JP2006265241A - クラゲタンパク質由来の新規ペプチドとその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】クラゲタンパク質由来の5種類の新規ACE阻害ペプチドを同定した。このうち2種類のペプチドは8個のアミノ酸からなり、残り3種類のペプチドはそれぞれ5,6,7個のアミノ酸からなる。いずれのペプチドもACE阻害活性を有するため、高血圧の予防に有効な機能性食品等として、また降圧剤等の医薬として利用することができる。
【選択図】なし
Description
(1)Gln―Ala―Pro―Ala―Gln―Ala―Val「以下、ペプチド1」
(2)Pro―Trp―Met―Tyr―Tyr「以下、ペプチド2」
(3)Phe―Gly―Val―Asn―Pro―Lys―Tyr―Thr「以下、ペプチド3」
(4)Phe―Thr―Ala―Pro―Met―Asn「以下、ペプチド4」
(5)Ser―Thr―Lys―Ala―Ser―Gly―Lys―Leu「以下、ペプチド5」
ペプチド1:グルタミン−アラニン−プロリン−アラニン−グルタミン−アラニン−バリン(配列番号1に示される配列)
ペプチド2:プロリン−トリプトファン−メチオニン−チロシン−チロシン(配列番号2に示される配列)
ペプチド3:フェニルアラニン−グリシン−バリンーアスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン(配列番号3に示される配列)
ペプチド4:フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン(配列番号4に示される配列)
ペプチド5:セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン(配列番号5に示される配列)
1.基質(Bz-Gly-His-LeuやHip-His-Leu)、アンギオテンシン変換酵素(ACE)をそれぞれ所定の緩衝液に溶解する。
2.最初に、試料液とアンギオテンシン変換酵素(ACE)を混合し放置した後、基質溶液を添加して、37℃で30分間作用させる。酵素作用は塩酸を添加して停止する。
3.所定の抽出処理を経て、基質から遊離してくる馬尿酸量を波長228nmの吸光度で測定し、試験値とする。
4.試料液の代わりに蒸留水で同様の処理を行った吸光度を、対照値とする。
5.先に塩酸液を添加して酵素の作用をゼロにしたときの吸光度を無作用値とする。
6.ACE阻害率は次の式で得られる。
阻害率(%)={(対照値−試験値)/(対照値−無作用値)}×100
ペプチド1 10mg
乳糖 35mg
小麦粉でんぷん 55mg
合計 100mg
以上の成分を混合し、カプセルに充填し、100mgのカプセル剤とする。
ペプチド2 5mg
乳糖 15mg
小麦粉でんぷん 80mg
合計 100mg
以上の成分を混合し、100mgの錠剤に成型する。
ペプチド含有濃縮液 30mg
乳糖 50mg
小麦粉でんぷん 50mg
コーンスターチ 20mg
合計 150mg
以上の成分を混合し、150mgの顆粒とする。
ペプチド含有濃縮液を凍結乾燥した粉末 30mg
乳糖 45mg
小麦粉でんぷん 25mg
合計 100mg
以上の成分を混合し、100mgのカプセル剤とする
[1]実験材料と方法
[1-1]クラゲタンパク質の加水分解
[1-2]加水分解産物のゲルろ過
[1-3]逆相HPLC(高速液体クロマトグラフィー)を用いたペプチドの単離精製
カラムは、ナカライテスク社製の5C18-AR-II(4.6×250mm)を使用し、検出波長は240nm、流速は1.4ml/minであった。移動相としてA液は0.1%TFA、B液は0.1%TFAを含むアセトニトリルを用いた。アセトニトリルの濃度勾配は30分で10%から55%まで上昇させた。試料は0.1%TFAで溶解し(10mg/ml)、100μlを注入した。溶出ピークごとに回収して凍結乾燥した。各ピークのACE阻害活性は、水(0.5ml)で溶解したサンプルのACE阻害率と210nmの吸光度から比活性を算出し、比較評価した。
グラジエント溶出でACE阻害活性を示した画分に対して、さらにイソクラティック溶出を行った。0.1%TFAを含む移動相のアセトニトリル濃度をグラジエント溶出での濃度を参考に調整し、単一の活性ピークを得るまで溶出条件を改良した。
[1-4]ペプチドの配列決定
[1-5]ACE阻害活性およびペプチド濃度の測定方法
ウサギ肺アセトンパウダー(シグマ社製)5gに120mlの0.1M Na2B4O7バッファー(pH 8.3,0.1M NaCl含有)を加え、4℃で30分間攪拌した。これを10000×gで15分間遠心分離を行い、上澄みをACE粗酵素抽出液とした。Bz-Gly-His-Leu(ペプチド研究所製)を基質として用いたACE活性測定によって、粗酵素液のACE活性の測定のための最適濃度を決定した。1ml単位で小分けして−20℃で保存した。
試験管に0.1M Na2B4O7バッファー(pH 8.3, 0.1M NaCl)で溶かした基質Bz-Gly-His-Leu(5.83mM)150μlを正確にとり、同バッファーで溶かしたペプチド試料(2mg/ml)50μl、ACE粗酵素液50μlを加え、37℃で40分間反応させた。反応は250μlの1N HClを加えて停止させた。次に、正確に1.0mlの酢酸エチルを加えて十分に攪拌後、遠心分離し(3500rpm、10min)、分解物Bz-Glyを抽出した酢酸エチル層を正確に0.3ml回収した。遠心エバポレーターで酢酸エチルを蒸発除去後、0.3ml H2Oを加え、攪拌後、228nmの吸光度を測定した。同じ手順で試料抜きの対照も同時に測定した。試料の吸光度と対照の吸光度の差のパーセンテージをACE活性の阻害率とした。
