PT101135A

PT101135A - Composicoes farmaceuticas contendo proteinas ou susbtancias peptidicas que intesificam a biodisponibilidade de agentes terapeuticos proteoliticamente labeis

Info

Publication number: PT101135A
Application number: PT101135A
Authority: PT
Inventors: Gordon L Amidon; Glen D Leesman; Patrick J Sinko
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1991-12-18
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1994-03-31
Also published as: WO1993011799A1; AU3058392A; NO942323D0; HU9401824D0; MX9207407A; CA2125400A1; IL104048A0; JPH06510796A; HUT69785A; NO942323L; EP0617626A1; FI942938A; FI942938A0; ZA929761B

Description

0 presente invento diz respeito à intensificação da biodisponibilidade de agentes terapêuticos proteoliticamente lábeis mediante a administração de cada um desses agentes terapêuticos sob a forma de uma sua combinação com um agente protec-tor constituído por uma proteína, uma proteína natural purificada, uma proteína fraccionada segundo as massas moleculares ou uma proteína parcialmente hidrolisada.

Antecedentes do invento

Os medicamentos à base de peptídeos e os medicamentos que contêm uma ligação lábil no que diz respeito âs peptidases estão classificados entre os mais prometedores agentes medicinais dos tempos modernos mas a sua instabilidade na presença de enzimas proteolíticas no tracto gastrointestinal e noutros tecidos mucosos requer, em geral, que a sua administração se efectue por via parentérica. Apesar de os pacientes poderem ser ensinados a injectar-se parentericamente, desde há muito vem sendo sentida a necessidade de aperfeiçoar um método não invasivo para a auto-administração de medicamentos à base de peptídeos.

Os inibidores de protease e os intensificadores da penetração são meios frequentemente tidos em consideração quando se trata de circundar as barreiras enzimáticas e de penetração â absorção de peptídeos e de proteínas pelas vias mucosas de administração. Devido a estas barreiras é fraca a biodisponibilidade de medicamentos â base de peptídeos e de proteínas. A administração por via não parentérica de medicamentos â base de peptídeos tem em geral e frequentemente como resultado uma muito baixa biodisponibilidade devido à hidrólise dos peptídeos pelas enzimas proteolíticas. No caso do leuprolida esta biodisponibilidade está compreendida entre 0,05%, após administração por via oral, e 38%, após administração por via vaginal; no caso da insulina, os números correspondentes são 0,05% e 18% [Lee (1990), Journal of Controlled Release. 13, 213], São exemplos de enzimas proteolíticas que inactivam os agentes terapêuticos proteoliticamente lábeis a pepsina, a tripsina, a quimotripsina, a elastase, a carboxipeptidase no lúmen intestinal e as aminopeptidases localizadas nas superfícies mucosas do tracto gastrointestinal (tracto GI), do nariz e da vagina. O transporte de oligopeptídeos através do jejuno de mamíferos adultos de modo a mantê-los intactos tem sido demonstrado in vitro e in vivo bem como em combinação com inibidores de peptidase [Friedman e Amidon (1991), Pharmaceutical Research. 8, ns 1, p. 93].

Fuji e outros (1987) reivindicam no pedido de patente nos E.U.A. ns 4 639 435 a utilização de metanossulfonato de l-isopropil-4-[4-(1,2,3,4-tetrahidronaftoiloxi)benzoil] piperazi-na como um inibidor de quimotripsina a ser co-administrado, pelas vias oral ou rectal, com um medicamento lábil no que diz respeito à quimotripsina (calicreína ou calcitonina). No texto também é proposto o uso de ésteres de benzoilpiperazina para este fim. Não é descrito, no referido, texto, o mecanismo de acção destes inibidores.

Cho e FLynn (1990) revelam no pedido de patente internacional WO-90/03164 a utilização de inibidores de proteáse numa formulação administrável por via oral mas não descrevem a natureza destes inibidores em pormenor; o único inibidor de proteáse que surge nos exemplos é a aprotinina. 4

Kidron e outros (1986) revelam no pedido de patente nos E.U.A. n2 4 579 730 o uso de inibidores de proteáse numa formulação contendo insulina administrável por via oral. A farinha de soja é proposta como fonte de inibidor de tripsina à base de soja (inibidor de tripsina/quimotripsina de Bowman-Birk; massa molecular 8000 daltons).

Ziv e outros (1987) revelam numa comunicação publicada em Biochem. Pharmacol.. 36. 1035-1039 o uso do inibidor de proteáse aprotinina para intensificar a absorção por via oral de proteínas.

Losse e outros (1987) revelam no pedido de patente na R.D.A. ns DD 252 539 AI a utilização de ácido epsilon-aminocaprói-co e de aprotinina como inibidores de proteáse em formulações contendo peptídeos administráveis por via oral. J. Lee (1990), numa comunicação publicada em J. Controlled Release, 13. 213-223, faz uma revisão da utilização de inibidores de proteáse em formulações contendo peptídeos administráveis pelas vias oral, nasal, bucal, rectal, vaginal,, pulmonar e ocular.

Foi demonstrado que determinados pequenos peptídeos que contêm aminoácidos num máximo de quatro intensificavam a biodis-ponibilidade de medicamentos à base de peptídeos.

Hussain e outros (1985) sugerem, numa comunicação publicada em Biochem. and Biophvs. Research Commun.. 133. ns 3, 923, que a administração por via nasal de peptídeos pode tornar--se uma via importante de administração desde que as peptidases existentes na mucosa nasal possam ser transitoriamente inibidas 5 - r

mediante a co-administração de substratos de .peptidase farmacolo-gicamente inactivos.

Faraj e outros (1990), numa comunicação publicada em Journal of Pharmaceutical Sciences. 79, ns 8, 698, mostraram que na presença dos pequenos peptideos, L-tirosil-L-tirosina e éster metálico de tri-L-tirosina, a hidrólise da leucina-encefalina foi reduzida, o que sugere que a inibição competitiva das peptidases nasais foi causada por estes pequenos peptideos.

Friedman e Amidon, supra, demonstraram que a co-perfu-são do tripeptídeo YGG com encefalina (YGGFL) teve como resultado uma maior absorção do YGGL num intestino de rato perfusionado.

Hori e outros (1983), numa comunicação publicada em J. Pharm. Sei.. 72. 435-439, revelam a utilização de diversos peptideos amino-protegidos para proteger a insulina de degradação quando injectada subcutaneamente. Os peptideos usados foram o benziloxicarbonil-Gli-Pro-Leu-Gli, o benziloxicarbo-nil-Gli-Pro-Leu, o dinitrofenil-Pro-Leu-Gli e o benziloxicarbo-nil-Gli-Pro.

