이 형성될 수 있다.
상기 단백질 분해효소의 처리는 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴 분쇄물에 열처리를 수행하여 상기 트랜스글루타미나제를 불활성화시킨 후에 수행할 수 있다. 상기 열처리는 50 내지 150℃ 또는 80 내지 120℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 수행할 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 통상의 단백질 분해효소일 수 있고, 일 예로 Protamex 또는 Neutrase일 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 처리량은 각각 굴 단백질의 농도의 0.5 내지 5% 또는 1 내지 2%일 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 처리는 구체적으로, Protamex를 처리한 후에 Neutrase를 처리하는 방법으로 수행할 수 있고, 상기 반응조건 및 반응시간과 효소의 불활성화 처리는 각 효소의 종류에 의해 적절하게 조절될 수 있으며, 일 예로 상기 반응 조건은 20 내지 60℃ 또는 35 내지 45℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 반응을 수행할 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 불활성화를 위한 열처리는 50 내지 150℃ 또는 80 내지 120℃에서 10분 내지 120분 또는 30분 내지 90분 동안 수행할 수 있다.
또한, 상기 제조방법은 상기 효소처리물에 최종 농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 첨가하는 단계 및 2 내지 6℃의 저온실에서 30분 내지 120분 또는 45분 내지 90분 동안 방치하여 에탄올 불용성 물질과 잔여 단백질을 침전시킨 후, 원심분리를 이용하여 제거하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 또한, 상기 침전물을 제거하여 수득한 상측액을 여과하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 만들어진 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물은 굴 효소처리물을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 굴 효소처리물을 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 심혈관질환은 바람직하게는 고혈압일 수 있다.
또한, 본 발명은 굴 효소처리물을 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 개선 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 심혈관질환은 바람직하게는 고혈압일 수 있다.
상기 굴 효소처리물은 해산물 효소처리물 제조를 위한 통상의 제조방법에 따라 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 굴을 트랜스글루타미나제를 처리한 후, 상기 트랜스글루타미나제로 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
상기 굴(oyster)은 사새목 굴과에 속하는 연체동물의 총칭으로, 일 예로 참굴 또는 굴조개일 수 있다. 상기 굴은 주로 조간대의 바위에서 서식하며, 바위에 부착하여 생활하고, 자웅동체이며, 바닷물의 플랑크톤이 먹이이다.
상기 굴 효소처리물은 굴 마쇄물에 효소를 처리한 것일 수 있다. 상기 굴 마쇄물은 끓는 물에 데친 굴에 물을 첨가한 후, 분쇄기를 이용하여 분쇄한 것일 수 있다.
상기 트랜스글루타미나제(transglutaminase)는 일 예로, 스트렙토베르티실룸 모바렌세(Streptoverticillium mobaraense)의 배양물로부터 추출하여 얻어진 효소로, 식품제조용 첨가물로 사용되고, 물에 용해되나 에탄올에 용해되지 않는 효소일 수 있다.
상기 단백질 분해효소는 통상의 단백질 분해효소일 수 있고, 일 예로 알카라제, 프레보라임, 프로텍스, 프로타멕스, 파라타제 및 뉴트라제로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 프로타멕스(Protamex) 또는 뉴트라제(Neutrase)일 수 있다.
본 발명은 펩타이드는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 이로 인하여 심혈관질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하며, 혈압 저하능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 식품인 굴 유래의 것으로 안전성이 보장되고 부작용이 문제되지 아니하다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 굴 단백질 효소 처리물에 대해 크로마노그래피를 수행하여 유효성분을 분리 및 정제 하는 단계와 그 결과를 나타내는 도면으로, TGPN은 트랜스글루타미나제와 단백질 가수분해효소(Protamex 및 Neutrase)를 순서대로 처리한 처리물이고, SX는 크기배제크로마토그래피, RP는 역상크로마토그래피 및 CX는 양이온-교환 크로마토그래피를 각각 수행한 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX1RP5RP5RP3SX1 내지 RP17CX1RP5RP5RP3SX3의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX3RP5RP2RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX3RP5RP6RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획을 나타낸 것으로, RP17CX4RP1RP1RP1SX1의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 최종 분획법을 실시한 결과물의 활성분획으로부터 추출한 아미노산을 질량분석기를 이용한 전기분무이온화법으로 펩타이드의 분자량을 분석한 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인된 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획 및 본 발명의 Cpep1 펩타이드(Pro-Asn)를 실험동물에 투여한 경우에 실험동물의 혈압변화를 측정하여 혈압저하능을 확인한 그래프로, 상기 그래프에서 ○는 식염수를 경구투여한 대조군(control)을 의미하고, ▼는 정어리 펩타이드를 경구투여한 비교군을 의미하며, ▲는 본 발명의 굴 효소처리물 경구투여한 실험예 3을 의미하고, ◆는 본 발명의 Cpep1 펩타이드(Pro-Asn)를 경구투여한 실험예 4를 의미한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것일 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.
