JPH06510796A - 酵素による不活性化から生物活性ペプチドを保護するための医薬組成物におけるダイズタンパク質又は加水分解物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素による不活性化から生物活性ペプチドを保護するための医薬組成物における ダイズタンパク質又は加水分解物本発明はタンパク質、精製された天然タンパク 質、分子量で分別されたタンパク質、又は部分的に加水分解されたタンパク質か らなる保護剤と組み合わせた治療剤を投与することによってタンパク質分解的に 不安定な治療剤の生物学的利用性を向上することに関するものである。

発明の背景 ペプチド医薬やペプチダーゼで分解される結合を有する医薬は最近では最も有望 な医薬であるが、胃腸管及び他の粘膜組織におけるタンパク質分解酵素の存在に よって不安定になるので、普通、それらを非経口的に投与する必要がある。患者 に対しては非経口的に注射するように指示することができるが、ペプチド医薬の 自己投与のために、皮膚非挿入的な方法を開発することが従来から望まれていた 。

プロテアーゼ・インヒビターや浸透強化剤は、粘Ｈｔ９ｉ与経路からペプチドや タンパク質が吸収されることに対する酵素的障壁及び浸透障壁を回避する手段と してしばしば考えられている。このような障壁のために、粘膜経路のペプチド及 びタンｌ＜り質医薬の生物学的利用性は低い。

特にペプチド医薬の経口的投与は、タンパク質分解酵素によるペプチドのカ日水 分解のために、生物学的利用性が非常に低（なっている。その範囲は、ループロ ライトについては、経口投与による０　０５％から膣投与による３８％までであ り、インスリンについては、相当する数値は０．０５％と１８％である。

Ｌｅｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ、上よ ２１３　（１９９０）参四。

タンパク質分解的に不安定な治療剤を不活性化するタンパク質分解酵素の例とし ては、腸腔内のペプシン　トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びカル ボキシベプヂダーゼ、及び胃腸管、鼻及び腟の粘膜表面上のアミノペプチダーゼ を埜げることができる。

成人哺乳動物の空腸を横断する完全オリゴペプチドの輸送は、ペプチダーゼ・イ ンヒビターとの組み合わせと同じように、生体外と生体内で示されてきた。

Ｆｒｉｅｄｍａｎ及びＡｍ１ｄｏｎ、ＰｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒ ｃｈ　８．Ｎｏ、１．ｌ）、９３．　（１９９１１゜Ｆｕｊｉｉ等は、米国特許 ＠４．６３９，４３５号明細書（１９８７）において、キモトリプシンで不安定 化する薬（カリクレイン又はカルシトニン）と−緒に経口的又は座薬的に投与さ れるキモトリプシンのインヒビターとして、■−イソプロピルー、４−［４−（ １，２，３，４−テトラヒドロナフトイルオキシ）ベンソイル１ピペラジン・メ タンスルホネートの使用をクレームしている。この特許文献には、前記の目的の ためにペンソイルピペラジンエステルを使用することも開示されている。これら のインヒビターのメカニズムについては、前記特許文献には記載がない。

Ｃｈｏ７ｉびＦｌｙｎｏは、国際特許出ＵＷＯ−９０１０３１６４号公報（１９ ９０）において、経口製剤におけるプロテアーゼ・インヒビターの使用を開示し ているが　それらインヒビターの性質を詳細には説明していない。実施例に記載 さ第１−でいる唯一のプロ５−アーゼ　インヒビターはアプロチニンだけである 。

Ｋ　ｉ　ｄ　ｒ　ｏ　ｎ等は、米国特３’［４，５７９，７３０号明細書（１９ ８６）において、インスリン経口製剤におけるプロテアーゼ・インヒビターの使 用を開示している。ダイス粉末がダイズトリブシン・インヒビター源として開示 されている（Ｂｏｗｍａｎ−１１ｉ　ｒｋ　ｔ−リブシン、′キモトリプシン・ インヒビター：分子量８０００ダルトン）。

Ｚｉｖ等は、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｍａｃｎｌ、３６．１０３５−１０３９　 （＋９８７＋において、ブＩ−１テアーゼ・インヒビターであるアプロチニンを 使用してタンパク質の経口吸収を白土させることを開示している。

Ｌ、　ｏ　ｓ　ｓ　ｅ等は、東ＩＺイノ特、！’ｆＤＤ２５２５３９Ａｌ　（１ ９８７）において、ペプチドの経口製剤におけるプロテアーゼ・インヒビターと してのε−アミノカプロン酸とアプロチニンとの使用を開示している。

Ｌｅｅは、Ｊ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　１３．２１３−２２３ 　（１９９０＋において、経口、経鼻、経頬、経直腸、経膣、経肺及び経眼の経 路用のペプチド製剤において、プロテアーゼ・インヒビターを使用することにつ いて検討している。

アミノ酸４個までのいくつかの小ペプチドが、ペプチド医薬の生物学的利用性を 向上することが示されていた。

Ｈｕｓｓａｉｎ等は、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１主１．　Ｎｏ、３゜ ９２３　（１ｉ５）において、鼻の粘膜にあるペプチダーゼを薬理学的に不活性 なペプチダーゼ基質との共同投与で一時的に阻害することができるとしたら、ペ プチドの経鼻投与は重要な経路になる可能性があることを示唆した。

Ｆａｒａｊ等は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉ ｅｎｃｅｓ　７９．Ｎｏ、８．６９８　（１９９０）において、小ペプチドであ るＬ−チロシル−し−チロシンとトリーＬ−チロシンメチルエステルの存在下で 、ロイシンエンケファリンの加水分解が減少することを示し、これらの小ペプチ ドによって　鼻のペプチダーゼが競合的に阻害されることを示唆した。

Ｆｒｉｅｄｍａｎ及びＡｍ１ｄｏｎは、前記の文献において、トリペプチドＹＣ ，Ｇとエンケファリン（ＹＧＧＦＩ−）とを−緒に１！ｉすると、ラットの潅流 腸においてＹＧＧＦＬの吸収が増加１゛ることを示した。

Ｈｏｒｉ等は、Ｊ、Ｐｈａｍ、Ｓｃｉ、７２，４３５　４３９　（１９８３）に おいて　各種のアミン保護ペプチドを使用して、インスリンを皮下注射した場合 に、インスリンを分解から（呆護することを開示している。用いられるペプチド は、ベンジルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、ベンジルオ キシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、ジ＝ｌ−ロフェニルーＰｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｙ、及びベンジルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏであった。多くの 刊行物が　植物性タンパク質の酵素処理を開示している。Ｊｏｈｎ　Ｒ，Ｔｕｒ ｎｅｒによる月間の米国特許第２．・１８９．２０８号明細書には、ペプシン変 性起泡剤成分が開示されている。アルカリ性材料、例えば、亜硫酸ナトリウム、 炭’、’１−ｔ−トリウム又は水酸（ヒナトリウムを使用して、ｐＨ６，４−６ ，８にてグリシニンを抽出する。続いて、調整用酸として二酸化硫黄を使用し１ 等電点ｐＨにて抽出物からグリシニンを沈殿させる（例えばｐＨ４，２−４，６ ）８次に、沈殿したグリシニン生成物を、タンパク質加水分解を起こす温度及び ｐＨ条件下で、ペプシンによって変性させる。グリシニンは、その水溶性が４０ −５０％に増加ｒるまで、ペプシンによって加水分解される。同けに、５ａｉｒ 等による米国特許第２．５０２．４８２号明細書は、ペプシンによるグリシニン の酵素的変性によって　ペプシン変性＃−離物の少なくとも６０重量％がｐＨ５ ，０で水溶性である中Ｎ物を生成することを報告している。

