KR101566036B1 - 간질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

효과가 높고, 부작용 걱정이 없으며, 섭취가 용이하고, 또한 가격적으로나 안전성의 면에서도 장기간 복용할 수 있는 간질환의 예방 및/또는 치료 효과가 있는 조성물을 제공한다. 본 발명은, 하기 식 : pyroGlu-(X)n-A (X 는 동일하거나 또는 상이하고, Gln 또는 Asn 이며, A 는 Gln, Asn, Leu, Ile 또는 Val 이고, n 은 0 ∼ 2 의 정수이다) 로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 또는 그 염에 관한 것이다.

Description

간질환의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING LUNG DISEASE}
본 발명은 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 펩티드, 그리고 그 펩티드를 함유하는 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
급성 간염이나 만성 간염, 알코올성 간 장해, 지방간 등의 간질환은, 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 특히 증상이 악화되어 간경변 등을 초래하면, 식도 정맥류나 간성 뇌증 등을 일으켜 예후가 매우 나쁘다. 또한 합병증으로서, 신장병이나 당뇨병을 일으키는 경우가 있어, 그 예방법이나 치료법이 요망되고 있다. 이들 간질환은 다양한 원인에 의해 일어나는 것이 밝혀졌으며, 예를 들어, 간염 바이러스의 감염에 의해 일어나는 A 형 간염, B 형 간염, C 형 간염, D 형 간염, E 형 간염, F 형 간염, G 형 간염이나 TT 형 간염 등, 알코올의 과잉 섭취에 의해 일어나는 알코올성 지방간이나 간경변, 약의 복용에 의해 일어나는 약제성 간염이나, 면역 이상에 의한 자기 면역성 간염 등을 들 수 있다.
이들 간질환의 치료를 위해, 글리시리진 제제, 라미부딘, 폴리엔포스파티딜콜린, 말로틸레이트, 디클로로아세트산디이소프로필아민, 티오프로닌, 프로토포르피린나트륨, 메틸메티오닌술포늄클로라이드, 인터페론, 우르소데옥시콜산, 소시호 탕, 간장 가수 분해물, 글루타티온 등의 의약품이 사용되고 있다. 그러나, 이들 약제는, 간질환을 신속하게 개선하는 효과가 낮아, 치료에 장시간을 필요로 하는 경우가 많다. 또한, 간질환을 어느 정도 신속하게 개선할 수 있는 경우라도, 개선 후의 GOT 값, GPT 값, γ-GTP 값이 정상으로 되어 있는 값의 상한 한도인 경우가 많다. 또한, 간질환의 치료 효과가 있는 경우라도 부작용이 있는 등의 문제가 있었다.
한편, 간장은 생체에 있어서 단백질 등의 영양소의 대사를 행하는 장소이므로, 아미노산이나 펩티드를 사용하여 간질환을 치료하고자 하는 시도가 행해져 왔다. 예를 들어, 특허 문헌 1 에는, 아미노산인 발린을 유효 성분으로서 함유하고, 발린 이외의 아미노산은 유효 성분으로서 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 간질환 치료 조성물이 제안되어 있다. 그러나, 아미노산은 독특한 강한 풍미가 있어, 계속적으로 섭취하는 것은 곤란하다.
또한 특허 문헌 2 에는, 류신-세린-리신-류신의 아미노산 4 개로 이루어지는 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 간질환약이 제안되어 있다. 그러나 이 펩티드의 효과는 복강 내 투여에서만 확인되어, 경구 투여에 의해서도 효과를 발휘할지는 불분명하다.
이와 같이, 풍미가 양호하여 일상적으로 섭취가 용이하고, 경구 투여에 의해서도 우수한 간질환의 치료 효과를 나타내며, 또한 안전성이 높은 간질환의 예방 또는 치료를 위한 약제, 및 식품의 개발이 요망되고 있다.
특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 평11-171763호
특허 문헌 2 : 국제공개 WO2002/072131호 팜플렛
발명의 개시
본 발명의 과제는, 효과가 높고, 부작용 걱정이 없으며, 섭취가 용이하고, 또한 가격적으로나 안전성의 면에서도 장기간 복용할 수 있는 간질환의 예방 및/또는 치료 효과가 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 간질환에 대하여 높은 개선 효과를 갖는 물질의 검색을 예의 실시한 결과, 특정한 배열을 갖는 펩티드를 투여하면, 간질환 환자의 GOT 값 및 GPT 값을 단기간 동안에 정상값 또는 그것에 가까운 값으로 개선하여, 간질환을 개선할 수 있는 것을 알아냈다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 하기 식 :
pyroGlu-(X)n-A
(X 는 동일하거나 또는 상이하고, Gln 또는 Asn 이며, A 는 Gln, Asn, Leu, Ile 또는 Val 이고, n 은 0 ∼ 2 의 정수이다)
로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 또는 그 염.
(2) X 가 Gln 이고, A 가 Gln, Leu 또는 Ile 이고, n 이 0 또는 1 인 (1) 에 기재된 펩티드 또는 그 염.
(3) (1) 또는 (2) 에 기재된 펩티드 또는 그 염의 적어도 1 종을 유효 성분으로서 함유하는 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물.
(4) 간질환이 바이러스 간염, 알코올성 간질환 또는 약제성 간질환인 (3) 에 기재된 조성물.
(5) 식품의 형태인 (3) 또는 (4) 에 기재된 조성물.
본 발명에 의해, 종래의 의약품에 의한 치료보다 안전성이 높고 간단한 방법으로 섭취할 수 있는, 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 펩티드, 그리고 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본특허출원 2007-77594호의 특허청구의 범위 및 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 구체적으로 설명한다. 본 발명에 있어서 간질환이란, 간 기능에 장해가 있는 증상을 가르킨다. 예를 들어, 바이러스성 간염, 알코올성 간염 및 약제성 간염 등의 염증성 간질환, 지방간 그리고 간경변을 들 수 있다. 병명이 확실치 않은 경우라도, GOT, GPT, γ-GTP 등의 간 기능의 지표에 이상이 관찰되는 증상도 간질환에 포함된다. 간질환의 예방 및/또는 치료 활성은, 간 기능을 측정함으로써, 즉, 상기와 같은 간 기능의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다. 예를 들어, 간세포의 파괴에 의해 혈액 중에 유리 (遊離) 되어 농도가 상승하는 간질환의 혈청 마커인 GOT 값 및 GPT 값을 측정함으로써 평가할 수 있다. 보다 구체적으로는, D-갈락토사민에 의해 간질환을 발병한 동물에 대하여 유효 성분을 투여하고, 간질환의 억제 작용을 측정하면 된다.