　　　
실시예 1: 굴 단백질 효소처리물의 제조
1-1. 굴 단백질 효소처리물의 제조
통영시 소재 수하조합에서 구입한 양식산 굴 3kg을 1분 동안 끓는 물에 데친 후, 체를 이용하여 물기를 제거하였다. 상기 끓는 물에 데친 굴에 상기 굴의 무게 2배에 해당하는 물을 첨가한 후, 분쇄기를 이용하여 2분 동안 3000 rpm의 조건으로 마쇄하였다. 상기 굴 마쇄물의 단백질 농도는 Lowry법을 이용하여 측정하였다. 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 2%의 농도가 되도록 각 트랜스글루타미나제 및/또는 단백질 분해효소를 첨가하고 반응시켜 가수분해물을 제조하였다. 구체적으로, 상기 가수분해물은 트랜스글루타미나제(transglutaminase, TGase, Ajinomoto Co, 일본), Protamex(Novozyme-Korea, 대한민국) 및 Neutrase(Novozyme-Korea, 대한민국)를 처리한 실험예 1과 단백질 분해효소인 Protamex 및 Neutrase만을 처리한 실험예 2이다.
상기 실험예 1의 가수분해물 제조는 보다 상세하게는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 우선, 상기 굴 분쇄물에 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 트랜스글루타미나제를 첨가하고 30℃에서 1시간 동안 반응을 수행하여 공유결합을 형성시킨 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 효소처리물에 Protamex를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 40℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 Protamex를 처리한 효소처리물에 Neutrase를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 효소처리물의 상층액을 수득하여 실험예 1을 제조하였다.
또한, 실험예 2는 상기 굴 분쇄물에 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 Protamex를 첨가하고 40℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시키고, 상기 Protamex를 처리한 효소처리물에 Neutrase를 상기 측정된 단백질 농도에 대하여 1%의 농도가 되도록 첨가하고 50℃에서 1시간 동안 반응을 수행한 후, 100℃에서 1시간 동안 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다. 상기 효소처리물의 상층액을 수득하여 실험예 2를 제조하였다.
상기 수득한 실험예 1과 실험예 2을 최종 농도가 60%(v/v)가 되도록 에탄올을 첨가하고, 4℃의 저온실에서 1시간 동안 방치하여 에탄올 불용성 물질과 잔여 단백질을 침전시킨 후, 원심분리(8000×g, 25min)를 이용하여 제거하였다. 침전물을 제거하여 수득한 상층액은 0.45 μm의 막으로 여과하고, 회전진공증발기(N-type, EYELA, 일본)를 이용하여 40℃ 이하의 온도에서 에탄올을 증발시키는 방법으로 건조시켜 실험예 1의 가수분해물을 및 실험예 2의 가수분해물을 제조하였다. 상기 가수분해물은 각각 건조중량을 기준으로 실험초기에 사용된 굴의 약 29%(28.5 내지 30.1%)인 것으로 확인되었다.
　　　
1-2. 혈압저하능의 확인
상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물 및 이하 유효성분의 혈압저하능을 확인하는 방법은 안지오텐신 전환효소(ACE) 저해능을 측정하는 방법으로 수행하였다.
상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물은 증류수로 희석하여 최종 농도가 0.5 mg/ml로 조절하여 확인하였다. 보다 상세하게는, ACE 저해능은 Wu et al(2002)의 방법을 기초로 수행하였다.
