CN101687909B - 预防或治疗肝脏疾病的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了对肝脏疾病具有预防和/或治疗效果的组合物，其是高度有效的，无副作用，容易摄取，从成本和安全角度考虑，能够长期摄入。本发明涉及具有下列式所代表的氨基酸序列的肽：pyroGlu-(X)n-A，其中X相同或不同，并且代表Gln或Asn；A代表Gln、Asn、Leu、Ile或Val；n是0至2的整数，或其盐。

Description

预防或治疗肝脏疾病的组合物
技术领域
本发明涉及对肝脏疾病具有预防和/或治疗活性的肽，和包含肽的预防和/或治疗肝脏疾病的组合物。
背景技术
肝脏疾病，例如急性肝炎、慢性肝炎、酒精性肝损伤和脂肪肝，是全社会所关注的严重问题。当症状恶化和肝硬化形成时，尤其引起食管静脉曲张、肝原性脑病等等，并且对患有这种疾病的患者的病状预断是非常差的。进一步的，肾病或糖尿病可以以并发症形式形成，并且人们期待这种疾病的预防或治疗方法。人们发现这些肝脏疾病是由各种原因引起的。其实例包括：由肝炎病毒感染引起的甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，丁型肝炎，戊型肝炎，己型肝炎，庚型肝炎和TT型肝炎；由过度消耗洒精所引起的酒精脂肪肝或肝硬化；由药物摄入所引起的药物引起的肝炎；和由免疫性疾病所引起的自身免疫性肝炎。
药学产品，例如甘草甜素制剂、拉夫米定、多烯磷脂酰胆碱、马洛替酯、肝乐、硫普罗宁(tiopronin)、原卟啉钠、维生素U(methylmethioninesulfonium chloride)、干扰素、熊去氧胆酸、小柴胡汤(Sho-saiko-to)、肝脏水解物和谷胱甘肽，用于治疗这种肝脏疾病。这些药物具有快速改善肝脏疾病的效果，然而，它们较弱，并且借助于这种药物的治疗常常很耗时。即使当肝脏疾病可以在某种程度上得到快速改善时，改善之后的GOT、GPT和γ-GTP水平常常处于正常水平的上限。当药物对肝脏疾病具有治疗效果时，进一步的，会出现不利地不良反应。
由于肝在身体内代谢营养素例如蛋白，所以已经尝试借助于氨基酸或肽来进行肝脏疾病的治疗。例如，JP专利公开(kokai)No.H11-171763A(1999)公开了治疗肝脏疾病的组合物，其包含作为活性组分的氨基酸缬氨酸，并且除了作为活性组分的缬氨酸之外，不包含其它氨基酸。然而，氨基酸具有特殊强烈的味道，由此难以持续地摄取它们。
WO 2002-072131公开了用于肝脏疾病的药物，其包含作为活性组分的肽(包含四个氨基酸，即亮氨酸，丝氨酸，赖氨酸和亮氨酸)。然而，仅仅通过腹腔内给药证实了这种肽的效果，并且不知道这种肽通过口服是否会显现其效果。
由此，期待开发出肝脏疾病的预防或治疗药物和食品，要求其具有良好味道、用常规方法容易摄取、通过口服对肝脏疾病显现出出色的治疗效果和具有高度安全性。
本发明的公开内容
本发明的目的是提供对肝脏疾病具有预防和/或治疗效果的组合物，其是高度有效的，无副作用，容易摄取，并且从成本和安全角度考虑，能够长期摄入。
为了寻找到具有改善肝脏疾病的令人满意疗效的物质，本发明人进行了专心研究。结果，他们发现，用某一顺序给予肽，可以在短时期内改善肝脏疾病患者的GOT水平和GPT水平，导致正常水平或与其接近的值，并且肝脏疾病能因此得到改善。
具体地说，本发明包括下列发明。
(1)由下式代表的氨基酸序列组成的肽：
pyroGlu-(X)n-A
其中X相同或不同，并且代表Gln或Asn；A代表Gln、Asn、Leu、Ile或Val；和n是0至2的整数，或其盐。
(2)按照(1)的肽或其盐，其中X代表Gln；A代表Gln、Leu或Ile；n是0或1。
(3)肝脏疾病的预防和/或治疗组合物，其中包含按照(1)或(2)的至少一种肽或其盐作为活性组分。
(4)按照(3)的组合物，其中肝脏疾病是病毒性肝炎、酒精性肝脏疾病或药物引起的肝脏疾病。
(5)按照(3)或(4)的组合物，其是食品形式。
本发明可以提供对肝脏疾病具有预防和/或治疗活性的肽，就它的高度安全性和容易摄入性而言，其优于使用常规药学产品的治疗，本发明还提供了预防和/或治疗肝脏疾病的组合物。
本说明书包括日本专利申请No.2007-77594的权利要求和说明书中公开的部分或所有内容，其是本申请的优先权文件。
实施本发明的最佳方式
