KR20140045691A

KR20140045691A - 클로렐라 유래 항고혈압 활성을 갖는 펩티드

Info

Publication number: KR20140045691A
Application number: KR1020120111738A
Authority: KR
Inventors: 전유진; 고석천; 이정석; 김대경; 김길남
Original assignee: 제주대학교 산학협력단; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2014-04-17
Also published as: KR101404850B1

Abstract

본 발명은 클로렐라에서 추출한 항고혈압 기능성 펩티드에 관한 것으로, 상세하게는 Val-Glu-Gly-Tyr의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드에 관한 것이다. 본 발명인 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드는 ACE 저해 활성을 통하여 고혈압에 탁월한 효과를 나타내는 바, 본 발명을 적절히 활용한다면 고혈압 치료에 적합한 약리학적 조성물과 같은 의약품을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 천연 물질에서 유래하였다는 특징에 기초할 때 건강기능식품으로도 제공할 수 있을 것이다.

Description

클로렐라 유래 항고혈압 활성을 갖는 펩티드{Antihypersensitive peptide from Chlorella ellipsoidea}

본 발명은 클로렐라에서 추출한 항고혈압 기능성 펩티드에 관한 것이다.

고혈압은 전 세계적으로 성인의 15~20%가 겪고 있는 질환으로 동맥경화, 뇌졸중, 심근경색 및 당뇨병 등 심각한 만성 질환을 야기시켜 사회적으로나 경제적으로 손실이 막대하다. 고혈압에 걸리면, 정상적인 혈압을 유지하던 기관들이 서서히 그 기능을 상실하고, 이와 함께 다양한 합병증을 유발하여 매우 높은 치사율을 보이는 만성 퇴행성 질환으로 발전한다.

고혈압의 원인은 거의 밝혀져 있지 않으나, 혈압을 상승시킬 수 있는 여러 가지 요인들 가운데 레닌-안지오텐신-알도스테론(Renin-Angiotensin-Aldosterone) 고리는 생체 내에서 혈압과 체액량을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 생체 중에 존재하고 있는 불활성화 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신 Ⅰ(angiotensin Ⅰ)은 안지오텐신 Ⅰ 전환 효소 (angiotensin Ⅰ converting enzyme, ACE)에 의하여 C-말단의 His-Leu이 떨어져 나감으로써 혈관벽 수축 작용이 있는 옥타펩티드(octapeptide)인 안지오텐신 Ⅱ(angiotensin Ⅱ)로 전환되며, 이렇게 생성된 안지오텐신 Ⅱ는 직접적으로 혈관을 수축하고, 신장에서 알도스테론의 분비를 증가시켜 체액량을 증가시킴으로써 혈압을 상승시키는 작용을 한다. 이러한 ACE의 활성을 억제시킴으로써 혈압상승의 원인이 되는 안지오텐신 Ⅱ의 생성을 저하시켜 혈압의 상승을 억제할 수 있게 된다. 따라서 레닌-안지오텐신-알도스테론 고리의 작용을 효과적으로 조절하는 약물의 발견은 고혈압 치료제 연구에 있어서 중요한 것이라 할 수 있다.

대표적인 ACE 억제제로서 화학합성제인 에넬라프릴(enelapril)이나 캡토프릴(captopril) 등이 개발되어 고혈압 개선제로서 이용되고 있지만, 마른기침, 두통, 안면홍조, 식욕부진, 미각이상, 발진, 백혈구 감소 등의 부작용이 많아 최근에는 부작용이 없는 천연물에서의 ACE 억제제의 개발이 중요시되고 있다.

강력한 생리활성(bioactive) 펩티드들은 다양한 단백질의 효소 가수분해를 통해 만들어질 수 있고, 천연물 유래의 펩티드들은 음식이 장내에서 소화되는 동안 신진대사 과정에서 잠재적인 생리적 조절자로 기능할 수 있다. 생리활성 펩티드들은 그 구조, 조성, 아미노산 서열에 따라 항산화, 항균, 항고혈압 효과 등 다양한 효과를 보여준다. 최근 많은 천연 성분의 ACE 저해 펩티드들이 합성 ACE 저해제의 대안으로 대두되고 있는데, 이들 ACE 저해 펩티드들은 참치 등뼈, 양젖 요거트, 달걀 흰자위, 카놀라박, 야크 밀크 카제인, 굴 등 천연식품의 단백질로부터 주로 분리되고 있다.