GOT (Glutamic Oxaloacetic Transaminase) 는 심근, 간장, 골격근, 신장 등의 조직이나 장기의 세포 중에 많이 존재하고, 아미노기를 전이시켜 아미노산을 형성하는 효소이다. 정상적인 상태라도, 인체를 구성하는 세포에 있어서 생성과 붕괴가 항상 일어나고 있는 효소이기 때문에, 건강인의 혈액 중에도 항상 소정량의 GOT 가 함유되어 있다. 그러나, 상기한 장기에 이상이 발생하면, 혈액 중에 다량의 GOT 가 유리되게 된다. 그 때문에, 혈액 중의 GOT 함유량 (GOT 값) 은 장기나 신체 조직에서의 질병 유무를 진단할 때의 중요한 지침 중 하나로 되어 있다. 간질환에 이환 (罹患) 되어 간세포가 붕괴되면, 정상값을 초과하는 양의 GOT 가 유리되므로, 이것을 측정함으로써 간질환의 종류나 중상도 등을 추정할 수 있다. 인간에 있어서의 GOT 값의 정상값은, 통상적으로 11 ∼ 40 IU/L 이다.
GPT (Glutamic Pyruvic Transaminase) 는, GOT 와 동일하게 아미노산 형성에 관여하는 효소로, 간세포에 특이적으로 많이 존재한다. 신장에는 간장의 1/3 정도 존재하고, 그 밖의 장기에서의 존재량은 적다. 건강인의 혈액 중에도 항상 소정량의 GPT 가 함유되어 있는데, 혈액 중의 GPT 함유량 (GPT 값) 은 간세포의 변성이나 괴사 등의 간 장해에 민감하게 반응하여 증가하므로, 간질환을 진단할 때의 중요한 지표 중 하나로 되어 있다. 간질환에 이환되어 간세포가 붕괴되면, 정상값을 초과하는 양의 GPT 가 유리되어, 이것을 측정함으로써 간질환의 종류나 중상도 등을 추정할 수 있다. 인간에 있어서의 GPT 값의 정상값은, 통상적으로 6 ∼ 43 IU/L 이다.
본 발명자들은, 하기 식 :
pyroGlu-(X)n-A
로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드 또는 그 염 (이하, 그 펩티드를 본 발명의 펩티드라고 호칭하는 경우가 있다) 이, 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 것을 알아냈다. 여기서 pyroGlu 는 피로글루타민산을 나타내고, X 는 동일하거나 또는 상이하고, Gln (글루타민) 또는 Asn (아스파라긴), 바람직하게는 Gln 이며, A 는 Gln, Asn, Leu (류신), Ile (이소류신) 또는 Val (발린), 바람직하게는 Gln, Leu 또는 Ile 이며, n 은 0, 1 또는 2, 바람직하게는 0 또는 1 이다. 이 식으로 나타내는 펩티드로는, 예를 들어, pyroGlu-Gln, pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Leu, pyroGlu-Ile, pyroGlu-Gln-Leu, pyroGlu-Gln-Ile, pyroGlu-Gln-Gln-Gln, pyroGlu-Gln-Gln-Leu, pyroGlu-Gln-Gln-Ile 등을 들 수 있다.
피로글루타민산은, 글루타민산의 γ 위치의 아미드기와
Figure 112009064839542-pct00001
위치의 아미노기가 폐환된 것이다. 본 발명의 펩티드는, 천연 또는 재조합 단백질의 부분적 가수 분해물, 화학 합성법에 의해 또는 유전자 공학적으로 제조된 펩티드, 또는 이들의 조합이어도 된다.
본 발명의 펩티드를 구성하는 아미노산으로는, D 체, L 체, DL 체 (라세미체) 모두 사용할 수 있는데, 특히 L 체를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩티드를 천연 단백질의 부분 가수 분해에 의해 조제하는 경우, 구성 아미노산은 전부 L 체가 된다. 본 발명의 펩티드를 화학 합성법에 의해 조제하는 경우, 구성 아미노산의 전부가 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 이루어지는 펩티드이어 도, 아미노산 중 어느 것이 L-아미노산이고 나머지가 D-아미노산인 펩티드이어도 조제할 수 있고, 모두 본 발명의 펩티드에 포함된다.
본 발명의 펩티드의 조성은, 아미노산 분석법에 의해 확인할 수 있다. 그 때, 일반적으로 실시되고 있는 산 가수 분해법에서는, 피로글루타민산도 글루타민도 글루타민산이 되어 버리기 때문에, 글루타민 및 피로글루타민산은 각각에 특이적인 효소를 사용하여 분해시킨 후 정량하는 방법이 바람직하게 사용된다. 또한, 펩티드가 합성물인 경우, 합성시에 있어서의 각 아미노산의 사용량이나 비율 등으로부터 조성을 구할 수 있다.
본 발명의 펩티드의 염은, 약학적 또는 식품으로서 허용할 수 있는 염이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 산 부가염 및 염기 부가염을 들 수 있다. 산 부가염으로는, 염산, 황산, 질산 및 인산 등의 무기산과의 염, 아세트산, 말산, 숙신산, 타르타르산 및 시트르산 등의 유기산과의 염을 들 수 있다. 염기 부가염으로는, 나트륨 및 칼륨 등의 알칼리 금속과의 염, 칼슘 및 마그네슘 등의 알칼리 토금속과의 염, 암모늄 및 트리에틸아민 등의 아민류와의 염을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드를 천연 단백질의 부분 가수 분해에 의해 조제하는 경우, 단백질의 가수 분해 방법으로는, 공지된 방법을 적절히 채용할 수 있다. 구체적으로는, 산을 사용하여 가수 분해하는 방법이나, 프로테아제를 사용하여 가수 분해하는 방법 등을 들 수 있다.
가수 분해에 사용되는 천연 단백질은, 입수 가능한 것이면 어떠한 단백질이어도 되지만, 안전성이 확인된 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 단 백질로서, 예를 들어 동물의 살, 가죽, 젖, 혈액 등에서 유래하는 동물성 단백질, 그리고 쌀이나 밀 등의 곡류, 및 감이나 복숭아 등의 과실류 등에서 유래하는 식물성 단백질을 들 수 있다. 이들 중에서도, 밀의 종자에 함유되는 글루텐 등의 단백질은, 글루타민이 풍부하게 함유되어 있는 것이 알려져 있어, 본 발명의 펩티드를 조제하기 위한 원료로서 바람직하다.