구체적으로, 0.3 M NaCl을 첨가한 0.1 M borate buffer(pH 8.3)로 5 mM hippuryl-His-Leu(HHL)과 0.25 m Unit ACE를 제조하였다. Eppendorf tube에 시료 40 uL, ACE 150 uL를 첨가하고, 37 ℃ 항온수조에서 10분간 교반 하면서 반응시킨 후 100 uL HHL을 가하여 37 ℃ 항온수조에서 30분간 교반하면서 반응시켰다. 반응 종결 후 150 uL의 1 M HCl을 가하여 효소 반응을 중지시킨 다음 10000 x g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분취하였다. 상기 분취한 상층액을 HPLC(Hitachi, Japan)로 유리한 hippuric acid(HA)의 함량을 측정하였다. HA의 정량을 위해 역상 column(Watchers 120 ODS-AP, 4.6 x 250 mm, 5 ㎛, Daiso, Japan)에 반응 중지용액 40 uL를 주입하였다. A 용매로는 0.1 % TFA를 포함하는 H20를 사용하고 B 용매로는 0.1 % TFA를 포함하는 100 % CH3CN을 사용하였다. Gradient는 5%에서 60 % B 용매 / 20 min 조건으로 선형 균배하면서 228 nm에서 흡광도를 측정하였다. Reference 용액은 시료대신 40 uL의 A용매를 사용하였고 유속은 1 mL/ min의 조건으로 용출하였다. 효소저해능은 하기 계산식1로 계산하였으며, 시료 농도별로 ACE저해활성을 측정하여 농도별 저해 활성을 선형 회귀분석 하였다. 또한 ACE 저해활성의 50%를 저해하는 데 필요한 시료 농도를 IC50으로 정의하였다.
[계산식 1]
ACE 저해(%)=(Reference의 HA - 시료의 HA)/Reference의 HA x 100
상기 실험예 1과 실험예 2의 가수분해물의 정제단계별 혈압저하능을 시료 처리 전의 안지오텐신 전환효소의 효소능을 기준으로 저해능을 확인한 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
표 1
시료명 가수분해물 크기배제 크로마토그래피 양이온-교환크로마노그래피
실험예 1 48.9% 79.8% 87.0%
실험예 2 38.1% 80.0% 86.7%
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 실험예 2의 가수분해물이 실험예 1에 비하여 정제가 거듭될수록 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인되어, 실험예 2로부터 안지오텐신 전환효소 저해능이 있는 펩타이드를 추출하는 것이 바람직할 것으로 판단되었다.
1-3. 활성성분 회수
상기 실시예 1-1에서 수득한 실험예 2의 가수분해물을 탈이온수에 녹인 후, 5 kDa 막(5 kDa membrane)을 장착한 한외여과기(8200, Amicon Co., USA)로 한외 여과하였다. 상기 한외 여과를 수행한 후, 수득한 상층액과 잔사를 진공동결 건조하여 각 굴 가수분해물의 활성성분 건조 분말을 제조하였다.
1-4. 분획물의 제조
상기 실시예 1-3에서 수득한 건조 분말(이하, TGPN)을 20% CH3CN에 용해하여 1kDa 막을 장착한 한외여과기(8200, Amicon Co., USA)로 한외 여과하여 상층액(1 kDa 초과 TGPN)과 여과액(1 kDa 이하 TGPN)을 분리하고, 10% CH3CN 10 ml로 정용하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 측정 결과, 1 kDa 초과 TGPN의 IC50은 4.5157 mg/ml이고, 1 kDa 이하 TGPN의 IC50은 0.6142 mg/ml으로, 1 kDa 이하 TGPN이 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인되었다.
상기 저해능이 우수한 1 kDa 이하 TGPN을 정제하면서, 유효성분을 분리하는 단계를 수행하였다. 상기 유효성분을 분리하기 위해 수행한 정제방법은 도 1에 나타낸 바와 같으며, 상세하게는 하기와 같다.