한편, 미세조류(microalgae)는 단백질, 탄수화물, 미네랄, 다양한 기능성 색소 등을 풍부하게 함유하고 있고, 미세조류 중에서도 특히 클로렐라(Chlorellar spp.)는 단세포 녹조류의 하나로, 영양소와 생리활성 물질을 풍부히 함유하고 있다고 보고되고 있다. 클로렐라는 항산화, 항당뇨, 항염, 면역조절과 같은 다양한 기능을 보유하고 있는 것으로 이미 알려져 있으나, 클로렐라 중에서 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)의 생리활성 효과는 아직 거의 알려진 바 없고, 특히 ACE 저해제로서의 효과는 전혀 보고되어 있지 않다. 특히, 클로렐라 엘립소이데아의 단백질 조성이 45%를 상회함에도 불구하고, 클로렐라 엘립소이데아는 주로 조류 에센스의 생산 후에는 거의 동물의 먹이로만 활용되거나 폐기되고 있을 뿐이다. 따라서, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아를 적절히 가공하여 잠재적 생약 물질로써 개발하고자 본 연구를 시작하였다.

Suetsuna K, Chen JR. Identification of antihypertensive peptides from peptic digest of two microalgae, Chlorella vulgaris and Spirulina platensis. Mar Biotechnol 2001;3:305-309.

따라서 본 발명의 목적은 항고혈압 기능성 펩티드를 제공하되, 천연물인 클로렐라 엘립소이데아에서 유래되는 항고혈압 활성을 갖는 기능성 펩티드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항고혈압 활성을 갖는 펩티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 가수 분해한 분해물로부터 분리 및 정제한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수 분해물은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)을 프로타멕스(Protamex), 코지자임(Kojizyme), 뉴트라제(Neutrase), 플라보우라자임(Flavourzyme), 알칼라제(Alcalase), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(a-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하여 효소 대 기질인 클로렐라 엘립소이데아를 1:100(w:w)의 양으로 반응시켜 수득한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 안지오텐신 I 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제 활성을 통해 고혈압을 예방 또는 치료하는 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩티드는 10 내지 200 uM의 농도로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 기능성 펩티드는 ACE 저해 활성이 뛰어난 특징이 있어, 고혈압을 예방, 치료 및 개선하기 위한 목적으로 제공되는 의약품의 제조에 사용할 수 있으며, 나아가 본 발명의 펩티드는 천연물인 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)에서 유래한 것으로 항고혈압용 건강기능식품의 제조로도 사용할 수 있어 궁극적으로 의약산업 및 식품산업에 응용되어 고부가가치 산업으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1A는 클로렐라 엘립소이데아 가수분해물 중 5 kDa 이하의 분획물을 세파덱스 G-25 컬럼으로 분리한 결과를 보여준다.
도 1B는 도 1A의 분획물의 ACE 저해 활성(IC₅₀)을 보여주는 결과이다.
도 2A는 세파덱스 G-25 컬럼으로 분리한 F4 분획물을 J sphere ODS-H80 컬럼으로 다시 분리한 결과를 보여준다.
도 2B는 도 2A의 분획물의 ACE 저해 활성(IC₅₀)을 보여주는 결과이다.
도 3은 클로렐라 엘립소이데아를 알칼라아제로 가수분해한 후 정제한 펩티드를 RP-HPLC를 이용하여 분자량 및 아미노산 서열을 분석한 결과이다.
도 4는 라인웨버-버크도를 이용하여 정제된 펩티드의 ACE 저해 경향을 분석한 결과이다.
도 5는 본태성 고혈압 쥐에서 정제된 펩티드를 경구 투여시 최대혈압의 변화를 보여주는 그래프이다.

본 발명은 항고혈압 활성을 갖는 신규 펩티드를 제공하는 것으로서, 구체적으로 천연물인 클로렐라 엘립소이데아에서 유래되는 항고혈압 활성을 갖는 신규 펩티드를 제공함에 그 특징이 있다.