下文，详细描述本发明的优选实施方案。在本发明中，术语“肝脏疾病”是指肝功能不全的症状。肝脏疾病的例子包括炎症性肝脏疾病例如病毒性肝炎、酒精性肝炎和药物引起的肝炎，脂肪肝和肝硬化。即使当疾病名称未经确认时，肝功能指标的异常症状，例如GOT、GPT和γ-GTP，在肝脏疾病的范围之内。可以通过试验肝功能来评价肝脏疾病的预防和/或治疗活性；即，试验如上所述的肝功能的指标。例如，可以通过试验肝细胞破坏时释放和富集在血液中的GOT和GPT的水平来评价这种活性；即肝脏疾病的血清指标。更具体地说，可以给予动物活性组分，这种动物已经通过D-氨基半乳糖而形成了肝脏疾病，然后可以试验抑制肝脏疾病的活性。
谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)大量存在于器官或组织例如心肌、肝、骨骼肌和肾的细胞中，并且GOT是将氨基转化形成氨基酸的酶。在正常情况下，因为GOT是在构成人体的细胞中不断产生和分解的酶，一定量的GOT始终包含在健康个体的血液中。然而，当在上述器官中出现异常时，大量GOT释放到血液中。由此，人们认为，当诊断在器官或身体组织中的疾病发生时，血液中的GOT含量(即GOT水平)是重要的指标。当人患有肝脏疾病并且肝细胞受到破坏时，GOT的释放数量超出正常水平。由此，其试验能够推断出肝脏疾病的类型、严重程度，等等。在人中，正常GOT水平通常是11至40IU/l。
与GOT一样，谷丙转氨酶(GPT)是参与氨基酸形成的酶，并且具体地大量存在于肝细胞中。GPT也存在于肾中，其数量大约是其在肝中的数量的三分之一，并且其存在于其它器官中的数量很小。一定量的GPT始终包含在健康个体的血液中。由于血液中的GPT含量(即GPT水平)可增加对肝脏病症例如肝细胞的变性或坏疽的响应，因此人们认为其是确诊肝脏疾病时的重要指标。当人患有肝脏疾病并且肝细胞受到破坏时，GPT的释放数量超出正常水平。由此，其试验能够推断出肝脏疾病的类型、严重程度，等等。在人中，正常GPT水平通常是6至43IU/l。
本发明人发现，由式pyroGlu-(X)n-A所代表的氨基酸序列组成的肽或其盐(下文中，这种肽往往称为“本发明的肽”)具有预防和/或治疗肝脏疾病的活性。本文中，pyroGlu代表焦谷氨酸；X可以相同或不同，并且代表Gln(谷氨酰胺)或Asn(天冬酰胺)，优选Gln；A代表Gln、Asn、Leu(亮氨酸)、Ile(异亮氨酸)或Val(缬氨酸)，优选Gln、Leu或Ile；n是0、1或2，优选0或1。上式代表的肽的例子包括pyroGlu-Gln，pyroGlu-Gln-Gln，pyroGlu-Leu，pyroGlu-Ile，pyroGlu-Gln-Leu，pyroGlu-Gln-Ile，pyroGlu-Gln-Gln-Gln，pyroGlu-Gln-Gln-Leu和pyroglu-Gln-Gln-Ile。
焦谷氨酸由谷氨酸的γ-位的酰胺基和α-位的氨基的闭环而产生。本发明的肽可以是天然存在的蛋白或重组蛋白的部分水解物、通过化学合成或遗传工程制备的肽、或其组合。
对于构成本发明的肽的氨基酸，可以使用D型、L型或DL型(即外消旋形式)氨基酸，L型氨基酸是尤其优选的。当通过天然存在的蛋白的部分水解来制备本发明的肽时，所有的组成氨基酸是L型。当通过化学合成来制备本发明的肽时，可以制备完全由L-氨基酸或D-氨基酸组成的肽，或制备包含L-氨基酸、其余由D-氨基酸组成的肽，两种类型的肽在本发明的肽的范围之内。
本发明的肽的组合物可以通过氨基酸分析来确定。在这种情况下，认为焦谷氨酸和谷氨酰胺都是通过常规酸水解方法确定的谷胺酸。由此，优选谷氨酰胺和焦谷氨酸借助于具体酶来独立地降解，而后定量。当肽是合成产物时，可以基于合成时所使用氨基酸的数量或百分数来确定组成。
对本发明的肽的盐没有特别限制，条件是，它是药物或食品可接受的形式。其实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐的例子包括：与无机酸成的盐，例如盐酸、硫酸、硝酸和磷酸；和与有机酸成的盐，例如乙酸、苹果酸、琥珀酸、酒石酸和枸橼酸。碱加成盐的例子包括：与碱金属成的盐，例如钠和钾；与碱土金属成的盐，例如钙和镁；和与胺成的盐，例如铵和三乙胺。
当通过天然存在的蛋白的部分水解来制备本发明的肽时，可以适当地进行常规蛋白水解方法。具体实例包括：使用酸的水解方法，和使用蛋白酶的水解方法。
可以使用任何可获得的天然存在的蛋白进行水解，并且优选使用具有确定安全性的蛋白。这种蛋白的例子包括：衍生自动物肌肉、皮肤、乳液和血液的动物蛋白，和衍生自粮食作物例如稻谷和小麦和果实例如柿子和桃子的植物蛋白。其中，已知蛋白例如包含在小麦种子中的谷蛋白含有大量的谷氨酰胺，并且优选这种蛋白作为制备本发明肽的起始原料。