Ｐｕ５ｋｉは、　゛タン１＜り質分解酵素処理によるダイズタンパク質の機能的 性質の変性”　［Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ、５２．６５５−６６５頁（１９７５ ）］において、アスペルギルス・イリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚ ａｅ）によるダイス単離物（ｐＨ４，５での沈殿物）の酵素的変性を報告してい る。

数１のＰＩ行物も食塙水溶液を使用してダイズタンパク質を抽出することを報告 している。Ａ、に、Ｓｍ１ｔｈ等の論文（Ｊｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉ Ｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、Ｖｒ川　６０．１９３８年６月、１３１６−１３２０ 頁）は、中性り類の存在Ｆで水性抽出するよりも、ｐＨ６，７の水だけでダイス 粗粉末を抽出１゛ることにより、一層多くのタンノ＼り質抽出物を得ることを報 告している。

Ｐｅｊｉｔの米国特許第４．１３１．６０７号明細書は、２段階アルカリ抽出を 開示し〔いる。抽出は、最７月に亜硫酸ナトリウム及びマグネシウム塩の存在下 でｐＨ７，０−８，，５にて実施し１次にｐ　ｌ−（を１０．０−１０．５に増 加させて抽出を完結させる６続いて、抽出物をｐＨ４，５−５，５に調節し、タ ンパク質抽出１５を沈殿又はカード化させる。Ｍａｒｔｉｎｅｚ等に対して付与 された特許（米国特許＠３．５７９．４９６号）明細書も、多段階溶媒抽出法を 同様に開示している。

発明の概要 本発明者が見出したところによれば、タンパク質、ペプチド、精製天然タンパク 質、及び、濾過され、溶媒抽出され、分子量により分別されるか又は部分的に加 水分解されたタンパク′Ｒ（以下、保護剤と称する）は、それら保護剤の不在下 では、口、鼻、直腸又は腟への投与の際に酵素的不活性化を受ける、タンパク質 分解的に不安定な治療剤の、経口、経鼻、経直腸及び綾振の生物学的利用性を向 トする７ 発明の詳細な説明 本発明は、保護剤と、薬理学的有効量のタンパク質分解的に不安定な（ｐｒｏｔ ｐｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ−１ａｂｉｌｅ）治療剤とからなるが、但し。

前記の保護剤がダイス粉末である場合には、前記の治療剤はインスリンではない ものとする。

もう一つの観、占では、本発明は、タンパク質分解的に不安定な治療剤を、生物 学的利用性を向−トする量の保護剤と組み合わせて（但し、前記の保護剤がダイ ス粉末である場合には、前記の治療剤はインスリンではないものとする）投与す ることを含む、前記治療剤を必要とする噴孔動物又は池の動物に対して、タンパ ク質分解的に不安定な治療剤の生物学的利用性を向上する方法からなる。

本発明による医薬組成物の活性成分である、タンパク質分解的に不安定な治療剤 には、それらの構造中にペプチド結合を有するもの、又は消化管や鼻又は腟の粘 膜に存在する各種のタンパク質分解酵素にさらされると、分解、変性又はその池 の方法で不活性になるものが含まれる。従って、それらの治療剤を経口、経鼻、 経直腸又は経膣から投与すると、活性治療剤は吸収されることができないか、又 は澗足な程度の治療効果をもたらすことができない。

そのようなタンパク質分解的に不安定な治療剤の例としては、ペプチド、例えば 　カルシトニン　プロラクチン　アドレノコルチコトロピン、チロ１−ロビン、 成長ホルモン、性腺刺激ホルモン、オキシトシン、バンプレシン、ガストリン、 テトラガストリン、ペンタガストリン、グルカゴン、セクレチン、パンクレオジ ミン、ｊｉＪ（Ｐ（ｓｕｌ〕５ｔａｎｃｅ　Ｐ）及びゴナドトロピンを挙げるこ とができる。タンパク質分解的に不安定な治療剤の他の例には、黄体形成放出ホ ルモン。

ループロライド、エンケファリン、卵胞刺激ホルモン、コレシストキニン、サイ モベンチン、エンドセリン、ニューロテンシン、インターフェロン、インターロ イ・キン、インスリン及びインスリ、ノ１−ｖｌビンがある。その他の例とし７ ては、治療用抗体、例えば敗血症ショックの治療に使われる治療用抗１イ＼もＪ ）６゜タンパク質分解的に不安定１４治療剤と１ヅ〔は、天然起源の精製抽出物 、それらの化学的変性体、更Ｃ，−は組纒袷養に、Ｊ、る生産物　及び遺伝子工 学技術によって生産的にされた微生物又は細胞を培養することによって得られる 生産物を使用することができる。タンパク質分解的に不安定な治療剤には、合成 ペプチド及び派生（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）合成ペプチド、例えば、テラキし ・ン（イソプロピル−Ｎ−ＩＮ−（４−−モルホリン−カルボニル）−Ｌ−フェ ニルアラニン＝−３−メチル−シスディンｌ−２（Ｒ）−ヒドロ痺シー３　（Ｓ ）　−＝アミノ−４−シクロへキシルブタノニー１−）（米国特許８４．８１４ ．３４２号明細書）も含まれる。

本発明の保護剤は、化学合成タンパク質及びペプチド、天然タンパク質、！ｉ製 天然タンパク質、化学変性天然タンパク質又は部分的に加水分解された天然タン パク質、又は分子量、％性若しくは電荷によって分別されたタンパク質、又はそ れらの混合物であることができる。天然の食品規格タンパク質又は部分的に加水 分解された食品規格タンパク質が好ましい。保護剤の分子量は、１０００より多 いのが好ましい。

保護剤の分子量分別の操作を変更して、天然タンパク質の所望の分子量フラクシ ョンを生成することができる。溶媒抽出を用いて、分子量、極性又は電荷により 、タンパク質を分離することができる。タンパク質の酵素的又は化学的加水分解 に続いて、限外濾過膜又は透析膜によって所望の分子量フラクションに分離する ことができる。分子量分別は、ゲルクロマトグラフィー又は他の方法によっても 行うことかできる。

タンパク質又はペプチドの加水分解は、熱処理によ頃又は酸、塩基若しくは臭化 シアン処理により、更には他の化学的手段によって実施することができる。

酵素処理は、単一のタンパク質分解酵素により、又は同時若しくは順々に作用す る各種のタンパク質分解酵素の組み合わせにより、実施することができる。各種 のタンＢり質分解酵素１例えば、ｌ・リブシン、キモトリプシン、エラスターゼ 、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシン及びコラゲナーゼを 使用↑ることができるが、それらに限定するものではない。