특히 본 발명에서 제공하는 항고혈압 활성을 갖는 펩티드는 안지오텐신 전환효소(ACE)를 저해하는 활성이 우수한 특징이 있는데, 안지오텐신 전환효소는 주로 폐모세혈관에 존재하고, 혈류에 있는 불활성상태의 안지오텐신 Ⅰ의 말단아미노산 2개를 분해함으로써 혈관 수축을 유도하고, 알도스테론(aldosterone) 분비를 항진시키고 체액을 증가시켜 혈압을 상승시킬 수 있는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시켜, 최종적으로 혈압을 상승시키는 작용을 하는 효소이다.

따라서 현재 사용되고 있는 고혈압 치료제의 경우 이러한 안지오텐신 전환효소의 활성을 저해할 수 있는 활성을 갖는 물질로서 궁극적으로 혈관 확장 효과를 유도하여 고혈압을 예방 및 치료하는 기작을 갖는다.

그러나 종래 고혈압 치료제로서 ACE 저해제는 합성 화합물에 의한 것이 대부분으로서 이러한 합성 화합물은 체내 부작용을 초래하는 문제가 종종 발생하고 있어 천연물 유래의 고혈압 치료제의 개발이 필요한 실정이었다.

이에 본 발명자들은 ACE 저해하는 활성이 우수한 펩티드를 천연물로부터 발굴하기 위해, 클로렐라 엘립소이데아를 다양한 단백질 분해 효소를 이용하여 가수분해하였다. 클로렐라 엘립소이데아를 가수분해할 수 있는 효소는 하기 표 1에 기재된 효소들이라면 모두 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 각 분해 효소에 대한 IC₅₀값을 분석하였는데, 하기 표 1을 참고하면 알칼라아제(Alcalase)는 본 발명자들이 실험한 분해 효소 중 가장 효과적인 분해 효소임을 알 수 있다.

참고로, 알칼라아제(Alcalase)는 식품 단백질을 가수분해하여 생리활성(bioactivity)을 나타내는 펩티드를 생산하는데 활용되는 대표적인 분해효소이다. 알칼라아제는 생리활성을 나타내는데 중요하다고 알려진 말단 아미노산 뿐만 아니라 크기가 작은 펩티드를 생산하는데에도 효과적이라고 알려져 있다.

또한, 가수분해된 단백질의 분자량은 기능성 물질로 작용할 수 있는 단백질 가수분해물을 생산하는데 중요한 요인 중 하나로 평가받고, 가수분해물을 다양한 분자량으로 구분하여 분리할 수 있는 방법 중 하나가 컷 오프(cut-offs)를 이용하여 UF(ultra-filtration) 멤브레인을 사용하는 것인 바, 본 발명자들은 알칼라아제 단백질 가수분해물을 UF 멤브레인을 이용하여 CEPH-Ⅰ(분자량 5kDa 이하), CEPH-Ⅱ(분자량 5~10kdDa), CEPH-Ⅲ(분자량 10kDa 이상) 3개의 개별 분획으로 분리하였고, 각 분획의 ACE 저해 활성을 조사하였다. 표 2에서 볼 수 있는 것처럼, 이 중 CEPH-I(즉, 분자량이 5kDa 미만인 분획)에서 가장 높은 ACE 저해 활성을 나타내었고, IC₅₀는 0.887mg/mL로 나타났다.

상기 결과를 보면 큰 분자량을 가진 분획에 비하여, 작은 분자량을 가진 분획에서 더 높은 ACE 저해 활성이 나타났는데, 따라서 본 발명자들은 ACE 저해 펩티드를 정제하기 위해 CEPH-I을 다시 분획하였다.

CEPH-I을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 세파덱스 G-25 (Sephadex G-25) 컬럼에서 분획하였다. 그 결과, 280nm에서 5개의 주요 흡광도 정점이 나타났는데(도 1A), 본 발명자들은 이들 5개의 정점에 해당하는 집단의 ACE 저해 활성을 각각 확인하였다(도 1B). 그 결과, 본 발명자들은 이들 분획 중 F4가 가장 강력한 ACE 저해 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이 경우 IC₅₀는 약 0.301mg/ml였다.