可以使用涉及使用酸的蛋白水解的常规方法。可以使用的酸的例子包括：无机酸，例如硫酸、盐酸、硝酸、磷酸和亚硫酸；和有机酸，例如草酸、枸橼酸、乙酸和甲酸。
当使用酸来水解蛋白时，需要按照酸类型或当量浓度来充分地调节水介质中的蛋白浓度。通常，优选将蛋白浓度调节至1.0％至80％(按照质量计算)。
当使用蛋白酶来水解蛋白时，可以使一或多种类型的蛋白酶作用于水介质中的蛋白，以便产生水解物。从有效水解的观点来看，优选，涉及唯一使用酸性蛋白酶的方法，和涉及使用酸性蛋白酶和中性蛋白酶或碱性蛋白酶的方法。当使用植物蛋白时，植物中的淀粉或纤维含量往往干扰蛋白酶的作用或纯化。在这种情况下，优选，在用蛋白酶处理前后，或与蛋白酶一起，使糖解酶例如淀粉酶或纤维素酶作用于蛋白。
可以将由此获得的蛋白水解物通过下列方法纯化，例如利用过滤不溶物质的方法，和一种提纯方法，其包括借助于醇水溶液的分馏(提取)，而后利用凝胶过滤色谱或高效液相色谱(HPLC)。
当通过化学合成来制备本发明的肽时，可以使用液相合成或固相合成方法。优选，进行固相合成时，其中氨基酸或肽的C端通过连接基固定在固相载体上，并且氨基酸朝着N端的方向连续地延长。当进行固相合成时，可以使用肽合成仪(例如，PSSM-8，Shimadzu，和Model 433A，ABI)。
对于固相合成，可以使用任何固相载体，条件是，这种载体能够与本发明肽的C端氨基酸的羧基结合；即Gln、Aln、Leu、Ile或Val。实例包括二苯甲基胺树脂(BHA树脂)，氯甲基树脂，氧基甲基树脂，氨甲基树脂，甲基二苯甲基树脂(MBHA树脂)，乙酸胺基甲基树脂(PAM树脂)，对烷氧基苄基醇树脂(王氏树脂)，4-氨甲基-苯氧基甲基树脂，和4-羟基甲基苯氧基甲基树脂。
对于合成技术的具体例子，本发明肽(即，pyroGlu-Gln-Gln)的制备方法描述如下。
C端氨基酸谷氨酰胺(Gln)(其中羧基是保护的)和第二个氨基酸(Gln)(其中氨基用保护基例如叔丁氧羰基(Boc)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)保护，并且羧基被激活)，进行缩合。随后，将所产生的Gln-Gln二肽的N端谷氨酰胺的氨基的保护基除去，然后使第三个氨基酸(Gln)(其中氨基用保护基例如叔丁基-氧羰基(Boc)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)保护，并且羧基被激活)缩合。当使用固相合成时，作为C端氨基酸的谷氨酰胺的羧基可以与固相载体结合，而不是将羧基保护。
可以如下激活羧基：使羧基与各种型式的试剂反应，产生相应的酰基氯、酸酐或混合酸酐、叠氮化物或-ONp或-OBt的活性酯。上述的肽缩合也可以在缩合剂或消旋抑制剂的存在下进行。实例包括碳二亚胺试剂，例如二环己基碳二亚胺(DCC)，水溶性的碳二亚胺(WSCD)和羰基二咪唑，焦磷酸四乙酯和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
固相合成完毕后，从固相载体中释放出肽，除去所有的保护基，而后洗涤。由此，可以获得粗品肽形式的Gln-Gln-Gln三肽。随后，通过环化，N端的谷氨酰胺可以转变为焦谷氨酸，获得本发明的肽。环化在水溶液中逐步进行，且环化速度可以通过提高温度来促进。也可以使焦谷氨酸作为N端氨基酸进行缩合来制备肽。
当进行液相合成时，可以用与固相合成的同样方式来合成肽，只是C端氨基酸不与固相载体结合。可以将由此获得的含有本发明肽的粗品肽通过常规方法充分地纯化，例如高效液相色谱(HPLC)，获得高度纯化的肽。
如上所述，具有靶向氨基酸序列的本发明的肽可以如下合成：使氨基酸连续缩合，并且通过肽的化学合成使C端朝着N端方向延伸。在这种情况下，使用L-或D-形式的氨基酸能够合成肽，其包含L-氨基酸，其余部分由D-氨基酸组成。
由此获得的本发明的肽对于肝脏疾病具有高预防和/或治疗活性。由此，这种肽可以用作预防和/或治疗肝脏疾病的组合物的活性组分。相应地，本发明的一个实施方案涉及预防和/或治疗肝脏疾病的组合物，其包含上述本发明的肽作为活性组分(下文可以称为“本发明的组合物”)。本发明的组合物可以包含仅仅一种类型或许多类型的本发明的肽。本发明的另一个实施方案涉及预防和/或治疗肝脏疾病的方法，包括给予温血动物本发明的肽或组合物。
在本发明中，疾病预防包括抑制和延迟发病。术语“疾病预防”也包括治疗之后预防疾病的复发，以及发病之前的预防。在本发明中，疾病的治疗包括疾病的治疗、症状的改善和抑制症状逐渐发展。