첫 번째 단계로, 상기 저해능이 우수한 1 kDa 이하 TGPN(30.1298 mg/ml, 20 ml)을 분자량별로 분리하기 위한 크기 배제 컬럼(Hiroad 16/60 superdex 30 pg, 16×600 mm, Pharmacia, 스웨덴)을 이용하여 226 nm에서 흡광도를 분석하였고, 용매는 20% CH3CN을 이용하였으며, 유속은 1 ml/min 조건에서 수행하고, 각 2ml씩 분취하였다. 상기 각 2 ml씩 분취한 시료의 분자량은 동일한 조건에서 각각의 표준 단백질의 용출부피를 통해 표준곡선을 작성하여 계산하였다. 상기 각 분자량으로 구분된 분획별로 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다.
두 번째 단계로 역상 HPLC column(218TP510 Protein&peptide C18, 10×250 mm, 5 μm, Grace Vydac, USA)을 이용하여 254nm에서 흡광도를 분석하였다. A용매로는 0.1% TFA를 포함하는 H2O를 이용하였고, B용매로는 0.1% TFA를 포함하는 CH3CN을 이용하였으며, 농도구배는 0에서 50% B용매/50min의 조건으로 선형구배하였으며, 유속은 3 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/65에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
세 번째 단계로 양이온 교환 HPLC column(TSK-gel SP-5PW, 7.5×7.5 mm, Tosoh, 일본)을 이용하여 254nm에서 흡광도를 분석하였다. A용매로는 10 mM phosphate buffer(pH 6.0)을 사용하였고, B용매는 1M NaCl을 포함한 10 mM phosphate buffer(pH 6.0)을 사용하였다. 농도구배는 0에서 1.0M B용매/100min의 조건으로 선형구배하였으며, 유속은 1 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/50에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
네 번째 단계로 역상 HPLC column(Watchers 120 ODS-AP, 4.6×250 mm, 5 μm, Daiso, 일본)을 이용하여 분취하였다. A용매로는 0.1% TFA를 포함하는 H2O를 이용하였고, B용매로는 0.1% TFA를 포함하는 CH3CN을 이용하였으며, 220 nm에서 흡광도를 분석하였다. 농도구배는 0에서 20% B용매/60min의 조건으로 선형 구배하였으며, 유속은 1 mL/min의 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/25에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
다섯 번째 단계로 네 번째 단계에서 사용한 것과 동일한 역상 HPLC column을 사용하여, 220nm흡광도로 검출하하였다. 용매는 0.1% TFA를 포함하는 12% CH3CN을 이용하였으며, isocratic 조건에서 1 mL/min의 유속으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/25에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
여섯 번째 단계로 네 번째 단계에서 사용한 것과 동일한 역상 HPLC column을 사용하여, 상기 다섯 번째 단계에서 얻어진 분획을 동일한 조건으로 부분정제하였다. 각 분획의 1/20에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
일곱 번째 단계로 크기 배제 FPLC 컬럼(Superdex Peptide HR 10/30, 10×300 mm, Pharmacia, 스웨덴)을 이용하여 정제하였으며, 용매는 12% CH3CN을 이용하였으며, 226nm 흡광도로 검출하였고, 유속은 0.5 ml/min 조건에서 수행하였다. 각 분획의 1/10에 해당하는 양의 안지오텐신 저해능을 측정하였다.
실시예 2: 활성분획의 안지오텐신 전환효소 저해능 측정
상기 실시예 1-4에서 제조된 각각의 활성분획의 안지오텐신 전환효소 저해능을 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하였다.
우선, 실시예 1-4에서 수득한 1 kDa 이상과 1 kDa 이하의 활성 분획을 비교한 결과, 안지오텐신 전환효소 저해능은 1 kDa 이상의 경우 IC50값이 4.5157 mg/ml로 확인되었고, 1 kDa 이하의 경우 IC50값이 0.6142 mg/ml로 확인되어 1 kDa 이하의 활성분획이 현저하게 우수한 저해능을 갖는 것으로 확인되었다.
상기 확인 결과에 따라, 1 kDa 이하의 활성분획을 실시예 1-4의 첫번째 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분획한 결과, 총 4개의 주요 분획층으로 확인되었고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
분획 IC50(mg/ml) 용출부피/void 부피 분자량(Da)
SX1 0.2642 0.95-1.95 >1,000
SX2 0.0790 2.35 200-500
SX3 0.1591 2.70 100-200
SX4 - 3.10 <100
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 저해능이 확인된 3개의 분획을 SX1, SX2 및 SX3로 명명하였다. 각각의 IC50값은 0.2642 mg/ml, 0.0790 mg/ml 및 0.1591 mg/ml 로 확인되었다.