Diversas publicações revelam tratamentos enzimáticos de proteínas de origem vegetal. Uma antiga patente nos E.U.A. (ns 2 489 208, concedida a John R. Turner) revela um componente de um agente de batimento ("whipping") modificado com pepsina. Um produto alcalino tal como o sulfito de sódio, o carbonato de sódio ou o hidróxido de sódio é usado para extrair glicinina estando o pH compreendido entre 6,4 e 6,8. Provoca-se então a precipitação da glicina a partir do extracto (por exemplo estando o pH compreendido entre 4,2 e 4,6), tendo o pH o seu valor isoeléctrico e sendo o dióxido de enxofre usado para ajustar o ácido. A glicinina precipitada é então modificada com pepsina sob - 6 - ϊ

proteína. A glicinina é hidrolisada com pepsina até a sua solubilidade em água ter aumentado para um valor compreendido entre 40% e 50%. De um modo análogo, a patente nos E.U.A. ns 2 502 482, concedida a Sair e outros, descreve a modificação enzimática da glicinina com pepsina a fim de produzir-se um produto isolado em que uma percentagem ponderai de pelo menos 60% da pepsina modificada é solúvel em água com um pH 5,0.

Puski (1975) descreve a modificação enzimática dos produtos isolados de soja (precipitados a pH 4,5) com Aspercrillus orvzae na comunicação "Modification of Functional Properties of Soy Proteins by Proteolitic Enzyme Treatment” (Modificação das Propriedades Funcionais das Proteínas da Soja Mediante Tratamento Enzimático Proteolítico) ΓCereal Chem. , 52., 655-665],

Diversas comunicações dão também notícia da utilização de soluções salinas para extrair proteínas da soja. Uma comunicação apresentada por A. K. Smith e outros (1983) em J. Amer. Chem. Soc., vol. 60, Junho de 1983, pp. 1316 a 1320) descreve como a extracção de farinha de soja com água de pH 6,7 tem um rendimento maior, no que se refere ao extracto de proteína que uma extracção aquosa na presença de sais neutros. A patente nos E.U.A. ns 4 131 607, concedida a Petit, descreve uma extracção alcalina em duas etapas. A extracção é inicialmente conduzida na presença de sulfito de sódio e de um sal de magnésio a um pH compreendido entre 7,0 e 8,5 que é depois aumentado para um pH compreendido entre 10,0 e 10,5 a fim de completar-se a extracção. Provoca-se então a precipitação ou a coagulação dos extractos de proteína mediante o ajustamento do pH do extracto para um valor compreendido entre 4,5 e 5,5. Uma patente concedida a Martinez e outros (Patente nos E.U.A. ns

I

3 579 496) descreve um processo semelhante · de extracção com múltiplos solventes.

Sumário do invento

Os presentes inventores descobriram que as proteínas, os peptídeos, as proteínas naturais purificadas e as proteínas filtradas, extraídas com solventes, com massas moleculares fraccionadas ou parcialmente hidrolisadas, doravante designadas como agentes protectores, intensificam a biodisponibilidade oral, nasal, rectal e vaginal dos agentes terapêuticos proteoliticamen-te lábeis que, na ausência dos referidos agentes protectores, sofreriam uma inactivação enzimática na sequência de tentativas de administração pelas vias oral, nasal, rectal ou vaginal.

Descrição pormenorizada do invento 0 presente invento diz respeito a um agente protector e a uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um agente terapêutico proteoliticamente lábil, na condição de que o referido agente terapêutico não seja insulina quando o referido agente · protector é farinha de soja.

Num seu outro aspecto, o presente invento diz respeito a um método para a intensificação da biodisponibilidade de um agente terapêutico proteoliticamente lábil num mamífero ou noutro animal necessitado do referido agente terapêutico, caracterizado por se administrar o referido agente terapêutico em combinação com uma quantidade intensificadora da biodisponibilidade de um agente protector, na condição de que o referido agente terapêutico não seja insulina quando o referido agente protector é farinha de soja.

A designação de agente terapêutico^; proteoliticamente lábil, que é um ingrediente activo numa composição farmacêutica de acordo com o presente invento, inclui todos aqueles que possuem ligações a peptídeos na sua estrutura ou que, apôs exposição a diversas enzimas proteoliticas presentes no tracto digestivo ou nasal ou na mucosa vaginal são inactivados por decomposição, por desnaturação ou por outros meios. Consequentemente, quando administrados pelas vias oral, nasal, rectal ou vaginal, os agentes terapêuticos activos não podem ser absorvidos ou não podem produzir os seus efeitos terapêuticos de modo completamente satisfatório. São exemplos destes agentes terapêuticos proteoliticamente lãbeis os peptídeos tais como calcitonina, prolactina, adrenocorticotropina, hormona do crescimento, hormona gonadotró-pica, oxitocina, vasopressina, gastrina, tetragastrina, pentagas-trina, glucagon, secretina, pancreozimina, substância P e gonado-tropina. Outros exemplos de agentes terapêuticos proteoliticamente lãbeis são a hormona libertadora luteinizante, o leuprolida, a encefalina, a hormona estimulante do folículo, a colecistoquini-na, a timopentina, a endotelina, a neurotensina, o interferon, as interleucinas, a insulina e a insulinotropina. Outros exemplos são os anticorpos terapêuticos tais como os usados para tratar choques sépticos.

Como agentes terapêuticos proteoliticamente lãbeis também pode usar-se extractos purificados de origem natural e as suas modificações químicas bem como produtos obtidos a partir de culturas de tecidos e produtos obtidos a partir de culturas de microrganismos ou de células tornados produtivos por meio de tácnicas de engenharia genética. Os agentes terapêuticos proteoliticamente lãbeis também podem incluir peptídeos sintéticos e derivados de peptídeos sintéticos tais como terlaquireno 9

(Ν- [Ν-(4-morfolinocarbonil) -L-fenilalanina-^-metilcisteína] -2 (R) --hidroxi-3(S)-amino-4-ciclo-hexilbutanoato de isopropilo) (patente nos E.U.A. ns 4 814 342).

Os agentes protectores de acordo com o presente invento podem ser proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados, proteínas naturais, proteínas naturais purificadas, proteínas naturais quimicamente modificadas ou proteínas naturais parcialmente hidrolisadas, ou proteínas que foram fraccionadas em função da massa molecular, da polaridade ou da carga, ou misturas dos referidos tipos de proteínas. Preferem-se as proteínas naturais de qualidade alimentar ou as proteínas de qualidade alimentar parcialmente hidrolisadas. A massa molecular do agente protector deverá ser superior a 1000.