本発明の保護剤を生産するための分別や酵素処理は、広範なりンバク質的材ネ４ に適用■゛る、す、ができる。′１ｌｌｌｌ物や植物起源の天然タンハク質が好 ；’Ｌい、それらのタンパク質的出発材料どしでは、ダイズ粉東ダイズタンパク 、小麦グル゛ｉ・ン。

アーモンド豆粉末、ビーナツツ豆粉末、カゼイン及び魚肉タンパク等があるが、 それらに限定されるものではない。

以Ｆの説明に限定するものではないが、本発明の保護剤は犠牲的なブＩ−げアー ・ゼ・インヒビターとして機能し２、それによって、経［工経鼻、経腟又は経直 腸がら投与された際に薬剤を分解することのできる成る稀のプロテアーゼに化学 変化を起こしやすい薬剤の生物学的利用性を向−Ｌ才゛るものど思われる。不安 定な薬剤と一緒にこれらの保護剤を投与↑ると、　（１）前記の保護剤による分 解ブローチＹ−ゼの競合的占１＋Ｉ！、　（２）向上された吸収力と治療効果を もたらす薬剤のプロテアーゼ分解の阻害、及び（３）保護剤の最終的な代謝や吸 収をもたらすことになる。

前記の作用機構を考慮すると、保護剤の溶解速度を、タンパク質勺解的に不安定 な治療剤の溶解速度にあわせることが望ましいと思われる。一般的に、保護剤の 溶解時間が短いと、低分子量治療剤に対１７て一層効果的であることを本発明者 は見出した。分子量範囲が１０００より大から１００，０００未満であるペプチ ドが好ましく、分子量範囲が１０００より犬から３０，０００未満であるペプチ ドが特に好ましい。

効果的な保護剤フラクションは、タンパク質分解的に不安定な治療剤の特定の不 安定性に合わせる必要がある。従って、アミノペプチダーゼ不安定性を有１“る 治療剤については、溶解速度が速（、アミノペプチダーゼに対して有効な保護剤 フラクションが好ましい。アミノペプチダーゼ不安定性を有する治療剤であるＤ −Ａ　ｌ　ａ−Ｄ−１，、ｅ　ｕ−エンケファリン（ＹｄＡＧＦｄｌ−）に対し て好ましい保護剤は、実施例１５で示されているように、ダイズ粉末をペプシン 処理してデカンテーションした、分子量３０，０００未満のフラクションである 。一般的に、−挿又はそれ以上の腸管又は粘膜のプロテアーゼに対して不安定性 を有するタンパク質分解的に不安定な治療剤に対して好ましい保護剤は、前記の ように保護剤を実用的な全投与量で投与した場合に、治療剤の全身的な生物学的 利用性を改善するものである。タンパク質分解的に不安定な特定の治療剤に対し て好まし保護剤フラクションは、デカンテーション、濾過、抽出、加水分解、及 び本明細書に記載するサイズ分別法によって得られる。タンパク質分解的に不安 定な特定の治療剤に対して好ましい保護剤フラクションは、本明細書の実施例に 記載したような生体外及び生体内操作を用いることによって同定される。

本発明による医薬組成物は、治療を必要とする咄乳動物又は他の動物に、保護剤 どタンＢり質分解的に不安定な治療剤とを胎内で共存させることのできる任意の 形、例えば、錠剤、顆粒剤又はカプセル剤の形で、両成分を別々に又は−緒に腸 溶性コーティングをして、投与するのが好ましい。この組成物は、通常使用され ている座薬ベースに両成分を加えて調製した座薬の形で経直腸又は経膣で投与す ることもできる。同様に、保護剤とタンパク質分解的に不安定な治療剤とを、経 鼻スプレー中で一緒に投与することもできる。望ましい場合には、前記の投与形 を、薬剤的に許容することのできる各種の添加剤、例えば、補助剤及び乳化剤と 共に加えることができる。

タンパク質分解的に不安定な治療剤の投与量は、その物質を従来法によって経口 的に投与する場合には、投与量の０．０００１１自から１倍が好ましい。保護剤 の量は、投与紅路、治療剤の不安定性及び治療剤の投与量に依存する。経口、経 直腸及び綾振投与においては、保護剤は一般的に約ｌＯ〜１５００ｍｇで投与さ れる。経口投与の溶液又は懸濁液の場合には、保護剤はｌ　Ｏｍｇ〜約１５ｍｇ で投与される。経鼻投与においては、保護剤の投与量は一般的に少なく、約１〜 １００ｍｇの範囲である。

本発明による数種の経腸吸収用医薬組成物を、下記の結果により、有効性につい て評価した。

以下、本望力を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれらによっ て限定されるものではない。

実ｎ澄Ｉ−」■販　ンバノ　ｒ　、　＋、　ｏ　：ｆ″′二　ノ　１：　ズ′　 ｐＨ７，５の０．ＯＩＭリン酸！！街液１３５ｍ１及び０．０５％チメロサール １５ｍ１中でダイズ粉末（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、）４．５ｇを１５分間 擾排口、ＩＯ分間哩音′ｅｉ処理１．、そして室温で２５時間攪拌した。混合物 を静置し、上澄み液を流し、遠心分離Ｉ７て濾過した。こうして、回収−使用す るための、又は更に処理するための直接可溶性フラクションを得た。

：１　ゝパ　：ＩＩゝ■票こ四ＷぶユＡ扮ゴ１分別上り盃Ａ粉末 実施例１の方法を繰り返して、デカント及び濾過したダイズ粉末溶液を調製し、 更にそれを以下のように処理して、分子量（ＭＷ）識別を行った。可溶化フラク ションを、真空オープン内で５５°Ｃにて蒸発乾固した。蒸発残渣を水に溶がし 。

分子１ｘｏｏｏカツトオフ（ＭＷＣＯ）スペクトラム透析チューブ中で、透析媒 体を定期的に取り替えながら２４時間にわたって水で透析した。残留物を蒸発さ せて、分子量がｔｏｏｏより犬の可溶化ダイズ粉末フラクシジン１．１７ｇを得 た。

尖　：ｒ＋）゛バｎ′１じＪｍ”　ＯＦ　：１：　Ｋ−Ｋ　０Ｋ−ＯＫ−’　” 市販ダイズ粉末［Ｓｉｇｍａ　Ｎｏ、Ｓ−９６３３］　（２８８ｇ＞を、ｐＨ７ ゜５の０．ＯＩＭリン酸１！ｌｊ液８６４０ｍ１及び０１％チメロサール１９２ ０ｍ１に、攪拌下で加えた。懸濁液を、更に１５分間マグネチック・スターラー で混合した。その後、混合物を１０分間超音波処理し、室温で２４時間攪拌した 。次に、溶液を２５００−３００Ｏｒｐｍで１時間遠心分離した。公称分子量限 界１００にのベリコンｐ　（Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、：マサチュ ーセッツ州ベッドフォード）を用いて、限外濾過によって上澄み液を分離した。