산을 사용하여 단백질을 가수 분해하는 방법으로는, 관용의 방법을 채용할 수 있다. 산으로는, 광산 (鑛酸) 인 황산, 염산, 질산, 인산, 아황산 등, 유기산인 옥살산, 시트르산, 아세트산, 포름산 등을 사용할 수 있다.
산을 사용하여 가수 분해하는 경우, 수성 매체 중에 있어서의 단백질 농도는, 산의 종류나 규정도에 따라 적절히 조절할 필요가 있는데, 통상적으로 1.0 ∼ 80 질량％ 로 조정하여 처리하는 것이 좋다.
프로테아제를 사용하여 단백질을 가수 분해하는 경우, 수성 매체 중, 1 종 또는 복수 종의 프로테아제를 작용시켜 가수 분해물을 생성시킬 수 있다. 산성 프로테아제를 단독으로 사용하는 방법 및 산성 프로테아제와 중성 프로테아제 또는 알칼리성 프로테아제를 사용하는 방법이 효율적으로 가수 분해할 수 있는 점에서 바람직하다. 또한, 단백질로서 식물성 단백질을 사용하는 경우, 식물에 함유되는 전분이나 섬유질이 프로테아제 작용이나 정제시의 장해가 되는 경우가 있다. 그러한 경우, 전술한 프로테아제를 작용시키기 전후 또는 프로테아제와 함께, 아밀라아제나 셀룰라아제 등의 당 분해 효소를 작용시키는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 단백질 가수 분해물을 정제하는 방법으로는, 불용물 을 여과하는 방법이나, 함수 알코올에 의해 분획 (추출) 한 후, 겔 여과 크로마토그래피나 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 정제하는 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 펩티드를 화학 합성법에 의해 조제하는 경우, 액상 합성법 및 고상 합성법 중 어느 것을 사용해도 된다. 바람직하게는, 고상 담체에 아미노산 또는 펩티드의 C 말단을, 링커를 개입시켜 고정화하고, 순차적으로 N 말단측으로 아미노산을 신장시켜 가는 고상 합성법이 바람직하다. 고상 합성법을 채용하는 경우, 펩티드 합성 장치 (예를 들어, 시마즈사 제조의 PSSM8, ABI 사 제조의 Model 433A 등) 를 사용하여 합성할 수도 있다.
고상 합성에 있어서 사용되는 고상 담체는, 본 발명의 펩티드의 C 말단 아미노산인 Gln, Aln, Leu, Ile 또는 Val 의 카르복실기와의 결합성을 갖는 것이면 어느 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들어, 벤즈히드릴아민 수지 (BHA 수지), 클로르메틸 수지, 옥시메틸 수지, 아미노메틸 수지, 메틸벤즈히드릴 수지 (MBHA 수지), 아세트아미드메틸 수지 (PAM 수지), p-알콕시벤질알코올 수지 (Wang 수지), 4-아미노메틸페녹시메틸 수지, 4-히드록시메틸페녹시메틸 수지 등을 들 수 있다.
구체적인 합성법의 일례로서, 본 발명의 펩티드인 pyroGlu-Gln-Gln 을 조제하는 경우의 순서를 이하에 나타낸다.
C 말단 아미노산인 글루타민 (Gln) 의 카르복실기를 보호한 것을 준비하고, 계속해서 아미노기를 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 기 또는 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 기 등의 보호기를 사용하여 보호하고, 카르복실기를 활성화한 2 번째 아미노산인 글루타민 (Gln) 을 축합시킨다. 이어서, 생성된 Gln-Gln 디펩티 드의 N 말단측 글루타민의 아미노기의 보호기를 제거한 후, 아미노기를 Boc (tert-부틸옥시카르보닐) 기 또는 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 기 등의 보호기를 사용하여 보호하고, 카르복실기를 활성화한 3 번째 아미노산인 글루타민 (Gln) 을 축합시킨다. 고상 합성법을 사용하는 경우에는, C 말단 아미노산의 글루타민의 카르복실기를 보호하는 대신, 고상 담체에 결합시키면 된다.
카르복실기의 활성화는, 그 카르복실기와 다양한 시약을 반응시켜, 대응하는 산 클로라이드, 산 무수물 혹은 혼합산 무수물, 아지드, 또는 -ONp 나 -OBt 등의 활성 에스테르 등을 형성시킴으로써 실시할 수 있다. 또한, 상기 펩티드 축합 반응은, 축합제나 라세미화 억제제, 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 수용성 카르보디이미드 (WSCD), 카르보디이미다졸 등의 카르보디이미드 시약, 테트라에틸피로포스페이트, 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 등의 존재하에 실시할 수도 있다.
합성 반응 종료 후, 고상 합성법의 경우에는 펩티드를 고상 담체로부터 해리시키고, 모든 보호기를 제거한 후 세정함으로써, Gln-Gln-Gln 트리펩티드를 미정제 펩티드의 상태로 얻을 수 있다. 이어서, N 말단의 글루타민을 고리화하여 피로글루타민산으로 함으로써, 본 발명의 펩티드가 얻어진다. 고리화는 수용액 중에서도 서서히 진행되지만, 온도를 상승시킴으로써 앞당길 수 있다. 또한, N 말단 아미노산으로서 피로글루타민산을 축합 반응에 제공하여 조제할 수도 있다.
액상 합성법을 사용하는 경우, C 말단의 아미노산이 고상 담체에 결합되어 있지 않을 뿐, 고상 합성법과 동일한 수단에 의해 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 펩티드를 함유하는 미정제 펩티드는, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 공지된 방법에 의해 적절히 정제하여, 순도가 높은 펩티드로서 얻을 수 있다.
상기와 같이 펩티드 화학 합성법에 있어서는, C 말단측에서 N 말단측으로 순차적으로 아미노산을 축합-신장시켜 감으로써, 목적으로 하는 아미노산 배열을 갖는 본 발명의 펩티드를 합성할 수 있다. 이 때, 각 아미노산의 L 체 또는 D 체를 사용함으로써, 어느 아미노산이 L-아미노산이고 나머지가 D-아미노산으로 이루어지는 펩티드를 합성할 수도 있다.