Os procedimentos para o fraccionamento segundo as massas moleculares do agente protector pode ser variado de modo a obter-se qualquer fracção de determinada massa molecular desejada de uma proteína natural. A extracção com solventes pode ser usada para separar proteínas em função da massa molecular, da polaridade ou da carga. À hidrólise enzimática ou química de uma proteína pode seguir-se a separação da fracção de massa molecular determinada desejada com o auxílio de membranas de ultrafiltração ou de membranas de diálise. O fraccionamento segundo as massas moleculares também pode ser realizado mediante cromatografia sobre gel ou outros meios. A hidrólise das proteínas ou peptídeos pode ser efec-tuada mediante tratamento por acção do calor ou mediante o tratamento com um ácido ou uma base, ou brometo de cianogénio, ou outro meio adequado. 10

O tratamento enzimático pode ser - efectuado com o auxílio de uma única enzima proteolítica ou com o auxílio de diversas combinações de enzimas proteoliticas actuando concorrente ou sequencialmente. Pode usar-se uma diversidade de enzimas proteoliticas, incluindo - mas a elas não se limitando - tripsi-na, quimotripsina, elastase, carboxipeptidase, aminopeptidase, pepsina e colagenase. O fraccionamento e os tratamentos enzimáticos destinados a produzir os agentes protectores de acordo com o presente invento podem ser aplicados a uma grande variedade de materiais proteináceos. As proteínas naturais de origem animal ou vegetal são os preferidos. Estes materiais de partida proteináceos incluem - mas a eles não se limitam - farinha de soja, proteína de soja, glúten de trigo, amêndoa em pó, amendoim em pó, caseína, proteína de peixe, etc.

Sem que tal pretenda ser limitativo, pensa-se que os agentes protectores de acordo com o presente invento funcionam como inibidores de protease sacrificiais que, em consequência, intensificam a biodisponibilidade dos agentes farmacêuticos que são lábeis no que diz respeito a determinadas proteáses que podem degradar os agentes farmacêuticos na sequência da administração por uma das vias oral, nasal, vaginal ou rectal. A coadministra-ção destes agentes protectores com os agentes farmacêuticamente lábeis tem como resultado (1) a ocupação competitiva das proteã-ses degradantes pelos referidos agentes protectores, (2) a inibição da degradação das proteáses dos agentes farmacêuticos que tem por consequência uma absorção e uma eficácia terapêutica intensificada e, finalmente, (3) o completamento do metabolismo e a absorção dos agentes protectores. 11

proposto julga-se desejável equilibrar a velocidade de dissolução do agente protector e a velocidade de dissolução do agente terapêutico proteoliticamente lãbil. Os presentes inventores descobriram que, em geral e no caso dos agentes terapêuticos de baixas massas moleculares, são mais eficazes os agentes protecto-res com tempos de dissolução curtos. Os peptídeos com massas moleculares superiores a 1000 e inferiores a 100 000 são os preferidos e, entre estes, são especialmente preferidos aqueles com massas moleculares superiores a 1000 e inferiores a 30 000. A fracção de agente protector eficaz deve ser adequada às características particulares de labilidade do agente terapêutico proteoliticamente lábil. A título de exemplo, no caso de um agente terapêutico que apresenta labilidade no que diz respeito â aminopeptidase, prefere-se uma fracção de agente protector com uma grande velocidade de dissolução e que seja eficaz contra a aminipeptidase. No caso do agente terapêutico lábil no que se refere à aminopeptidase D-Ala-D-Leu-encefalina (YdAGFdL) um agente protector preferido á a fracção de farinha de soja decantada tratada com pepsina de massa molecular inferior a 30 000, tal como é demonstrado no Exemplo 15. No caso de um agente terapêutico proteoliticamente lábil que apresenta labilidade no que diz respeito a uma ou mais proteãses lumenais ou mucosas prefere-se um agente protector que intensifique a biodisponibili-dade sistémica do agente terapêutico quando o agente protector é praticamente doseado na sua totalidade, tal como atrás se descreveu. As fracções de agente protector preferidas, para um determinado agente terapêutico proteoliticamente lábil, são obtidas mediante processos de decantação, filtração, extracção, hidrólise e fraccionamento segundo o tamanho que se encontram descritos na presente memória descritiva. As fracções de agente protector preferidas, para um determinado agente terapêutico 12

χ' proteoliticamente lábil, são identificadas mediante procedimentos in vitro e in vivo tais como os aqui exemplificados. A composição farmacêutica de acordo com o presente invento é administrada de preferência a um mamífero ou a outro animal necessitado de um qualquer tratamento em que um agente protector e um agente terapêutico proteoliticamente lábil possam coexistir no intestino, por exemplo sob a forma de comprimidos, grânulos ou cápsulas, estando ambos os ingredientes munidos de um revestimento entérico quer em separado quer em conjunto. A composição também pode ser administrada pelas vias rectal ou vaginal sob a forma de supositórios preparados mediante a adição de ambos os ingredientes a uma base para supositórios vulgarmente utilizada. De modo semelhante, o agente protector e um agente terapêutico proteoliticamente lábil podem ser administrados em conjunto num pulverizador nasal. Quando desejável, pode adicionar-se às formas diversos aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como excipientes e emulsionantes. A dose do agente terapêutico proteoliticamente lábil administrada está compreendida de preferência entre 0,0001 e 1 vez a dose dessa subtância quando administrada oralmente e formulada de acordo com a técnica precedente. A quantidade de agente protector será uma função da via de administração, da labilidade do agente terapêutico e da dose de agente terapêutico. No caso de a administração se efectuar por uma das vias oral, rectal e vaginal, a dose administrada de agente protector estará geralmente compreendida entre cerca de 10 mg e cerca de 1500 mg. No caso de se tratar de soluções ou suspensões a administrar pela via oral, a dose de agente protector administrada será em geral inferior estando compreendida entre 1 mg e 100 mg. 13

Diversas composições farmacêuticas : .;de acordo com o presente invento destinadas a serem absorvidas no intestino foram avaliadas no que diz respeito à sua eficácia, obtendo-se os resultados apresentados em seguida.

Os Exemplos que se seguem pretendem apenas ilustrar melhor o presente invento e não limitar o seu âmbito que se encontra definido nas reivindicações.

Exemplo 1

Processamento de proteínas e farinhas comercializadas. Fracciona-mento por solubilizacão. Farinha de soía.

Agitou-se durante 15 minutos 4,5 g de farinha de soja (Sigma Chem. Co.) em numa mistura de 135 ml de tampão fosfato 0,01 M, pH 5, e de 15 ml de Thimerosal a 0,05%, sonicou-se a mistura resultante durante 10 minutos e agitou-se durante 25 horas à temperatura ambiente. Deixou-se depositar a mistura, retirou-se o produto sobrenadante, centrifugou-se e filtrou-se. Obteve-se deste modo a fracção directamente solúvel destinada a ser recuperada e usada ou ulteriormente processada.