한편, 동결건조시킨 F4 분획을 0.1% TFA를 포함하는 아세톤니트릴(acetonitrile, 0-50%, 50분) 선형 구배를 이용하여 J sphere ODS H-80(C₁₈, 4um, 4.6×250mm, YMC, Kyoko, Japan) 컬럼을 이용하여 RP-HPLC로 다시 분리한 결과, 도2A와 같은 3개의 정점을 확인할 수 있었다. 즉, F4는 다시 3개의 분획으로 분리되었는데(F4-I~F4-Ⅲ), 각 분획 집단을 다시 동결건조시킨 후 ACE 저해 활성을 조사해 본 결과, F4-I 분획 집단이 가장 강력한 ACE 저해 활성을 나타내었다(도 2B).

상기와 같은 분리과정을 통하여, 본 발명자들은 마침내 클로렐라 에립소이데아로부터 정제된 펩티드를 얻을 수 있었고, 이들 아미노산 서열을 Q-TOF ESI 질량 분광기로 분석하였다. 본 발명자들이 MS/MS를 이용하여 클로렐라 에립소이데아로부터 정제된 펩티드의 염기서열을 분석한 결과, Val-Glu-Gly-Tyr으로 확인되었고, 그 분자량은 약 467.2 Da으로 확인되었다(도 3).

이미 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 가수분해물로부터 유래된 펩티드로써 Ile-Val-Val-Glu(IC₅₀=315.3uM) 등이 보고된 바 있는데, 본 발명자들이 클로렐라 에립소이데아(Chlorella ellipsoidea)로부터 분리한 펩티드는 이미 보고된 펩티드보다 더 높은 ACE 저해 활성(IC₅₀=128.4uM)을 나타냄을 확인할 수 있었다.

또한, 생리활성 펩티드는 통상적으로 3~20개의 아미노산 잔기로 구성되는데, 작은 분자량을 갖는 펩티드들이 큰 분자량을 갖는 펩티드들에 비하여 더 강력한 생리활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 다양한 ACE 저해 능력이 있는 펩티드 저해제들 간의 구조-활성 관계도를 살펴보면, 이들이 ACE에 결합하는 능력은 기질의 C-말단의 3개의 펩티드 서열에 의하여 강하게 영향 받고, 이 결과는 이들 위치에 소수성 아미노산을 포함하는 펩티드들이 강한 ACE 저해제로 작용할 수 있음을 시사한다. 한편, C-말단의 Trp, Tyr, Pro, Phe과 N-말단의 측쇄 지방족 아미노산은 ACE에 결합하는 펩티드로서 적합성을 부여하고, 그 결과 이들은 ACE의 경쟁적 저해제로 작용할 수 있다고 알려져 있다. 이들 연구와 함께, 활성 펩티드의 N-말단 부위의 소수성 아미노산은 ACE 활성 부위에 결합하는데 중요한 역할을 할 것이라고 예측되어 왔고, Val과 Leu 잔기는 ACE 저해 펩티드에서 가장 빈번하게 관찰되는 아미노산로 확인되었다. 또한, 최근 보고된 바에 따르면 컴퓨터 분석을 통한 ACE 저해 펩티드는, N-말단에 소수성 아미노산을 가지고 있고, 중앙부에 양전하를 띠는 아미노산을 가지고 있으며, C-말단에 방향족 아미노산을 가지는 있는 경우 높은 상당히 효과적인 ACE 저해 효과를 나타낸다고 한다.

본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아에서 정제된 펩티드가 ACE의 경쟁적 저해제인지 확인하기 위하여 라인위버 버어크도로 분석해 보았다(도 4). 캅토프릴(Captopril)은 활성 ACE 부위에 결합함으로써 기질과 경쟁적으로 작용하는 대표적인 경쟁적 저해제로 알려져 있는데, 본 발명자들은 클로렐라 엘립소이데아에서 정제된 펩티드도 또한 ACE의 경쟁적 저해제로 작용함을 확인할 수 있었다.

