CN104888226A - 一种蛋白质和/或多肽类物质的制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白质和多肽类物质的制剂，所述制剂中含有海藻酸盐或其衍生物。所述海藻酸盐及其衍生物是一种无毒廉价的天然多糖，在本发明所涉及的制剂中能保护蛋白质和多肽类物质免于胰蛋白酶的降解。与传统胰蛋白酶抑制剂相比，所述多糖作为抗酶解辅料弥补了前者成本高、毒性大和不稳定等缺陷，使得应用本发明的蛋白质与多肽类制剂的疗效提高的同时，成本和毒性显著下降。

Description

一种蛋白质和/或多肽类物质的制剂

技术领域

本发明涉及一种制剂，具体说是一种含有海藻酸盐及其衍生物的蛋白质和多肽类物质的制剂。

背景技术

近年来，伴随着分子生物学、生物化学技术的飞速发展，蛋白质和多肽类药物的研究与应用取得了划时代的进展。所述蛋白质和多肽类药物是指由氨基酸基本单元组成的复杂的具有一定生物学功能的大分子物质。多肽和蛋白质之间并没有严格的区分，一般来讲，多肽是指低于五十个氨基酸组成的化合物，高于五十个氨基酸以上的化合物通常称为蛋白质。之所以蛋白质和多肽类药物得到重视，是由于相比于传统药物而言，它具有药效高、副作用低、无蓄积毒性、能直接参与机体调控和治疗目的明确等优势。但是这类药物普遍存在着体内稳定性差、极易变性失活、易于从血液循环中清除等缺陷。如何将此类药物制成稳定、安全、有效的制剂，已成为一个极富挑战性和具有实用价值的研究热点。

早期的蛋白多肽类药物制剂多以注射途径给药，这需要在医院等特定环境下使用，病人要承受一定痛苦，且这种给药途径的副作用也很大。改变蛋白多肽类药物的给药途径，提高其稳定性，是这类药物发展的核心问题。

在所有给药途径中，口服给药一直是最受欢迎的给药方式。但在正常情况下，口服蛋白质和多肽类药物的生物利用度是很低的，其原因有很多，包括胃酸的破坏、胃肠道中的蛋白水解酶的降解，以及药物分子量过大、脂溶性差、与消化道生物膜的亲和力差，难以通过消化道的生物膜屏障等。蛋白质和多肽类药物能否口服给药成功，关键在于解决这些问题。

其中蛋白质和多肽被破坏的直接主要原因又是胃肠道中蛋白水解酶的降解，例如胰岛素在胃酸pH的环境下仍可保持活性，但生物酶对其的降解效率非常高。蛋白质和多肽的吸收缓慢因素也间接导致其在胃肠道中滞留时间延长，提高了蛋白水解酶的效率。

为了提高蛋白与多肽类药物制剂通过非注射给药途径的生物利用度，其制剂需具备防止蛋白水解酶破坏蛋白质和多肽类物质的功能。近几年来这一方面的研究和发明层出不穷。

目前已上市、开发中或研究中的蛋白质和多肽类药物制剂，按照其提高活性成分稳定性的方法分类，主要通过以下五种途径中的一种或多种实现：

（1）加入能够影响蛋白酶活性的物质，抑制蛋白酶对有效成分的降解破坏，例如蛋白酶抑制剂，PH调节剂，凝集素等；

（2）通过一定手段将有效成分包裹起来，隔绝其与不利因素的接触；

（3）加入促渗剂或其他手段促进有效成分穿过生物膜进入血液，缩短有效成分容易遭到破坏的时间；

（4）改进蛋白质分子结构或加入稳定剂提高有效成分本身对不利因素的耐受性；

（5）未列举的少数其他途径；

目前已上市、开发中或研究中的蛋白质和多肽类药物制剂，其中主要发挥保护作用的物质主要分为以下几类：

（1）蛋白酶抑制剂。高效，但成本高，更严重的是毒副作用较难评估，容易造成消化系统紊乱，近年来已经较少研究；

（2）蛋白酶抑制剂改性材料。将抑制剂化学修饰到常用的药用高分子辅料上应用。通过固定化降低了毒性和抑制剂用量，但合成工艺复杂，合成过程中容易导致抑制剂失活，合成过程中可能引入新的不安全物质等缺陷仍需进一步研究改善；

（3）能够通过特定工艺形成胶束、微囊、凝胶、脂质体、纳米粒等实体将蛋白质和多肽类药物富集其中的物质。这一类物质最多，其中包括一些天然可降解大分子，如海藻酸钙、壳聚糖、卵清白蛋白、纤维素等，还包括一些人工合成的无毒材料，如聚赖氨酸、PLGA等。主要目的都是降低活性药物与蛋白水解酶接触的机会。