이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 펩티드는, 높은 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 가지므로, 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물에 있어서의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 따라서, 일 실시형태에 있어서 본 발명은, 상기 본 발명의 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물에 관한 것이다 (이하, 본 발명의 조성물이라고 호칭하는 경우가 있다). 본 발명의 조성물은, 본 발명의 펩티드를 1 종류만 함유하고 있어도 되고, 복수 종 함유하고 있어도 된다. 또한, 일 실시형태에 있어서 본 발명은, 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 간질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 질환의 예방에는, 질환의 발증을 억제하는 것 및 지연시키는 것이 포함되고, 질환에 걸리기 전의 예방뿐만 아니라, 치료 후의 질환 재발에 대한 예방도 포함된다. 본 발명에 있어서 질환의 치료에는, 질환을 치유하는 것, 증상을 개선하는 것 및 증상의 진행을 억제하는 것이 포함된다.
본 발명에 있어서 포유 동물은 온혈 척추 동물을 가리키고, 예를 들어, 인간 및 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 및 토끼 등의 설치류, 개 및 고양이 등의 애완 동물, 그리고 소, 말 및 돼지 등의 가축을 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 영장류, 특히 인간에 대한 투여에 적합하다. 간질환에 이환된 인간, 간질환으로 진단된 인간, 간질환에 이환될 가능성이 있는 인간, 간질환을 예방할 필요가 있는 인간, 그리고 GOT 값 및/또는 GPT 값이 이상인 인간, 예를 들어 정상값보다 큰 인간에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 조성물은, 통상적인 경우, 펩티드의 질량으로서 성인 1 일당 0.01 ∼ 20 g, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 g 의 범위에서 투여된다. 본 발명에서 사용되는 펩티드를 천연 단백질을 부분 가수 분해하여 조제하는 경우, 천연물에서 유래하는 안전성이 높은 것이므로, 그 투여량을 더욱 늘릴 수도 있다. 투여량은 효과 등을 보면서 적절히 증감시키는 것이 바람직하다. 1 일당의 투여량을 1 회에 투여 또는 섭취할 수도 있지만, 수 회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물의 형태는 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 의약 조성물 및 식품 (사료를 포함한다) 으로서 조제할 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약 조성물로서 조제하는 경우에는, 통상적으로 본 발명의 펩티드와 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 제제로서 조제한다. 약학적으로 허용되는 담체란, 일반적으로 유효 성분인 본 발명의 펩티드와는 반응하지 않는, 불활성의, 무독의, 고체 또는 액체의, 증량제, 희석제 또는 캡슐화 재료 등 을 말하며, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 적절한 그들의 혼합물, 식물성 오일 등의 용매 또는 분산 매체 등을 들 수 있다.
의약 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않고, 정제, 환제, 과립제, 분제, 세립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 드링크제, 액제, 좌제, 유동식 등의 경구 투여 형태, 설하정 (舌下錠), 점비 스프레이제, 주사제 등의 비경구 투여 형태 등 임의의 제형으로 할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 방법으로는, 경구 투여 외에, 의약의 투여에 일반적으로 사용되고 있는 투여 방법, 예를 들어, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 등을 들 수 있다. 또한, 직장, 설하, 비내 (鼻內) 등 소화관 이외의 점막으로부터 흡수시키는 투여 방법을 채용할 수도 있고, 이 경우, 예를 들어 좌제, 설하정, 점비 스프레이제 등의 형태로 투여할 수 있다.
의약 조성물에 있어서의 본 발명의 펩티드 함유량은, 그 형태에 따라 상이한데, 건조 질량을 기준으로 하여, 통상적으로 0.001 ∼ 99 질량％, 바람직하게는 0.01 ∼ 90 질량％, 보다 바람직하게는 1 ∼ 85 질량％, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 80 질량％ 의 범위이며, 상기 서술한 성인 1 일당의 섭취량을 달성할 수 있도록 1 일당의 투여량을 관리할 수 있는 형태로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물을 식품으로서 조제하는 경우, 그 형태는 특별히 제한되지 않는다. 식품에는 음료도 포함되고, 건강 식품 및 기능성 식품도 포함된다. 건강 식품 및 기능성 식품은, 구체적으로는, 정제, 환제, 과립제, 분제, 세립제, 산제, 캡슐제, 시럽제, 드링크제, 액제, 유동식 등의 각종 제제 형태로 할 수 있다. 제제 형태의 식품은 상기 의약 조성물과 동일하게 제조할 수 있고, 예를 들어, 적당한 부형제 (예를 들어, 전분, 가공 전분, 젖당, 포도당, 물 등) 를 첨가한 후, 관용의 수단을 사용하여 제조할 수 있다. 식품의 구체예로서, 또한 커피 음료, 차 음료, 과즙 함유 음료, 청량 음료, 유음료, 버터, 마요네즈, 쇼트닝, 마가린, 다양한 샐러드 드레싱, 빵류, 면류, 쌀밥류, 파스타, 소스류, 과자, 쿠키류, 초콜릿, 캔디, 추잉검, 각종 조미료, 각종 다이어트 제품 등을 들 수 있다. 이들 식품에 본 발명의 펩티드를 배합함으로써, 본 발명의 식품 형태의 조성물을 조제해도 된다.
본 발명의 식품에 있어서, 본 발명의 펩티드 함유량은, 식품의 형태에 따라 상이한데, 건조 질량을 기준으로 하여, 통상적으로 0.01 ∼ 80 질량％, 바람직하게는 0.1 ∼ 75 질량％, 보다 바람직하게는 1 ∼ 70 질량％, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 70 질량％ 의 범위이다. 본 발명의 펩티드는 안전성이 높은 것이므로, 그 함유량을 더욱 늘릴 수도 있다. 1 일당의 섭취량은, 1 회로 섭취해도 되지만, 수 회로 나누어 섭취해도 된다. 상기 서술한, 성인 1 일당의 섭취량을 달성할 수 있도록 관리할 수 있는 형태로 하는 것이 바람직하다.
간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 본 발명의 펩티드 혹은 그 염, 또는 이것을 함유하는 본 발명의 조성물을 섭취함으로써, 간질환의 병상 진행의 저지나, 병상의 개선 또는 간질환의 이환 방지 등의 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 조성물에는, 의약, 식품, 사료의 제조에 사용되는 다양한 첨가제 를 배합할 수 있고, 또한 다양한 활성 물질과 공존시켜도 된다. 이와 같은 첨가제 및 활성 물질로는, 각종 유지, 생약, 아미노산, 다가 알코올, 천연 고분자, 비타민, 미네랄, 식물 섬유, 계면 활성제, 정제수, 부형제, 안정제, pH 조정제, 산화 방지제, 감미료, 정미 (呈味) 성분, 산미료, 착색료 및 향료 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는, 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 그 밖의 유효 성분의 1 종 또는 복수 종과 혼합 또는 조합하여 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 간질환의 예방 및/또는 치료용 조성물은, 본 발명의 펩티드에 추가하여, 간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 그 밖의 유효 성분을 함유하고 있어도 된다.