残留液（〉１００Ｋ）を捨て、公称分子量３０にベリコン膜を使用して透過液（ ＜１００Ｋ）を分離した。２番目（３０に一１００Ｋ）は残しておき、２ｉ）目 の透過液を公称分子量ＩＫベリコン膜で分離した。３番目の残留液（ＩＫ−３０ に、）は残しておき、３番目の透過液（＜ＩＫ）は捨てた。ＩＫ−３０にフラク ションを凍結乾燥し、３０に−１００にフラクションを真空オープン中で乾燥し た。１に−３０にフラクションの収量（７，３３ｇ）は、原料ダイズ粉末の２． ５％であった。３０に一１００Ｋフラクションの収量（５，２５ｇ）は、原料ダ イズ粉末の１．　８％であった。

４　′　「ｊ　゛　バノ　−：べ　２　゛　こ　７　ノ　゛　こノ１：１、 ペプシンを使用してダイズ粉末を低分子！　（ＭＷ）フラグメントに加水分解し 、加水分解物を次の方法に従ッて１０００−３５００Ｋ、３５００−６／８Ｋ及 び６／’８に−１２／１４にの分子量フラクションに分別した。

ダイズ粉末（Ｓｉｇｍａ　＃Ｓ−９９６３３：５−　４ｇ）及びチメロサール（ Ｒ終濃度５０ｐｐｍ）を、ｐＨ１，９（７）０．２Ｎ−ＫＣＩｌｏ、２Ｎ−ＨＣ Ｉ含有溶液１８０ｍ１に加え、３０分間混合した後、ペプシン（Ｓｉｇｍａ　＃ Ｐ−６８８７　：　１８．０ｍｇ１を加えた。アリコート各２０ｍ１を１分子量 １２゜０００−１４．０００カツトオフ（ＭＷＣＯ）スペクトラムの透析チュー ブ９個にそれぞれ入れ、３７°Ｃの振動水浴中でｐＨ１，９のＫＣＩ緩衝液５５ ｍ１で透析した。２時間１麦及び６時間後に１１衛液を変え、透析を２４時間続 けた。各時間毎の透過液（＜１２／１４Ｋｌ　を−緒にして真空オープン中で５ ５°Ｃにて留去させた。

２時間目、６時間目及び２４時間目の試料を、Ｉ　ＯＯＯ’ＭＷＣＯチューブに 入れ、水で透析した。得られた残ｌＪ液（ＩＫ−１２／１４に＋を真空オーブン で５５”Ｃにて留去させ、合計重量４４９．５ｍｇを得て、そのうち４１８ｍｇ を脱イオン水３０ｍ１に溶がし、２本の３５００ＭＷＣＯ透析チューブに入れ、 室温で２４時間　水５５ｍ１で透析した。２時間、６時間及び２４時間の透析後 に水を変え、透過液（ＩＫ−３，５Ｋ）を−緒にし、真空オーブン中で５５°Ｃ で留去させた。　− 各チューブの残留液をそれぞれ６０００／８０００ＭＷＣＯチューブに入れ、前 記と同ＦＭに処理した。透過液を留去させると、３５００−６０００／８０００ Ｍｗ（７１１）フラグメントが得られた。６ｏｏｏ／８ｏｏｏ−１２ｏｏｏ／１ ４ｏｏ。

ＭＷフラクションを代表する残留液を一緒にして留去させた。以下に、前記の分 別操作を要約して示す。

分別経路上 パ　、８べ２゛こ　゛ ダイズ粉末（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、；Ｓ−９６３３）を実施例１と同様 に処理し、乾燥した。この材料を３０　Ｋ−ＭＷＣ’０１ｌｉで限外濾過した。

残留液（＞３０Ｋ）を集めて乾燥した。この材料１３．８ｇを水９００ｍ１に溶 がし、０、ＩＮ−ＨｃＩでｐＨ２，Ｑに調整した。固定化ペプシン（４％架橋ア ガロースビーズに固定：Ｓｉｇｍａ　Ｃｂｅｍ、Ｃｏ、：Ｐ−３２８６：４０ユ ニット／ｍｇ）１．１９’ｇを加えた。コ（７）Ｗ濁液を３７°ｃに維持し、３ 枚（７）３０に−Ｍｗｃｏｇで限外透析した。透過液（＜３０Ｋ）を１５分間隔 で集めて凍結乾燥した。残留液（＞３０Ｋ）を限タシ濾過にかけてリサイクルし た。ペプシン加水分解の生成物は透過液にある。表１に、各透過フラクションの 容量、及び各乾燥フラクション中の加水分解ペプチドの重量を示す。　：　Ｈ： ＠　１　こ’　Ｂ　１　べ　、′−ペ　すｎ　””ｍｌ’ｌ　ｍ １５　−”　６００　’３６１．１ ３０　”　３（１０３８５，０ ４５３００３４１，５ ６−ｏ　３００　３６１．３ ７５”　２７５　４０３．　２ ９０　３５０　３９０、　１ ＋０５　’　５００’　５５７．８ １２０　６００　４１０、　５ ゛　５　・ ：１　゛　パノ　−　：車　こ　；　寥−２゛　に工１ス　−ゼ°　ズ　、 ダイズ粉末（６００ｍｇｌを、５０ｐｐｍのチメロザールを含むｐＨ７，５のｏ 、ｏｉＭリン酸カリウム！１ｔｌｉ？＋！２　ｏ　ｍ　ｌ中に分散させた。トリ プシン２ｍｇを抑え、混合１１５を１２／１・ｉＫ−Ｍ〜ＶＣＯ透析チューブに 入れた。混合物を３７°Ｃの振動水浴中でｉｌｌ液液５０ｍ１透析した。２時間 後及び６時間後に緩衝液を変えて２４時間透析を続けた。５Ｑｐｐｍのチメロサ ールを６時間目の緩衝液に加えた。この操作を３回行った。

各３回のそれぞれの透析試ｆ４について、２時間目、６時間目及び２４時間目の 透過液試１４を一緒にして、２８０ｎｍの吸収度を測定して、その試料を５５° Ｃの真空オープン中で留去させた。３つの留去残渣に脱イオン水２０ｍ１及び５ ０ｐｐｍのチメロサールを加えて元に戻した。

エラスターゼ（エラスターゼ溶液０．１８２ｍ１．１１ｍｇタンパク質／ｍ１） ２．０ｍｇをそれぞれに加え、その試料を１２／１４に−ＭＷＣＯ透析チューブ に入れて、緩Ｉｉ液で透析した。６時間１狙二緩衝液を変えて、２４時間透析を 続けた。２８０ｎｍで吸収度を測定した後、前記と同様にして透過液を留去させ た。

こうして得られた材料を連続処理トリプシン／エラスターゼクイズと称する。

分子量は＜１２／１４Ｋ　（１２／１４に未満）であった。

：　こ　ｌ　襲　こ　−−し１　文　。

レニンアンタゴニスト・トリペプチドであるテラキレン（硬質ゼラチンカプセル 製剤中の固形結晶医薬粉末２００ｍｇ）を、水１５０ｍ１中の供試インヒビター Ｉｇの水性スラリーと一緒に、絶食させた４頭のピーグル大に投与した。トリペ プチドの血清レベルを、投与から１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３ 時間後及び４時間後の６回測定した。４頭の絶食させた犬は、それぞれの試験に おいて、各々の前週にそれ自体のコントロールどして使用した。血清をＮ−ブチ ルクロライドで抽出し、キモトリプシン水溶液でインキュベートした０分解生成 物は、フルオレスカミンで誘導体化した後に分析した。蛍光検出型としては、Ｋ ｒａｔｏｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ　２８０を用いた。カラムには、Ｗａｔｅ ｒｓ　Ｎｏｖａｐａｋ　Ｃ−１８を用いた。放射波長は３８０ｎｍであった。