（4）促渗剂。通常是一类两亲性小分子，提高蛋白质和多肽跨过小肠屏障的效率，缩短蛋白水解酶作用时间，这一类物质包括胆酸盐、吐温80等等。

参考文献（Guggi,D.and A.Bernkop-Schnurch,In vitroevaluation of polymeric excipients protecting calcitonin againstdegradation by intestinal serine proteases.InternationalJournal of Pharmaceutics,2003.252(1-2):p.187-196）中方法主要通过将商品化胰蛋白酶抑制剂化学接枝到药用辅料壳聚糖骨架上，制备得到的新辅料同时具备生物粘附与抗酶解的双重功能；

参考文献（Yin,L.C.,et al.,Beneficial properties for insulinabsorption using superporous hydrogel containinginterpenetrating polymer network as oral delivery vehicles.International Journal of Pharmaceutics,2008.350(1-2):p.220-229）中方法主要通过一种高分子材料大量吸附肠道内的钙离子，由于钙离子是胰蛋白酶的辅因子，该材料借此抑制胰蛋白酶活性，保护蛋白质和多肽类药物免于降解；

参考文献（Deat-Laine,E.,et al.,Development and in vitrocharacterization of insulin loaded whey protein and alginatemicroparticles.International Journal of Pharmaceutics,2012.439(1-2):p.136-144）中方法主要通过海藻酸钠与卵清白蛋白的复合材料，制备成药用凝胶微球，将蛋白质和多肽类药物紧密包裹，并缓慢释放，降低被酶解率。

发明内容

本发明涉及一种含有海藻酸盐或其衍生物的蛋白质和多肽类物质的制剂。本发明的重点是将这种多糖应用到蛋白质和多肽类物质的制剂中，并且首次发现其具有抗胰蛋白酶酶解的作用，能够保护蛋白质和多肽类物质的制剂中的活性成分免于降解破坏。

具体的，当蛋白质和多肽类物质的制剂中含有海藻酸盐或其衍生物时，相比于单纯的蛋白质或多肽类物质，当在相同环境中遇到相同浓度和活性的胰蛋白酶时，含有海藻酸盐或其衍生物的制剂中的蛋白质或多肽类物质更难以被胰蛋白酶降解破坏，对胰蛋白酶的耐受性更高。

具体的，本发明涉及一种蛋白质和多肽类物质的制剂，其特征在于所述的制剂中含有海藻酸盐或其衍生物中的一种或二种以上，以及含有蛋白质或多肽类物质中的一种或二种以上，除上述两种物质外还可以含有或不含有其他组分，其他组分的优选范围是水、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、甘露醇、蔗糖、乳糖、糊精、木糖醇、可压性淀粉、微晶纤维素、聚羟甲基丙烯酸烷基酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和羟甲基纤维素钠中的一种或两种以上。所述制剂采用常规制剂类型，优选范围是片剂、散剂、胶囊剂、喷雾剂、膏剂、栓剂、吸入剂和滴眼液中的一种。所述制剂中含有的蛋白质或多肽类物质的优选范围是激素、酶、疫苗、抗体、干扰素、基因转染载体、蛋白质纳米粒、人参提取物、鹿茸提取物、海参提取物和冬虫夏草提取物中的一种或两种以上的混合物，其中，所述的激素包括胰岛素，生长激素和降血钙素中的一种或两种以上的混合物。所述制剂中含有海藻酸盐及其衍生物的质量分数介于0.1%至90%之间，海藻酸盐选自海藻酸的钠盐、钾盐和锂盐中的一种或两种以上的混合，其衍生物的优选范围是丙烯酸酯海藻酸盐、丙烯酰胺海藻酸盐和乙酸乙烯酯海藻酸盐中的一种或两种以上的混合盐。值得强调的是制剂中不溶性海藻酸盐组分不超过全部海藻酸盐及其衍生物总质量的5%。所述制剂中的海藻酸盐或其衍生物与制剂中的其他组分可以通过共混、静电相互作用、疏水相互作用、氢键或共价方式结合，尤其需要强调的是所述其他组分包括蛋白质或多肽类物质和制剂中的其他材料。

名词注释：生物利用度是指药物经非静脉注射给药（口服，皮肤给药，呼吸道给药等）后能够出现在体循环中的份量。

海藻酸是一种来自海藻的由D-甘露糖醛酸（记为M）和L-古洛糖醛酸（记为G）两种结构单元通过随机重复排列组成的线性多糖。海藻酸盐及其衍生物是一种长链状天然高分子聚合物，它是一种获得FDA认可的无毒材料，自然界中含量丰富，提取和纯化工艺成熟成本低廉，是作为药用辅料的理想材料。海藻酸盐是海藻酸羧基上的氢被其他阳离子替代形成的盐类。海藻酸盐衍生物是指海藻酸盐骨架上的羟基或羧基被其他原子或原子团取代后所形成的较复杂盐类。