본 발명자들은 정제된 펩티드의 ACE 저해 활성을 좀 더 명확히 하기 위하여, 본태성 고혈압 쥐(SHRs)을 이용하여 동물실험을 실시하였다(도 5). 즉, 본 발명자들은 본 발명인 정제된 펩티드의 항고혈압 효과를 확인하기 위하여 정제 펩티드를 10mg/kg으로 경구 투여한 후 2, 4, 6, 8 시간 경과 후 각각 최대혈압(SBP)을 측정해 보았다. 캡토프릴(Captopril)은 양성 대조군으로 사용되었고, 살린(Saline)은 음성 대조군으로 사용되었다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 본태성 고혈압 쥐의 휴지 상태 최대혈압은 189.5±1.4mmHg이었으나, 정제된 펩티드 및 캡토프릴(Captopril)의 투여 후 최대혈압이 현저히 감소하였고, 이 효과는 약 6시간 동안 지속됨을 확인할 수 있었다. 최대혈압의 최고 감소 정도는 펩티드 처리 그룹과 캡토프릴 처리 그룹에서 모두 4시간 경과 후 나타났으며, 이 경우 각각 22.8mmHg와 35.4mmHg의 최대혈압 감소효과가 있었다.

작은 크기의 펩티드들은 장 내에서 쉽게 흡수될 수 있다. 본 발명인 정제된 펩티드도 상대적으로 낮은 분자량을 가지고 있어, 본태성 고혈압 쥐에서 상기와 같은 효과적인 최대혈압 감소 효과를 나타내는 듯하다. 즉, 상기 펩티드는 소화 과정 없이 효율적으로 체내에 흡수되기 때문에, 본태성 고혈압 쥐에서 이와 같은 효율적인 항고혈압 효과를 발휘한다고 판단된다.

따라서 상기와 같은 특징을 갖는 본 발명의 펩티드는 항고혈압 기능성 펩티드 물질로서 약리학적 조성물과 같은 의약품은 물론, 건강기능 식품에 유용하게 사용될 수 있다.

즉, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 기능성 펩티드는 조성물에 10 내지 200μM 농도로 포함될 수 있으며, 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 95 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 바이오기능성 펩티드를 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압 관련 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 고혈압 관련 질환의 예방 및 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 백운풀 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명은 고혈압 관련 질환의 예방 및 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 고혈압 관련 질환의 예방 및 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 고혈압 관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약제학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~100㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 기능성 펩티드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 복강내, 국소, 피내, 흡입 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 바람직한 실시 방법을 제시한다.

<실시예>

재료 준비

해양 클로렐라 엘립소이데아는 Marine Bio Process Co., Korea로부터 입수하여, 동결건조기를 이용하여 -70℃에서 동결건조하였다. 동결건조된 클로렐라 에립소이데아 분말은 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 프로타멕스(Protamex), 코지자임(Kojizyme) 500MG, 뉴트라제(Neutrase) 0.8L, 플래이버자임(Flavourzyme) 500MG, 알칼라아제(Alcalase) 2.4L FG는 Novo Co.(Novozyme Nordisk, Bagsvaerd)에서 구입하였고, 트립신(trypsin), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 펩신(pepsin), 파파인(papain), N-히퓨릴-히스티딘-류신 테트라하이드레이트(N-Hippuryl-His-Le tetrahydrate(HHL)), 안지오텐신 I 전환 효소(토끼로부터 유래된 폐 아세톤 분말)와 세파덱스 G-25(Sephadex G-25)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo, USA)로부터 구입하였다. 다른 화학물질과 시약들은 분석용 등급을 사용하였다.

<실시예 1>

클로렐라 엘립소이데아로부터 단백질 가수분해물(CEPH)의 제조

클로렐라 엘립소이데아로부터 신규의 ACE 저해제를 발굴하기 위해, 다양한 효소(Protamex, Kojizyme, Neutrase, Flavourzyme, Alcalase, trypsin, α-chymotrypsin, pepsin, papain)를 이용하여 각 효소의 최적의 조건에 따라 클로렐라 엘립소이데아를 효소 가수분해하였다. 이때 효소/기질 비율을 1/100(w/w)로 하고, 기질과 효소를 버퍼와 함께 100 ml 플라스크에서 혼합하여 최적온도와 최적 pH 조건(표.1)이 유지되는 장치 내에서 반응하였다. 효소 반응이 종결되는 즉시, 효소를 불활성화 시키기 위하여 100℃에서 10분간 가열하였다. 가수분해물은 원심분리기(3500rpm, 4℃, 20분)을 이용하여 잔여물을 제거하였다. 잔류 CEPH를 UF 멤브레인을 이용하여 분자량 5kDa과 10kDa 컷 오프(Cut-offs)를 이용하여 분리하였다.

