WO2018235981A1 - 넙치 유래의 항고혈압 펩타이드 및 이를 포함하는 항고혈압용 조성물 - Google Patents

넙치 유래의 항고혈압 펩타이드 및 이를 포함하는 항고혈압용 조성물 Download PDF

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WO2018235981A1
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seq
peptide
hypertension
amino acid
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PCT/KR2017/007369
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전유진
고주영
이지혁
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제주대학교 산학협력단
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/80—Antihypertensive peptides

Definitions

  • the present invention relates to a flounder ( Paralichthys).
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or food composition for the treatment or prevention of hypertension, which comprises a peptide isolated from fractions of hydrolysates of muscles of olivaceus .
  • the world's hypertensive population has exploded, reaching 1 billion people, and is expected to surpass 1.5 billion by 2025.
  • the proportion of hypertensive patients in the total population is 30% in the United States, 38% in the UK-Sweden-Italy, 45% in Spain and 55% in Germany, while the developed countries are quite high, but developing countries, especially those countries where the economy is changing rapidly in Western style
  • the number of people with hypertension has increased explosively, reaching one in three in India and one out of four in Ghana - South Africa.
  • Angiotensin II (Angiotensin I), which is present in vivo, is an angiotensin II (angiotensin II) which has a vasoconstrictor activity by the disruption of C-terminal His-Leu by an angiotensin converting enzyme (ACE)
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • marine organisms have a unique metabolic process and a unique environment that are not found in terrestrial organisms, and thus have a variety of novel physiologically active substances.
  • marine life has not been sufficiently studied and it is also a field of high expectation for the development of new useful natural materials.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving or preventing hypertension comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating hypertension, which comprises administering to a subject a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Yet another object of the present invention is to provide a use of a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of hypertension.
  • the flounder ( Paralichthys Since fractions of each molecular weight of the hydrolyzate of olivaceus muscle and peptides isolated from the fractions have inhibitory activity against angiotensin I converting enzyme (ACE), the fractions of the hydrolysates of the flounder ( Paralichthys olivaceus )
  • the isolated peptides can be used in pharmaceutical compositions or food compositions for treating or preventing hypertension.
  • Figure 1 shows the results of separating three fractions from the flounder muscle hydrolyzate using FPLC.
  • Figure 2 shows the peptide and molecular weight of the Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA) sequence isolated from the fraction of the flounder muscle hydrolysates.
  • VFSGWAA Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala
  • Figure 3 shows peptides and molecular weights of the Leu-His-Phe (LHF) sequence isolated from the fraction of the flounder muscle hydrolysates.
  • Figure 4 shows peptides and molecular weights of Trp-Pro-Trp (WPW) sequences isolated from fractions of flounder muscle hydrolysates.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of evaluating the ACE inhibitory effect of the peptides isolated from the fraction of the flounder muscle hydrolyzate.
  • Figure 6 shows the molecular docking analysis of the peptides isolated from the fractions of the flounder muscle hydrolysates.
  • the present inventors have produced hydrolysates of the muscles of the flounder ( Paralichthys olivaceus ) using the hydrolytic enzymes alcalase, flavourzyme, kojizyme, and protamex , It was confirmed that fractions of the respective hydrolysates with respective molecular weights and peptides having a specific amino acid sequence separated from the fractions had an inhibitory activity against angiotensin I converting enzyme (ACE).
  • ACE angiotensin I converting enzyme
  • the flounder ( Paralichthys olivaceus muscles of the present invention can be used in a pharmaceutical composition or food composition for the treatment or prevention of hypertension using the peptides isolated from the fractions of the hydrolyzate of muscle.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hypertension, comprising a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for treating or preventing hypertension is Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala (VFSGWAA) -Ala (VFSGWAA) as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • composition of the present invention may contain one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 3 as an active ingredient.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is Leu-His-Phe (LHF) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is Trp-Pro-Trp (WPW).
  • the peptides were isolated from flounder ( Paralichthys olivaceus muscles, and the hydrolyzate may be an alcalase hydrolyzate, a flavorzyme hydrolyzate, a kojizyme hydrolyzate and a protamex hydrolyzate of flounder, Hydrolysates thereof, and hydrolysates thereof.
