KR20130112969A - 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-I converting enzyme: ACE) 저해제 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한, 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 지닌 펩타이드의 구조를 제공한다. 본 발명에 따른 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품은 고혈압의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

Description

안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품 {The Pharmaceutical composition and functional food for inhibiting angiotensin-I converting enzyme}

본 발명은 고혈압 예방 및 치료에 도움이 되는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 안지오텐신 전환효소 저해작용을 하는 물질 및 그 펩타이드에 구성에 관한 것이다.

고혈압은 순환기 계통의 만성퇴행성 질환으로서 혈압조절 및 전해질 균형의 조절에 중요한 역할을 하는 레닌-안지오텐신계 시스템(Renin-angiotensin system)의 생리학적 기전으로 설명된다. 이러한 기전은 도 1에 나타난 바와 같이, 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-I converting enzyme: ACE)는 데카펩타이드(decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ로부터 다이펩타이드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로서 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 역할을 한다. 안지오텐신 전환효소에 의해 생성된 안지오텐신 Ⅱ의 증가는 강한 혈압 상승작용과 항이뇨 호르몬인 알도스테론의 분비를 촉진하고 물과 나트륨의 배설을 억제하여 순환 혈액양을 증가시킴으로서 고혈압을 일으키게 한다. 또한, 안지오텐신 전환효소는 혈관 이완작용을 하는 브레디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화 시킴으로써 결과적으로 혈압상승을 유발하는 역할을 한다. 따라서 안지오텐신 전환효소의 활성을 억제함으로써 혈관 수축을 막아 혈압 강하 효과를 나타낼 수 있기에 고혈압을 낮출 수 있다.

고혈압을 위한 혈압강하제로는 이뇨제, β-차단제, 교감신경억제제, 혈관 확장제, Ca-길항제 및 candasatan, ibesartan, losartan, 등과 같은 AT₁-reptor 차단제가 있다. 그러나 이러한 약물들은 대부분 혈액 점도를 높이거나 전해질의 불균형 유발, 당뇨병 유발, 심부전증 악화, 기력감퇴, 신장기능 장애 등의 부작용을 야기하는 경우가 있다.

한편, 근래에 이르러 건강과 장수에 대한 관심이 집중되면서 식품 성분이 나타내는 항암, 항노화 및 항고혈압 등 다양한 생리활성 연구가 다각적으로 수행되고 있다. 식품으로부터 유래한 물질은 이들 성분이 천연물이라는 측면에서 큰 가치가 있다.

특히, 식품으로부터 유래한 물질 중 펩타이드는 단백질이 아미노산으로 분해되는 과정의 중간 산물로서 일반적으로 분자량이 10,000 dalton 이하이며 다양한 생리활성을 가지고 있기 때문에 최근 관심이 증가되고 있다. 식품 단백질 유래의 펩타이드는 원래 단백질 구조에서는 기능적 특성이 없지만, 단백질 분해효소로 가수분해하면 유전자 조작에 의해 생산 및 개조가 가능하고 소비자 기호와 식품 안전성을 기대할 수 있다는 장점이 있다. 많은 연구에서 펩타이드 성분이 면역증강, 칼슘흡수 촉진, 항혈전, 콜레스테롤 조절작용, 항고혈압등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 식품으로부터 유래한 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물은 이들 성분이 천연물이라는 측면에서 매우 큰 가치가 크다. 따라서, 강력한 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는 천연물질 탐색에 대한 지속적인 연구가 이루어지고 있으며, 높은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는 새로운 식품 유래 물질에 대한 연구가 필요하다. 또한, 식품으로부터 유래한 안지오텐신 전환효소 저해 활성 물질의 분리 및 정제를 통한 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가지는 펩타이드의 구조 분석이 필요한 시점이다.

따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식품 유래의 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능 식품, 그리고 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식품 유래 안지오텐신 전환효소 저해활성을 가지는 펩타이드의 구조를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 키조개 추출물 또는 키조개 의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소(Angiotensin-I converting enzyme: ACE) 저해용, 바람직하게는 혈압강하용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 즉, 본 발명은 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물의 의약 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 (S1) 키조개에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; (S2) 상기 S1 단계에서 얻어지는 반응액을 가열하여 반응액 내의 단백질 분해 효소를 불활성시키는 단계; 및 (S3) 상기 S2 단계에서 얻어지는 반응액을 원심분리하여 얻은 상징액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가진 키조개의 효소 가수분해물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (S1) 키조개에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; (S2) 상기 S1 단계에서 얻어지는 반응액을 가열하여 반응액 내의 단백질 분해 효소를 불활성시키는 단계; 및 (S3) 상기 S2 단계에서 얻어지는 반응액을 원심분리하여 얻은 상징액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키조개의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용, 바람직하게는 혈압 강하용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 즉, 본 발명은 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드의 안지오텐신 전환효소 저해용 의약 용도를 제공한다.