그 결과, 5 kDa 이내의 분자량을 갖는 CEPH-Ⅰ분획, 5~10 kDa의 분자량 분포를 갖는 CEPH-Ⅱ 분획, 10 kDa 이상의 분자량 분포를 보이는 CEPH-Ⅲ로 분획화하였고, CEPH 분획(fraction)은 동결건조하여 사용 시까지 -70℃이하에서 보관하였다.

하기 표 3은 각 효소의 최적 반응 조건을 나타낸 것이다.

효소	최적온도	최적 pH
Kojizyme	40	6.0
Flavourzyme	50	7.0
Neutrase	50	6.0
Alcalase	50	8.0
Protamex	40	6.0
Pepsin	37	2.0
Trypsin	37	8.0
a-Chymotrypsin	37	8.0
Papain	37	6.0

< 실시예 2>

ACE 저해 펩티드의 정제

상기 실시예 1에서 수득한 가수분해물 중 ACE 저해 활성을 측정하여 가장 활성이 강한 분획을 여과시킨 후, 증류수로 평형화(equilibrated)된 세파덱스 G-25(Sephadex G-25) 레진으로 포화된 컬럼(2.5×75cm)에 로딩하여 활성 펩티드를 분리하였다(도 1 참조). 이때 용매의 유동속도는 2ml/min으로 하고, 용리점은 280nm에서 관찰하였다. 각 분획은 분획 수집기에 5분 간격으로 각 분획단 10ml씩 수집하였고, ACE 저해 활성을 보이는 분획들은 동결건조하였다. 가장 높은 ACE 저해 활성을 보이는 분획을 증류수에서 용해하고, J sphere ODS-H80 컬럼(C18, 4um, 4.6×250mm, YMC, Kyoto, Japan) 상에 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리하였다. RP-HPLC 분석을 위해, 기울기 용리에 사용된 이동상은 증류수에 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 포함된(v/v) 용리제 A와 아세토니트릴(acetonitrile)에 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 포함된(v/v) 용리제 B로 구성하였다. 분리는 유동속도 1.0 ml/min에서 0 ~ 50% 농도 구배 용리제 B를 이용하여 행하였다. 용리제의 UV 흡광도는 280nm에서 관찰하였다(도 2 참조). 마지막으로 ACE 저해 활성을 갖는 분획을 수집하여 동결건조하고, 이를 아미노산 서열 분석하였다(도 3 참조).

또한, 상기 실험과정에서 ACE 저해 활성 분석은 다소 변형된 Cushman & Cheung의 방법에 의해 수행하였는데, 각 분석을 위하여 50 ul의 가수분해물 용액을 50ul의 ACE 용액(25mU/ml)과 37℃에서 30분간 전배양하고, 100ul의 기질[500mM NaCl(pH 8.3)을 포함하는 50mM 소듐 보레이트(Sodium Borate) 버퍼상의 25mM Hippuryl-His-Leu] 과 함께 37℃에서 60분간 배양하였다. 반응은 1N 염산 250ul를 첨가하여 종결시켰다. 마뇨산(Hippuric acid)은 500ul 에틸 아세테이트로 추출하였다. 그 후 추출물 200ul를 80℃ 드라이오븐에서 증발 탈수법을 행하였다. 그 잔류물을 1ml의 증류수에 용해하고 UV 스펙트럼 밀도를 228nm에서 측정하였다. IC₅₀는 ACE 저해 활성의 50%가 억제되는 저해제의 농도를 의미한다.

< 실시예 3>

항고혈압 활성을 갖는 펩티드의 분자량 및 아미노산 서열 결정

클로렐라 일립소이데아로 정제된 펩티드의 분자량과 아미노산 서열은 전자 분무 이온화법(ESI)과 결합된 Q-TOF 질량 분석기(Micromass, Altrincham, UK)를 이용하여 분석하였다. 정제된 펩티드는 메탄올/물(1:1, v/v)에 용해하였고, ESI source로 주입한 후, 분자량은 질량분석기를 이용하여 (M-2H)²⁺ 분석에 의해 결정하였다. 분자량 결정 후 펩티드는 tandem MS 분석을 통하여 서열번호를 결정하였다.