  • the alcalase hydrolyzate, flavorzyme hydrolyzate, kojizyme hydrolyzate and protamex hydrolyzate of the flounder were prepared, and protamex was used
  • the yield of hydrolyzate was the highest at 86.68 ⁇ 1.10%, the protein content was over 70%, and the IC 50 value of ACE (Angiotensin I converting enzyme) inhibition was 68.53 ⁇ g / ml. Lt; / RTI >
  • the ACE Angiotensin I converting enzyme
  • angiotensin II which is a decapeptide
  • angiotensin II having a vasoconstrictive action by cleaving a dipeptide (His-Leu).
  • An increase in angiotensin II promotes hypertension by promoting strong hypertension and secretion of the antidiuretic hormone aldosterone, inhibiting the excretion of water and sodium, and increasing circulating blood volume.
  • ACE also degrades and inactivates vascular relaxant bradykinin, which in turn results in elevated blood pressure.
  • the scientific name of the flounder is Paralichthys olivaceus , about 60 cm in length, and a long elliptical shape that is wide up and down.
  • the mouth is large, the teeth are well developed, and the eyes are on the left side of the body.
  • black and white spots are scattered on a dark yellowish brown background, but the side without snow is white.
  • the protamex hydrolysates which were the most effective, were evaluated in terms of yield, protein content and ACE (Angiotensin I converting enzyme) inhibitory effect in flounder muscle hydrolysates> 10 kDa (over 10 kDa) (5 kDa), and an IC 50 value of inhibiting ACE (Angiotensin I converting enzyme) in the fractions of ⁇ 5 kDa ( ⁇ 5 kDa) was 35.18 ⁇ g / ml, and the fraction with the antihypertensive activity ⁇ 5 kDa ( ⁇ 5 kDa) was the best.
  • ACE Angiotensin I converting enzyme
  • FPTA Fluorescence Activated Protein Liquid Chromatography, AKTA START, GE Healthcare
  • the peptides are selected from the group consisting of flounder ( Paralichthys olivaceus ) muscle hydrolysates of less than 5 kDa.
  • hypertension of the present invention
  • the World Health Organization defines hypertension as a hypertension when the hypertension exceeds 160 mmHg and the hypertension exceeds 95 mmHg. It is classified as essential hypertension due to unclear underlying cause and secondary hypertension due to causative disease, of which more than 90% is known to belong to essential hypertension.
  • the flounder Paralichthys 1 to 3 isolated from fractions of the hydrolysates of olivaceus muscles were found to have an angiotensin I converting enzyme (ACE) -inhibiting activity, and using these peptides, , A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of hypertension.
  • ACE angiotensin I converting enzyme
  • prevention may refer to any action that inhibits or delays the onset of hypertension by administering the composition of the present invention to a subject.
  • treatment as used in the present invention means all the actions of causing the hypertensive symptom to be improved or benefited by administering the composition of the present invention to a suspected hypertensive subject.
  • compositions comprising the peptides of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients or diluents conventionally used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the peptide included in the composition is not particularly limited, but may include 0.001% by weight to 99% by weight, preferably 0.01% by weight to 50% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition may be any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, nonaqueous solutions, suspensions, emulsions, And may be oral or parenteral, various formulations.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin And the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like.
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent.
  • Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount as used herein means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will vary depending on the species and severity, age, sex, The type of drug, the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of release, the duration of the treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an object for treating hypertension, and any of them can be applied.
  • non-human animals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, guinea pigs, rats, mice, cattle, sheep, pigs and goats can be used, , Intraperitoneally, intrapulmonary, and intranasal, and may be administered by a suitable method, including localized administration, if necessary, for localized treatment.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the individual, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intra-uterine dural or intracerebral injection.
  • Suitable total daily doses may be determined by the treatment within the scope of sound medical judgment and are generally in the range of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg can be administered once or several times a day.
  • the present invention provides a food composition for improving or preventing hypertension comprising, as an active ingredient, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • composition of the present invention may contain one or more peptides selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 3 as an active ingredient.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA), and the food composition for improving or preventing hypertension is Val-Phe-Ser-Gly-Trp- -Ala (VFSGWAA) as an active ingredient.