상기 각종 유지로는, 예를 들어, 대두유, 썬플라워유, 올리브유 등의 식물 유지, 우지 (牛脂), 정어리유 등의 동물 유지를 들 수 있다.
상기 생약으로는, 예를 들어, 우황, 지황, 구기자, 로열 젤리, 인삼, 녹용 등을 들 수 있다.
상기 아미노산으로는, 예를 들어, 시스테인, 류신, 아르기닌 등을 들 수 있다.
상기 다가 알코올로는, 예를 들어, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 당 알코올 등을 들 수 있다. 당 알코올로서, 예를 들어 소르비톨, 에리트리톨, 자일리톨, 말티톨, 만니톨 등을 들 수 있다.
상기 천연 고분자로는, 예를 들어, 아라비아검, 한천, 수용성 콘 화이버, 젤라틴, 잔탄검, 카세인, 글루텐 또는 글루텐 가수 분해물, 레시틴, 덱스트린 등을 들 수 있다.
상기 각종 비타민으로는, 예를 들어, 비타민 C (아스코르브산), 비타민 B 군, 비타민 E (토코페롤) 외에, 비타민 A, D, K, 부티르산리보플라빈 등이 포함된다. 또한, 비타민 B 군에는, 비타민 B1, 비타민 B1 유도체, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 B12, 또한 비오틴, 판토텐산, 니코틴산, 엽산 등의 각종 비타민 B 복합체가 포함된다. 비타민 B1 및 그 유도체에는, 티아민 또는 그 염, 티아민디술파이드, 푸르설티아민 또는 그 염, 디세티아민, 비스부티티아민, 비스벤티아민, 벤포티아민, 티아민모노포스페이트디술파이드, 시코티아민, 옥토티아민, 프로설티아민 등의 비타민 B1 의 생리 활성을 갖는 모든 화합물이 포함된다.
상기 미네랄로는, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 아연, 철 등을 들 수 있다.
상기 식물 섬유로는, 검류, 만난, 펙틴, 헤미셀룰로오스, 리그닌, β-글루칸, 자일란, 아라비녹실란 등을 들 수 있다.
상기 계면 활성제로는, 예를 들어, 글리세린 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르 등을 들 수 있다.
상기 부형제로는, 예를 들어, 백당, 포도당, 콘 스타치, 인산칼슘, 젖당, 덱스트린, 전분, 결정 셀룰로오스, 사이클로덱스트린 등을 들 수 있다.
간질환의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 그 밖의 유효 성분으로는, 상기 의약품 외에, 이소플라본, 히알루론산, 발린, 글루타민, 엽산, 가막조개, 사과, 미꾸라지, 배 등을 들 수 있다.
상기 이외에, 예를 들어, 타우린, 글루타티온, 카르니틴, 크레아틴, 코엔자 임 Q,
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-리포산, 글루쿠론산, 글루쿠로노락톤, 테아닌, γ-아미노부티르산, 캡사이신, 각종 유기산, 플라보노이드류, 폴리페놀류, 카테킨류, 크산틴 유도체, 프락토올리고당 등의 난소화성 올리고당, 폴리비닐피롤리돈 등을 첨가제로서 배합해도 된다. 이들 첨가제의 배합량은, 첨가제의 종류와 원하는 섭취량에 따라 적절히 결정할 수 있는데, 일반적으로는 0.01 ∼ 30 질량％ 의 범위이고, 바람직하게는 0.1 ∼ 10 질량％ 의 범위이다.
하기 실시예에 의해 본 발명의 펩티드 및 조성물의 제조예 및 시험예를 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다.
실시예
(제조예 1) pyroGlu-Gln-Gln 의 합성
ABI 사 제조의 Model 433A 펩티드 합성 장치를 사용하여, 고상법으로 합성하였다.
Boc-Gln-Pam 수지 2 g 을 출발 원료로 하고, Boc-Gln, Boc-Glu(OBzl) 의 각 보호 아미노산을 사용하고, 이하의 순서로 자동 합성을 실시하였다.
(1) Boc-Gln-Pam 수지의 Boc 기의 제거 반응
(2) 세정
(3) Boc-Gln 의 활성화
(4) Gln-Pam 수지에 활성화 Boc-Gln 을 첨가하여 축합 반응
(5) 세정
(6) 미반응 N 말단 아미노기의 아세틸화 반응
(7) 세정
(8) Boc-Gln-Gln-Pam 수지의 Boc 기의 제거 반응
(9) 세정
(10) Boc-Glu(OBzl) 의 활성화
(11) Gln-Gln-Pam 수지에 활성화 Boc-Glu(OBzl) 을 첨가하여 축합 반응
(12) 세정
(13) 미반응 N 말단 아미노기의 아세틸화 반응
(14) 세정
(15) Boc-Glu(OBzl)-Gln-Gln-Pam 수지.
또한, Boc 기의 제거 반응은 트리플루오로아세트산-디클로로메탄 (50 : 50) 으로 20 분간 처리함으로써 실시하였다. 세정 공정은 전부 디클로로메탄을 사용하고, 3 회 실시하였다. 축합 반응은, Boc 보호 아미노산을 DCC, HOBt 의 존재하에서, 수지 결합 아미노기의 5 배 등량을 첨가하여 60 분간 반응시킴으로써 실시하였다.
얻어진 Boc-Glu(OBzl)-Gln-Gln-Pam 수지를 펩티드 합성 장치로부터 꺼내 다른 용기로 옮기고, 수지 1 g 당 티오아니솔 1 ㎖, 에탄디티올 0.5 ㎖ 를 첨가하고 실온에서 10 분간 교반하였다. 다음으로 빙랭하에서 불화수소 10 ㎖ 를 천천히 첨가하고, 30 분간 교반한 후, 불화수소를 감압 증류 제거하였다. 냉 (冷) 디에틸에테르 100 ㎖ 로 용기를 채우고, 1 분간 교반하여 펩티드 및 수지를 석출시켰다. 이것을 폴리프론 필터 PF060 (어드밴텍 제조) 으로 여과 채취하고, 차가운 디에틸에테르 (-40 ℃) 로 세정하였다. 미리 준비한 차가운 디에틸에테르 300 ㎖ 에 펩티드를 트리플루오로아세트산 약 30 ㎖ 로 용해시켜 적하하고, 다시 석출시켰다. 이것을 3 ㎛ 구멍 PTFE 막 (어드밴텍 제조) 으로 여과 채취하고 차가운 디에틸에테르 (-40 ℃) 로 세정하고, 펩티드를 2 규정 아세트산에 용해시킨 후, 동결 건조시켰다. 보호 펩티드-Pam-수지 2.35 g 으로부터 미정제 펩티드 1.21 g 을 얻었다. 미정제 펩티드를 물에 용해시키고, 60 ℃ 에서 6 시간 피로글루타민산으로의 고리화 반응을 실시하고, 동결 건조시켰다.