본 발명에서 건강기능식품이란 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또는 가공한 식품 모두를 지칭하며, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.

고혈압은 도 1과 같이 레닌-안지오텐신 시스템의 생리학적 기전으로 설명되며, 도 1에 나타난 안지오텐신 전환효소를 저해하는 것은 혈압강하 작용을 하게 되므로 고혈압의 예방 및 치료가 가능할 것이다. 본 발명자들은 키조개에서 이러한 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가지는 물질을 찾아내어 본 발명을 완성하였다. 보다 구체적으로, 키조개 추출물, 특히 키조개의 효소 가수분해물이 높은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가짐을 확인하였다.

본 발명에서 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가지는 성분으로 사용되는 키조개는 자웅이체이며 난생으로 학명은 Atrina pectinata이고, 영어 명칭은 pen-shell이다. 분류학적으로 연체동물문(Phylum Mollusca), 이매패강(Bivalvia), 홍합목(Order Mytiloida), 키조개과(Family Pinnidae)에 속하는 식용 조개류이다. 키조개는 단백질과 필수아미노산, 비타민, 무기질, 정미성분, 향미성분 등을 함유하고 있어 영약학적 가치가 크다. 이러한 키조개에 관련한 연구는 기초 생태와 양식 개발을 위한 연구에만 제한되어 수행되었을 뿐, 키조개에서의 생리활성 물질 탐색에 관한 연구는 미흡하였다. 본 발명은 키조개의 생리활성 물질에 대한 탐색을 통하여 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 밝혀내었다. 본 발명에 따르는 키조개는 키조개육을 의미하는 바이다.

따라서, 본 발명은 키조개 추출물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 본 발명에 따르는 키조개 추출물은 키조개를 본 발명이 속한 분야에서 통상적인 추출의 방법으로 분리해 낸 키조개의 성분을 가진 물질을 의미한다.

본 발명에 사용된 키조개 추출물은 건조된 키조개를 분쇄한 다음 통상적인 용매 추출방법에 이용되는 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트 등의 적당한 용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가지는 추출물이라면 어느 추출방법이든 무관하다. 다만, 바람직하게, 물(더 바람직하게는 열수)이 추출용매로 이용된다.

또한, 본 발명은 키조개의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 바람직하게 상기 키조개의 효소 가수분해물은 키조개 효소 가수분해물의 추출물 또는 정제물이며, 추출 또는 정제는 통상의 방법으로 행하여 질 수 있다. 본 발명에 따르는 키조개의 효소 가수분해물이란, 키조개 육을 가수분해 효소, 예를 들어 알칼라아제(Alcalase, Novo Co. 제조), 플라보자임(Flavourzyme, Novo Co. 제조), 프로타멕스(Protamex, Novo Co. 제조), 뉴트라제(Neutrase, Novo Co. 제조), 파파인(Papain, Sigma Co. 제조), 트립신(Trypsin, Sigma Co. 제조), 키모트립신(chymotrypsin, Sigma Co. 제조) 등에 의해 가수분해된 물질을 의미한다. 상기 키조개의 효소 가수분해물은 상기 키조개 추출물보다 더 높은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는다.

상기 키조개의 효소 가수분해물은 효소에 따라 상이한 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 보이나, 키조개 추출물보다는 더 높은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 보인다. 특히 프로타멕스에 의한 가수분해물이 가장 저해 활성이 우수하다. 이러한 키조개의 효소 가수분해물이 효소의 종류에 따라 안지오텐신 전환효소 저해활성이 다르게 나타나는 것은 효소가 기질에 작용하는 절단 분위가 달라, N-말단 및 C-말단에 위치하는 아미노산의 종류가 달라지기 때문이라 판단된다. 또한, 키조개 추출물에 비하여 키조개의 효소 가수분해물이 더 높은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는 것은 효소에 의한 가수분해에 의하여 단백질이 분해되어 다양한 펩타이드를 생성하기 때문이라 판단된다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 또는 건강기능식품을 포함하면 혈압강하의 효과를 가지게 된다.