  • the food composition may further comprise a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is Leu-His-Phe (LHF) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is Trp-Pro-Trp (WPW).
  • the term " improvement" means that a suspected disease such as hypertension, which is prevented or treated by using a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 3, It says.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 3 of the present invention may be added to the food composition for the purpose of preventing or improving hypertension.
  • the food composition of the present invention may be in the form of pills, powders, granules, infusions, tablets, capsules or liquid preparations.
  • the type of food to which the peptides of the present invention can be added is not particularly limited, Various drinks, gum, tea, vitamin complex, and health supplement foods.
  • other components may be added to the food composition, and the kind thereof is not particularly limited.
  • it may contain various herbal medicine extracts, food-acceptable food-aid additives or natural carbohydrates such as ordinary food, but is not limited thereto.
  • food supplementary additive in the present invention means a component which can be added to foods in a supplementary manner, and is appropriately selected and used by those skilled in the art as added to produce health functional foods of each formulation.
  • food-aid additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, , a pH adjusting agent, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, and a carbonating agent used in a carbonated beverage.
  • flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, , a pH adjusting agent, a stabilizer, a preservative, a glycerin, an alcohol, and a carbonating agent used in a carbonated beverage.
  • Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavorings such as tau mart
  • stevia extracts rebaudioside A, Etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • the food composition may be a health functional food.
  • the term " health functional food " used in the present invention refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and circles by using raw materials and components having useful functions in the human body.
  • the term “functionality” means that the structure and function of the human body are controlled to obtain nutritional effects or effects useful for health use such as physiological actions.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art and can be prepared by adding raw materials and ingredients that are conventionally added in the art. Also, unlike general medicine, there is an advantage that there is no side effect that can occur when a medicine is used for a long time by using food as a raw material, and it is excellent in portability.
  • the amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to the intended use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the peptide of the present invention may be added in an amount of 1 to 50% by weight, preferably 5 to 10% by weight, in the raw material composition, but is not limited thereto.
  • the amount can also be used in the above-mentioned range.
  • the kind of the food There is no particular limitation on the kind of the food.
  • examples of the food to which the above substances can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, Alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health functional foods in a conventional sense.
  • the present invention provides a method for preventing or treating hypertension comprising administering to a subject a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • individual in the present invention means all animals including humans suffering from hypertension.
  • the present invention provides a use of a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of hypertension.
  • the materials used in the present invention are the flounder purchased from the fish market of Jeju Island ( Paralichthys olivaceus) were used, and the bone of the flounder muscles was drained, washed, washed, washed and dried to homogeneity, and stored at -70 ° C.
  • the hydrolysates of the flounder muscles were prepared by using 4 kinds of protein hydrolytic enzymes (Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Protamex) at the substrate to enzyme ratio of 1000: 1 (weight ratio) for 18 hours Hydrolysis. After the reaction was completed, the mixture was boiled at 100 ° C for 10 minutes to inactivate the enzyme, and the pH was adjusted to 7.0. Centrifuged at 3,500 rpm for 20 minutes, filtered, lyophilized and stored at -70 ° C for use as a sample.
  • protein hydrolytic enzymes Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Protamex
  • Table 1 shows the yield, protein content and ACE inhibitory activity of the muscle hydrolysates derived from flounder. As shown in Table 1, the yield of the hydrolyzate using protamex was the highest at 86.68 ⁇ 1.10%, the protein content was at least 70%, and the IC 50 value showing the inhibitory effect of ACE (Angiotensin I converting enzyme) was 68.53 ⁇ g / ml , Which had ACE inhibitory activity at a relatively low concentration of hydrolysates.
  • ACE Angiotensin I converting enzyme
  • Example 2 ACE inhibitory activity of hydrolyzate-derived fraction of the flounder muscle by molecular weight
  • the protamex hydrolyzate which had the best effect, was evaluated by collectively evaluating the yield, protein content and ACE (Angiotensin I converting enzyme) inhibitory effect of the flounder muscle hydrolysates prepared in Example 1 to obtain a peptide having an ACE inhibitory effect Containing fractions.
  • the protamex hydrolysates were separated by> 10 kDa (over 10 kDa), 5-10 to kDa, and ⁇ 5 kDa ( ⁇ 5 kDa) by ultrafiltration membrane.