Exemplo 2

Processamento de proteínas e farinhas comercializadas. Fracciona-mento segundo as massas moleculares por solubilizacão e diálise. Farinha de soia

Seguiu-se o procedimento do Exemplo 1 a fim de preparar uma solução de farinha de soja decantada e filtrada que foi subsequentemente processada de modo a obter-se uma discriminação segundo as massas moleculares (MM). A fracção solubilizada foi 14

evaporada até à secura a 55°C num forno de vácuo., 0 evaporado foi dissolvido em água e dialisado contra água numa tubagem de diálise de espectro de corte de massa molecular (CMM) 1000 durante um período de 24 horas com mudanças periódicas do meio de diálise. 0 material retido foi evaporado dando origem a 1,17 g de uma fracção de farinha de soja solubilizada de MM superior a 1,17 g* :

Exemplo 3

Processamento de proteínas e farinhas comercializadas. Fracciona-mento secundo as massas moleculares por solubilizacão e ultrafil-tracão (UF): fraccões de 1 K a 30 K e de 30 K a 100 K

Adicionou-se, sob agitação, 288 g de farinha de soja (Sigma ns s-9633) a uma solução de 8640 ml de tampão fosfato 0,001 M, pH 7,5, e de 1920 ml de Thimerosal a 0,1%. A suspensão resultante foi agitada durante mais 15 minutos com o auxílio de um agitador magnético. A mistura foi então sonicada durante 10 minutos e depois agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. A solução foi depois centrifugada entre 2500 rpm e 3000 rpm durante uma hora. 0 líquido sobrenadante foi separado mediante ultrafiltração usando uma membrana com um limite de massa molecular nominal de 100 K Pellicon (Millipore Corp., Bedford, MA, E.U.A.). 0 produto retido (>100 K) foi eliminado e o produto permeado (< 100 K) foi separado usando uma membrana com um limite de massa molecular nominal de 30 K Pellicon. 0 segundo produto retido (30 K a 100 K) foi preservado e o segundo produto permeado foi separado com o auxílio de uma membrana com um limite de massa molecular nominal de 1 K Pellicon. O terceiro produto retido (1 K a 30 K) foi preservado e o terceiro produto permeado (< 1 K) foi eliminado. A fracção de 1 K a 30 K foi secada por congelação e a fracção de 30 K a 100 K foi secada num forno de vácuo. 0 J. i '· * 'χ 15

- ? í V ·< rendimento da fracçao de l K a 30 K (7,33' gj foi de 2,5% da farinha de soja de partida. O rendimento da fracção de 30 K a 100 K (5,25 g) foi de 1,8% da farinha de soja de partida.

Exemplo 4

Processamento de proteínas e farinhas comercializadas. Hidrólise mediante pepsina e fraccionamento segundo as massas moleculares por diálise. Farinha de soia

Hidrolisou-se a farinha de soja de modo a obter-se fragmentos de menor massa molecular (MM) usando pepsina e o produto hidrolisado foi fraccionado de modo a obter-se fracções de 1000 K a 3500 K, de 3500 K a 5/8 K e de 6/8 k a 12/14 K de acordo com o procedimento descrito em seguida.

Adicionou-se 5,4 g de farinha de soja (Sigma ns S-99633; 5,4 g) e Thimerosal (concentração final de 50 ppm) a 180 ml de uma solução contendo (HCl 0,2 N)/(KCl 0,2 N), pH 1,9, e misturou--se durante meia hora, após o que se adicionou 18,0 g de Pepsin (Sigma ne P-6887; 18,0 g). Colocou-se partes alxquotas de 20 ml cada em cada uma das 9 peças de uma tubagem de diálise de espectro de corte de massa molecular (CMM) 12 000 a 14 000 e dialisou--se contra 55 ml de tampão KCl, pH 1,9, a 37°C num banho de água agitado. 0 tampão foi mudado após 2 horas e após 6 horas e a diálise foi prosseguida durante 24 horas. Os produtos permeados (< 12/14 K) obtidos ao fim de cada período de tempo foram combinados e evaporados a 55°C num forno de vácuo.

As amostras obtidas após 2 horas, 6 horas e 24 horas foram colocadas numa tubagem de CMM 1000 e dialisadas contra água. Os produtos retidos resultantes (1 K a 12/14 K) foram evaporados a 55°C num forno de vácuo obtendo-se um total de 449,5 16

mg; 418 mg deste produto foram dissolvidos * em 30 ml de água desionizada e colocados em duas peças de uma tubagem de diálise de CMM 3500 e dialisados contra 55 ml de água à temperatura ambiente durante 24 horas. A água foi mudada após períodos de diálise de 2, 6 e 24 horas e os produtos permeados (1 K a 3,5 K) foram combinados e evaporados a 55°C num forno de vácuo.

Os produtos retidos em cada peça da tubagem foram colocados isoladamente numa tubagem de CMM 6000/8000 e tratados do modo atrás descrito. A evaporação dos produtos permeados originou fragmentos com MM compreendidas entre 3500 e 6000/8000. Os produtos retidos, representando a fracção com MM compreendidas entre 6000/8000 e 12000/14000, também foram combinados e evaporados. 0 esquema I resume o procedimento de fraccionamento descrito. 17

ESQUEMA I farinha de soja tratada com pepsina diálise de CMM de 12/14 K ->- p. retido (> 12/14 K) p. permeado (< 12/14 K) diálise de CMM de 1 K ->- p. permeado (< 1 K) p. retido (1 K a 12/14 K) diálise de CMM de 3,5 K ->-1 p. retido p. permeado (3,5 K a 12/14 K) (1 K a 3,5 K) diálise de CMM de 6/8 K ->- p. retido p. permeado (6/8 K a 12/14 K) (3,5 K a 6/8 K)

Exemplo 5

Processamento de proteínas e - farinhas. Tratamento com pepsina imobilizada

Processou-se farinha de soja (Sigma Co., ns S-9633) tal como no Exemplo 1 e secou-se. Este produto foi ultrafiltrado com o auxílio de uma membrana de CMM de 30 K. O produto retido (> 30 K) foi recolhido e secado. Dissolveu-se 13,8 g deste material em 900 ml de água e ajustou-se o pH para o valor 2,0 com o auxílio 18

de HCl 0,1 N. Adicionou-se 1,19 g de pepsina Imobilizada (imobilizada sobre agarose com 4% de ligação cruzada em pérolas, Sigma Chem. Co., ns P-3286, 40 unidades/mg). Esta suspensão, mantida a 37°C foi ultrafiltrada através de membranas de CMM de 30 K. O produto permeado (< 30 K) foi recolhido a intervalos de 15 minutos e foi secado por congelação. O produto retido (> 30 K) foi reciclado mediante o processamento por ultrafiltração. Os produtos da hidrólise com o auxílio de pepsina aparecem no produto permeado. O Quadro I apresenta o volume de cada fracção permeada e a massa do peptídeo hidrolisado em cada fracção seca.

QUADRO I

Peptídeos hidrolisados com o auxílio de pepsina obtidos pelos métodos descritos no Exemplo 5

Tempo de recolha Volume Massa recolhida (min) (ml) (mg) 15 600 361,1 30 300 385,0 45 300 241,5 60 300 361,3 75 275 403,2 90 • 350 390,1 105 500 557,8 120 600 410,5 135 550 261,6 19 19

Exemplo 6

Processamento de proteínas e farinhas comercializadas. Hidrólise mediante tratamentos enzimáticos sequenciais. Tripsina e elastase. Farinha de soja

Dispersou-se 600 g de farinha de soja em 20 ml de tampão fosfato de potássio 0,01 M, pH 7,5, com 50 ppm de Thimerosal. Adicionou-se 2 mg de tripsina e a mistura foi colocada numa tubagem de diálise de CMM de 12/14 K. A mistura foi dialisada contra 50 ml de tampão a 37°C num banho de água agitado. 0 tampão foi mudado após 2 horas e após 6 horas e a diálise foi prosseguida durante 24 horas. Adicionou-se 50 ppm de Thimerosal ao tampão adicionado após 6 horas. Este procedimento foi repetido mais três vezes.