胰蛋白酶是存在于人体小肠中发挥降解消化异源蛋白质作用的最主要酶类。它由胰腺分泌的胰蛋白酶原形成，胰蛋白酶原进入小肠后被其他胰蛋白酶酶酶解激活后才具有活性。成熟的人胰蛋白酶由223个氨基酸残基组成，分子量为23300，最适pH在7.8至8.5之间。胰蛋白酶等电点为10.5，因此中性条件下带有较强正电。

所述海藻酸盐及其衍生物是一种无毒廉价的天然多糖，在本发明所涉及的制剂中能保护蛋白质和多肽类物质免于胰蛋白酶的降解。与传统胰蛋白酶抑制剂相比，所述多糖作为抗酶解辅料弥补了前者成本高、毒性大和不稳定等缺陷，使得应用本发明的蛋白质与多肽类制剂的疗效提高的同时，成本和毒性显著下降。

附图说明

图1——胰岛素在模拟肠液中的降解动力学曲线。图中横坐标是酶解时间，纵坐标是酶解体系中未被降解胰岛素浓度相对于反应开始时浓度的百分比。由上至下的曲线分别表示：空白对照——体系中不含胰蛋白酶时，胰岛素自身在体系中的稳定性（□），实施例1——体系中含有胰蛋白酶和海藻酸钠时胰岛素的降解曲线（△），对照例2——体系中含有胰蛋白酶和大豆胰蛋白酶抑制剂时胰岛素的降解曲线（▽）和对照例3——体系中含有胰蛋白酶时胰岛素的降解曲线（○）；

具体实施方式

实施例1：

制剂类型为口服液，按照以下成分列表所述量，于搅拌下依次加入原料，4℃下搅拌2h混匀后无菌过滤，低温脱气即得。

成分列表

注：其中海藻酸钠分子量为5kDa，G/M=80:20；

抗酶解能力检测：

取5ml模拟肠液（PBS，pH=7.6，其中含有CaCl20.2mg/ml、胰蛋白酶0.04mg/ml。所用胰蛋白酶购自阿拉丁试剂，比活力3000IU/mg）放入恒温水浴里预热至37℃，加入实施例1所述口服液制剂1ml，涡流混匀后维持37℃反应2h，并且从0min开始每30min从体系中取样200μl立即与100μl酶解终止液（盐酸0.25mol/L）混合。所有样品保存于4℃待测。

未分解胰岛素的检测方法：

体系中胰岛素的含量参考中国药典2010方法并略微改动，利用waters的高效液相色谱系统（HPLC），色谱柱为C18反相柱（250mm*4.6mm），检测器是紫外-可见光谱检测器，流动相为乙腈:水相=78:22，其中水相中含有0.2mol/L的硫酸钠，以及磷酸2.7ml/L并用乙醇胺调pH至2.3。检测流速1ml/min，温度40℃。

最终得到的口服液中胰岛素的酶解动力学曲线见附图1（△）。

结论说明：制剂中含有海藻酸钠时，制剂中胰岛素在体外模拟小肠环境中被胰蛋白酶降解的降解速率显著下降，37℃下降解两小时后仅有约15%的胰岛素被降解。

对照例2：

制剂类型为口服液，按照实施例1的方法并按照下述成分列表制备制剂，并按照实施例1的相关方法评价口服液的酶解动力学曲线，结果见附图1（▽）。

结论说明：作为实施例1的对照例，制剂中将海藻酸钠替换为等质量的商品化大豆胰蛋白酶抑制剂（STI），结果在相同条件下，商品化STI对胰岛素的降解并没有显著影响，两小时后仍有约90%胰岛素被降解。

成分列表

注：商品化STI购自阿拉丁（T113170）

对照例3：

制剂类型为口服液，按照实施例1的方法并按照下述成分列表制备制剂，并按照实施例1的相关方法评价口服液的酶解动力学曲线，结果见附图1（○）。

结果说明：当制剂中不含任何酶抑制剂时，在相同条件下，两小时后有约90%胰岛素被降解。

成分列表

实施例4：

制剂类型为口服液，制备方法见实施例1，成分列表如下:

成分列表

实施例5：

制剂类型为片剂，按照以下成分列表所述量，将原料粉末混合研磨后过60目筛，压片。

成分列表

实施例6：

制剂类型为片剂，按照实施例1所述方法制备原料液，成分列表如下，然后将原料液冻干得到白色棉絮状粉末，压片即得。

成分列表

实施例7：

制剂类型为胶囊剂，按照实施例1所述方法制备原料液，成分列表如下，然后将1ml原料液置于轧囊机储液槽中，保温40～45℃压囊，使用明胶浆500g，明胶浆：甘油：水=1:0.5:1，室温吹干24小时，无水乙醇洗涤干燥，造粒即得。

