TWI516273B

TWI516273B - 一種篩選自苦瓜籽蛋白之具降血壓活性胜肽及其製備方法

Info

Publication number: TWI516273B
Application number: TW103140584A
Authority: TW
Inventors: 張誌益; 徐睿良
Original assignee: 國立屏東科技大學
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2014-11-24
Publication date: 2016-01-11
Also published as: TW201618804A

Description

一種篩選自苦瓜籽蛋白之具降血壓活性胜肽及其製備方法

本發明係關於一種抑制血管收縮素轉化酶的胜肽，乃用於預防、治療高血壓相關症狀之醫藥、食品組合物，該胜肽萃取自苦瓜籽；本發明係關於該胜肽製備方法。

近年來，生物活性胜肽備受研究人員和製藥業所關注，由於其對健康有益的效果，非常適合作為一個潛在的候選藥物。胜肽對其他候選藥物的第一個優點是它們提供更大的效力、選擇性和特異性(限於非特異性結合到比期望的目標等分子結構)。此外，胜肽的降解產物是胺基酸，因此可從而減少該代謝產物對於引起全身系統性毒性的風險(將藥物-藥物交互作用最小化)和少數胜肽積聚在組織中(減少因胜肽代謝物所造併發症的風險)。

高血壓是現代社會相當普遍的慢性病，目前常用的習知降血壓藥物多為血管收縮素轉換酶(angiotensin I-converting enzyme)抑制劑，血管收縮素轉換酶抑制劑之作用機制為抑制血管收縮素I轉換為能強效收縮血管的血管收縮素II，進而減緩因血管收縮所造成的高血壓。然而，習知降血壓藥物例如卡托普利(captopril)、伊那拉普利(enalapril)、利欣諾普(lisinopril)常會造成病患乾咳、干擾味覺、皮膚起疹、腎臟負擔或心律不整等副作用。

先前研究以天然食材衍生而來之血管收縮素轉換酶抑制劑中，例如來自雞蛋蛋白溶菌酶(lysozyme)之一習知酵素水解產物。惟該習知酵素水解產物之製備方法中，除了需要使用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶等三種酵素之外，亦必須經過80℃及95℃加熱及酸化處理，此外，還得經過繁複之純化後，才可以獲得具有血管收縮素轉換酶抑制活性之特定胜肽，過程實屬複雜。故該習知酵素水解產物之製備方法，實有改善之必要。

本發明之目的即在於提供一種胜肽，係包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列。

本發明之另一目的係在於提供一種抑制血管收縮素轉化酶的胜肽，係包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列。

本發明之另一目的係在於提供一種用於預防或治療一或多種與血管收縮素轉換酶相關症狀之醫藥組合物或食品組合物，其中該醫藥組合物或食品組合物係包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列及其藥學上可接受之載劑或賦形劑。

本發明之另一目的係在於提供一種胜肽用於製備預防或治療一或多種與血管收縮素轉換酶相關症狀之醫藥組合物的用途，其中該胜肽係包含如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列。

本發明之另一目的係在於提供一種胜肽製備方法，係包含：(1)將苦瓜籽乾燥、磨成粉及過篩後，得一均質的苦瓜籽粉末；(2)將該苦瓜籽粉末溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，並以超音波振盪器處理後，將所得到之上清液及沉澱物離心分離；(3)將該上清液冷凍乾燥後，溶於1%十二烷基硫酸鈉(SDS)中，並於離心後取其上清液，該上清液經10%三氯乙酸(TCA)/丙酮萃取及冷凍乾燥後，得一蛋白顆粒；(4)該蛋白顆粒以蛋白酶水解，並經分子量3kDa超過濾膜及高效液相層析儀(HPLC)處理，最後得一如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示之序列。

為達成前述發明目的其中所述之胜肽製備方法，其中該蛋白酶係為胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、鹼性蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶。