얻어진 미정제 펩티드를 하기 조건의 HPLC 로 정제하였다.
칼럼 : Inertsil ODS-3 φ20 × 250 ㎜ (GL 사이언스 제조)
이동상 : 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 → 0.1 ％ 트리플루오로아세트산 중 35 ％ 아세토니트릴의 농도 구배
유속 : 10 ㎖/분
검출기 : 자외 분광 광도계 210 ㎚
온도 : 40 ℃
HPLC 크로마토그램의 메인 피크를 분리 채취하고, 펩티드 시퀀서를 사용하여 분리 채취물의 아미노산 배열을 해석하였다. 1 g 의 미정제 펩티드로부터 0.88 g 의 pyroGlu-Gln-Gln 정제 펩티드를 얻었다.
(제조예 2) pyroGlu-Leu 의 합성
Boc 메소드를 사용하여 액상법에 의해 합성하였다.
(1) Boc-pyroGlu 와 HCl Leu-OtBu 의 축합 반응
나스형 플라스크에 HCl Leu-OtBu (390 ㎎) 를 넣고 DMF 5 ㎖ 에 용해시킨 후, 빙랭시키고 트리에틸아민 0.124 ㎖ 를 첨가하였다. 이어서 Boc-pyroGlu-OH (400 ㎎), HOBt (470 ㎎), WSCD HCl (367 ㎎) 을 첨가하고, 빙랭하에서 12 시간 교반하여 축합 반응시켰다. 반응 종료 후, 감압하여 DMF 를 증류 제거하고, 잔류물을 아세트산에틸에 용해시킨 후, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액, 10 ％ 시트르산 수용액, 물, 포화 식염수의 순서로 아세트산에틸을 세정한 후, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축시켜 얻어진 잔류물에 에테르-헥산을 첨가하여 Boc-pyroGlu-Leu-OtBu 를 고화시키고, 채취하였다. 수량 (收量) 은 609 ㎎, 수율 88 ％ 였다.
(2) 탈보호
상기에서 얻어진 Boc-pyroGlu-Leu-OtBu (600 ㎎) 를 나스형 플라스크에 넣고, 트리플루오로아세트산 5 ㎖ 를 첨가하여 용해시키고, 1 시간 빙랭하에서 탈보호 반응시켰다. 트리플루오로아세트산은 N2 가스로 제거하고, 탈보호 펩티드를 에테르를 첨가하여 고화시킨 후, 여과 채취하였다. 얻어진 고체를 4N HCl/디옥산에 용해시키고, 에테르를 첨가하여 다시 고화시키고 여과 채취하였다. 수량 220 ㎎, 수율 53 ％ 였다.
(제조예 3) pyroGlu-Ile 의 합성
제조예 2 와 동일한 방법으로 HCl H-Ile-OtBu 390 ㎎ 을 출발 원료로 하여 합성하였다. 축합 반응의 수량은 613 ㎎, 수율 88 ％ 이고, 탈보호 펩티드는 수량 260 ㎎, 수율 67 ％ 였다.
(제조예 4) pyroGlu-Gln-Gln 의 합성
Fmoc 메소드를 사용하여 액상법에 의해 합성하였다.
(1) Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu 의 합성
나스형 플라스크에 HCl H-Gln-OtBu (1.15 g) 를 넣고 DMF 5 ㎖ 에 용해시킨 후, 빙랭시키고 트리에틸아민 0.74 ㎖ 를 첨가하였다. 이어서 Fmoc-Gln(Trt)-OH (2.94 g), HOBt (1.3 g), WSCD HCl (1.01 g) 을 첨가하고, 빙랭하에서 12 시간 교반하여 축합 반응시켰다. 반응 종료 후, 감압하여 DMF 를 증류 제거하고, 잔류물을 아세트산에틸에 용해시킨 후, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액, 10 ％ 시트르산 수용액, 물, 포화 식염수의 순서로 아세트산에틸을 세정한 후, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축시켜 얻어진 잔류물에 에테르-헥산을 첨가하여 Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu 고화시키고, 채취하였다. 수량 3.51 g, 수율 92 ％ 였다.
(2) Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu 의 탈 Fmoc 기
나스형 플라스크에 Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu (1.12 g) 를 넣고, 1M NaOH 수용 액 7 ㎖ 를 빙랭하에서 첨가하였다. 백탁이 발생하였으므로 메탄올을 첨가하여 용해시키고, 0 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 시트르산을 첨가하여 중화시킨 후, 감압 농축시켜 얻어진 백색 고체에 물을 첨가하고 교반하여, 검 형상의 고형물을 얻었다. 이것을, 클로로포름을 용매로 하여 실리카 겔 칼럼에 가하고, 목적으로 하는 성분을 분리 채취하고, 에테르로 고화시켰다. 수량은 590 ㎎, 수율 73 ％ 였다.
(3) Boc-pyroGlu-Gln(Trt)-Gln-OtBu 의 합성
나스형 플라스크에 H-Gln(Trt)-Gln-OtBu (580 ㎎) 를 넣고 DMF 5 ㎖ 에 용해시킨 후, 빙랭시키고 트리에틸아민 156 ㎕ 를 첨가하였다. 이어서 Boc-pyroGlu-OH (232 ㎎), HOBt (273 ㎎), WSCD HCl (213 ㎎) 을 첨가하고, 빙랭하에서 12 시간 교반하여 축합 반응시켰다. 감압하여 DMF 를 증류 제거하고, 잔류물을 아세트산에틸에 용해시킨 후, 5 ％ 탄산수소나트륨 수용액, 10 ％ 시트르산 수용액, 물, 포화 식염수의 순서로 아세트산에틸을 세정한 후, 무수 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 황산나트륨을 여과 분리하고, 여과액을 감압 농축시켜 얻어진 잔류물을 다시 진공 펌프로 감압하여 용매를 제거하였다. 수량 509.3 ㎎, 수율 64 ％ 였다.