成分列表

注：乙酸乙烯酯海藻酸钠是海藻酸钠的一种衍生物，是在引发剂过硫酸钾存在下，单体乙酸乙烯酯发生链式聚合反应接枝到海藻酸钠骨架上，得到的一种两亲性海藻酸钠材料。

实施例8：

制剂类型为气雾剂。按照实施例1所述方法制备原料液，成分列表如下，然后在室温下将5ml原料液灌入15ml气雾剂容器，后装上阀门并压紧，再将容器内原有气体抽去，最后通过压装机以约90kPa的操作压力灌入压缩氮气即得。

成分列表

实施例9：

制剂类型为片剂，将海藻酸铵与胰岛素通过共价连接制成复合物，复合物中海藻酸铵与胰岛素的物质的量之比约为0.7，按照以下成分列表所述量，将原料粉末混合研磨后过60目筛，压片。

成分列表

实施例10：

制剂类型为口服液，海藻酸钾通过共价键与聚乙二醇上相连形成复合物，按照如下成分列表分别配制原料液，在搅拌下，向每升原料液A中缓慢加入100ml原料液B，4℃下搅拌30分钟之后，再加入100ml原料液C，4℃下搅拌30分钟后低温静置脱气，紫外照射灭菌即可。

成分列表A

成分列表B

将全部实施例的体外降解实验检测结果汇总如下。实验中模拟肠液体系、孵育温度和时间、实验方法均与实施例1一致，将各实施例中的制剂按照每5g模拟肠液中加入1g制剂的比例加入到相同体积的模拟肠液中开始降解，37℃下孵育2小时后检测体系中未降解蛋白质的含量，与反应开始时未降解蛋白质含量的比值，即为制剂中蛋白类物质未降解率，数值越高说明制剂中有效成分的保持效果越好。

上述典型实施例在本发明的所有方面中是示例性的，而不是限定性的，因此本发明能够根据蛋白质和多肽类物质的理化性质以及制剂的应用环境进行典型实施例的多种变型，技术人员可从包含的描述中获得所述变型，所有这些变型被认为落入本发明的范围和精神内。

Claims (7)

1.一种蛋白质和/或多肽类物质的制剂，其特征在于：所述的制剂中含有海藻酸盐或其衍生物中的一种或二种以上，以及含有蛋白质或多肽类物质中的一种或二种以上；

所述海藻酸盐及其衍生物在制剂中的质量分数之和介于0.1%至90%之间；优选范围介于5%至30%之间；

所述蛋白质和多肽类物质在制剂中的质量分数之和介于0.1%至60%之间，优选范围介于1%至10%之间。

2.按照权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述的海藻酸盐选自海藻酸的钠盐、铵盐和钾盐中的一种或两种以上的混合盐；

所述海藻酸盐的衍生物包括丙烯酸酯海藻酸盐、丙烯酰胺海藻酸盐和乙酸乙烯酯海藻酸盐中的一种或两种以上的混合盐。

3.按照权利要求1或2所述的制剂，其特征在于：所述的海藻酸盐或其衍生物中钙盐、镁盐、铁盐、锌盐和钡盐的总质量与全部海藻酸盐及其衍生物的总质量的比值小于0.05。

4.按照权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述的制剂除含有权利要求1中已述的组分外，还含有其它组分，其它组分由水、氯化钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、甘露醇、蔗糖、乳糖、糊精、硬脂酸钠、木糖醇、可压性淀粉、微晶纤维素、聚羟甲基丙烯酸烷基酯、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和羟甲基纤维素钠中的一种或两种以上构成；

所述其它组分在制剂中的质量分数介于0至90%之间，优选范围介于10%至50%之间。

5.按照权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述海藻酸盐或其衍生物与制剂中的其他组分间通过共混、静电作用、疏水作用或者共价方式结合；

所述海藻酸盐或其衍生物与蛋白质或多肽类物质间通过共混、静电作用、疏水作用或者共价修饰方式结合。

6.按照权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂的剂型包括片剂、散剂、胶囊剂、喷雾剂、膏剂、栓剂、吸入剂和滴眼液中的一种。

7.按照权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述的蛋白质或多肽类物质选自激素、酶、疫苗、抗体、干扰素、基因转染载体、蛋白质纳米粒、人参提取物、鹿茸提取物、海参提取物和冬虫夏草提取物中的一种或两种以上的混合物，其中，所述的激素包括胰岛素，生长激素和降血钙素中的一种或两种以上的混合物。