為達成前述發明目的其中所述之胜肽製備方法，其中該蛋白酶水解係以酵素受質比1：50~1：100之重量比例混合該蛋白酶及該蛋白顆粒。

為達成前述發明目的其中所述之胜肽製備方法，其中該分子量超過濾膜係為3kDa分子量超過濾膜，該HPLC為逆相高效液相層析儀(RP-HPLC)。

如申請專利範圍第11項所述之胜肽製備方法，其中該HPLC之流動相溶液包括溶液(A)5%乙腈(ACN)/0.1%三氟乙酸(TFA)於去離子水中與溶液(B)95%乙腈(ACN)/0.1%三氟乙酸(TFA)於去離子水中，並以1毫升(ml)/分鐘之速率沖提，其中該沖提步驟如下：(1)初始-45分鐘以100%A溶液至70%A混和30% B溶液沖提；(2)45-50分鐘以70%A混和30%B溶液至20%A混和80% B溶液沖提；(3)50-55分鐘以20%A混和80% B溶液等度沖提(isocratic elution)；(4)55-60分鐘以20%A混和80%B至100% B溶液沖提。

第1圖A為HPLC圖譜分析分子量小於3kDa的經過蛋白酶處理之苦瓜籽萃取蛋白質。B為使用自HPLC圖譜(A)分層所得之胜肽分離層(共19個分離層)，測量各分離層抑制血管收縮素轉化酶的活性。

第2圖為LC-MS圖譜分析圖之J分離層。

第3圖A為使用MS/MS光譜分析質量電荷比(m/z)為355.51的胜肽後，確認該胜肽為VSGAGRY(VY-7)。B為使用MS/MS光譜分析質量電荷比(m/z)為409.83的胜肽後，確認該胜肽為VDSDVVKG(VG-8)。

第4圖A為VY-7的IC₅₀抑制濃度。B為VG-8的IC₅₀抑制濃度。

第5圖A為VY-7，B為VG-8模擬腸道消化之後的殘餘物，以LC-MS圖譜分析。

第6圖為利用SDS-PAGE分析苦瓜籽蛋白質。

第7圖為VY-7在不同濃度之下對血管收縮素轉化酶的抑制效果。

第8圖為高血壓大鼠口服VY-7之後的收縮壓變化。

第9圖為血管收縮素轉化酶對於VY-7之預測結合位。

第1表為苦瓜籽萃取蛋白質水解之後小於3kDa之胜肽主要產物。

第2表為比較血管收縮素轉化酶抑制劑lisinopril與VY-7，與血管收縮素轉化酶之間結合位。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本發明係關於一種抑制血管收縮素轉化酶的胜肽，乃至於治療高血壓之醫藥組合物，本發明另關於一種胜肽製備方法，以及該胜肽用於製備降血壓藥物之用途。

術語““治療”、“治療中”及其類術語係指延緩、改善、減少或逆轉目前正折磨著患者之該病症或該病症相關之任何症狀的方法以及預防該病症或其任何正出現之症狀的方法。

術語”藥學上可接受”意謂物質或組合物必須與調配物之其他成份相容，且對患者無害。

本發明的組合物係可利用熟習此技藝者所詳知的技術，將上述的乳桿菌分離株，與一藥學上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable vehicle)，製備成一適用本發明組合物之劑型。其中該劑型包含但不限於：溶液(solution)、乳劑(emulsion)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、口含錠(lozenge)、片劑(troche)、口嚼膠(chewing gum)、膠囊(capsule)以及其他類似或適用本發明之劑型。

其中該藥學上可接受之載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。

上述組合物中，亦可視需要適宜地添加一或多種以上製劑領域內通常使用之溶解補助劑、緩衝劑、保存劑、着色劑、香料、風味劑等。

術語”藥學上可接受之賦形劑”，如本文中所用者，意指諳於此技者所知可與胺基酸為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2胜肽的物理和化學特性相容之任何生理學惰性，藥理學上不活性之物質。藥學上可接受之賦形劑包括，但不限於，聚合物、樹脂、增塑劑、填料、潤滑劑、稀釋劑、黏合劑、崩解劑、溶劑、共一溶劑、界面活性劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、藥學級的染料或顏料及黏度劑。

術語“醫藥組成物(pharmaceutical composition)”為一種固體或液體組成物，其形式、濃度和純度程度適合投予給病患(如人類或動物病患)，在投予之後，其可誘發所欲生理變化。醫藥組成物典型地為無菌及/或非發熱性者(non-pyrogenic)。

如本文所用術語「有效量」係指產生期望生物反應所必需之量。如彼等業內普通技術者可理解，複合物或生物活性劑之有效量可視諸如下列等因素而變化：期望生物終點、擬遞送生物活性劑、囊封基質之組成、目標組織等等。