As amostras de produto permeado obtidas após 2, 6 e 24 horas em cada uma das três diálises foram combinadas, a absorvên-cia a 280 nm foi determinada e as amostras foram evaporadas num forno de vácuo a 55°C. Os três resíduos da evaporação foram reconstituídos com 20 ml de água desionizada, 50 ppm em Thimerosal.

Adicionou-se 2,0 mg de elastase (0,182 ml de solução de elastase, 11 mg de proteína/ml) a cada um deles e as amostras resultantes foram colocadas numa tubagem de diálise de CMM de 12/14 K e dialisadas contra tampão. 0 tampão foi mudado após 6 horas e a diálise foi prosseguida durante 24 horas. Após a determinação da absorvência a 280 nm, os produtos permeados foram evaporados do modo atrás descrito. 0 produto assim obtido foi designado por soja sequencialmente tratada com tripsina/elastase, MM < 12/14 K. 20

Exemplo 7 ' ·': ·

Intensificação da absorção por via oral de terlaquireno por acção de agentes protectores em cães 0 tripeptídeo antagonista da renina terlaquireno (200 mg demedicamento formulado como um sólido cristalino em pó numa cápsula de gelatina dura) foi coadministrado a quatro cães Beagle jejuados juntamente com uma pasta aquosa constituída por 1 g do inibidor a testar e por 150 ml de água. Os níveis de tripeptídeo no soro foram medidos em 6 momentos posteriores à administração: 15 min, 30 min, lh, 2h, 3 h, e 4 h. Em cada teste usou-se quatro cães jejuados, sendo cada um deles, numa semana precedente, utilizado como o seu próprio controlo. O soro foi extraído com cloreto de N-butilo e depois foi incubado com uma solução aquosa de quimotripsina. 0 derivado, obtido com o auxílio de fluorescamina, do produto da degradação foi testado. O detector da fluorescência utilizado foi um Spectroflow 280 Kratos. A coluna usada foi uma Novapak C-18 Waters. O comprimento de onda da emissão foi de 380 nm. A fase móvel empregada foi água/aceto-nitrilo 75:25 e a débito foi de 1,0 ml/min. O limite de detecção foi de 10 ng/ml. As áreas zero-a-quatro-horas sob as curvas (ASCs) foram calculadas a partir do traçado do gráfico concentração vs. tempo para cada cão usando a regra trapezoidal. O Quadro II demonstra que a proteína de soja comercializada (PP 620 de Protein Technologies Inc.) e uma fracção de 1K a 30 K de farinha de soja processada (preparada do modo descrito no Exemplo 3) intensificam a biodisponibilidade do terlaquireno, um agente terapêutico lãbil no que diz respeito à quimotripsina, quando administrado por via oral. 21

Área sob a curva (ASC) nível de plasma vs. tempo para cães ASC ^g-h/ml) Cão Formulação 34112 34101 04132 04094 Média PP 620 0,863 0,436 0,117 0,417 0,458 Soja (1 K a 30 K) 0,420 0,320 0,078 0,326 0,286 Controlo 0,043 0,026 0,022 0,106 0,049 Razão PP620/Contr. 20,1 16,8 5,3 3,9 11,5 Soja(l-30 K)/ /Controlo 9,8 12,3 3,5 3,1 7,2

Exemplo 8

Proteccão contra a degradação pela cmimotripsina do terlaquireno; metodologia in vitro

Seguiu-se um procedimento comum para testar a potência inibidora in vitro de diversas proteínas e seus produtos processados contra a degradação pela quimotripsina do terlaquireno que foi o seguinte: Preparou-se soluções a testar de a-quimotripsina -7 . ... (0,67 x 10 M), de terlaquireno (0,065 mM) e do mibidor a testar (em concentrações de 0,1 mg/ml a/ou 0,5 mg/ml) em tampão (ácido cítrico 0,10 M)/(fosfato dissódico 0,20 M), pH 6,5, sendo a concentração final do tampão 300 mOsm, e incubou-se a 37°C. Recolheu-se amostras no instante zero e depois a intervalos de 5 minutos e interrompeu-se o processo de incubação mediante a \y: adição HC1 até ser atingido o pH 2,0 antes de se proceder a cromatografia líquida de elevado rendimento preparatória. A análise mediante CLAP foi realizada com o auxílio de uma coluna Resolve 5u C-18 Waters. A fase móvel usada foi uma mistura água/acetonitrilo 50:50 a que foi adicionado 1 ml de ácido fosfórico por litro. Os dados foram expressos sob a forma de inibições percentuais da degradação de terlaquireno quando comparado com o seu valor de controlo no instante zero, calculada a partir da seguinte equação: inibição percentual = 100% x [l-k^ /kc] onde kin representa a velocidade de degradação inicial do terlaquireno na presença dos agentes protectores e k representa a velocidade inicial de degradação do terlaquireno na ausência dos agentes protectores.

As inibições percentuais foram determinadas para a fracção de 1 K a 30 K de farinha de soja ultrafiltrada e decantada, tal como se mostra no Quadro III.

QUADRO III

Redução da degradação catalisada pela quimotripsina do terlaquireno por acção da fracção de 1 K a 30 K de farinha de soja ultrafiltrada e decantada Concentração do inibidor (mg/ml) * Concentração do inibidor ((mg de proteína)/ml) Inibição percentual 0,5 0,04905 75,4 0,25 0,02453 79,8 0,1 0,00981 21,5 0,05 0,00491 29,3 0,01 0,00098 4,8

Corrigida em função do teor de proteína.

Exemplo 9

Hidrólise pela guilotriosina do terlaquireno. Metodologia para

Determinar os valores K. dos inibidores -1- A constante é definida como a constante de inibição de Michaelis-Menton - uma medida convencional da afinidade de um inibidor no que se refere a um local activo e, consequentemente, da sua potência como inibidor da enzima. As determinações da podem ser efectuadas com base na velocidade inicial de degradação obtida para concentrações variáveis do inibidor e para concentrações constantes do substrato e da enzima. As velocidades iniciais são expressas sob a forma de milimoles de terlaquireno degradadas por minuto, tal como se indica no Quadro IV.

V

QUADRO IV

Redução da degradação catalisada pela quimotripsina do terlaquireno por acção da fracção de 1 K a 30 K de farinha de soja ultrafiltrada e decantada Concentração do inibidor (mg/ml) * * Concentração do inibidor ((mg de proteína)/ml) * k (mmol/min) 0,5 0,04905 1,93 x 10-4 0,25 0,02453 1,59 X 10-4 0,1 0,00981 6,17 X 10"4 0,05 0,00491 5,56 X 10~4 0,01 0,00098 7,48 X 10"4 Controlo reunido 7,86 X 10“4

Diminuição da velocidade inicial do terlaquireno Corrigida em função do teor de proteína

Alternativamente, a determinação de para uma única concentração de inibidor ("K^ de ponto único") pode ser realizada com o auxílio da equação padrão de Michaelis-Menton para a inibição competitiva. A determinação de para concentrações múltiplas (" de múltiplos pontos") pode ser realizada com base na mesma relação, adaptando os dados à equação mediante a análise com base na regressão não linear.