  • Table 2 shows the results of measuring the antihypertensive activity by evaluating the ACE inhibitory effect according to the fraction by molecular weight of the protamex flounder hydrolyzate.
  • the IC 50 value showing an inhibitory effect of ACE was ⁇ 35.18 ⁇ g / ml at ⁇ 5 kDa (less than 5 kDa) fraction and the anti-hypertensive activity was ⁇ 5 kDa (less than 5 kDa) And the most excellent ones were confirmed.
  • the molecular weight and amino acid sequence of the peptides were measured using a Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI) to confirm the amino acid sequence of the three fractions, and the results are shown in FIGS. 2 to 4, the amino acid sequence of the peptide is represented by Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA), Leu-His-Phe (LHF), and Trp-Pro-Trp And the molecular weights were 737.41 Da, 416.23 Da and 488.23 Da, respectively.
  • ESI electrospray ionization
  • ACE inhibition activity of the peptides of the VFSGWAA sequence showed the highest antihypertensive activity with the highest ACE inhibitory activity.
  • ACE Angiotensin I converting Enzyme
  • visible IC 50 values are 27.50 ⁇ g / ml effect, for LHF 36.63 ⁇ g / ml, with 40.42 ⁇ g / ml for WPW the peptide of VFSGWAA sequence ACE inhibitory potency was the highest.
  • Molecular docking analysis is a program that can predict the binding potential (enzyme active site binding site and ACE inhibitory peptide binding site) and binding energy value of a protein (enzyme) -ligand (ACE inhibiting peptide) complex.
  • ACE enzyme active site binding site and ACE inhibitory peptide binding site
  • ACE inhibiting peptide binding energy value of a protein (enzyme) -ligand (ACE inhibiting peptide) complex.
  • ACE PDB: 1086 of the protein in the Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org)
  • DS Flexible Docking program of Accelrys Discovery Studio
  • FIG. 6 shows the results of molecular docking analysis of peptides derived from the flounder muscle hydrolysates.
  • the VFSGWAA peptide was found to be hydrogen bonded to the ACE amino acids Glu 384, Arg 522, and His 353, the LHF peptide to Tyr 520, Gln 281 to hydrogen bond, and the WPW peptide to hydrogen bond to Ala 354 and Asp 377.
  • Their binding energies were -216 kcal / mol, -186 kcal / mol and -138 kcal / mol, respectively.
  • the CDOCK interaction energies were -90.70 kcal / mol, -54.62 kcal / mol and -62.67 kcal / Was more effective at inhibiting the ACE enzyme than the other two peptides.

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Abstract

본 발명은 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리된 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 펩티드가 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지므로, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.

Description

넙치 유래의 항고혈압 펩타이드 및 이를 포함하는 항고혈압용 조성물
본 발명은 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드를 포함하는 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
세계의 고혈압 인구가 폭발적으로 증가해 현재 10억명에 이르고 있으며, 2025년에는 15억명을 돌파할 것으로 보고되고 있다. 전체인구에서 고혈압 환자가 차지하는 비율은 미국 30%, 영국-스웨덴-이탈리아 38%, 스페인 45%, 독일 55%로 선진국들이 상당히 높은 편이지만 개발도상국들, 특히 경제가 서구 스타일로 급속히 바뀌고 있는 나라들도 고혈압 환자가 폭발적으로 늘어나 인도의 경우 3명 중 1명, 가나-남아프리카공화국 4명 중 1명에 이르고 있다.
고혈압의 원인은 거의 밝혀져 있지 않으나 혈압을 상승시키는 여러 가지 요인들 가운데 레닌-안지오텐신-알도스테론 (Renin-Angiorensin-Aldosterone) 고리는 생체 내에서 혈압과 체액량을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 생체 중에 존재하고 있는 불활성화 안지오텐신 I (Angiotensin I)은 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE)에 의하여 C-말단 His-Leu가 떨어져 나감으로써 혈관벽 수축 작용을 가지는 안지오텐신 II (Angiotensin II)로 전환되어 혈관을 수축하고, 신장에서 알도스테론의 분비를 증가시켜 체액량을 증가시킴으로써 혈압을 상승시키는 작용을 한다. 따라서 ACE의 활성을 억제시킴으로써 혈압상승의 원인이 되는 안지오텐신 II 생성 저하를 통해 혈압을 억제할 수 있다.