在本发明中，术语“温血动物”是指恒温动物。其实例包括灵长类，例如人和猴子，啮齿类例如小鼠、大鼠和兔子，玩赏动物例如狗和猫，和家畜例如牛、马和猪。本发明的组合物优选给予灵长类，特别优选人。特别优选，将本发明组合物给予遭受肝脏疾病痛苦的人、诊断为患有肝脏疾病的人、可能患有肝脏疾病的人、需要预防肝脏疾病的人和具有异常GOT和/或GPT水平的人(例如，GOT和/或GPT水平比正常水平高的人)。
本发明的组合物通常以成年人每天0.01g至20g(质量)肽的数量给药，优选0.1g至10g肽。当本发明中使用的肽是通过天然存在蛋白的部分水解制备时，其剂量可以进一步增加，这是由于它的高度安全性(由于源自于天然存在的物质)。优选，按照效果及其它条件来适当地增减剂量。可以优选一次性给予或摄取日剂量，或以若干分开的剂量给予。
对用于肝脏疾病的预防和/或治疗的本发明组合物的形式没有特别限制。例如，这种组合物可以以药物组合物或食品(包括动物饲料)形式制备。
当以药物组合物形式制备本发明的组合物时，通常，以包含本发明肽和可药用载体的药物制剂形式制备组合物。通常，术语“可药用载体”是指不与作为活性组分的本发明肽反应的非活性、无毒和固体或液体填料、稀释剂或密封剂。其实例包括水，乙醇，多元醇(例如丙三醇，丙二醇，或液体聚乙二醇)，其任何混合物，和溶剂或分散介质例如植物油。
对药物组合物的剂型没有特别限制，可以使用任意的剂型。其实例包括口服剂型，例如片剂、丸剂、粒剂、喷(dust)剂、细颗粒、粉状药物、胶囊、糖浆剂、饮料制剂、液体药剂、栓剂和液体膳食，以及肠胃外给药剂型，例如舌下片剂、鼻喷入剂和注射制剂。
除了口服之外，本发明的药物组合物可以通过药物给予一般所使用的技术来给予，例如静脉内给药、肌注给药和皮下给药，。此外，可以使用涉及通过粘膜(非胃肠道)吸收的给药技术，例如直肠、舌下或鼻内给药。在这种情况下，药物组合物可以以例如栓剂、舌下片剂或鼻喷入剂的形式给予。
本发明肽在药物组合物中的含量根据其形式而改变。一般是(按照质量计算，按干物质计算)0.001％至99％，优选0.01％至90％，更优选1％至85％，进一步优选5％至80％。优选，调节日剂量，以便实现成年人每日的上述剂量。
当以食品形式制备本发明的组合物时，对其形式没有特别限制。术语“食品”是指饮料、健康食品和功能性食品。具体地说，健康食品和功能性食品可以以各种药物制剂形式制备，例如片剂、丸剂、粒剂、粉剂、细小颗粒、粉状药物、胶囊、糖浆剂、饮料制剂、液体制剂和液体膳食。药物制剂形式的食品可以用与药物组合物同样的方式制备。例如，加入合适的赋形剂(例如淀粉、加工的淀粉、乳糖、葡糖或水)，然后可以通过常规方法制备食品。食品的具体例子进一步包括：咖啡饮料，茶饮料，含有果汁的饮料，软饮料，乳制饮料，黄油，蛋黄酱，酥油，人造黄油，各种型式的色拉调料，面包，面条，米饭，通心面，调味品，甜食，饼干，巧克力，糖果，咀嚼胶，各种型式的佐料和各种型式的饮食产品。通过将本发明的肽引入到这种食品中，本发明的组合物可以以食品形式制备。
本发明肽在本发明食品中的含量根据食品形式来变化，一般是(按照质量计算，按干物质计算)0.01％至80％，优选0.1％至75％，更优选1％至70％，进一步优选5％至70％。由于本发明的肽具有高度安全性，其含量可以进一步提高。其每日摄取的数量可以一次性地给予或以若干分开的剂量给予。优选，调节日剂量，以便实现成年人每日的上述剂量。
摄入对于肝脏疾病具有预防和/或治疗活性的本发明肽、其盐或包含其的本发明组合物，可以产生阻碍肝脏疾病进展的效果、改善疾病症状的效果或预防肝脏疾病痛苦的效果。
本发明的组合物可以含有各种用于制备药物、食品和饲料产品的添加剂，并且可以进一步含有各种活性物质。这种添加剂和活性物质的例子包括各种油和脂肪，药材，氨基酸，多元醇，天然存在的聚合物，维生素，矿物质，食用纤维，表面活性剂，净化水，赋形剂，稳定剂，pH值调节剂，抗氧化剂，甜味剂，调味组分，酸化剂，色素和合成香料。本发明的肽可以以其与一或多种类型的其它活性组分的混合物形式给予，或与其组合给予，其它活性组分对于肝脏疾病具有预防和/或治疗活性。相应地，除了本发明的肽之外，本发明的预防和/或治疗肝脏疾病的组合物还可以包含对肝脏疾病具有预防和/或治疗活性的其它活性组分。
各种型式的油和脂肪的例子包括植物油和脂肪，例如大豆油、红花油和橄榄油，和动物油和脂肪，例如牛油和沙丁鱼油。
生药的例子包括亚洲牛黄，地黄提取物(rehmanniae radix)，枸杞子，蜂王浆，人参和鹿茸。
氨基酸的例子包括半胱氨酸、亮氨酸和精氨酸。