상기 IC50값이 가장 우수한 것으로 확인된 SX2를 회전진공증발기(N-1, EYELA, 일본)로 농축하고, 이를 실시예 1-4에 기재된 두 번째 분획법으로 검출하는 단계를 실시하였으며, 이 중, 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 분획, 구체적으로 50% 이상의 활성을 가진 분획을 분리하였다. 상기 분리된 분획은 각각 RP9(9.5min, 4-5% CH3CN) 및 RP17(15.7min, 10-11% CH3CN )로 명명하였고, 각각의 활성은 55.67%와 50.54%이었다.
상기 IC50값이 우수한 것으로 확인된 RP9 및 RP17를 회전진공증발기로 농축하고, 이에 대하여 실시예 1-4에 기재된 세 번째 분획법을 실시하였으며, RP9의 경우 8개 분획으로, RP17의 경우 5개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 이 중, 저해능이 우수한 것을 각각 RP9CX1(2.68min, 10 mM NaCl), RP17CX1(2.40min, 8 mM NaCl), RP17CX3(4.23min, 26 mM NaCl) 및 RP17CX4(5.09min, 35 mM NaCl)로 명명하였고, 각각의 활성은 54.58%, 76.11%, 72.68%와 70.20%이었다. 상기 저해능이 우수한 것으로 확인된 활성분획 각각은 진공동결건조장치(FDU-540, EYELA, 일본)로 용매를 휘발시켜 제거하였다.
상기 용매를 제거한 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 네 번째 분획법을 실시하였으며, RP9CX1의 경우 2개 분획을 제외한 분획이 모두 254nm 또는 280nm의 흡광도가 220nm의 흡광도 보다 높게 나왔고, 상기 RP9CX1의 2개의 분획은 안지오텐신 전환효소 저해능을 나타내지 아니하여 이후 실험에서 제외하였다.
또한, RP17CX1의 경우 6개 분획으로 분취하고, RP17CX3의 경우 8개 분획으로 분취하였으며, RP17CX1의 경우 4개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. 이 중, 저해능이 우수한 것을 확인하면, 각각 RP17CX1RP1(43.22min, 11-12% CH3CN), RP17CX1RP4(46.72min, 12-13% CH3CN) 및 RP17CX1RP5(47.68min, 13% CH3CN)에서 각각 55.20%, 69.79% 및 76.02%의 저해능을 나타내었고, RP17CX3RP4(44.13min, 12% CH3CN), RP17CX3RP5(45.02min, 12% CH3CN) 및 RP17CX3RP6(45.61min, 12% CH3CN)에서 각각 52.57%, 54.99% 및 71.25%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX4RP1(43.26min, 12% CH3CN) 및 RP17CX4RP2(44.53min, 12% CH3CN) 에서 각각 43.13% 및 32.62%의 저해능을 나타내었다.
상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 다섯 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 구체적으로, RP17CX1RP1의 경우 3개 분획으로 분취하였고, RP17CX1RP4의 경우 6개 분획으로 분취하였으며, RP17CX1RP5의 경우 7개 분획으로 분취하였고, RP17CX3RP5의 경우 6개 분획으로 분취하였으며, RP17CX3RP6의 경우 3개 분획으로 분취하였고, RP17CX4RP1의 경우 단일 peak가 검출되었고, RP17CX4RP2의 경우 4개 분획으로 분취하여 안지오텐신 전환효소 저해능을 측정하였다. RP17CX3RP4의 경우, 분취된 분획물 모두 안지오텐신 전환효소 저해능이 없는 것으로 확인되었다.
이 중, 저해능이 우수한 것을 확인하면, RP17CX1RP1RP2(8.80min)은 58.65%의 저해능을 나타내었으나, 명확한 분획의 구분이 어려워 더 이상의 분획이 어려운 것으로 확인되었다.