Exemplo 10 0 tempo de dissolução é um factor importante na eficiência dos agentes protectores de acordo com o presente invento. No âmbito da presente memória descritiva define-se o tempo de > < 25

dissolução como o tempo necessário para què Ό/5 mçf/ml do sólido a testar se dissolvam completamente em tampão (ácido cítrico 0,1 M)/(fosfato dissódico 0,2 M) , pH 7, à temperatura ambiente em rotação em torno de um eixo transversal a 8 rpm. 0 momento dem que se completou a dissolução foi determinado mediante inspecção visual.

Exemplo 11 A percentagem de proteína foi determinada para diversos materiais que são agentes protectores. As concentrações de carbono, hidrogénio e azoto na amostra foram determinadas com o auxílio de um Analisador dos Elementos C, H e N Perkin-Elmer 2400. Pesa-se rigorosamente aproximadamente 2 mg de amostra e coloca-se esta no analisador. A percentagem de azoto na amostra foi multiplicada por 6,25 para obter-se uma estimativa da percentagem de proteína.

Exemplo 12

Determinou-se a capacidade de redução da degradação do terlaquireno pela quimotripsina demonstrada por diversas fracções de proteínas comercializadas e processadas. A farinha de soja utilizada foi adquirida a Sigma Chem. Co.; a farinha de amêndoa e a farinha de amendoim foram adquivridas a Pert Labs.; o glúten de trigo foi adquirido a Total Foods Corp.. A farinha de soja adquirida a Sigma Chem. Co. não é torrada contendo por conseguinte o inibidor de tripsina/quimotripsina de Bowman-Birk, com MM de 8000. A proteína de soja (ns PP620) adquirida a Protein Technologies, Inc. é uma preparação tratada por acção do calor em que o inibidor de tripsina/quimotripsina, ^çle Bowman-Birk foi inactivado. A inibição percentual foi determinada do modo descrito no Exemplo 8. O Quadro V demonstra que as fracções de agente protector testadas reduzem a degradação do terlaquireno catalisada pela quimotripsina, um inibidor da renina sensível a quimo-tripsina. 27

Inibição in vitro da dearadacao do terlaquireno por accão de proteínas comercializadas e processadas (0,5 mg/ml) Fonte de produto de partida / / Descrição Inibição percentual (de acordo com o Ex. 8) 1. Farinha de soja, tratada com pepsina e dialisada (> 1 K) 87 2. Farinha de soja, tratada com pepsina e fraccionada (Ex. 4) MM 1000 a 35000 MM 3500 a 6/8 K MM 6/8 K a 12/14 K 24.0 46,6 85.1 3. Farinha de soja 69,9 4. Farinha de soja, decantada e e ultrafiltrada MM 1 K a 30 K MM 30 K a 100 K 75.4 e 93,3 (2 preparaç.) 75.4 e 86,8 (2 preparaç.) 5. Farinha de soja, diálise para MM > 1000 97,6 6. Glúten de trigo, decantado e e ultrafiltrado MM 1 K a 30 K 95,8 7. Glúten de trigo 76,8 8. Farinha de amendoim, decantada e e ultrafiltrada MM 1 K a 30 K 28,6 9. Farinha de amêndoa, decantada e e ultrafiltrada MM 1 K a 30 K 37,6 10. Proteína de soja (Protein Tech., Inc.) 86,0

Exemplo 13

Determinou-se a percentagem de proteína, o tempo de dissolução e a constante de diversos produtos proteicos comercializados e de fracções proteicas processadas (do modo descrito nos Exemplos 11, 10 e 9, respectivamente). Estes dados são apresentados no Quadro VI. Estes dados demonstram que podem ser preparadas fracções redutoras da degradação que exibem não só um valor baixo da constante como um curto tempo de dissolução. A farinha de soja adquirida a Sigma Chem. Co. não é torrada contendo por conseguinte o inibidor de tripsina/quimotrip-sina de Bowman-Birk, com MM de 8000.

QUADRO VI

Velocidade de dissolução e constantes de inibição de proteínas comercializadas e processadas representativas Fonte de prod. partida / / Descrição % de proteína Tempo de dissolução K. deèer. A. Proteínas/Farinhas comerciais 1. Caseína (Sigma C-5890) 87,94 > 4 dias 0,240* 2. Farinha de soja 51,69 > 4 dias * 0,18 3. Glúten de trigo 78,81 > 4 dias 0,091* B. Substâncias ultrafiltradas (1 K a 30 K) 1. Farinha de soja 9,81 0,1 min 0,00765 2. Farinha de amêndoa 10,37 2,3 min 0,0618* 3. Caseína 71,31 1,8 min - 4. Farinha de amendoim 13,19 3,1 min 0,120* 5. Glúten de trigo 37,81 3,8 min 0,0060* C. Substâncias ultrafiltradas (30 K a 100 K) 1. Farinha de soja 44,44 2,6 min 0,0029 D. Diálise, > 1 K 1. Farinha de soja 76,5 >4 dias 0,010 E. Tratada com pepsina, ultrafiltrada (< 30 K) 1. Farinha de soja 80,1 0,1 min 0,049 * , , Estimativa da de ponto unico (concentração do mibidor: 0,5 mg/ml) vv

Exemplo 14

Degradação enzimática da colecistoguinina-8 ÍCC0-8) por accão das Vesículas da Membrana do Bordo da Escova fbrush") intestinal do coelho (VMBE) . Inibição por accão de fraccões de proteína de soía

Preparou-se vesículas de membrana do bordo da escova ("brush") do jejuno (VMBE) de ratazana de acordo com o método de Kessler e outros (1978) descrito em Biochem. Biophvs. Acta. 506. 136. Incubou-se VMBE (25 μg de proteína) com CCQ-8 (10 μΜ) na presença e na ausência de agentes protectores (0,15 mg/ml) num volume total de 1 ml a 37°C. Recolheu-se amostras passados 1 minuto e 3 minutos, interrompeu-se o processo de incubação mediante a adição de acetonitrilo num banho de gelo e testou-se as amostras em relação a CCQ-8 mediante cromatografia líquida de elevado rendimento. Os dados apresentados no Quadro VII demonstram que duas fracções de massas moleculares diferentes de proteína de soja processada revelaram ser activas como inibidores da degradação de CCQ-8 por acção de proteases de VMBE, presumivelmente aminopeptidases.