多元醇的例子包括乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，甘油和糖醇。糖醇的例子包括山梨糖醇，赤藓醇，木糖醇，麦芽糖醇和甘露糖醇。
天然存在的聚合物的例子包括阿拉伯树胶，琼脂，水溶性的玉米纤维，凝胶，黄原胶，酪蛋白，谷蛋白或谷蛋白水解物，卵磷脂和糊精。
除了维生素C(抗环血酸)、维生素B家族和维生素E(生育酚)之外，各种维生素的例子还包括维生素A、D和K，和核黄素四丁酸酯。维生素B家族包括各种维生素B复合物，例如维生素B1，维生素B1衍生物，维生素B2，维生素B6，维生素B12，生物素，泛酸，烟酸和叶酸。维生素B1和它们的衍生物包括具有维生素B1的生理活性的所有化合物，例如维生素B1或其盐，二硫胺，呋喃硫胺或其盐，地赛硫胺(dicethiamine)，舒布硫胺(bisbutytiamine)，双苯酰硫胺，苯磷硫胺，二硫化磷酸硫胺(thiamine monophosphate disulfide)，赛可硫胺，辛硫胺和丙硫硫胺。
矿物质的例子包括钙、镁、锌和铁。
食用纤维的例子包括树胶，甘露聚糖，果胶，半纤维素，木质素，β-葡聚糖，木聚糖和阿糖基木聚糖。
表面活性剂的例子包括脂肪酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯和脂肪酸糖酯。
赋形剂的例子包括蔗糖，葡糖，玉米淀粉，磷酸钙，乳糖，糊精，淀粉，结晶纤维素和环糊精。
除了上述药品之外，对肝脏疾病具有预防和/或治疗活性的其它活性组分的例子包括异黄酮，透明质酸，缬氨酸，谷氨酰胺，叶酸，河蚬，苹果，泥鳅和梨。
除了上述之外，下列可以作为添加剂加入：例如牛磺酸，谷胱甘肽，维生素BT，肌酸，辅酶Q，α-硫辛酸，葡糖醛酸，葡糖醛酸内酯，茶氨酸，γ-氨基丁酸，辣椒碱，各种有机酸，类黄酮，多酚，儿茶素，黄嘌呤衍生物，不消化性寡糖例如低聚果糖，或聚乙烯吡咯烷酮。应该按照添加剂类型和合乎需要的摄取数量，适当地确定所加入的这种添加剂的量。通常，这种数量(按照质量计算)在0.01％和30％之间，优选0.1％至10％。
下面详细描述本发明的肽和组合物的制备实施例和试验实施例，但本发明不受其限制。
实施例
(制备实施例1)pyroGlu-Gln-Gln的合成
使用Model 433A肽合成仪(ABI)，利用固相方法合成pyroGlu-Gln-Gln。
使用2gBoc-Gln-Pam树脂作为起始原料和Boc-Gln与Boc-Glu(OBzl)保护的氨基酸，用下面的方式进行自动合成。
(1)从Boc-Gln-Pam树脂上除去Boc基团
(2)洗涤
(3)活化Boc-Gln
(4)将激活的Boc-Gln加入到Gln-Pam树脂中进行缩合
(5)洗涤
(6)将未反应的N端氨基乙酰化
(7)洗涤
(8)从Boc-Gln--Gln-Pam树脂上除去Boc基团
(9)洗涤
(10)活化Boc-Glu(OBzl)
(11)将激活的Boc-Glu(OBzl)加入到Gln-Gln-Pam树脂中进行缩合
(12)洗涤
(13)将未反应的N端氨基乙酰化
(14)洗涤
(15)Boc-Glu(OBzl)-Gln-Gln-Pam树脂
通过用三氟乙酸-二氯甲烷(50∶50)处理20分钟，除去Boc基团。使用二氯甲烷重复洗涤步骤三次。在DCC和HOBt的存在下，通过加入Boc-保护的氨基酸(其数量是树脂所结合氨基的当量的5倍)进行缩合，使反应进行60分钟。
将产生的Boc-Glu(OBzl)-Gln-Gln-Pam树脂从肽合成仪中除去，并转入另一个容器中。每g树脂加入茴香硫醚(1ml)和0.5ml乙二硫醇，并在室温下搅拌所得物质10分钟。随后，在冰冷却下慢慢地加入10ml氟化氢，将混合物搅拌30分钟，通过减压蒸馏除去氟化氢。反应容器充满100ml冷的二乙醚，搅拌所得物质1分钟，使肽和树脂沉淀。用Polyfron过滤器PF060(Advantec Co.，Ltd.)过滤收集产物，用冷的二乙醚(-40℃)洗涤。将肽溶于大约30ml三氟乙酸中，将得到的肽溶液滴加到预先制备的300ml冷的二乙醚中，而后再沉淀。用PTFE膜(孔径3μm，Advantec Co.，Ltd.)过滤收集产物，用冷的二乙醚(-40℃)洗涤产物，将肽溶于2N乙酸中，而后冷冻干燥。由2.35g保护的肽-Pam-树脂获得粗品肽(1.21g)。将粗品肽溶于水中，将产物在60℃下环化6小时环化为焦谷氨酸，而后冷冻干燥。
在下列条件下将得到的粗品肽通过HPLC纯化。
柱：Inertsil ODS-3，φ20×250mm(GL Sciences Inc.)