또한, 본 발명은 (S1) 키조개에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; (S2) 상기 S1 단계 이후 반응액을 가열하여 반응액 내의 단백질 분해 효소를 불활성시키는 단계; 및 (S3) 상기 S2 단계 이후 반응액을 원심분리하여 얻은 상징액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가진 키조개의 효소 가수분해물을 제조하는 방법을 제공한다. 이때 상기 효소는 프로타멕스를 이용하여 가수분해 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 (S1) 키조개에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계; (S2) 상기 S1 단계 이후 반응액을 가열하여 반응액 내의 단백질 분해 효소를 불활성시키는 단계; 및 (S3) 상기 S2 단계 이후 반응액을 원심분리하여 얻은 상징액을 여과하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 키조개의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 향상시키는 방법을 제공한다. 이때 상기 효소는 프로타멕스를 이용하여 가수분해 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드, 바람직하게 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 안지오텐신 전환효소 저해용 펩타이드를 제공한다. 상기 Arg는 L-아르기닌 잔기, Gln은 L-글루타민 잔기, Pro은 L-프롤린을 나타낸다.

상기 펩타이드는 안지오텐신 전환효소에 대해 안지오텐신-Ⅰ과 경쟁적으로 결합하여 안지오텐신 전환효소의 활성을 감소시킨다. 안지오텐신 전환효소 활성에 저해를 나타내는 펩타이드는 그 구성 아미노산의 조성이나 함량보다는 그 구성 펩타이드의 종류나 아미노산의 배열에 더 큰 영향을 받는다. 즉, 펩타이드의 길이나 구조 및 아미노산의 종류, 배열순서 등 복합적인 작용에 의하여 안지오텐신 전환효소 저해 작용을 하게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 혈압강하제로 사용될 수 있다.

상기 펩타이드는 화학적합성으로도 얻을 수 있지만, 바람직하게 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가지는 키조개의 효소 가수분해물의 분리 및 정제를 통해 얻을 수 있다. 상기 펩타이드의 분리 및 정제는 통상적으로 올리고펩타이드의 정제에 사용되는 것과 같은 동일한 수법, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 분배 크로마토 그래피 및 겔 여과 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, 용매침전, 염석 등의 방법을 적절하게 조합함으로써 실시할 수 있다. 본 발명의 펩타이드의 정제 시, 목적물질을 포함하는 분획은 안지오텐신 전환효소 저해작용 및/또는 수율을 지표로 결정하여 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 따르는 키조개 추출물, 키조개의 효소 가수분해물, 또는 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드는 안지오텐신 전환효소 저해 작용 및 브라디키닌 불활성화 억제작용을 가져 결과적으로 혈압강하작용을 나타낸다. 따라서, 상기 물질들을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물 및 또는 건강기능식품은 고혈압으로부터 유래하는 여러 가지 질환, 예를 들어 뇌출혈, 뇌경색, 협심증, 심근경색, 신부전 등에 대한 예방제 또는 치료제, 구체적으로는 혈압강하제 등으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물은 본 발명에 따른 키조개 추출물, 키조개의 효소 가수분해물 또는 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드 이외에 또한 공지된 또는 장래에 밝혀질 안지오텐신 전환효소 저해작용을 갖는 물질 및 약제 등을 병용할 수 있다.

안지오텐신 전환효소 저해 활성 또는 혈압강하라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물은, 매일 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 가능하다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 그러나 상기 투여량은 투여 경로 및 제형, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성, 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물의 순도와 함량 등에 따라 다양할 수 있다.

본 발명에 따른 안지오텐신의 전환효소 저해제의 유효성분은 경구투여 또는 비경구 투여 중 어떠한 것에 의해서도 투여될 수 있다. 비경구 투여로는 정맥주사, 직장투여 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 안지오텐신의 전환효소 저해제는 고형 제제, 반고형제제 또는 액상 제제일 수 일 수 있다. 고형 제제는 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 좌제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형 제제에는 부형제, 착향제, 결합제, 방부제, 붕해제, 활택제, 충진제 등이 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 반고형 제제로는 크림제, 로션제, 유화제, 리니멘트제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제, 계면활성제 등을 첨가하여 제조할 수 있다. 액상 제제로는 물, 알코올, 프로필렌 글리콜 용액 같은 용액제, 현탁액제, 유제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 적당한 착색제, 착향제, 안정화제, 점성화제 등을 첨가하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 산제는 본 발명의 유효 성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 유효 성분; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 안지오텐신 전환효소 저해용 건강기능식품은 본 발명에 따른 키조개 추출물, 키조개의 효소 가수분해물 또는 Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드를 식품 첨가물로 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 물질들을 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 다른 식품 성분과 함께 병용하여 사용하는 등 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 안지오텐신 전환효소 저해용 유효성분의 혼합양은 사용목적(건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수도 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없다. 본 발명에 따른 안지오텐신 전환효소 저해용 유효물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로오즈와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자이리톨, 소르비톨, 에르트리톨 등의 당알콜 등을 사용할 수 있다. 감미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100ml당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 0.02~0.03g이다.