擬藉由標題方法治療之「患者」、「個體」或「宿主」可為靈長類(例如，人類)、牛、羊、馬、豬、齧齒類動物、貓、或大。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

實施例1

本發明之活性胜肽SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，其製備方法如下：自苦瓜中取出苦瓜籽，置於50℃烘箱內乾燥2日；乾燥苦瓜籽磨成粉，之後過篩，取得均質苦瓜籽粉末；將苦瓜籽粉末以5：1(v/w)溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)，使用超音波震盪器打破苦瓜細胞壁；超音波強度為30%處理30秒四次；再以超高速低溫離心機以14,000rpm於4℃分離5分鐘，取得上清液；將前步驟所得上清液冷凍乾燥，乾燥所得粉末以1：5(w/v)溶於1% SDS；再以超高速低溫離心機以14,000rpm於4℃分離5分鐘，取得上清液；將上清液以2：1(v/v)溶於10%三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液之中，放置於-40℃環境中30分鐘；前步驟溶液以超高速低溫離心機以14,000rpm於4℃分離5分鐘，丟棄上清液，將沉澱物冷凍乾燥，得蛋白質沉澱物。

將前步驟蛋白質沉澱物，以1：50(w/w)比例利用多蛋白酶水解，該蛋白質酶與水解處理條件為trypsin(37℃,pH 8)、chymotrypsin(37℃,pH 8)、pepsin(37℃,pH 1.5)、alcalase(50℃,pH 8)、thermolysin(60℃,pH 8)各12小時；再用超濾膜以超高速低溫離心機以14,000rpm於25℃分離5分鐘，過濾出小於3kDa胜肽，再以冷凍乾燥得胜肽粉末。

前步驟所得到胜肽，以LC-MS/MS分析，於第1表揭露分析辨識之主要蛋白質。

實施例2

以實施例1方法取得1mg苦瓜籽萃取胜肽，溶於25μl 5% ACN與0.2%TFA水溶液；取20μl該溶液以RP-HPLC分離，使用管柱為C₁₈；HPLC之流動相溶液包括溶液(A)5%乙腈(ACN)/0.1%三氟乙酸(TFA)於去離子水中與溶液(B)95%乙腈(ACN)/0.1%三氟乙酸(TFA)於去離子水中，並以HPLC以1毫升(ml)/分鐘之速率沖提，其中該沖提步驟如下：(1)初始-45分鐘以100%A溶液至70%A混和30% B溶液沖提；(2)45-50分鐘以70%A混和30%B溶液至20%A混和80% B溶液沖提； (3)50-55分鐘以20%A混和80% B溶液等度沖提(isocratic elution)；(4)55-60分鐘以以20%A混和80%B至100% B溶液沖提。

分離層產物以214nm UV吸收光譜鑑定產物(第1圖A)。

前項所分離產物以不同濃度溶於200mM硼酸與300mM氯化鈉緩衝溶液，調整至pH 8.3，分別取10μl混和30μl 2.5mM hippuryl-L-histidyl-L-leucine(HLL)，於37℃反應5分鐘；再加入溶於200mM硼酸緩衝液之20μl 50mU/ml血管收縮素轉換酶，置於37℃反應30分鐘，再置於37℃，用震盪器以200rpm混和反應物，反應30分鐘；以70μl 1M鹽酸終止反應，再以1500g離心5分鐘。HLL與產物hippuric acid(HA)以逆向高效液相層析儀(RP-HPLC)分離，使用管柱為使用管柱為C₁₈，以及使用UV吸收光譜(228nm)測定HA含量。

計算抑制效果公式為：抑制效果=[1-(△A實驗組/△A對照組)]x 100，其中△A為UV吸收光譜(228nm)波峰定量值。

J分層對於血管收縮素轉換酶抑制效果高達80.21%(第1圖B)。

將J分層之產物以LC-MS分析其中胜肽，發現有二主要產物(第2圖)，再將該二產物以MS/MS分析，得知該二產物胜肽序列為VSGAGRY(VY-7或SEQ ID NO：1)以及VDSDVVKG(VG-8或SEQ ID NO：2)(第3圖A、B)。