또한, RP17CX1RP4RP6(11.10min)은 73.62%의 저해능을 나타내었고, RP17CX1RP5RP5(13.27min)은 54.17%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX3RP5RP2(9.60min)은 64.11%의 저해능을 나타내었고, RP17CX3RP5RP6(12.03min)은 53.53%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX3RP6RP4(12.12min)은 58.97%의 저해능을 나타내었고, RP17CX1RP1 (12.80min)의 단일 피크는 53.46%의 저해능을 나타내었으며, RP17CX4RP2RP4(11.80min)은 RP17CX4RP2로부터 분취된 분획물 중, 확연히 차이가 나는 59.60%의 저해능을 나타내었다.
상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 여섯 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과는 다음과 같다. 구체적으로, RP17CX1RP4RP6의 경우 모든 분획에서 안지오텐신 전환효소 저해능이 없는 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 상기 분획은 낮은 활성을 가지는 여러 분획으로 분리된 것으로 판단되었다. 한편, RP17CX1RP5RP5의 경우, 총 3개의 분획(RP17CX1RP5RP5RP1, RP17CX1RP5RP5RP2 및 RP17CX1RP5RP5RP3)으로 구분되었으며, 이중 RP17CX1RP5RP5RP3(15.60min)에서 15.60%의 저해능을 나타내었다. 또한, RP17CX3RP5RP2(11.17 min), RP17CX3RP5RP6(14.24 min), RP17CX3RP6RP2(12.60 min), RP17CX4RP1RP1(12.57 min) 및 RP17CX4RP2RP4(13.74 min)의 경우, 모두 단일 분획으로 분리되었다.
마지막으로, 상기 분획에 대해 실시예 1-4에 기재된 일곱 번째 분획법을 실시하였으며, 그 결과를 도 2 내지 도 5 및 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
분획번호 저해능(%)
(A) RP17CX1RP5RP5RP3SX1 66.11
RP17CX1RP5RP5RP3SX2 22.90
RP17CX1RP5RP5RP3SX3 0.37
(B) RP17CX3RP5RP2RP1SX1 93.67
(C) RP17CX3RP5RP6RP1SX1 57.66
(D) RP17CX4RP1RP1RP1SX1 92.76
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, RP17CX1RP5RP5RP3의 경우, 총 3개의 분획으로 구분되었으며, 이중 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획에서 66.11%의 안지오텐신 저해능이 확인되었다.
실시예 3: 아미노산 서열분석
상기 실시예 2에서 최종적으로 선택된 분획에 포함된 아미노산 서열을 분석하였다. 상기 아미노산 서열 분석은 아미노산 서열과 정확한 분자량의 결과를 얻기 위해 QTOF2(Micormass, 영국) 질량분석기를 이용하여 전기분무이온환(ESI)법을 수행하였고, 서열을 확인하기 위하여 Edmnan법을 수행하였으며, 이를 통하여 분석한 결과가 일치하는 펩타이드로 아미노산 서열 분석을 수행하였다. 상기 분석 결과를 도 6 및 하기 표 4에 기재하였다.
표 4
명칭 아미노산 서열 서열번호
Cpep1 Pro-Asn(P-N) 1
Cpep2 Arg-His-Asp(R-H-D) 2
상기 도 6 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2에서 안지오텐신 저해능이 가장 우수한 것으로 확인된 분획에 포함된 아미노산 Cpep1과 Cpep2는 각각 질량이 215 Da과 381.43 Da인 것으로 확인되었고, 각각 2개와 3개의 아미노산 잔기로 구성된 펩타이드이며, 그 서열은 상기 표 4와 같은 것으로 확인되었다.