상기 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 물질은 천연과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물은 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가진다. 또한 본 발명에 따르는 펩타이드 역시 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 가진다. 상기 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는 물질들은 식품 유래로서 천연물로서 가치가 크다.

또한, 본 발명에 따르는 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 갖는 물질은 혈압 강하 효과로 고혈압의 예방 및 치료에 매우 유용하다.

본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 레닌-안지오텐신 시스템에 관련된 기작이다.
도 2는 본 발명에 따르는 키조개의 효소 가수분해물의 제조 방법에 관한 도시이다.
도 3은 본 발명에 따르는 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 분리 및 정제 방법에 관한 도시이다.
도 4는 본 발명에 따르는 키조개 추출물 및 키조개의 효소 가수분해물의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따르는 키조개의 프로타멕스 효소에 의한 가수분해물의 농도별 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따르는 키조개의 프로타멕스 가수분해물을 한외여과막을 사용하여 분리한 5개 분획의 안지오텐신 전환효소 저해 활성 및 수율을 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따르는 분자량 1,000 dalton 이하의 저분자 펩타이드를 ODS AQ column을 사용하여 얻은 크로마토그램이다.
도 8은 본 발명에 따르는 분자량 1,000 dalton 이하의 저분자 펩타이드를 ODS AQ column에 의하여 분리된 각 분획들의 안지오텐신 전환효소 저해 활성 및 수율을 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따르는 PO3를 Vydac C-18 column을 사용하여 얻은 크로마토그램이다.
도 10은 본 발명에 따르는 PO3를 Vydac C-18 column에 의하여 분리된 각 분획들의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따르는 PO3V4를 rechromathography하여 얻은 크로마토그램이다.
도 12는 본 발명에 따르는 PO3V4를 rechromathography에 의하여 분리된 각 분획들의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정한 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따르는 PO3V5를 Superdex Peptide HR column에 의한 gel permeation chromatography를 실시하여 얻은 크로마토그램이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<키조개 열수추출물의 제조>

키조개 육의 재료

2009년 7월 충남 보령 천수만에 서식하는 자연산 키조개(Pen shell, Atrina pectinata)를 채취하여 내장 및 이물질을 제거한 후 키조개 육을 동결 건조하였다. 이를 분말상태로 냉동보관하면서 실험시료로 사용하였다.

키조개 육의 열수 추출

상기 키조개 육 분말에 30배(w/w)의 증류수를 첨가하여 균질화 하였고, heating mentle에서 100℃로 4 시간 동안 열수추출하였다. 추출물을 6,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상징액을 취하였다. 상징액을 Advantec Filter Paer No. 2(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)로 여과한 후, 여과 된 상징액은 동결건조하여 분말화하여 키조개 열수추출물을 제조하였다.

<키조개의 효소 가수분해물의 제조>

가수분해에 이용되는 효소

Alcalase 2.4 L, Flavourzyme 500 MG, Neutrase 0.8 L, 및 Protamex의 상업용 단백질 분해효소를 Novo Co.(Novozyme Nordisk, Bagsvaerd, Denmark)에서 구입하여 사용하였다. 하기 표 1에 각 효소별 반응 최적 조건 및 효소의 구성을 나타내었다.

효소 가수분해물의 제조

키조개 육 분말에 30배량(w/w)의 증류수를 가한 후 상기 단백질 분해효소를1%가 되게 첨가하고 최적조건 하에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 90-100℃에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음 6,000 rpm으로 15 분간 원심분리 하여 상징액을 얻었으며, 상징액은 0.45 μm syringe filter로 여과하였다. 여과된 상징액을 동결건조하여 분말화하였고, 분말시료는 -20℃에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다. 효소 가수분해물의 제조 방법에 관하여 도 2에 나타내었다.