종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제들이 부작용 등의 문제가 발생됨에 따라, 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다. 또한, 각국에서는 의약품은 물론이고, 효소와 건강보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 자연 상태의 생물, 특히 대량 배양 및 번식이 용이한 생물에 대한 연구도 활발하게 진행하고 있다.
한편, 해양생물은 육상생물에 없는 특유의 대사과정과 독특한 환경으로 인하여 다양한 신규 생리활성물질의 탐색 기능성을 가지고 있다. 또한, 육상생물은 이미 많은 연구가 진행되었으나 해양생물은 아직 충분하게 연구되지 않아서 새로운 유용성을 가진 천연물질 개발에 대한 기대치가 높은 분야이기도 하다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 고혈압의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 고혈압의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 펩티드는 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지므로, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.
도 1은 FPLC를 이용하여, 넙치 근육 가수분해물에서 3종의 분획물(fraction)을 분리한 결과를 나타낸다.
도 2는 넙치 근육 가수분해물의 분획물에서 분리된 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA) 서열의 펩티드와 분자량을 나타낸다.
도 3은 넙치 근육 가수분해물의 분획물에서 분리된 Leu-His-Phe (LHF) 서열의 펩티드와 분자량을 나타낸다.
도 4는 넙치 근육 가수분해물의 분획물에서 분리된 Trp-Pro-Trp (WPW) 서열의 펩티드와 분자량을 나타낸다.
도 5는 넙치 근육 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들의 ACE 저해 효과를 평가한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 넙치 근육 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드의 Molecular docking 분석을 나타낸 것이다.
본 발명자는 가수분해 효소인 알칼레이즈(alcalase), 플라보자임(flavourzyme), 코지자임(kojizyme), 및 프로타멕스(protamex) 4종을 이용한 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물들을 제조하였으며, 상기 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 특정 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성이 있는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA)로, 상기 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물은 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA)로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 추가로 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 Leu-His-Phe (LHF)이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 Trp-Pro-Trp (WPW)일 수 있다.
상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물에서 분리될 수 있으며, 상기 가수분해물은 넙치의 알칼레이즈(alcalase) 가수분해물, 플라보자임(flavourzyme) 가수분해물, 코지자임(kojizyme) 가수분해물 및 프로타멕스(protamex) 가수분해물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 넙치의 알칼레이즈(alcalase) 가수분해물, 플라보자임(flavourzyme) 가수분해물, 코지자임(kojizyme) 가수분해물 및 프로타멕스(protamex) 가수분해물을 제조하였으며, protamex를 이용한 가수분해물의 수율이 86.68±1.10%으로 가장 높았으며, 단백질 함량도 70% 이상이었으며, ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC50 값도 68.53 ㎍/ml로 비교적 낮은 농도의 가수분해물에서 ACE 저해 활성을 가지는 것을 확인하였다.
상기 ACE(Angiotensin I converting enzyme)는 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신I으로부터 다이펩티드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로써 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신Ⅱ로 전환시키는 역할을 하는 효소이다. 안지오텐신Ⅱ의 증가는 강한 혈압 상승 작용과 항이뇨 호르몬인 알도스테론(aldosterone)의 분비를 촉진하고 물과 나트륨의 배설을 억제하여 순환 혈액량을 증가시킴으로써 고혈압을 일으키게 한다. 또한 ACE는 혈관 이완 작용을 하는 브레디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화시킴으로써 결과적으로 혈압 상승을 유발하는 역할을 한다.
본 발명에서 상기 넙치의 학명은 Paralichthys olivaceus이며, 몸길이는 60cm가량이며, 모양은 위아래로 넓적한 긴 타원형이다. 입이 크고 이빨이 잘 발달되어 있으며, 눈은 몸의 왼쪽에 있다. 눈이 있는 쪽은 진한 황갈색 바탕에 흑색 및 백색 반점이 흩어져 있으나, 눈이 없는 쪽은 백색이다. 수심 10-200m연안의 모래나 펄 지역에 서식하며, 2-6월에 산란한다. 우리나라 전 연안에 출현하며, 쿠릴 열도, 일본, 남중국해에 분포한다. 넙적한 체형 때문에 흔히 '광어'라고 부르며, 눈이 왼쪽에 있기 때문에 일반적으로 눈이 오른쪽에 있는 가자미류와 쉽게 구별된다.