移動相は水７／アセトニトリル（７５：２５）で、流量は１．０ｍｌ／分であっ た。

検出限界は、ｌｏｎｇ／ｍｌてあった。台形法（ｔｒａｐｅｚｏｉｄａｌ　ｒｕ Ｉｅ）を使用して各人について、濃度一時間のプロットから、曲線下の０〜４時 間の面積（Ａ　ＵＣｓ　）を計算した。

表２は、市販のダイズタンパク質（ＰＰ　６２０：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎ ｏ！ｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ　製）及び処理されたダイズ粉末の１−３０にフラクシ ョン（実施例３で調製）が、キモトリプシンで不安定になる治療剤であるテラキ レンの経口生物学的利用性を向上することを示している。

表Ｌ イヌに関する、血漿レベル下の領域対時間カーブ（ＡＵＣ）ＡｔＪＣ（μｇ〜時 間／ｍｌ） １　３４１＋２　３４１０１　０４１３２　０４０９４　”ｆｊＰＰ６２０　０ ．８６３　０．４３６　０．１１？　０．４１７　０．４５８ダイズ（１−３０ Ｋ）　０．４２０　０．３２０　０．０７８　０．３２６　０．２８６コントロ ール　０．０４３　０．０２６　０．０２２　０．１０６　０．０４９比：　２ ０１　１６８　５．３　３，９　１１．５ＰＰ６２０／コント叶ル ダイス（１−３０Ｋ）　９．８　１２．３　３．５　３．１　７．２゛トル ８゛−−し゛　Ｉｊ’　ｓ　：　’ 標準的な操作を用いて、種々のタンパク質及びその処理生成物と、テラキレンの キモトリプシン分解との生体外阻害能力を、以下のように評価した。ａ−キモト リプシン（０，６７ＸＩＦ’Ｍ）、テラキレン（０，０６５ｍＭ）及び供試イン ヒビター（約０１から／又は０．５ｍｇ／ｍ＋の濃度）の試験溶液を、ｐＨ６， ５のクエン酸（０，ｌＯＭ）／リン酸２ナトリウム（０，２０Ｍ）ｉ！衡液中で 、Ｒ終緩衝液濃度３００ｍＯｓｍとして調製し、３７°Ｃでインキユベートした 。

時間Ｏの時点及びその後５分間の間隔で試料を取り、）ＩＣＩでｐＨ２，０にし て冷却し、ＨＰＬＣ分析の準備をした。テラキレンのＨＰＬＣ分析は、Ｗａｔｅ ｒｓ　Ｒｅ５ｏｌｖｅ　５ｕ　Ｃ−１８カラムを使用して実施した。移動相は水 ／アセトニトリル（５０：５０）混合物であり、その混合物１リツトル当たり１ ｍｌのリン酸を加えた。データは、次式から計算し、時間０の時点をコントロー ル値として比較したテラキレン分解の阻害％として示した。

阻害％＝１００Ｘ　［１−ｋｌｎ＋、／ｋｅ］ここでｋｌ、、ｈは保護剤存在下 でのテラキレンの初期分解速度であり、ｋｅは保護剤がない場合のテラキレンの 初期分解速度である。

阻害％は、表３に示すように、デカントし、限外濾過されたダイス粉末のＩＫ− ３０にフラクションについて測定した。

デカントされた限外濾過ダイス粉末の１−３０にフラクションに−し゛　モ１１ ゛　・小　− インヒビター濃度　インヒビター濃度傘ｍ　ｍＪ　ｍ　’へ°　ｍＩ　％ ０．５　０．０４９０５　７５．４ ０．２５　０．０２４５３　７９．１１１０．１　０．００９８１　２１．５ ０．０５　０．００４９１　２９．３ ０．０＋　０．０００９８　４．８ ３タンパク質含量に関して修正 ９゛−−レ゛　α−モ・１　パ　：　ヒ　−Ｋｉ定汰 Ｋｉは阻害ミカエリス−メンテン定数として定義され、活性部位に対するインヒ ビターの親和力として？ｆ来がら測定されるもので、酵素のインヒビターとして の能力を表す。Ｋｉは、一定の基質及び配素濃度において、数種の濃度のインヒ ビターに間して得られた初期分解速度のデータから測定することができる。初期 速度は、表４に示すとおり、１分間当たりに分解されたテラキレンのミリモルと して表される。

表土 デカントされた限外濾過ダイス粉末の１−３０にフラクションに−−し＋　ｌ　 嘗〜　・小 インヒビター濃度　インヒビター濃度３１に１ｍ　ｍｌ　ｍ　１”　ｍｌ　ｍｍ ｏｌｍＯ，５０，０４９０５１，９３Ｘｌｏ−’０２５０．０２４５３　１．５ ９Ｘ　ＩＦ　’０．１　０．００９８１　６．１７Ｘ１０−’０．０５　０．０ ０４９１　’　５．５６Ｘ１０−’０．０１　０．０００９８　７．４８ＸＩＯ ”−ル　］′０−ル　７．８６Ｘ１０−’９テラキレンの初速欠損 ・會タンパク質含量に関して修正 別法として、インヒビターの単一濃度についてのＫｉ（一点Ｋｉ）を、競合的阻 害についての標準ミカエリス−メンテン式を使用して測定することができる。

多点濃度についてのＫｉ（多点Ｋｉ）を、同じ間係を使用し、非線形回帰（ｒｅ ｇｒｅｓｓｉｏｎ）分析を用いて前記式にデータを合わせて測定することができ る。

実茄伊１１１ 本発明の保護剤の性能において、溶解時間は重要な因子である。本明細書に開示 する目的で、供試固体の０．５ｒＢ／ｍｌスラリーが、室温にて８ｒｐｍの攪拌 下で、ｐＨ７のＯ，１Ｍクエンｌｉ！１０．　：２＋ｖｉリン酸２ナトリウム！ ！面液に完全に溶解するのに必要な時間を、溶解時間として報告する。視覚検査 によって、完全に溶解した１３つを決めた。

大正呈上上 保護剤である各種のタンパク質について、タンパク質％を測定した。試料中の炭 素、水素、及び窒素の濃度を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　２４００Ｃ，Ｈ。

Ｎ元素分析器を用いて測定した。約２ｍｇの試料を正確に秤量し、分析器に入れ た。試料中の窒素％に６．２５を乗じてタンパク質％推定価とした。

実嵐圓１１ 各種の市販及び処理タンパク質フラクシジンが、キモトリプシンによるテラキレ ンの分解を減少させる能力を測定した。ダイス粉末はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ。