(4) 탈보호
Boc-pyroGlu-Gln(Trt)-Gln-OtBu (760 ㎎) 를 나스형 플라스크에 넣고, 트리플루오로아세트산 10 ㎖ 를 첨가하여 용해시키고, 4 시간 빙랭하에서 반응시켰다. 트리플루오로아세트산은 N2 가스로 제거하고, 에테르를 첨가하여 탈보호 펩티드를 고화시켰다. 원심 분리에 의해 고체를 채취하고, 다시 에테르를 첨가하여 현탁시키고 원심 분리로 고체를 채취하였다. 이 조작을 3 회 반복하여 미정제 펩티드를 얻었다. 수량 445 ㎎, 수율 100 ％ 였다.
(5) pyroGlu-Gln-Gln 의 정제
상기에서 얻어진 미정제 펩티드에는 물에 불용성인 불순물이 함유되어 있었으므로, 미정제 펩티드를 물에 현탁시키고, 필터를 통과시켜 여과액을 모았다. 여과액에 1M 염산 2 ㎖ 를 넣고 동결 건조시켰다. 동결 건조물에 에테르를 첨가하여 본 발명의 펩티드를 고화시키고, 고체를 채취하여 건조시켰다. 최종 수량 256 ㎎, 수율 63 ％ 였다.
(제조예 5) 천연 단백질로부터의 pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Gln, pyroGlu-Leu, pyroGlu-Ile 의 추출
(1) 반응 가마에 이온 교환수 9,700 ㎏, 무수 시트르산 38 ㎏ 및 밀 글루텐 (활성 글루텐, Weston Foods Limited 제조) 1,500 ㎏ 을 투입하고, 45 ℃ 로 가온한 후, 프로테아제 (아마노 제약 주식회사 제조 「프로테아제 M 아마노」) 2.2 ㎏ 및 아밀라아제 (한큐 바이오 인더스트리 주식회사 제조 「액화 효소 T」) 1.1 ㎏ 을 첨가하고, 45 ℃ 에서 5 시간 가수 분해 반응을 실시하고, 이어서 25 ％ 수산화나트륨 수용액을 사용하여 액의 pH 를 4.4 ∼ 4.5 로 조정하고 7 시간 유지하여 효소 처리를 실시하였다.
(2) 이어서, 액을 80 ℃ 로 20 분간 유지하여 프로테아제를 실활시킨 후, 65 ℃ 로 냉각시키고, 거기에 아밀라아제 (한큐 바이오 인더스트리 주식회사 제조 「액화 효소 T」) 0.5 ㎏ 을 첨가하여 밀 글루텐 중에 함유되어 있던 전분질 및 섬유질을 가수 분해시킨 후, 액을 90 ℃ 로 20 분간 유지하여 아밀라아제를 실활시켰다.
(3) 다음으로, 액을 10 ℃ 이하로 냉각시킨 후, 다시 55 ℃ 로 가열하고, 거기에 활성탄 (타케다 약품 공업 주식회사 제조 「타케콜」) 100 ㎏ 을 첨가하고 55 ℃ 에서 30 분간 교반하였다.
(4) 액온을 45 ℃ 로 하고, 농과 (濃過) 보조제 (쇼와 화학 공업 주식회사 제조 「라디오 라이트」) 를 첨가하고, 가압 여과 장치를 사용하여 여과를 실시하여, 여과액 7,000 리터 (7 ㎥) 를 회수하였다.
(5) 상기 (4) 에서 회수한 여과액을 감압하에서 농축시킨 후, 플레이트 히터를 사용하여 110 ℃ 에서 20 초간 가열하여 살균하고, 이어서 55 ℃ 까지 냉각시켰다.
(6) 상기 (5) 에서 얻어진 액을, 분무 건조 장치를 사용하여 송풍 온도 160 ℃, 배풍 온도 80 ℃ 의 조건하에 분무 건조시켜, 밀 글루텐의 가수 분해물 분말 약 1,000 ㎏ 을 얻었다.
(7) 상기 (6) 에서 얻어진 분말로부터 겔 여과법을 사용하여 분자량 1000 이하의 획분을 분리 채취하고, 추가로 HPLC 를 사용하여 정제를 실시하였다. HPLC 에서는 제조예 1 과 동일한 방법으로 얻어진 pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Gln, pyroGlu-Leu, pyroGlu-Ile 합성품을 기준으로, 동일한 조건에서 동일한 리텐션 타임의 부분을 채취하였다. 그 결과, 800 ㎏ 의 밀 글루텐의 가수 분해물 분말로부터 각각 4.5 ㎏, 1.6 ㎏, 0.9 ㎏, 0.7 ㎏ 의 펩티드가 얻어졌다.
(8) 펩티드 시퀀서를 사용하여 정제한 펩티드의 아미노산 배열을 해석한 결과, 각각 pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Gln, pyroGlu-Leu, pyroGlu-Ile 의 배열을 갖고 있었다.
(실시예 1) 정제의 제조
제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Gln 펩티드 84 g, 결정 셀룰로오스 (아사히 화성 주식회사 제조) 10 g 및 폴리비닐피롤리돈 (BASF 사 제조) 5 g 을 혼합하고, 이것에 에탄올 3 ㎖ 를 첨가하고, 습식법에 의해 통상적인 방법에 따라 유 (類) 입자를 제조하였다. 그것에 의해 얻어진 유 입자를 건조시킨 후, 스테아르산마그네슘 1.1 g 을 첨가하여 타정용 과립 분말로 하고, 타정기를 사용하여 타정하여, 1 정이 1 g 인 정제 100 개를 제조하였다 (정제 1 정당의 pyroGlu-Gln 함유량 0.84 g).
(실시예 2) 시럽제의 제조
정제수 400 g 을 자비 (煮沸) 하고, 이것에 백당 750 g 및 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Leu 펩티드 100 g 을 뒤섞으면서 첨가하여 용해시키고, 뜨거울 때에 천에 넣고 짜서 여과하고, 이것에 정제수를 첨가하여 전체량을 1000 ㎖ 로 하여 시럽제를 제조하였다 (시럽제 100 ㎖ 당의 pyroGlu-Leu 함유량 10 g).
(실시예 3) 과립제의 제조
제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Ile 펩티드 76 g, 젖당 (DMV 사 제조) 13.3 g, 결정 셀룰로오스 (아사히 화성 주식회사 제조) 6.7 g 및 폴리비닐피롤리돈 (BASF 사 제조) 4 g 을 혼합하고, 이것에 에탄올 30 ㎖ 를 첨가하고, 습식법에 의해 통상적인 방법에 따라 과립을 제조하고, 건조시킨 후, 정립 (整粒) 하여 과립제를 얻었다 (과립제 10 g 당의 pyroGlu-Ile 함유량 7.6 g).