상기 표 4에 기재된 펩타이드의 안지오텐신 전환효소의 저해능을 확인하기 위하여, 상기 안지오텐신 전환효소 저해능 측정방법에 따라, 안지오텐신 전환효소를 50% 저해할 수 있는 농도인 IC50을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
표 5
명칭 아미노산 서열 IC50 (μM)
Cpep1 Pro-Asn(P-N) 0.19
Cpep2 Arg-His-Asp(R-H-D) 2.96
상기 표 5에 기재된 바와 같이, 상기 두 펩타이드는 안지오텐신 전환효소의 저해능이 매우 우수한 것으로 확인되었고, 특히, 서열번호 1의 Cpep1(Pro-Asn)은 0.19 μM 함량으로도 안지오텐신 전환효소의 50%를 저해할 수 있는 것으로 확인되어, 이후 안지오텐신 전환효소와 관련된 심혈관계 질환의 치료제 등의 다양한 용도로 사용될 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 4: 혈압저하능의 확인
상기 실시예 3에서 안지오텐신 저해능이 가장 우수한 것으로 확인된 서열번호 1의 Cpep1(Pro-Asn)이 체내에서도 동일한 혈압저하능을 가질 수 있는지와 관련하여 실험동물을 이용하여 확인하였다.
상기 실험에서 사용한 실험동물은 12주령의 고혈압 동물 모델인 SHR(spontaneously hypertensive rat) 수컷 쥐(male rat)를 사용하였다. 5주령의 본태성 고혈압 수컷 쥐를 한국 화학연구소(유성, 대한민국)로부터 분양받아, 표준식이(AIN-76, Dytes Inc., USA)를 공급하고 적응기와 안정기를 거쳐 12주령이 되었을 때, 실험에 사용하였다.
상기 실험동물은 대조군, 비교군 및 실험군으로 구분하여, 각각 3마리씩 분리사육하였고, 환기 및 온도는 모두 동일한 조건을 주었으며, 오전 6시부터 오후 6시까지 조명을 이용하여 명암조건을 주고, 식이는 사료와 음료수를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.
실험물질로 상기 서열번호 1의 Cpep1(Pro-Asn, MW 229.2)와 비교군으로 사용된 정어리 펩타이드(Val-Tyr, MW 280.3)는 ㈜ 에니젠(대한민국)에 의뢰하여 합성하였으며, 실험군으로 사용된 굴 펩타이드 추출 시료는 상기 실시예 2에서 안지오텐신 전환효소 저해능이 가장 우수한 것으로 최종적으로 확인된 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획을 사용하였다. 상기 비교군으로 사용된 정어리 펩타이드는 기존에 혈압저하능이 있는 것으로 확인된 펩타이드의 서열을 갖는 펩타이드이다.
상기 실험물질의 투여와 관련하여, 대조군은 실험동물의 체중에 비례하여 100 mg/kg(실험물질/체중)의 함량으로 경구 투여하였고, 비교군(positive control)은 정어리 펩타이드(Val-Tyr)를 실험동물의 체중에 비례하여 100 mg/kg(실험물질/체중)의 함량으로 경구 투여하였다. 실험군으로, 실험예 3은 상기 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획을 실험동물의 체중에 비례하여 200 mg/kg(실험물질/체중)의 함량으로 경구 투여하였으며, 실험예 4는 상기 서열번호 1의 서열을 갖는 합성 펩타이드(Cpep1, Pro-Asn)를 실험동물의 체중에 비례하여 100 mg/kg(실험물질/체중)의 함량으로 경구 투여하였다.
상기 실험동물에 대해 각각 실험물질을 투여 후부터 24시간이 경과할 때까지 혈압을 측정하였다. 상세하게는, 실험물질 투여 후, 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간이 경과한 시점에 상기 실험동물의 꼬리동맥의 수축기 혈압을 tail cuff법으로 측정하였다.