Ｃｏ、の製品、アーモンド豆粉末及びビーナツツ豆粉末はＰｅｒｔ　Ｌａｂｓの 製品、小麦グルテンはＴｏｔａｌ　Ｆｏｏｄｓ　Ｃｏｒｐ、の製品であった。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｔｎ、　Ｃｏ、製のダイス粉末は炒っていないので、分子量 ８０００の活性ポウマン・パーク（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂ　ｉ　ｒｋ））リブシン／ キモトリプシンインヒビターを含んでいる。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、製のダイズタンパク質（ ＃ＰＰ６２０）は熱処理調製物であるので、ポウマン・パーク・トリプシン／キ モトリプシンインヒビターは不活性化されている。阻害％は実施例８に記載の方 法で測定した。表５は、供試保護剤フラクションが、キモトリプシン感受性のレ ニンインヒビターであるテラキレンのキモトリプシン作用による分解を減少させ ることを示しでいる。

市販及び炉・Ｊｌ　）ｙンパク簀（０鋪艮・Ｈｔｌ）による−　１、−−−−− 予“プ合１７つ＞１分解−のΔ１イ参肩、！、−一、、−−−−６１．−−一− −−１−−イシ（Ｊｌｌ　イ）１（、／３％万一、−７−−、−一　、　、、　 、−＝、、、、、、、ｕ’ｉ町；１シ’ＡｆＥメ１；！）杓鰹窒P列用、、ｉ； ゐ１ １　、　ｉ、ｌ”　（ス゛粉木°ｌ＼°）“ンン処理及びビ（析（・ｌＫ）　８ ７聾１゛イス“粉末；へ°゛７゛ンン処１里及び分別（実施ＰＡ４）分子量’　 １ｆｌ（Ｘ）−ぢ００　λ４０′→子量’、　３５００−６．／’８Ｋ　４６． ６ｔ→子＠６．・’８に−１２，、、、”１４Ｋ　＆５．ｉ３り゛イス゛Ｉ分末 　６９，９ ４り゛イス゛粉末；テ゛カント及び限外）慮過分子量１１に一３０Ｋ　７５．４ 及び９３．３（２調製物）分子量：　３０Ｋｉ００Ｋ　７５．４及び８６．８（ ２調製物）５り゛イス゛粉末；分子量１０００以−１−二透析　９７６６小麦り ゛ルテン：テ゛カント及び限外湾メ再分子ｊｌ　：　ＩＫ−３０Ｋ　９５．８７ ！ト麦り’ｌｌノン　７６８ ８　ヒ”−ｉ’：Ｉ豆粉末：テ゛カント及び限外濾過分子量：　ＩＫ−３０Ｋ　 ２８６ ９アー玉ンド豆粉末：テ゛カント及び限外濾過η子量：　ＩＫ−３０Ｋ　３７６ セｙ４−イフタノ乃：り１（σケ９ｙ１１工旦ａ私Ｊ旦εユ、−一□−一」シ１ ９ニー人飛中１Ｌ止 市販の神々のタンパクｌ料及び処理タンパク質フラクションについて、タンパク 質％、溶解時間及びＫｉを測定した（それぞれ実施例１１１０及び９に記載の方 法による〉。これらのデータを表６に示す。これらのデータは、低Ｋｔ及び短溶 解時間の両方を示す分解抑制性フラクションを調製することができることを示し ている。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、　（”、ｏ、製のダイズ粉末は炒っていないので、分子 量８０００の活性−１ｅウマン・ハーク・］・リブン）７７４１１リブシンイン （ニヒ゛ターを含んでいる。

表Ｏ Ａ市販タン′り質／Ｉ分分 末　カセ゛イン（ＳｉｇｍａＣ−５８９０）　８７．’Ｘ　＞　４日　０．２４ ０”２り゛イスゝ粉末　５１．６９　＞４日　０１８″３小麦り゛肩ン　７８． ８１　＞　４日　０．０９１”Ｂ限外濾過（ＩＫ−３０Ｋ）物質 １．９Ｅ１”￥９末　９８１　ｏ　１分　０００７６５２７七ド豆粉末　１０３ ７　２３分　０．０６１８電３カ七ゝイン　７１．３１　１．８分　−４ビ−ナ フ豆１９末　１３，１９　３．１分　０．０１２０’５小麦り゛［７３７，８１ ３８分　０．００６０”Ｃ限外濾過（３０に一１００Ｋ）物質 １り゛イス゛粉末　４４．４４．　２．６分　０．００２９Ｄ透析：〉ＩＫ １、タ′イスゝ粉末　７６．５　＞４日　０．０１０Ｅ限外濾過及びへ°アシン 処理（＜３０Ｋ）１４：コレ２ス　ｍ＝’−８ＣＣＫ−８−ビ・・・　−・　、 −ｊ）ＢＢＭＶ　：　”パ　−　５　゛こ−７＝ラット空腸の刷子縁膜小胞（ｂ ｒｕｓｈ　ｂｏｒｄｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅｖｅｓｉｃｌｅ：ＢＢＭＶ）を、Ｋ ｅｓｓｌｅｒ等の方法に従って調製した〔Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ　５０６　（１９７８）１３６］、ＢＢＭＶ（２５μｇタンパク質）を、 ３７°Ｃにて、全量１ｍｌで、保護剤（０，１５ｍｇ／ｍｌ）の存在下及び不在 下で、ＣＣＫ−８（１０μｍｏｌ）と共にインキュベートシた。試料を１分後及 び３分後に取り出し、氷水浴中でアセトニトリルで反応を停止し、高速液体クロ マトグラフィーを使用して、未分解ＣＣＫ−８を分析した。表７に示すデータは 、処理ダイズタンパク質の二つの異なった分子量フラクションが、ＢＢＭＶプロ テアーゼ（おそらくはアミノペプチダーゼ）によるｃ　ＣＫ、　−８Ｓ解のイン ヒビターとして活性であったことを示している。

此二りゴこ゛７ＣＣＫ−８；ビ゛）°　六ＣＣＫ−０ ソｂＮ≧渉゛ＩＩ　目　ＩＫ−３０Ｋ　３０に４００Ｋ（分）　インヒヒ゛ター なし　インヒヒ゛ター　イン比゛ター１分　４２％　５９％　６７％ 」Ｌ　８％　１０％　１６％ 実侘びユｊユ」」１畢σ−ミノベーー　−一ゼこ　７Ｊ　こ・ペンタベブヂドで あるエンケファリンアナログのＤ−Ａ　］　］ａ−Ｄ−Ｌｅ　ｕ−エンケファリ ン（ＹｄＡＧＦｄＬ）　（１，０ｍｇ）を、慢性的回腸痩孔形成（ｆｉｓｔ＋口 ａ　ｔ　Ｌ′！ｄ）ラッ１−に、回腸から直接投与した。放射性同位元素で標識 したＹｄＡＧＦｄＬ　（１，１２μｇ）を４種の各保護剤と一緒に投与した。そ れらの１影護削は、　（１）デカントシたダイズ粉末［分子量ＩＫ未満１　：　 （２）デカンｌ〜及び限外濾過したダイズ粉末１分子量ＩＫ−３０Ｋ］　：　（ ３）ペプシン処理した（ＦＭＣＡＣＴ＋−ＭＯＤ）ダイズ粉末［分子量３０に未 ＸＩ　：　（４）効力のあるアミノペプチダーゼ・インヒビター・アマスタチン （正のコントロール）である。投与１妾の神々の時点で、頚静脈カニユーレから 血液を採取し、逆相ＫＣ−１８薄層クロマトグラフィー（ＴＬ、Ｃ）プレー４　 （Ｗｂａ　ｔｍｅｎ　Ｃ０１）を朽用して放射分析薄層りＵマドグラフィーによ り、完全ＹｄＡＧＦｄＬを定量ｌ−た。Ｔ　Ｌ　Ｃブｌ／−トを、ｌ−プロパツ ール／帆　ＩＭリン酸塩級養液（ｐＨ４−１）　（３０ニア０）で展開した。