同上述方法，測定VY-7或VG-8對於血管收縮素轉換酶抑制效果；分析其抑制效果達到總量之50%時的濃度(IC₅₀)，IC₅₀分別為7.96μM(VY-7)與13.3μM(VG-8)(第4圖A、B)。

為分析該二胜肽於口服之後在腸道內降解狀況，模擬腸道環境，將該二胜肽分別與pepsin以50：1(w/w)於pH 1.5反應兩小時，再以氫氧化鈉調整至pH 7-8，加入trypsin(20：1 w/w)、α-chymotrypsin(20：1 w/w)，於37℃反應5小時，同時以200rpm震盪；最後以95℃10分鐘終止反應。

以LC-MS分析上述實驗產物，觀察到VY-7降解殘餘量約為50-49%，VG-8降解殘餘量約為50-28%(第5圖A、B)。

實施例3

使用SDS-PAGE分離苦瓜籽萃取蛋白質，LC-MS/MS分析得知MAP30與momordin a約位於含量最多之30kDa(第6圖)；因此推斷可以由苦瓜籽萃取蛋白製造高量的VY-7。

測定VY-7抑制效果的藥物動力學實驗，以不同濃度VY-7對不同濃度受質的抑制效果繪成Lineweaver-Burk plot，結果顯示VY-7的抑制方式為競爭式抑制(competitive inhibition)(第7圖)。

利用具有高血壓表現型(尾收縮壓高於210毫米汞柱(mmHg))的大鼠實驗VY-7經由口服之後對於收縮壓的抑制效果，三重複之大鼠分別給予(1)純水(對照組)、(2)captopril(已知的血管收縮素轉化酶抑制劑)2mg/kg、(3)VY-7 2mg/kg、(4)使用thermolysin粗略水解的苦瓜籽萃取胜肽10mg/kg，於口腔插管注入0.5ml，注入之後每2小時測量血壓；結果顯示苦瓜籽萃取胜肽能對高血壓產生抑制效果，於8小時內收縮壓自220mmHg降至約180-190mmHg(第8圖)。

經由軟體(Molegro Virtual Docker 6.0)分析VY-7與血管收縮素轉化酶受質結合位(第9圖)，結果顯示VY-7與血管收縮素轉化酶受質結合位產生4個氫鍵，少於lisinopril(已知的血管收縮素轉化酶抑制劑)的8個氫鍵，但是VY-7所產生的氫鍵較短因此作用力較強(第2表)，由此可以說明VY-7之抑制能力。

綜合以上所述，本發明提供2新發現之苦瓜籽萃取胜肽，皆對於血管收縮素轉化酶具有抑制效果，顯示該2胜肽為治療高血壓等心血管疾病之潛力新藥或食品，並且能以模擬腸道環境之實驗佐證。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

<110> 屏東科技大學

<120> 一種篩選自苦瓜籽蛋白之具降血壓活性胜肽及其製備方法

<160> 2

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 苦瓜(Momordica charantia)

<400> 1

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 苦瓜(Momordica charantia)

<400> 2

Claims

一種胜肽，係SEQ ID NO：1所示之序列。
一種用於預防或治療一或多種與血管收縮素轉換酶相關症狀之醫藥組合物，係包含序列為SEQ ID NO：1所示之胜肽。
如申請專利範圍第2項所述之醫藥組合物，其中該症狀係選自高血壓、動脈粥狀硬化、血栓、心臟衰竭、糖尿病及其腎臟併發症、心功能不全及其組合。
一種用於預防或治療一或多種與血管收縮素轉換酶相關症狀之食品組合物，係包含序列為SEQ ID NO：1所示之胜肽。
如申請專利範圍第4項所述之食品組合物，其中該症狀係選自高血壓、動脈粥狀硬化、血栓、心臟衰竭、糖尿病及其腎臟併發症、心功能不全及其組合。
一種胜肽用於製備預防或治療一或多種與血管收縮素轉換酶相關症狀之醫藥組合物的用途，其中該胜肽係SEQ ID NO：1所示序列。
如申請專利範圍第6項所述之醫藥組合物的用途，其中該症狀係選自高血壓、動脈粥狀硬化、血栓、心臟衰竭、糖尿病及其腎臟併發症、心功能不全及其組合。