효소	최적 조건		효소의 구성
	온도(℃)	pH
Alcalase	50	7.0	An endoprotease
Neutrase	50	7.0	Containg both endoprotease and eptidase activities
Flavourzyme	50	7.0	An endoprotease
Protamex	50	7.0	A bacterial protease complex use for the hydrolysis of food protein

<안지오텐신 전환효소 저해 활성의 측정>

키조개 열수추출물 및 키조개의 효소 가수분해물의 안지오텐신 전환효소 저해 활성은 Yamamoto 등(1980)의 방법으로 측정하였다. 안지오텐신 전환효소는 토끼의 허파에서 아세톤 분말(Sigma, St Louis, MO, USA)로 정제한 시료1 g에 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 10 mL를 가한 다음 5℃에서 24시간 교반한 후 원심분리 4000 rpm, 30 분하여 얻은 상징액을 안지오텐신 전환효소 조효소액으로 사용하였다.

안지오텐신 전환효소 저해 활성은 10 mg/mL의 농도로 제조한 시료 50 μL에 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3) 100 μL 와 안지오텐신 전환효소 조효소액 50 μL를 가한 다음 37℃에서 10분간 preincubation 시킨 후, 0.3 M NaCl이 함유된 sodium borate buffer(pH 8.3) 5 mL 에 HHL(hippuryl-histidyl-leucine) 25 mg을 첨가하여 만든 기질 50 μL 를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이에 1 M HCl 250 μL를 가하여 반응을 정지시켰다. 공시험은 시료용액 대신 증류수 50 μL를 사용하였으며, 대조군은 1 M HCl 250 μL를 먼저 가하여 반응을 정지시킨 후 효소액을 가하였다. 여기에 ethyl acetate 1.5 mL를 가하여 15 초 교반한 후, 원심분리(3,000 rpm, 5 분, 4℃)하여 상징액 1 mL를 취하였다. 이 상징액을 120℃에서 30분간 건조시킨 다음 실온에서 5분간 방치한 후 증류수 3 mL를 가하여 15초간 교반하여 용해시키고 228 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 첨가 전 후 활성의 백분율로 안지오텐신 전환효소 저해율을 측정하였으며, 안지오텐신 전환효소 저해 활성 효과는 아래 계산식을 이용하여 계산하였다.

ACE inhibition activity (%) = (

)

S: 시료(Sample)의 흡광도

C: 공시험(증류수를 넣은 군)의 흡광도

B: 대조군(HCl에 의한 반응 정지 후 효소를 넣은 군)의 흡광도

통계 처리

각 실험은 3회 이상 반복 실험을 통하여 얻은 결과를 SAS(1999-2001) 프로그램을 사용하여 통계처리 하였으며, 각 군의 평균과 표준편차를 산출하고, 시료간의 차이 유무를 Duncan 의 Multiple rage test를 이용하여 처리간의 결과차이를 분석하였다.

<키조개의 효소 가수분해물의 안지오텐신 전환효소 저해 활성 물질 분리>

키조개 가수분해물에서 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드는 도 3에 나타난 바와 같이 한외여과, column chromatography 및 HPLC(AKTA explorer 100, pharmacia, Sweden)을 이용하여 분리??정제하였다. 펩타이드 성분의 검출은 HPLC에 장착된 UV detector를 사용하여 215 nm에서 실시하였다.

한외여과법

고분자의 polypeptide를 제거하고 저분자 펩타이드의 분리 과정을 효율적으로 수행하기 위하여 Tugeon 등(1990)의 방법에 따라 한외여과법을 실시하였다. 즉, 키조개의 효소 가수분해물을 molecular weight cut-off로 각각 1,000 dalton과 3,000 dalton, 10,000 dalton, 100,000 dalton인 한외여과막(YM-1, YM-3, YM-10과 YM-100 membrane, DIAFLO ultrafiltration membrane, Amicon Co., Beverly, MA, USA)을 사용하여 5개 fraction(100,000 dalton 이상, 100,000-10,000 dalton, 10,000-3,000 dalton, 3,000-1,000 dalton, 1,000 dalton 이하)으로 각각 나누어 농축시킨 후 동결 건조하여 각각의 안지오텐신 전환효소 저해효과를 측정하였다

ODS AQ column에 의한 분리

ODS-AQ column에 의한 분리는 Matsui 등(1993)의 방법을 변형하여 수행하였다. 즉, 한외 여과를 통해 분획한 펩타이드 중 안지오텐신 전환효소 저해활성이 뛰어난 분회물, 동결 건조 시료 0.2 g을 HPLC용 증류수 2 mL에 녹여 10% 용액으로 만든 후, ODS-AQ colum(26 ㅧ 300 mm, Vt: 170 mL)에 주입하였다. 이때 용출액은 HPLC용 water를 A 용매, HPLC용 ethanol을 B 용매로 하여 gradient 조건에서 분리하였고, 유속은 10 mL/min으로 용출시켜 10 mL씩 분취하였으며 215 nm와 280 nm에서 각각 detection하고, 각 분획물을 모아 감압농축한 후 진공동결건조하여 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정하였다.