그 결과, 본 발명에서 분리 및 정제한 항고혈압 활성을 갖는 펩티드는 4개의 아미노산으로 구성된 Val-Glu-Gly-Tyr 펩티드라는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

ACE 저해 활성 분석

상기 실시예 3에서 분리 및 동정한 본 발명의 항고혈압 활성을 갖는 펩티드가 고혈압을 유발시키는 ACE를 저해하는 활성이 있는지 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 이를 위해 0.1mg/ml, 0.05mg/ml 및 0.025mg/ml의 각 펩티드를 대상으로 효소 활성을 측정하였는데, 효소 활성은 기질(HHL)의 농도로 측정되었다. 저해제 존재하에서 ACE 저해 경향은 라인웨버-버어크 도면(Lineweaver-Burk plot)에 의해 결정하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 동정한 펩티드는 농도 의존적으로 항고혈압 활성, 즉, ACE를 저해하는 활성을 갖는 것으로 나타났으며, 참고로 도 4에서 1/V[uM/min]과 1/S[mM]는 각각 반응속도 및 기질의 역수를 의미한다.

< 실시예 5>

동물실험을 통한 본 발명의 고혈압 치료 효과 측정

180mmHg 이상의 꼬리 본태성 고혈압을 갖는 본태성 고혈압 쥐(SHRs, 10주 수컷, 무특이병원체, 250~300g)는 SLC. Inc.(Shizuoka, Japan)에서 구입하였다. 본태성 고혈압 쥐은 표준 실험실 식이요법, 12h 주야주기, 24±1℃ 온도로 강철 케이지에서 개별적으로 사육하였다. 식수는 자율적으로 이용할 수 있도록 하였다. 또한 본 발명의 펩티드를 살린(Saline)에 용해하여 10mg/kg의 양으로 경구 투여하였다. 최대혈압(SBP)은 본태성 고혈압 쥐(SHRs)를 온열 장비에서 37℃, 15분간 따뜻하게 한 후, tail-cuff 법을 이용하여 CODA^TM 혈압 모니터(Kent Scientific Corp., Torrington, USA)에서 측정하였다(*p<0.01). 또한, 이때 양성 대조군으로는 안지오텐진 변환 효소 저해제인 캡토프릴(captopril)를 투여한 군과 비교하였으며, 음성대조군으로는 본 발명의 펩티드 대신 살린 버퍼를 투여한 군을 사용하였다. 또한, 통계분석은 본 발명의 모든 데이터에 대해 3회 측정 후 평균±표준편차로 표현하였다. 대조군과 투여군과의 최대혈압(SBPs) 차이는 t-테스트를 통하여 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 분리 및 정제한 펩티드는 양성대조군으로 사용한 캡토프릴보다는 약하지만 우수한 항고혈압 효과, 즉 혈압 이완 효과를 보이는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Cheju National University Industry-Academic Cooperation Foundation KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Antihypersensitive peptide from Chlorella ellipsoidea <130> PN1207-410 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Amino acid sequence from Chlorella ellipsoidea <400> 1 Val Glu Gly Tyr 1

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 항고혈압 활성을 갖는 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)에서 유래하는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성을 갖는 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 펩티드는 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 가수 분해한 분해물로부터 분리 및 정제한 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성을 갖는 펩티드.
제3항에 있어서,
상기 가수 분해물은 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)를 프로타멕스(Protamex), 코지자임(Kojizyme), 뉴트라제(Neutrase), 플라보우라자임(Flavourzyme), 알칼라제(Alcalase), 트립신(trypsin), 알파-키모트립신(a-chymotrypsin), 펩신(pepsin) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 효소를 사용하여 효소 대 기질인 클로렐라 엘립소이데아를 1:100(w:w)의 양으로 반응시켜 수득한 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성을 갖는 펩티드.
제1항에 있어서,
상기 펩티드는 안지오텐신 I 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제 활성을 통해 고혈압을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 항고혈압 활성을 갖는 펩티드.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 펩티드는 10 내지 200 uM의 농도로 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 고혈압의 예방 및 치료용 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는 고혈압의 예방 또는 개선용 건강기능식품.