본 발명의 일실시예에서는 넙치 근육 가수분해물들 중에서 수율, 단백질 함량 및 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효능을 종합적으로 평가하여 효과가 가장 좋았던 protamex 가수분해물을 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만) 분자량별로 분리하였으며, <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물(fraction)에서 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC50 값이 35.18 ㎍/ml로 가장 낮아서, 항고혈압 활성이 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물(fraction)에서 가장 우수한 것을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는 ACE 저해 효능이 가장 좋았던 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물로 FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, AKTA START, GE Healthcare)를 실시하여 총 3개의 fractions을 얻었으며, 상기 3개의 fractions에서 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 분리하였다.
따라서, 본 발명에서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리될 수 있다.
본 발명의 용어 "고혈압(hypertension)"과 관련하여, 세계건강보건기구 (WHO)에서는 최고 혈압이 160 mmHg 이상이고 최저 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 고혈압으로 규정하고 있으며, 고혈압 질환의 종류로는 크게 원인이 불분명한 본태성 고혈압과 원인 질병에 의한 속발성 고혈압으로 구분되는데 이 중 90% 이상이 본태성 고혈압에 속하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 서열번호 1 내지 3로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드들이 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지는 것을 확인하여, 상기 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물에 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 고혈압의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 고혈압 발병 의심 개체에 투여하여 고혈압에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 펩티드들을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 펩티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 고혈압 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물 을 제공한다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 추가로 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA)로, 상기 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물은 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA)로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함한다.
본 발명에서, 상기 식품 조성물은 추가로 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 Leu-His-Phe (LHF)이며, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 Trp-Pro-Trp (WPW)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 펩티드와 고혈압, 넙치, 예방에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서의 용어, "개선"은 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 이용하여 예방 또는 치료되는 고혈압과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
구체적으로, 본 발명의 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 고혈압의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 상기 펩티드들을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 상기 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있는 바, 본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 상기 펩티드는 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 고혈압의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드", "고혈압", "예방", "치료"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "개체"란 고혈압이 발생한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 투여에 의해 고혈압이 치료 또는 예방되는 개체는 제한없이 포함한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 고혈압의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에서, 용어 "서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드", "고혈압", "예방", "치료"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1. 넙치 근육의 가수분해물의 제조
본 발명에 사용된 재료는 제주도 수산시장에서 구입한 넙치(Paralichthys olivaceus)를 사용하였으며, 넙치 근육의 뼈를 발라내고 저미고(fillet) 수세 및 동결건조 후 균일하게 되도록 마쇄한 후 -70℃에 보관하면서 사용하였다.
넙치 근육의 가수분해물은 넙치 근육의 동결 건조물을 단백질 가수분해 효소 4종 (Alcalase, Flavourzyme, Kojizyme, Protamex)을 사용하여 각 효소의 최적조건으로 기질 대 효소비 1000:1(중량비)로 18 시간 동안 가수분해하였다. 반응이 끝난 후에는 효소를 불활성화시키기 위해 100℃에서 10분간 끓이고, pH를 7.0으로 맞춰주었다. 3,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 필터한 후에 동결건조하여 -70℃에 보관하면서 샘플로 사용하였다.
상기 가수분해 효소 4종을 이용한 효소 가수분해물에서는 전반적으로 높은 수율을 확인할 수 있었다. 표 1은 넙치 유래 근육 가수분해물들의 수율, 단백질 함량 및 ACE 저해 효능을 나타낸 것이다. 표 1을 참고하면, protamex를 이용한 가수분해물의 수율이 86.68±1.10%으로 가장 높았으며, 단백질 함량도 70% 이상이었으며, ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC50 값도 68.53 ㎍/ml로 비교적 낮은 농도의 가수분해물에서 ACE 저해 활성을 가졌다.