상기 혈압측정은 보다 구체적으로 상기 실험동물을 37 내지 38℃의 보온상자에서 10분간 가온하여 꼬리 동맥을 완전히 확장시킨 후, restrainer에 고정하고, 소동물 비혈관식 자동혈압계(LE5001 pressure meter, LSI ETICA, 스페인)를 사용하여 수축기 혈압을 5회 측정한 후, 그 평균값을 계산하는 방법으로 수행하였으며, 그 결과를 하기 도 7에 나타내었다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 안지오텐신 전환효소 저해능이 우수한 것으로 확인된 RP17CX1RP5RP5RP3SX1 분획을 투여한 경우인 실험예 3의 혈압저하능이 우수한 것으로 확인되어, 안지오텐신 전환효소 저해능이 있었던 분획물의 혈압저하능이 확인되었으며, 비교군과 비교한 결과 혈압 강하 정도 및 혈압 저하능 유지 시간이란 점에서 비교군보다 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 서열번호 1의 서열을 갖는 펩타이드(Pro-Asn)를 투여한 실험예 4는 시간 의존적으로 혈압이 감소되었으며, 9시간이 경과한 시점까지 혈압강하 정도가 진행되었고, 12시간 이상까지 그 효과가 지속되는 것으로 확인된 반면, 대조군의 경우 혈압 측정 시간이 경과되면서 오히려 약간 상승하는 것이 확인되었고, 기존 혈압저하능을 가지는 것으로 확인된 펩타이드의 서열로 합성된 합성 펩타이드를 투여한 비교군의 경우 혈압저하능이 그리 크지 않는 것으로 확인되었다. 즉, 가장 효과가 우수한 것으로 확인된 실험예 4의 경우, 초기 측정시에 대조군에 비하여 측정 혈압이 약 12 정도 높았음에도 불구하고, 9시간이 경과한 시점에서는 오히려 혈압이 낮아지는 것으로 확인되었다. 또한, 초기 혈압과 비교한 측정치를 고려하면, 투여 전 혈압의 약 10%에 해당하는 혈압을 강하시키는 것으로 확인되어 혈압강하능이 매우 우수한 것으로 확인되었고, 실험동물에 대해 경구투여에 의해 측정한 결과이므로 실제 임상적으로도 그 효과가 우수할 것으로 예상되었다.
결론적으로, 본 발명의 펩타이드를 투여한 실험예 4의 경우 혈압 강하 정도 및 혈압 저하능 유지 시간이란 점에서 공지 펩타이드를 투여한 비교군보다 우수한 것으로 확인되었다.
본 발명은 펩타이드 또는 산부가염은 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme, ACE)를 저해할 수 있고, 이로 인하여 심혈관질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용할 뿐만 아니라, 식품인 굴 유래의 것으로 안전성이 보장되고 부작용이 문제되지 아니한다. 또한, 3면이 바다인 대한민국에서 풍부하게 수확되는 굴로부터 효소처리에 의하여 수득할 수 있는 것이므로, 상기 펩타이드의 제조는 기존 화학적으로 인공 합성하는 것에 비하여, 경제성도 우수하다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 기존의 화학적으로 제조된 심혈관계 질환에 대한 치료 또는 개선용 인공 물질을 대체할 수 있다는 점에서 관련 산업에 폭 넓게 이용될 수 있다.
본 발명의 안지오텐신 저해능이 우수하고, 혈압저하능이 뛰어난 펩타이드는 2종류로 Cpep1이라 명칭된 펩타이드는 서열번호 1의 서열 즉, Pro-Asn(P-N)의 서열을 가진 펩타이드이고, Cpep2라 명칭된 펩타이드는서열번호 2의 서열 즉, Arg-His-Asp(R-H-D)의 서열을 가진 펩타이드이다.

Claims (14)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme)의 저해능을 갖는 것인 펩타이드 또는 이들의 산 부가염.
  3. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드.
  4. 제3항에 따른 뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 심혈관질환이란 고혈압, 심장병, 뇌졸중, 혈전증, 협심증, 심부전, 심근경색, 죽상경화증 및 동맥경화로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나인 심혈관질환 치료 또는 개선용 조성물.
  7. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 치료용 용도.
  8. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 고혈압 치료용 용도.
  9. 굴에 트랜스글루타미나제를 처리하는 단계 및 상기 트랜스글루타미나제를 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물 제조방법.
  10. 제7항의 제조방법에 따라 제조되고, 굴 효소처리물을 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물.
  11. 굴 효소처리물을 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 굴 효소처리물은 굴을 트랜스글루타미나제로 처리한 후, 상기 트랜스글루타미나제로 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 방법으로 제조한 것인 심혈관질환 치료 또는 예방용 조성물.
  13. 굴 효소처리물을 유효성분으로 포함하는 심혈관질환 개선 또는 예방용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 굴 효소처리물은 굴을 트랜스글루타미나제로 처리한 후, 상기 트랜스글루타미나제로 처리한 굴에 단백질 가수분해효소를 처리하는 방법으로 제조한 것인 심혈관질환 개선 또는 예방용 조성물.
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