流动相：梯度从0.1％三氟乙酸至35％乙腈(在0.1％三氟乙酸中)
流速：10ml/min
检测器：紫外分光光度计，210nm
温度：40℃
对HPLC色谱的主要峰分馏，使用肽测序仪分析分馏产品的氨基酸序列。从1g粗品肽中获得0.88g pyroGlu-Gln-Gln的纯肽。
(制备实施例2)pyroGlu-Leu的合成
通过Boc液相方法合成pyroGlu-Leu。
(1)Boc-pyroGlu和HCl Leu-OtBu的缩合
将HCl Leu-OtBu(390mg)加入到茄型烧瓶中，溶于5ml DMF，用冰冷却，而后加入0.124ml三乙胺。随后，加入400mg Boc-pyroGlu-OH、470mg HOBt和367mg WSCD HCl，在冰冷却下搅拌混合物12小时，进行缩合反应。反应完毕后，减压蒸馏除去DMF，将残余物溶于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠水溶液、10％枸橼酸水溶液、水和饱和盐水连续地洗涤乙酸乙酯，用无水硫酸钠干燥产物。过滤分离硫酸钠，减压浓缩滤液，将醚-己烷加入到得到的残余物中，凝固，收集Boc-pyroGlu-Leu-OtBu。产率是609mg(88％)。
(2)脱保护
将上面获得的Boc-pyroGlu-Leu-OtBu(600mg)加入到茄型烧瓶中，加入5ml三氟乙酸，溶解Boc-pyroGlu-Leu-OtBu，在冰冷却下进行脱保护1小时。使用N2气体除去三氟乙酸，通过加入醚使脱保护的肽凝固，而后过滤收集。将得到的固体溶于4N HCl/二噁烷中，加入醚进行再凝固，而后过滤收集。产率是220mg(53％)。
(制备实施例3)pyroGlu-Ile的合成
用与制备实施例2同样的方式合成pyroGlu-Ile，使用390mg HClH-Ile-OtBu作为起始原料。缩合反应的产率是613mg(88％)，脱保护肽的产率是260mg(67％)。
(制备实施例4)pyroGlu-Gln-Gln的合成
利用Fmoc液相方法合成pyroGlu-Gln-Gln。
(1)Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu的合成
将HCl H-Gln-OtBu(1.15g)加入到茄型烧瓶中，溶于5ml DMF，用冰冷却，而后加入0.74ml三乙胺。随后，加入2.94g Fmoc-Gln(Trt)-OH、1.3g HOBt和1.01g WSCD HCl，在冰冷却下搅拌混合物12小时，进行缩合反应。反应完毕后，减压蒸馏除去DMF，将残余物溶于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠水溶液、10％枸橼酸水溶液、水和饱和盐水连续地洗涤乙酸乙酯，用无水硫酸钠干燥产物。过滤分离硫酸钠，减压浓缩滤液，将醚-己烷加入到得到的残余物中，凝固并收集Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu。产率是3.51g(92％)。
(2)从Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu上除去Fmoc基团
将Fmoc-Gln(Trt)-Gln-OtBu(1.12g)加入到茄型烧瓶中，在冰冷却下加入7ml 1M NaOH水溶液。由于混合物形成白色浑浊物，加入甲醇，将其内含物溶解，使反应在0℃进行2小时。加入枸橼酸进行中和之后，将水加入到由真空浓缩所得到的白色固体中，搅拌混合物，获得胶状固体。将产物施加到硅胶柱上，使用氯仿作溶剂，将靶向组份分馏，并借助于醚来进行凝固。产率是590mg(73％)。
(3)Boc-pyroGlu-Gln(Trt)-Gln-OtBu的合成
将H-Gln(Trt)-Gln-OtBu(580mg)加入到茄型烧瓶中，溶于5ml DMF，用冰冷却，而后加入156μl三乙胺。随后，加入232mg Boc-pyroGlu-OH、273mg HOBt和213mg WSCD HCl，在冰冷却下搅拌混合物12小时，进行缩合反应。减压蒸馏除去DMF，将残余物溶于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠水溶液、10％枸橼酸水溶液、水和饱和盐水连续地洗涤乙酸乙酯，用无水硫酸钠干燥产物。过滤分离硫酸钠，减压浓缩滤液，使用真空泵、通过减压从得到的残余物中除去溶剂。产率是509.3mg(64％)。
(4)脱保护
将Boc-pyroGlu-Gln(Trt)-Gln-OtBu(760mg)加入到茄型烧瓶中，加入10ml三氟乙酸，将Boc-pyroGlu-Gln(Trt)-Gln-OtBu溶解，在冰冷却下使反应进行4小时。使用N2气体除去三氟乙酸，通过加入醚使脱保护的肽凝固。离心回收固体，再次加入醚，使固体悬浮，离心收集固体。将该步骤重复三次，获得粗品肽。产率是445mg(100％)。