Figure PCTKR2017007369-appb-T000001
실시예 2: 넙치 근육의 가수분해물 유래 분자량별 분획물의 ACE 저해 활성
실시에 1에서 제조된 넙치 근육 가수분해물들 중에서 수율, 단백질 함량 및 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효능을 종합적으로 평가하여 효과가 가장 좋았던 protamex 가수분해물을 최종적으로 선택하여 ACE 저해 효과를 가지는 펩티드를 함유하는 분획물을 분리하고자 하였다. 한외여과막을 이용하여 protamex 가수분해물을 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만) 분자량별로 분리하였다.
표 2는 protamex 넙치 가수분해물의 분자량별 분획물(fraction)에 따른 ACE 저해 효능을 평가하여 항고혈압 활성을 측정한 결과이다. 그 결과 <5 kDa(5 kDa 미만)의 fraction에서 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC50 값이 35.18 ㎍/ml로 가장 낮아서 <5 kDa(5 kDa 미만)의 fraction에서 항고혈압 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2017007369-appb-T000002
실시예 3: 항고혈압 활성의 펩티드 분리 및 구조 분석
실시예 2에서 ACE 저해 효능이 가장 좋았던 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물로 FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography, AKTA START, GE Healthcare)를 실시하여 총 3개의 fractions을 얻었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
3개의 Fractions의 아미노산 서열을 확인하기 위해 펩티드들의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정하고 그 결과를 도 2 내지 4에 나타내었다. 상기 도 2 내지 4를 참조하면, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA), Leu-His-Phe (LHF) 및 Trp-Pro-Trp (WPW)으로 확인되었고, 분자량은 각각 737.41 Da, 416.23 Da, 488.23 Da으로 나타났다.
실시예 4: 펩티드별 ACE 저해 효능
상기 Val-Phe-Ser-Gly-Trp-Ala-Ala (VFSGWAA), Leu-His-Phe (LHF) 및 Trp-Pro-Trp (WPW) 펩티드의 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 저해 효과를 평가하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. ACE 저해활성을 측정한 결과 VFSGWAA 서열의 펩티드가 ACE 저해 효능이 가장 높아 항고혈압 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다. 또한, VFSGWAA의 경우, ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC50 값이 27.50 ㎍/ml, LHF의 경우 36.63 ㎍/ml, WPW의 경우 40.42 ㎍/ml로 VFSGWAA 서열의 펩티드가 ACE 저해효능이 가장 높음을 확인하였다.
실시예 5: ACE 저해 펩티드의 Molecular docking 분석
Molecular docking 분석은 단백질(효소)-리간드(ACE 저해 펩티드) 복합체의 결합 가능성(효소 active site 결합위치 및 ACE 저해 펩티드의 결합위치) 및 결합 에너지 값을 예측할 수 있는 프로그램이다. Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org)에서 단백질의 3차원 구조를 제공받아 사용하였으며(ACE, PDB: 1O86) Accelrys Discovery Studio (DS) 3.5 (Accelrys, Inc)의 Flexible Docking 프로그램을 활용하여 분석하였다.
도 6은 넙치 근육 가수분해물 유래 펩티드의 Molecular docking 분석 결과를 나타낸다. 상기 VFSGWAA 펩티드는 ACE의 아미노산인 Glu 384, Arg 522, His 353과 수소결합을 하고 있으며, LHF 펩티드는 Tyr 520, Gln 281과 수소결합, WPW 펩티드는 Ala 354, Asp 377과 수소 결합하는 것으로 나타났다. 이들의 Binding energy는 각각 -216 kcal/mol, -186 kcal/mol 및 -138 kcal/mol이였으며, CDOCK interaction energy는 -90.70 kcal/mol, -54.62 kcal/mol 및 -62.67 kcal/mol로 VFSGWAA 펩티드가 나머지 두 펩티드 보다 ACE 효소를 더 잘 저해함을 확인할 수 있었다.
통계처리
실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error (SE) 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 Duncan test 분석방법을 사용하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 추가로 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물에서 분리된 것인, 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 가수분해물은 넙치의 알칼레이즈(alcalase) 가수분해물, 플라보자임(flavourzyme) 가수분해물, 코지자임(kojizyme) 가수분해물 및 프로타멕스(protamex) 가수분해물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리된 것인, 약학 조성물.
  6. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 추가로 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함하는 것인, 식품 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물.
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