Vydac C-18 column에 의한 분리

Vydac C-18 column에 의한 RP(reverse-phase)-HPLC의 분석은 용매 조건에 따라 두 단계로 나누어 분리하였다.

Linear gradient elution에 의한 분리

ODS-AQ column으로 분획한 펩타이드 중 안지오텐신 전환효소 저해활성이 뛰어난 분획물, 동결 건조 시료 0.2 g을 HPLC용 증류수 2 mL에 녹여 10% 용액으로 만든 후, Vydac C-18 column(10 ㅧ 250 mm, Vt: 19.6 mL)에 주입하였다. 이때 용출액은 0.05% TFA in water를 A용매, 0.05% TFA in acetonitril(ACN)을 B 용매로 하여 gradient 조건에서 분리하였고, 유속은 2 mL/min으로 용출시켜 2 mL씩 분취하였으며 215 nm와 280 nm에서 각각 detection 하고, 각 분획물을 모아 감압농축한 후 진공 동결 건조하여 안지오텐신 전환효소 저해효과를 측정하였다.

Isocratic elution에 의한 재분리

Vydac C-18 column(10 ㅧ 250 mm, Vt: 19.6 mL)에 의해 1차적으로 용출된 분획물 중 안지오텐신 전환효소 저해효과가 뛰어난 분획물을 Vydac C-18 column에 재 주입하였으며, 이때 용출액은 0.07% TFA와3% acetonitril(ACN) in water을 함유한 용매로 하여gradient 조건에서 분리하였고, 유속은 2 mL/min으로 용출시켜 2 mL씩 분취하였으며 215 nm nm와 280 nm에서 각각detection 하고, 각 분획물을 모아 감압농축한 후 진공 동결 건조하여 안지오텐신 전환효소 저해효과를 측정하였다.

Superdex Peptide HR colum에 의한 분리

Vydac C-18 column으로 분획한 펩타이드를 Superdex peptide column(10 ㅧ 300 mm, Vt: 24 mL)에 주입하고, 이때 용출액은 HPLC용 water를, 유속은 0.5 mL/min으로 용출시켜 1 mL씩 분취하였으며 215 nm와 280 nm에서 각각 detection하고, 각 분획물을 모아 감압농축 및 진공 동결 건조하여, 최종적으로 잔존하는 염의 불순물을 제거하고 분리??정제 하였다.

<펩타이드의 아미노산 서열 분석>

Superdex peptide HR column chromatography에 의해 최종적으로 분리??정제 된 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드 분획의 아미노산 배열 분석은 ProciseTM(Perkin Elmer, protein sequencing system, Foster, CA, USA)을 이용하였으며, 분석 시 Bio-Brene액을 처리하여 standard를 측정한 다음, 시료 20 ㅅL를 사용하여 분석하였다.

<키조개의 효소 가수분해물의 안지오텐신 전환효소 저해 효과 평가>

키조개육을 식품에 주로 사용하는 상업용 효소인 Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Neutrase에 의해 가수분해 된 시료의 항고혈압 활성 여부를 확인하기 위하여 시료농도10 mg/mL에서 안지오텐신 전환효소저해 활성을 측정한 결과는 도 4과 같다. No enzyme(키조개의 열수추출물)에 비해 키조개의 효소 가수분해물의 저해활성이 우수한 것으로 나타났다. 효소 종류별 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 비교해 보면, protamex를 이용한 경우 안지오텐신 전환효소 저해효과가 85.7%로 가장 우수하였으며, Flavourzyme 과 Neutrase 를 이용한 가수분해물의 경우 각각 56.5%와 52.6%까지의 높은 활성을 보였다. Alcalase 을 이용한 경우에는 47.4%의 활성을 보여 다른 효소에 비해 낮은 활성을 보여주었다.

Protamex 가수분해물의 농도별 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 조사한 결과는 도 5처럼, 안지오텐신 전환효소 저해효과는 농도 의존적으로 시료농도가 증가할수록 증가하였다. 이처럼 키조개의 효소 가수분해물은 안지오텐신 전환효소작용을 억제하여 고혈압 예방효과가 있을 것으로 사료 된다.