試験管にペプチド試料液0.5mlをとり、0.1M Na2B4O7バッファー(pH 9.2, 0.1M NaCl含有)2.0ml、0.01M Na2SO3液0.5ml、0.1% TNBS0.5mlを加え、37℃で1時間反応させた。420nmの吸光度を測定した。同時に同じ手順で0〜350μMのリジンおよびアラニンで作成した検量線からペプチド濃度を求めた。
[2]結果
「QAPAQAV」即ち、グルタミン−アラニン−プロリン−アラニン−グルタミン−アラニン−バリン(配列番号1)
と決定された。
「PWMYY」即ち、プロリン−トリプトファン−メチオニン−チロシン−チロシン(配列番号2)
と決定された。
ペプチド3:FGVNPKYT、即ち、フェニルアラニン−グリシン−バリンーアスパラギン−プロリン−リジン−チロシン−スレオニン(配列番号3)
ペプチド4:FTAPMN、即ち、フェニルアラニン−スレオニン−アラニン−プロリン−メチオニン−アスパラギン(配列番号4)
ペプチド5:STKASGKL、即ち、セリン−スレオニン−リジン−アラニン−セリン−グリシン−リジン−ロイシン(配列番号5)
配列番号2:クラゲタンパク質由来新規ペプチド2のアミノ酸配列
配列番号3:クラゲタンパク質由来新規ペプチド3のアミノ酸配列
配列番号4:クラゲタンパク質由来新規ペプチド4のアミノ酸配列
配列番号5:クラゲタンパク質由来新規ペプチド5のアミノ酸配列
Claims (15)
- 配列表の配列番号1〜5のいずれかに示されるペプチドおよびそのいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に1又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドからなる群から選ばれたペプチド。
- ペプチドが、配列番号1〜5のいずれかに示されるペプチドである、請求項1記載のペプチド。
- ペプチドが、配列番号1〜5のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に1又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有してなるペプチドである、請求項1記載のペプチド。
- 以下の(1)〜(5)のいずれかのアミノ酸配列からなり、アンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
(1)Gln―Ala―Pro―Ala―Gln―Ala―Val
(2)Pro―Trp―Met―Tyr―Tyr
(3)Phe―Gly―Val―Asn―Pro―Lys―Tyr―Thr
(4)Phe―Thr―Ala―Pro―Met―Asn
(5)Ser―Thr―Lys―Ala―Ser―Gly―Lys―Leu - 請求項4記載のいずれかのペプチドのアミノ酸配列中の1又は複数のアミノ酸が置換もしくは欠失し、又は、同配列に1又は複数のアミノ酸が挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、かつアンギオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
- クラゲを原料とし、請求項4記載のいずれかのペプチド及び/又は請求項5記載のいずれかのペプチドを含む、ペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末。
- ペプシンなどのタンパク質分解酵素によってクラゲタンパク質を加水分解後、ゲルろ過クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーを用いて、加水分解産物からアンギオテンシン変換酵素阻害活性の高い活性画分を分離し、得られる濃縮液を凍結乾燥する工程を含む、請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末の製造方法。
- 酵素による加水分解を20〜50時間行う、請求項7記載の製造方法。
- 請求項4又は5に記載のいずれかのペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するアンギオテンシン変換酵素阻害剤。
- 請求項4又は5に記載のいずれかのペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を包含する食品。
- 請求項4又は5に記載のいずれかのペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する医薬。
- 請求項4又は5に記載のいずれかのペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する健康食品組成物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含するサプルメント。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド、又は請求項6記載のペプチド含有濃縮液もしくはこれを凍結乾燥した粉末を有効成分として包含する降圧用又は血圧調整用医薬組成物。
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CN102286590A (zh) * | 2011-09-01 | 2011-12-21 | 李亚有 | 一种海蜇降压肽的制备方法 |
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