QUADRO VII

Degradação de CCQ-8 por acção de proteases de VMBE Efeito da proteína de soja fraccionada % de CCQ-8 remanescente Tempo de incubação MM 1 K a 30 K MM 30 K a 100 K (min) Sem inibidor Inibidor Inibidor 1 min 42% 59% 67% 3 min 8% 10% 16%

Exemplo 15

Proteccão contra a deoradacao por accão da aminopeptidase in vivo

Administrou-se directamente ao íleo de ratos ilealmente fistulados 1,0 mg análogo do pentapeptídeo encefalina D-Ala-D--Leu-encefalina (YdAGFdL). Administrou-se 1,12 μg de YdAGFdL radioactivamente marcado com cada um dos quatro agentes protecto-res: (1) farinha de soja decantada, MM < 1 K, (2) farinha de soja decantada e ultrafiltrada, MM entre 1 K e 30 K, (3) farinha de soja tratada com pepsina (FMC ACTI-MOD), MM <30 Ke (4) o potente inibidor de aminopeptidase amastatina (controlo positivo) . Recolheu-se sangue de uma cânula da veia jugular em diversos momentos posteriores à administração e a quantidade de YdAGFdL intacta foi determinada por um método radiométrico de cromatogra-fia em camada fina (CCF) usando placas de CCF de fase reversa KC-18 (Whatman Co.). As placas de CCF foram eluídas com 1-propa-nol/(tampão fosfato 0,1 M) 30:70, pH 4,1.

No Quadro VIII apresenta-se as biodisponibilidades absolutas para diversos tratamentos. A farinha de soja tratada com pepsina (FMC ACTI-MOD), MM < 30 K revelou ser particularmente eficaz como agente protector contra as aminopeptidases intestinais, tal como demonstra o aumento de 11 vezes na percentagem absorvida. 0 potente inibidor de aminopeptidase amastatina também se revelou eficaz, o que demonstra que a biodisponibilidade da YdAGFdL fica parcialmente limitada pela degradação por acção das aminopeptidases intestinais. A farinha de soja não torrada não ofereceu protecção contra a degradação por acção das aminopeptidases intestinais.

V,-

QUADRO VIII ^ * 5· t

Agente protector n % de YdAGFdL Biodisponibilidade Nenhum (controlo) 16 1,78 ± 0,46 Farinha de soja decantada, MM < 1 K (100 g) 4 1,74 ± 0,68 Farinha de soja decantada, ultrafiltrada (FMC ACTI-MOD), MM 1 K a 30 K (150 mg) 4 2,76 ± 1,43 Farinha de soja tratada com pepsina, MM < < 30 κ (íoo mg) 4 19,54 ± 13,75 Amastatina (1 mg) (controlo pos., Sigma) 6 8,76 ± 4,47 Farinha de soja não torr. (Sigma) (50 mg) 2 1,88 ± 0,67

Exemplo 16

Preparação de farinha de soia tratada com pepsina usando pepsina imobilizada

Suspendeu-se 36 g de farinha de soja (Sigma Chem. Co.) em 1080 ml de água e 120 ml de solução a 0,1% (p/v) de Thimerosol. A suspensão foi misturada à temperatura ambiente durante 24 h e centrifugada durante uma hora a 3600 rpm. 0 produto sobrenadante foi ultrafiltrado com o auxílio de uma membrana de CMM de 30 K. A fracção de MM > 30 K foi recolhida, concentrada e o seu pH foi ajustado para o valor 2 com o auxílio de HC1 0,5 N. A fracção de

MM > 30 K foi introduzida num módulo reactor em espiral ACTO-MOD carregado com 8 g de pepsina imobilizada (FMC Corp. Pinebrook, NJ, E.U.A.). 0 fluxo emergente do reactor foi ultrafiltrado com o auxílio de uma membrana de CMM de 30 K. A fracção de MM > 30 K foi obrigada a circular de novo através de reactor. Após um total de 2 h de tratamento com enzimas e após ultrafiltração, preservou-se a fracção de MM < 30 K que foi designada por "farinha de soja (< 30 K) ultrafiltrada, tratada com pepsina".

Exemplo 17

Inibição de tripsina - Degradação catalisada de benzoil-arcrinina -para-nitroanileto in vitro

Utilizou-se o procedimento descrito em seguida para avaliar a potência inibidora in vitro de um agente protector de acordo com o presente invento contra a degradação catalisada pela tripsina do benzoil-arcrinina-para-nitroanileto (ΒΑΡΝΑ) . Preparou--se as soluções a testar de tripsina (1,25 ^g/ml, 103 (unidades de BAEE)/ml, ΒΑΡΝΑ (0,5 mg/ml) e inibidor a testar (0,5 mg/ml) em tampão (TRIS 0,048 M)/(CaCl2 0,019 M), pH 8, contendo 3,75 μg/ml de albumina de soro bovino e incubou-se as mesmas a 37°C. Recolheu-se amostras passados 5 minutos e depois a intervalos de 5 minutos até serem decorridos 40 minutos e interrompeu-se o processo de incubação com um mesmo volume de ácido acético a 30% v/v antes de proceder-se à análise. A análise do produto da degradação resultante da hidrólise do ΒΑΡΝΑ, 4-nitroanilina, foi efectuado com o auxílio de um espectrofotómetro UV/vis Lambda 3B Perkin-Elmer. A absorvência das amostras cujo processo de incubação foi interrompido foi medida em 410 nm. Os dados foram expressos sob a forma de inibições percentuais da degradação do ΒΑΡΝΑ em comparação com um controlo, que não continha inibidor, calculada mediante a seguinte equação: inibição percentual = 100% x [l-(S^n/SQ) onde S^n representa a velocidade de alteração da absorvência com o tempo na presença de inibidor e Sq representa a velocidade de alteração da absorvência com o tempo na ausência de inibidor. A inibição percentual foi determinada usando a fracção de MM entre 30 K e 100 K de farinha de soja filtrada. Este lote de farinha de soja processada foi preparado de acordo com o método de solubilização e ultrafiltração descrito no Exemplo 3. Os resultados obtidos encontram-se no Quadro IX e demonstram que a fracção de proteína processada testada reduz a degradação catalisada pela tripsina do ΒΑΡΝΑ.

QUADRO IX

Redução da degradação catalisada pela tripsina de ΒΑΡΝΑ por acção da fracção de MM entre 30 K e 100 K de farinha de soja processada

Concentração de inibidor Concentração da proteína do inibidor (mg/ml) (mg de prot.)/ml Inibição percent. 0,5 0,41 73

Exemplo 18

Procedimentos adicionais de fraccionamento e tratamento enzimáti-co

Os procedimentos de fraccionamento de acordo com as

massas moleculares de proteínas e de peptídeos descritos nos Exemplos 1 a 8 foram variados a fim de obter-se qualquer fracção de qualquer massa molecular desejada mediante uma escolha adequada de membranas de ultrafiltração ou de membranas de diálise. 0 fraccionamento segundo as massas moleculares também pode ser efectuado mediante cromatografia em gel. O tratamento enzimático, exemplificado nos Exemplos 4 a 7, é realizado com o auxílio de uma única enzima proteolítica, ou com o auxílio de diversas combinações de enzimas proteolíticas actuando concorrente ou sequencialmente. Utiliza-se uma diversidade de enzimas proteolíticas incluindo - mas a elas não se limitando - tripsina, quimotripsina, elastase, carboxipeptidase, aminopeptidase, pepsina e colagenase. 0 fraccionamento e os tratamentos enzimáticos descritos nos Exemplos la 8 são aplicados a uma diversidade de produtos proteináceos de origem vegetal ou animal. Estes produtos de partida proteináceos de origem vegetal ou animal incluem - mas a elas não se limitam - farinha de soja, proteína de soja, glúten de trigo, amêndoa em pó, amendoim em pó, caseína e proteína de peixe.