(실시예 4) 유동식의 제조
약 65 ℃ 의 순수 750 ㎖ 에 카세인 나트륨 (DMV 사 제조) 40 g, 말토덱스트린 (산와 전분사 제조) 160 g 및 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Ile 펩티드 25 g 을 첨가하여 용해시키고, 이어서 비타민 믹스 5 g, 그리고 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 염소, 철, 인, 구리, 아연, 망간 및 황의 미네랄 혼합액 5 g 을 첨가하였다. 혼합액을 호모 믹서 (토쿠슈 기화 공업 제조) 에 투입하고, 약 8000 rpm 으로 15 분간 조 (粗) 유화시켰다. 얻어진 유화액을 약 20 ℃ 로 냉각시키고, 향료를 첨가한 후, 1000 ㎖ 로 최종 메스업을 실시하였다. 이 액 230 g 을 파우치에 충전한 후, 질소 치환을 실시하면서 파우치를 밀봉하고, 121 ℃ 에서 15 분간 살균을 실시하여 농후 유동식을 얻었다 (유동식 230 g 당의 pyroGlu-Ile 함유량은 약 5.8 g).
(실시예 5) 빵의 제조
소맥분 (강력분) 150 g 과 드라이 이스트 2 g 을 혼합하였다. 그 외에, 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Gln-Gln 펩티드 20 g, 설탕 20 g, 식염 3 g, 탈지 분유 6 g 을 온탕 70 g 에 용해시키고, 계란 1 개를 첨가하여 잘 혼합하였다. 이것을 소맥분에 첨가하고, 손으로 잘 반죽한 후, 버터 약 40 g 을 첨가하고 다시 반죽하여, 20 개의 롤 빵 생지를 제조하였다. 이어서, 발효시킨 후, 표면에 푼 계란을 바르고, 오븐에서 180 ℃ 에서 약 15 분 구워, 롤 빵을 제조하였다 (이 롤 빵은, 1 개당 pyroGlu-Gln-Gln 을 약 1 g 함유하고 있었다).
(실시예 6) 파스타용 미트 소스의 제조
파스타용 미트 소스 1 인분 (150 g) 을 냄비에 넣고, 동시에 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Gln-Gln 펩티드 5 g 을 첨가하고 가온하여, 파스타용 미트 소스를 조제하였다. 이 소스를 파우치에 충전한 후, 질소 치환을 실시하면서 파우치를 밀봉하고, 121 ℃ 에서 15 분간 살균을 실시하여 pyroGlu-Gln-Gln 펩티드를 함유하는 파스타용 미트 소스를 얻었다.
(실시예 7) 우동의 제조
소맥분 (중력분) 300 g 에 대하여, 물 150 g 에 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Gln 펩티드 15 g 및 식염 15 g 을 분산시킨 것을 첨가하여 잘 혼합하고 반죽하고 묵힌다. 그 후, 생지를 연신하고, 폭 약 5 ㎜ 로 절단하여 우동을 제조하였다. 이것을 비등한 끓인 물에서 약 10 분 삶은 결과, 외관, 맛, 식감 모두 양호하였다. 이 우동은, 1 식사분당 pyroGlu-Gln 펩티드를 약 5 g 함유하고 있었다.
(시험예 1) 간질환에 대한 효과 (간 장해 모델 래트를 사용한 투여 시험)
(1) 시험 방법
4 ~ 5 주령의 Wistar 계 래트를 실험에 사용하였다. 각 래트를 정제 표 준 사료로 1 주일 예비 사육한 후, 4 시간 절식 (絶食) 시키고, 제조예 2 에서 얻어진 pyroGlu-Leu, 제조예 3 에서 얻어진 pyroGlu-Ile 를 각각 10 ㎎/1 ㎖ 의 비율로 물에 용해시키고, 20 ㎎/㎏ 의 투여량으로 각각 복강 내 투여하였다. 1 시간 후에 D-갈락토사민 (시그마) 을 800 ㎎/㎏ 의 투여량으로 복강 내 투여하였다. D-갈락토사민 투여 4 시간 후부터는 자유 섭식으로 하였다. 1 군의 동물 수는 5 마리로 하고, 대조군에는 본 발명의 펩티드 대신에 물을 투여하였다.
D-갈락토사민 투여 24 시간 후에 래트로부터 채혈하여, 혈액 중의 GOT 및 GPT 를 측정함으로써, 간 장해 정도를 비교하였다.
GOT, GPT 는 JSCC 표준화 대응법 (미우라 유타카, 일본 임상, 53-증-266, 1995) 에 의해 각각 측정하였다. 분석한 결과를 표 1 에 나타낸다.
GOT (IU/L) GPT (IU/L)
물 391 50
pyroGlu-Leu 215 30
pyroGlu-Ile 314 45
표 1 의 결과로부터, 본 발명의 펩티드가 강력한 GOT 및 GPT 의 증가 억제 작용을 나타내어, 간 장해, 즉 간질환을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.
(시험예 2) 간질환에 대한 효과 (간 장해 모델 래트를 사용한 투여 시험)
(1) 시험 방법
시험예 1 과 동일하게 하여 시험을 실시하였다. 래트에는, 제조예 5 에서 얻어진 pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Gln, pyroGlu-Leu 또는 pyroGlu-Ile 를 10 ㎎/1 ㎖ 의 비율로 물에 용해시키고, 40 ㎎/㎏ 의 투여량으로 각각 경구 투여하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.
GOT (IU/L) GPT (IU/L)
물 2180 391
pyroGlu-Gln-Gln 524 100
pyroGlu-Gln 509 124
pyroGlu-Leu 555 131
pyroGlu-Ile 491 98
표 2 의 결과로부터, 본 발명의 펩티드가 강력한 GOT 및 GPT 의 증가 억제 작용을 나타내어, 간 장해, 즉 간질환을 억제하는 작용을 갖는 것을 알 수 있었다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.

Claims (7)

  1. pyroGlu-Gln, pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Leu 및 pyroGlu-Ile 로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 그 염의 적어도 1 종을 유효 성분으로서 함유하는 간질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    간질환이 바이러스 간염, 알코올성 간질환 또는 약제성 간질환인 약학 조성물.
  3. pyroGlu-Gln, pyroGlu-Gln-Gln, pyroGlu-Leu 및 pyroGlu-Ile 로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드 또는 그 염의 적어도 1 종을 유효 성분으로서 함유하는 간질환의 예방 및/또는 개선용 식품 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    간질환이 바이러스 간염, 알코올성 간질환 또는 약제성 간질환인 식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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