表８は、各種の処理からの絶対的な生物学的利用性を示している。ペプシン処理 （ＦＭＣＡＣＴＩ−ＭＯＤ）ダイズ粉末（分子量３０に未満）は、腸内のアミノ ペプチダーゼに対（−で保護剤として特に有効であり、吸収％においてほぼ１日 倍の増加が示された。効力のあるアミノペプチダーゼ・インヒビターであるアマ スタチンも有効で、ＹｄＡＧＦｄＬの生物学的利用性が腸内アミノペプチダーゼ による分解によって部分的に制限されることを示した。炒られていないダイズ粉 末は、腸内アミノペプチダーゼによる分解に対１．て保護作用を促供しなかった 。

表五 保護剤　ｎ　ＹｄＡＧＦｄＩ力生物学的な上［は止±−−１６１，７８±０．４ ６テ゛カンテーンヲンされたタ゛イス゛１沿末　４　１．．７４−１−０．６８ ＜ＩＫ　Ｌｏｏｍ　− テ゛カンテーンヲン及び限外濾過された　４　２７６±１．４３り１イスゞ粉末 （ＦＭＣＡＣＴＩ−ＭＯＤ；１に一３０Ｋ　：　１５０ｍ　− へ°７°ンン処理り゛イス゛を９末；　４　１９．５４±１３７５分子１ヒ剰辺 狂Ｗ釦鵠Ｌ　□ アマスタチン（Ｉｍｇ）　６　８．７６±４４７−　コ゛　トル　Ｓｉ　ｍａＣ ｂｅｍｉｃａｌＣｏ、　□−タ゛イス゛粉末：非焙煎処理　２　１８８±０．６ ７Ｓｉ　ｍａ　５０ｍ　□ Ｌヴンン郊Ｊ１出Ｌ　ズ　テ１：　−′づノ１ε召ユ使里ダイズ粉末（Ｓｉｇｍ ａ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、）　（３６ｇ）を、水１０１０８Ｏ及びＯ，１％（ｗ／ｖ ）のチメロソール溶液１２０ｍ１に分散させた。懸濁液を２４時間室温で混合し 、３６０Ｏｒｐｍで１時間遠心分離した。上澄み液を、３ＯＫ−ＭＷＣＯ膜を使 用して限外濾過した。分子量３０に超フラクションを集めて濃縮し、０．５Ｎ− ＨＣＩでｐＨ２に調節した。この分子ｊ１３０に超フラクシコンを、固定化ペプ シン（ＦＭＣＣａｒｐ、：ニュージャージー州パインプルツク＞８ｇを挿入した ＡＣＴＩ−ＭＯＤスパイラル・リアクター・モジュールに入れた。酵素リアクタ ーからの流出液を、３０に−ＭＷＣＯｖＡを使用して限外濾過した１分子量３０ に未満フラクションは残しておき１分子量３０に超フラクションは酵素リアクタ ーを再循環させた０合わせて２時間の酵素処理及び限外濾過の後に、分子量３０ に未満フラクシヨンを全部残し、これを「限外濾過されたペプシン処理（＜３０ Ｋ）ダイズ粉末」と称する。

：声、・　べ゛ＪＩビニニ：：−二ノ＝］シ１（ビ、干へ［Ｉ；ゝ−バーーニ　 ロ　ニ１　°　」Ｌブン）」■し医１と 以下の操作を用いて、ペンソイル−アルギニン−パラ−ニトロアニリド（ＢＡＰ ＮＡ）のトリプシン触媒作用による分解に対する、本発明の保護剤の生体外阻害 能力を評価した。トリプシン（１２５μｇ／ｍｌ、１０３　ＢＡＥＥ単位／ｍｌ ）、ＢＡＰＮＡｏ、５ｍｇ／ｍｌ及び供試インヒビター（０，５ｍｇ／ｍｌ）の 試験液を、ウシ血清アルブミン３７５μｇ／ｍｌを含むｐＨ８のＴＲｌ５（０， ０４８Ｍ３　／ＣａＣ１２（０，０１９Ｍ）１！衝液中で￥Ａｇし、３７°Ｃで インキュベートした。５分後に試料を採取し、その後４０分まで５分間隔で採取 し、等容量の３０％ｖ　／　ｖ酢酸で反応を停止して分析の準備とした。ＢＡＰ ＮＡ加水分解物である４−ニトロアニリンの分解生成物の分析は、Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　３Ｂ　ＵＶ／Ｖ＋ｓスペクトロフォトメーターを 使用して実施した１反応停止試料の吸収は４１０ｎｍで測定した。データは、イ ンヒビターを含んでいないコントロールとの比較に基づいて、以下の式から計算 した。ＢＡＰＮＡ分解の阻害％として示した。

阻害％＝１００％Ｘ　［＋−５１，ｈ／Ｓ０１ここで５ｌｎｈはインヒビター存 在下での時間経過に伴う吸収の変化速度であり、Ｓｏはインヒビター不在下での 時間経過に伴う吸収の変化速度である。

阻害％は、濾過されたダイズ粉末の３０に−１００にフラクションを使用して測 定した。処理されたダイズ粉末のロフトは、実施例３に記載した可溶化及び限外 濾過法に従って調製した。結果を表９に示す、処理された供試タンパク質フラク ションが、ＢＡＰＮＡのトリプシンによる分解を減少させていることを示してい る。

表１ ゛′−゛″ハ０　゛ ｍｌ　ｍｂ’バ　ｍｌ　’１ ０．５　０．４１　７３ ：・　・ｒ＋　’ 実施例１〜８に記載のタンパク質及びペプチドの分子量分別法を変更して、限外 濾過膜又は透析膜を適当に選択することにより、任意の所望の分子量フラクショ ンが生産される。分子量分別も、ゲルクロマ１〜グラフイーによって行われる。

実施例４〜７に例示したように、酵素処理は、単一のタンパク質分解酵素又はタ ンパク質分解酵素を各種紐み合わせて、一度に又は順々に作用するようにして行 われる。各種のタンパク質分解酵素、例えば、トリプシン、キモトリプシン、エ ラスターゼ、カルポキシベ゛ブチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシン及びコ ラゲナーゼが使用されるが、これらに限定されるものではない。