Exemplo 19 A capacidade de dissolução rápida e de imediata actua-ção após ser libertado in vivo demonstrada por um agente protec-tor é um factor importante para a eficiência dos agentes redutores da degradação de acordo com o presente invento. Para testar esta capacidade comparou-se in vitro as capacidades de redução da degradação de terlaquireno num ambiente dinâmico da farinha de soja e da fracção de MM entre 30 K e 100 K de farinha de soja decantada e ultrafiltrada. A metodologia in vitro do Exemplo 8 - 36 - ι r ι

foi seguida se exceptuarmos o facto de a soluçjlo a testar presentemente conter apenas enzima e terlaquireno em tampão. O inibidor a testar (farinha de soja ou fracção de MM entre 30 K e 100 K de farinha de soja decantada e ultrafiltrada) foi adicionado numa concentração de 0,01 mg/ml sem misturação adicional enquanto a solução estava a ser agitada à velocidade 5 num banho de água (American Scientific, modelo ns YB531) a 37°C. Recolheu-se amostras passados 19 segundos, 1 minuto e depois a intervalos de 2 minutos até serem decorridos 11 minutos, em seguida a intervalos de 5 minutos até ser decorrida a totalidade de 46 minutos. A interrupção, a análise mediante cromatografia líquida de elevado rendimento e a análise de dados foram efectuadas do mesmo modo que no Exemplo 8.

QUADRO X

Inibidor a testar (0,01 mg/ml) * k (mmol/min) Inibição percentual Farinha de soja 2,96 x IO-4 27,1 Farinha de soja decantada e ultrafiltrada MM 30 K a 100 K 0,86 x 10“4 78,8

Apesar de o presente invento ter sido descrito em função das suas formas de execução preferidas, que constituem o melhor modo de o levar à prática segundo o estado actual de conhecimento dos presentes inventores, deve ter-se em conta que podem ser efectuados diversos desvios e modificações, como será 37 ν sem se evidente para aqueles com conhecimentos gerais neste domínio, que desse modo se saia do âmbito do presente invento tal como encontra definido nas reivindicações anexas.

Lisboa, 16 de Dezembro de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR COROON, 10- A 3* 1200 USBOA

Claims

1 t // / -

REIVINDICAÇÕES ia. - Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um agente protector e uma quantidade biologicamente eficaz de um agente terapêutico proteoliticamente lábil, na condição de que o referido agente terapêutico não seja insulina quando o referido agente protector for farinha de soja. 2â, - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser seleccionado entre uma proteína, um peptídeo, uma proteína natural purificada, uma proteína farccionada segundo os pesos moleculares, uma proteína extraída com solvente ou uma proteína parcialmente hidrolisada. 3§. - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada que foi hidrolisada por uma via enzimática. 4®. - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a referida via enzimática fazer uso de uma enzima seleccionada entre tripsina, cromotripsina, elastase, carboxipeptidase, aminopeptidase, pepsina ou colagenase. 5§. - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada e fraccionada segundo os pesos moleculares com um peso molecular superior a 1000. 2

6â. - Composição farmacêutica de acordò com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada fraccionada segundo os pesos moleculares com um peso molecular compreendido entre 1000 e 30 ooo. 7-, - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser seleccionado entre farinha de soja, proteína de soja, glúten de trigo, farinha de amêndoa, farinha de amendoim, caseína ou proteína de peixe. 8^. - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína ou uma proteína parcialmente hidrolisada fraccionada segundo os pesos moleculares que é derivada de uma proteína natural. 9§. - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido agente terapêutico proteo-liticamente lãbil ser seleccionado entre calcitonina, prolactina, adrenocorticotropina, tirotropina, a hormona do crescimento, a hormona gonadotrópica, oxitocina, vasopressina, gastrina, tetra-gastrina, pentagastrina, glucagon, secretina, pancreozima, substância P, gonadotropina, imunoglobulina, leuprolida, hormona libertadora da hormona luteinizante, encefalina, colecistoquini-na, hormona estimulante dos folículos, interferão, interleucina, timopentina, endotelina, neurotensina, insulina, insulinotropina ou terlaquireno. 10s. - utilização de um agente terapêutico em combinação com um agente protector, caracterizado por o referido agente terapêutico em combinação com referido agente protector ser 3

empregue na preparação de uma composição farmacêutica para intensificar a biodisponibilidade de um agente terapêutico proteoliticamente lábil, na condição de que o referido agente terapêutico não seja insulina quando o referido agente protector for farinha de soja. lia. - Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser seleccionado entre uma proteína, um peptídeo, uma proteína natural purificada, uma proteína fraccionada segundo os pesos moleculares, uma proteína extraída com solvente ou uma proteína parcialmente hidrolisada. 12a. - Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada que foi hidrolisada por uma via enzimá-tica. 13â. - Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a referida via enzimãtica fazer uso de uma enzima seleccionada entre tripsina, cromotripsina, elastase, carboxipeptidase, aminopeptidase, pepsina ou colagenase. 14 a - Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada fraccionada segundo os pesos moleculares com um peso molecular superior a 1000. 15â. - Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína parcialmente hidrolisada fraccionada segundo os pesos moleculares com um peso molecular compreendido entre 1000 e 30 000. 4 162. - utilização de acordo com -a.··reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser seleccionado entre farinha de soja, proteína de soja, glúten de trigo, farinha de amêndoa, farinha de amendoim, caseína ou proteína de peixe. 172. - utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente protector ser uma proteína ou uma proteína parcialmente hidrolisada fraccionada segundo os pesos moleculares que é derivada de uma proteína natural.

182. - Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o referido agente terapêutico proteoliticamente lãbil ser seleccionado entre calcitonina, prolactina, adrenocor-ticotropina, tirotropina, a hormona do crescimento, a hormona gonadotrópica, oxitocina, vasopressina, gastrina, tetragastrina, pentagastrina, glucagon, secretina, pancreozima, substância P, gonadotropina, imunoglobulina, leuprolida, hormona libertadora da hormona luteinizante, encefalina, colecistoquinina, hormona estimulante dos folículos, interferon, interleucina, timopentina, endotelina, neurotensina, insulina, insulinotropina ou terlaqui-reno. 192. - utilização de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o referido agente proteoliticamente lábil ser o terlaquireno.

202. - Utilização de acordo de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por o referido agente proteoliticamente lábil ser o terlaquireno. Lisboa, 16 de Dezembro de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VKJTOR CORDON, 10-A 3.® 1200 LISBOA