(5)pyroGlu-Gln-Gln的纯化
上面获得的粗品肽含有不溶于水的杂质。由此，将粗品肽悬浮在水中，过滤收集滤液。向滤液中加入2ml 1M盐酸，并冷冻干燥。将醚加入到冷冻干燥产品中，使本发明的肽凝固，回收固体，而后干燥。最终产率是256mg(63％)。
(制备实施例5)从天然存在的蛋白中提取pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu和pyroGlu-Ile
(1)将离子交换水(9,700kg)、38kg无水枸橼酸和1,500kg面筋(活性谷蛋白，Weston Foods Limited)加入到反应容器中，将温度升至45℃，加入2.2kg蛋白酶(Protease M Amano，Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.)和1.1kg淀粉酶(液化酶T，Hankyu Bioindustry Co.，Ltd.)，在45℃进行水解5小时。随后，使用25％氢氧化钠水溶液将液体pH值水平调节至4.4至4.5，将液体在这种状态下保持7小时，然后进行酶处理。
(2)随后，将液体在80℃保持20分钟，使蛋白酶失活，将液体冷却至65℃，向其中加入0.5kg淀粉酶(液化酶T，Hankyu Bioindustry Co.，Ltd.)，使包含在面筋中的淀粉和纤维组分水解，使液体在90℃保持20分钟，使淀粉酶失活。
(3)随后，将液体冷却至10℃或更低，将液体再次加热至55℃，向其中加入100kg活性炭(Takecoal，Takeda Pharmaceutical CompanyLimited)，在55℃搅拌混合物30分钟。
(4)将液体温度调节至45℃，加入助滤剂(钠沸石，Showa ChemicalIndustry Co.，Ltd.)，使用压滤装置进行过滤，回收7,000升滤液(7m3)。
(5)将上面(4)中回收的滤液真空浓缩，使用片式加热器、通过在110℃加热20秒将浓缩物消毒，然后将产物冷却至55℃。
(6)使用喷雾干燥器，在160℃的鼓风温度和80℃的排风温度下，将上面(5)中获得的液体喷雾干燥，获得大约1,000kg面筋水解物的粉末。
(7)通过凝胶过滤，从上面(6)中获得的粉末中分馏出分子量1,000或更小分子量的馏份，通过HPLC进一步进行纯化。以用与制备实施例1同样的方式获得的合成pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu和pyroGlu-Ile为基准，通过HPLC，将在相同条件下显示相同保留时间的部分回收。结果，从800kg面筋的粉末水解物中获得4.5kg、1.6kg、0.9kg和0.7kg肽。
(8)使用肽测序仪分析纯化肽的氨基酸序列。结果，发现肽分别含有序列pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu和pyroGlu-Ile。
(实施例1)片剂的制备
将制备实施例5中获得的pyroGlu-Gln肽(84g)、10g结晶纤维素(Asahi Kasei Corporation)和5g聚乙烯吡咯烷酮(BASF)混合，向其中加入3ml乙醇，利用常规湿法制备颗粒。将得到的颗粒干燥，向其中加入1.1g硬脂酸镁，制备用于制备片剂的粉末，使用压块机制备片剂，制备100个片剂，各自具有1g的重量(每片含有pyroGlu-Gln 0.84g)。
(实施例2)糖浆剂的制备
将净化水(400g)煮沸，加入750g蔗糖和制备实施例5中获得的100g pyroGlu-Leu肽，在搅拌期间将其溶解，对溶液进行过滤，同时维持加热状态，向其中加入净化水，将总量调到1,000ml，制备糖浆剂(每100ml糖浆剂含有pyroGlu-Leu 10g)。
(实施例3)颗粒剂的制备
将制备实施例5中获得的PyroGlu-Ile肽(76g)、13.3g乳糖(DMV)、6.7g结晶纤维素(Asahi Kasei Corporation)和4g聚乙烯吡咯烷酮(BASF)混合，向其中加入30ml乙醇，按照常规湿法制备颗粒。干燥之后，调节颗粒大小，获得颗粒剂(每10g颗粒剂含有pyroGlu-Ile 7.6g)。
(实施例4)液体膳食的制备
在大约65℃，将酪蛋白酸钠(DMV，40g)，160g麦芽糖糊精(SanwaCornstarch Co.，Ltd.)和制备实施例5中获得的25g pyroGlu-Ile肽加入并溶于750ml净化水中。随后，加入5g维生素混合物和5g包含钠、钾、钙、镁、氯、铁、磷、铜、锌、锰和硫化物的矿物质混合物。将混合物加入到均匀(homo)混合器(Tokushu Kika Kogyo Co.，Ltd.)中，在大约8,000rpm下大致乳化15分钟。将得到的乳剂冷却至大约20℃，加入合成香料，将产物在量筒中稀释至1,000ml的最终数量。用乳剂(230g)填充小袋，将小袋热(hermatically)密封，同时进行氮气置换，将液体在121℃消毒15分钟，获得浓缩液体膳食(每230g液体膳食含有大约5.8gpyroGlu-Ile)。