実施例１〜８の分別及び酵素処理は、動物又は植物起源の広範なタンパク質に速 用される。そのようなタンパク質性原料としては、ダイズ粉末、ダイズタンパク 質、小麦グルテン、アーモンド豆粉末、ビーナツツ豆粉末、カゼイン及び魚肉タ ンパク質を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

実施医上ｌ 保護剤が生体内での放出時に急速に溶解して作用する能力は、本発明の分解抑制 剤の性質として重要な因子である。この目的で、デカント及び限外濾過されたダ イズ粉末及び３０に−１００にダイズ粉末が、動的環境下でテラキレンの分解を 抑制する能力を、生体外で比較した。実施例８に記載の生体外の方法を、試験溶 液が１！衛液中に酵素及びテラキレンだけを含んでいることを除いて、繰り返し た。供試インヒビター（デカント及び限外濾過されたダイズ粉末又は３０に一１ ００ダイズ粉末）を、他の追加的な混合物を加えないで、Ｏ，０１ｍｇ／ｍｌの ′ａ度で加え、溶液を３７°Ｃの水ン谷＜Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃモデル＃ＹＢ５３１）中で速度５て振とうさせた。試料採取は、１９秒後、 １分後、その後は２分間隔で１１分経過するまで、そしてその後は合計４６分間 にわたり５分間隔で行った１反応停止後、ＨＰＬＣ分析及びデータ解析を実施例 ８と同様に行った。

供試インヒビター　ｋ”　阻害％ ０、（と馳刀名Ｚ二ｍｌ　ｍｏｌ ｒイス゛事分末　分末　２．９６ＸＩＯ−’　２７．１テ１カントされた限外濾 過　０．８６ＸＩＯ’　７８．８”　”　３０に−１（Ｘ）Ｋ−一 本発明を、本発明考が現在のところ承知しているベストモードを構成１゛る好ま しいＷ３様に添って説明１−だが、当業者に自明の各種の変更や変形は本発明の 範囲に含まれるものである６ ！□　、＋　Ｎ。　ρｃＴ／ＵＳ　９２１０９３３６フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７／３４　 ８３１４−４Ｃ３７／３６　８３１４−４Ｃ ３７／３８　８３１４−４Ｃ ３７／４３　８３１４−４Ｃ ３７／６６　Ｈ８３１４−４Ｃ ４７／４２　Ｄ　７４３３−４Ｃ （７２）発明者　シンコ、パトリック、ジエイ。

アメリカ合衆国ニュージャージイー用 ０７４３６　オークランド市ミネハハ・プルバード６４ Ｉ

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．保護剤と生物学的有効量のタンパク質分解的に不安定な治療剤とを含む医薬 組成物であって、前記保護剤がダイス粉末である場合には前記治療剤がインスリ ンではないものとする、前記の医薬組成物。
2. ２．前記の保護剤が、タンパク質、ペプチド、精製天然タンパク質、分子量によ る分別タンパク質、溶媒抽出タンパク質、又は部分的加水分解タンパク質から選 んだ、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ３．前記の保護剤が，酵素手段によって加水分解された部分的加水分解タンパク 質である、請求項１に記載の医薬組成物。
4. ４．前記の酵素手段が、トリブシン，キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキ シペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシン又はコラゲナーゼである、請求 項３に記載の医薬組成物。
5. ５．前記の保護剤が，分子量が１０００より大であり、部分的に加水分解され、 分子量により分別されたタンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
6. ６．前記の保護剤が、分子量が１０００〜３００００であり、部分的に加水分解 され、分子量により分別されたタンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物 。
7. ７．前記の保護剤が、ダイズ粉末、ダイズタンパク質、小麦グルテン、アーモン ド豆粉末、ビーナッツ豆粉末、カゼイン又は魚肉タンパク質である、請求項１に 記載の医薬組成物。
8. ８．前記の保護剤が、天然タンパク質から誘導された、タンパク質又は分子量に よる分別−部分的加水分解タンパク質である、請求項１に記載の医薬組成物。
9. ９．前記のタンパク質分解的に不安定な治療剤が、カルシトニン、プロラクチン 、アドレノコルチコトロピン、チロトロビン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン 、オキシトシン、バソプレシン、ガストリン、テトラガストリン、ベンタガスト リン、グルカゴン、セクレチン、バンクレオジミン、物質Ｐ、ゴナドトロピン、 イムノグロブリン、ループロライド、黄体形成放出ホルモン、エンケファリン、 コレシストキニン、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、 サイモベンチン、エンドセリン、ニューロテンシン、インスリン、インスリノト ロビン、又はテラキレンである、請求項１に記載の医薬組成物。
10. １０．タンパク質分解的に不安定な治療剤を、その治療剤を必要とする哺乳動物 に、その治療剤の生物学的利用性を向上するのに充分な量の保護剤と組み合わせ て（但し、前記の保護剤がダイズ粉末である場合には、前記の治療剤はインスリ ンではないものとする）投与することを含む、前記のタンパク質分解的に不安定 な治療剤の生物学的利用性を向上する方法。
11. １１．前記の保護剤が、タンパク質、ペプチド、精製天然タンパク質、分子量に よる分別タンパク質、溶媒抽出タンパク質、又は部分的加水分解タンパク質から 選んだ、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記の保護剤が、酵素手段によって加水分解された部分的加水分解タンパ ク質である、請求項１０に記載の方法。
13. １３．前記の酵素手段が、トリブシン，キモトリプシン、エラスターゼ、カルボ キシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、ペプシン又はコラゲナーゼである、請 求項１２に記載の方法。
14. １４．前記の保護剤が、分子量が１０００より大であり、部分的に加水分解され たタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
15. １５．前記の保護剤が、分子量が１０００〜３００００であり、部分的に加水分 解されたタンパク質である、請求項１０に記載の方法。
16. １６．前記の保護剤が、ダイズ粉末、ダイズタンパク質、小麦グルテン、アーモ ンド豆粉末、ビーナッツ豆粉末、カゼイン又は魚肉タンパク質からのタンパク質 又は部分的加水分解タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
17. １７．前記の保護剤が、天然タンパク質であるタンパク質又は部分的加水分解タ ンパク質である、請求項１０に記載の方法。
18. １８．前記のタンパク質分解的に不安定な治療剤が、カルシトニン、プロラクチ ン、アドレノコルチコトロピン、チロトロビン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモ ン、オキシトシン、バソプレシン、ガストリン、テトラガストリン、ベンタガス トリン、グルカゴン、セクレチン、バンクレオジミン、物質Ｐ、ゴナドトロピン 、イムノグロブリン、フィブリノーゲン、ループロライド、黄体形成放出ホルモ ン、エンケファリン、コレシストキニン、卵胞刺激ホルモン、インターフェロン 、インターロイキン、サイモベンチン、エンドセリン、ニューロテンシン、イン スリン、インスリノトロビン、又はテラキレンである、請求項１０に記載の方法 。
19. １９．前記のタンパク質分解的に不安定な治療剤がテラキレンである、請求項１ ８に記載の方法。
20. ２０．前記のタンパク質分解的に不安定な治療剤がテラキレンである、請求項９ に記載の医薬組成物。