<안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 구조 해석>

키조개의 효소 가수분해물의 선정

앞의 결과에서 Alcalase, Flavourwyme, Protamex, Neutrase에 의해 가수분해된 키조개 육의 안지오텐신 전환효소 저해효과가 가장 우수한 Protamex 가수분해물을 다음 실험의 시료로 선정하였으며, 이로부터 안지오텐신 전환효소 저해 활성 물질을 분리??정제를 진행 하였다.

분자량의 따른 안지오텐신 전환효소 저해활성

한외여과막을 사용 하여 5개 분획의 안지오텐신 전환효소 저해 활성 및 수율은 도 6과 같다. 안지오텐신 전환효소 저해효과는 분자량 1,000 dalton 이하 분획물이 62.9%로 가장높았으며, 1,000-3,000 dalton 사이는 61.9%, 3,000-10,000 dalton 사이는 57.2%, 10,000-100,000 dalton 는 28.0%, 100,000 dalton 이상 분획물은 12.2%로 분자량이 낮을수록 안지오텐신 전환효소 저해 활성은 높게 나타나 키조개의 효소 가수분해물의 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드 또한 저분자임을 알 수 있었다.

분자량 1,000 dalton 이하 분획물의 수율이 69.2%로 대부분을 차지했고 1,000-3,000 dalton사이는 11.6%, 3,000-10,000 dalton사이는 9.1%, 10,000-100,000 dalton는 8.3%, 100,000 dalton 이상 분획물은 7.5%로 매우 낮게 나타났다.

따라서 수율과 안지오텐신 전환효소 저해효과를 동시에 고려하여 분자량이 1,000 dalton 이하(Fraction 1)를 다음 분리 단계의 시료로 선정하였다.

ODS AQ column에 의한 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 분리

한외여과로 얻어진 키조개의 효소 가수분해물 중 수율과 안지오텐신 전환효소 저해효과가 우수한 분자량 1,000 dalton 이하의 저분자 펩타이드(Fraction 1)를 동결건조한 후, 염의 제거와 펩타이드 분획을 동시에 실시할 수 있는 ODS AQ를 충진한 column을 사용하여 도 7의 chromatogram을 얻었다. 이 chromatogram을 용리 부피(elution volume) 340 mL, ethanol 농도를 0~60% 용액으로 용출시켜 분획(PO1, PO2, PO3, PO4) 4개로 나누었다. 펩타이드 결합부위에서 빛의 굴절을 일으켜 펩타이드 양을 단적으로 측정할 수 있는 흡광도를 215 nm에서 측정하여 4개의 분획물의 안지오텐신 전환효소 저해 활성과 수율을 측정하여 도 7에 나타내었다. PO1, PO2, PO3, PO4 는 각각 16.9%, 53.1%, 70.4%, 73.4%의 안지오텐신 전환효소 저해효과를 나타내었고, PO1, PO2, PO3, PO4 의 수율은 51.3% 24.1%, 16.8%, 7.7%로 나타났다.

20-40% ethanol 용액으로 용출 된 분획(PO3)의 안지오텐신 전환효소 저해 활성과 수율을 동시에 고려하여 다음 분리 단계 시료로 선정하였다.

Vydac C-18 column에 의한 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 분리

Linear gradient elution에 의한 분리

ODS-AQ column chromatography에서 시료로 선정된 분획물(PO3)을 동결건조한 후 후 Vydac C-18 column을 사용하여 도 9의 chromatogram을 얻었다. 이 chromatogram을 elution volume 45 mL, 0.05% TFA를 함유한 ACN 용액으로 용출시킨 분획(PO3V1, PO3V2, PO3V3, PO3V4) 4개로 나누었다. 펩타이드 결합부위에서 빛의 굴절을 일으켜 펩타이드양을 단적으로 측정할 수 있는 흡광도를 215 nm에서 측정하여 4개의 분획물의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 측정하여 도 10에 나타내었다. PO3V1, PO3V2, PO3V3, PO3V4 는 각각 3.6%, 7.6%, 2.5%, 27.4%의 안지오텐신 전환효소 저해 활성를 나타내었다.

4개의 분획물 중 안지오텐신 전환효소의 저해효과를 고려하여 분획(PO3V4)을 다음 분리 단계 시료로 선정하였다.