(实施例5)面包的制备
将小麦粉(面包专用小麦粉)(150g)与2g干酵母混合。另外，将20g制备实施例5中获得的pyroGlu-Gln-Gln肽、20g糖、3g盐和6g脱脂奶粉溶于70g温水中，向其中加入鸡蛋，将产物彻底混合。将生成物加入到小麦粉中，用手将混合物彻底地揉搓，向其中加入大约40g黄油，进一步揉搓混合物，制作用于20个小面包(roll buns)的生面团。使生面团发酵，将打碎的蛋施加到表面上，将生成物在烘箱中、在180℃烘烤大约15分钟，做出小面包(每个小面包含有大约1g pyroGlu-Gln-Gln)。
(实施例6)制备用于通心面的肉酱
将一份用于通心面的肉酱(150g)加入到浅盘中，同时加入5g制备实施例5中获得的pyroGlu-Gln-Gln肽，将其加热，制备用于通心面的肉酱。用得到的调味品填充小袋，将小袋hermetically密封，同时进行氮气置换，将调味品在121℃消毒15分钟，获得含有pyroGlu-Gln-Gln肽的肉酱(用于通心面)。
(实施例7)制备日本小麦面条
将15g制备实施例5中获得的pyroGlu-Gln肽和15g盐(在150g水中)的分散体加入到300g小麦粉(全用途面粉)中，并将生成物彻底地揉搓，使其静置。而后，拉伸生面团，并切成大约5mm的宽度，制作日本小麦面条。将生成物在沸水中煮大约10分钟。得到的日本小麦面条显示了良好的外观、味道和质地。每份日本小麦面条含有大约5gpyroGlu-Gln肽。
(试验实施例1)对肝脏疾病的效果(使用肝脏病症大鼠模型的给药试验)
(1)试验方法
Wistar大鼠(4至5周大)用于实验。用纯标准饲料将大鼠预先喂养一周，并禁食4小时。将制备实施例2中获得的pyroGlu-Leu和制备实施例3中获得的pyroGlu-Ile各自溶于水中(10mg/1m1)，并将得到的溶液进行腹膜内给予，数量各自为20mg/kg。1小时以后，腹膜内给予800mg/kg数量的D-氨基半乳糖(Sigma)。给予D-氨基半乳糖之后4小时，使大鼠自由地进食。每个组由5只大鼠组成，给予对照组水，代替本发明的肽。
给予D-氨基半乳糖之后24小时，从大鼠中提取血液样品，试验血液中的GOT和GPT水平，比较肝脏病症的程度。
按照JSCC标准方法(Hiroshi Miura，Japanese Journal of ClinicalMedicine(Nippon Rinsho)，53-reprinted-266，1995)试验GOT和GPT水平。分析结果示于表1中。
表1
  GOT(IU/L)   GPT(IU/L)
  水   391   50
  pyroGlu-Leu   215   30
  pyroGlu-Ile   314   45
示于表1中的结果表明，本发明的肽显示了抑制GOT和GPT升高的强烈活性，和抑制肝脏异常(即肝脏疾病)的活性。
(试验实施例2)对肝脏疾病的效果(使用肝脏病症大鼠模型的给药试验)
(1)试验方法
用与试验实施例1同样的方式进行试验。将制备实施例5中获得的pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Gln、pyroGlu-Leu或pyroGlu-Ile溶于水中(10mg/1m1)，并将得到的溶液口服给予大鼠，数量为40mg/kg。结果示于表2中。
表2
  GOT(IU/L)   GPT(IU/L)
  水   2180   391
  pyroGlu-Gln-Gln   524   100
  pyroGlu-Gln   509   124
  pyroGlu-Leu   555   131
  pyroGlu-Ile   491   98
示于表2中的结果表明，本发明的肽显示了抑制GOT和GPT升高的强烈活性，和抑制肝脏异常(即肝脏疾病)的活性。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请以其整体引入本文中作为参考。

Claims (2)

1.选自pyroGlu-Gln、pyroGlu-Gln-Gln、pyroGlu-Leu和pyroGlu-Ile的肽或其盐在制备用于预防和/或治疗肝脏疾病的组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中肝脏疾病是病毒性肝炎、酒精性肝脏疾病或药物引起的肝脏疾病。
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