Isocratic elution에 의한 재분리

일반적인 column chromatography에서 용매의 pH 및 이동상은 분획분리에 중요한 인자가 된다(Jeong 등, 2003). 본 실험에서도 0.05% TFA를 함유한 ACN 용액으로 용출시킨 분획물 중 안지오텐신 전환효소 저해 활성이 높은 PO3V4를 동결건조한 후 이동상을 바꾸어 rechromatography를 행한 결과 도 11과 같이 5개의 분획으로 분리되었다. PO3V4V1, PO3V4V2, PO3V4V3, PO3V4V4, PO3V4V5 는 각각 4.7%, 4.2%, 5.2%, 5.5%, 10.8%의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 도 12에 나타내었다. 그 중 안지오텐신 전환효소 저해 효과를 고려하여 분획(PO3V4V5)을 다음 분리 단계 시료로 선정하였다.

Superdex Peptide HR column에 의한 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 분리

Vydac C-18 column chromatography에 의해 최종 분리된 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드를 HR column chromatography에 의해 최종 분리된 분회물에 최종적으로 남아 있는 염 등의 불순물들을 제거하고 각각의 정제정도를 확인하기 위하여 Superdex Peptide HR column에 의한 gel permeation chromatography를 실시하여 도 13의 chromatogram을 얻었다. Superdex Peptide HR column으로, 단일 펩타이드(PO3V4V5S)를 얻었다. 이러한 결과는 안지오텐신 저해활성이 높은 펩타이드들이 1, 2차 정제를 통하여 이미 충분히 정제되었으며, 이렇게 정제된 분획이 3차 정제과정 중에서 단일 펩타이드로 정제되는 것으로 보인다. 마지막으로 단일 펩타이드(PO3V4V5S)을 아미노산 배열 측정용 시료로 사용하였다.

안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드의 아미노산 서열

Superdex Peptide HR column chromatography에 의해 최종 분리된 안지오텐신 전환효소 저해 펩타이드, 단일 분획물(PO3V45S)의 아미노산 서열을 분석하였다. PO3V4V5S 는 아미노산 3개로 구성된 펩타이드로 아미노산 서열이 Arg-Gln-Pro의 순으로 나타났으며, 이 펩타이드의 분자량을 계산한 합이 435.3 dalton으로 나타났다.

실험 결과에 따라, 키조개에서 분리한 물질의 저해 작용은 그 구성 아미노산의 조성이나 함량보다는 그 구성 펩타이드의 종류나 아미노산의 배열에 더 큰 영향을 받고 있음을 확인하였다. 즉 키조개에서 분리한 물질이 나타내는 안지오텐신 전환효소 저해 작용은 저분자 펩타이드의 길이나 구조 및 아미노산의 종류, 배열순서 등의 복합적인 작용에 의하여 안지오텐신 전환효소 저해에 작용 하는 것으로 추정된다.

Claims (15)

1. 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 (Angiotensin-I converting enzyme: ACE) 저해용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 효소는 프로타멕스(Protamex)인 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 키조개의 효소 가수분해물은 키조개의 효소가수분해물의 추출물 또는 정제물인 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안지오텐신 전환효소 저해는 혈압강하를 위한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 키조개 추출물 또는 키조개의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 (Angiotensin-I converting enzyme: ACE) 저해용 건강기능식품.
6. 제 5항에 있어서, 상기 효소는 프로타멕스(Protamex)인 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 건강기능식품.
7. 제 5항에 있어서, 상기 키조개의 효소 가수분해물은 키조개의 효소가수분해물의 추출물 또는 정제물인 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 건강기능식품.
8. 제 5 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안지오텐신 전환효소 저해는 혈압강하를 위한 것임을 특징으로 하는 건강기능식품.
9. (S1) 키조개에 단백질 분해 효소를 첨가하여 반응시키는 단계;
   (S2) 상기 S2 단계에서 얻어지는 반응액을 가열하여 반응액 내의 단백질 분해 효소를 불활성시키는 단계; 및
   (S3) 상기 S2 단계에서 얻어지는 반응액을 원심분리하여 얻은 상징액을 여과하는 단계를
   포함하는 것을 특징으로 하는 키조개의 안지오텐신 전환효소 저해 활성을 향상시키는 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 효소는 프로타멕스(Protamex)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 약학 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 상기 안지오텐신 전환효소 저해는 혈압강하를 위한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
13. Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 안지오텐신 전환효소 저해용 건강기능식품.
14. 제 13항에 있어서, 상기 안지오텐신 전환효소 저해는 혈압강하를 위한 것임을 특징으로 하는 건강기능식품.
15. Arg-Gln-Pro로 이루어지는 펩타이드.

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