WO2017073849A1 - 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2017073849A1
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extract
arthritis
sawtooth
present
mavan
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PCT/KR2016/001371
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김형락
권미성
정은지
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부경대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/03—Phaeophycota or phaeophyta (brown algae), e.g. Fucus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of arthritis comprising the sawtooth mavan extract as an active ingredient.
  • the body consists of about 200 joints. Joints are areas where bones meet. Joints are composed of cartilage, articular capsule, synovial cord, ligaments, tendons, muscles, etc., so that the bones can move smoothly between the bones and absorb the shock generated by the movement.
  • Inflammatory diseases in these joints include chronic joint rheumatism, which is believed to be caused by autoimmunity, infectious arthritis caused by bacterial infections, degenerative arthritis that causes degeneration or destruction of joint cartilage or bone due to various causes, and degenerative changes in connective tissue.
  • Soluble metabolites can be broadly classified into crystalline arthritis and the like deposited as crystals in connective tissue around the joint.
  • Degenerative arthritis causes degeneration of chondrocytes constituting the joint due to aging, which inhibits the synthesis of type II collagen and proteoglycan, which are the matrix substances of the joint, in chondrocytes.
  • type II collagen and proteoglycan which are the matrix substances of the joint, in chondrocytes.
  • inflammatory cytokines such as interleukin-1 ⁇ and tumor necrosis factor- ⁇ are produced, the synthesis of matrix metalloproteinase (MMP), which degrades articular substrates, It is a disease caused by the destruction of joint tissue due to increased activity in joint cells.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • arthritis is further exacerbated by the production of nitrogen monoxide by inflammatory cytokines and the production of self-amplifying cytokines by the produced nitrogen monoxide, leading to the synthesis of more MMPs, thereby promoting the degradation of articular substrates.
  • inflammatory cytokines increase the production of the lipid metabolite, prostaglandin E2, causing an inflammatory response in arthritis.
  • the inflammatory response involves various biochemical phenomena, and in particular, the reaction is initiated or regulated by various enzymes related to the inflammatory response produced by immune cells.
  • the immune cells move to damaged sites through blood vessels with the help of histamine, nitric oxide (NO) or prostaglandin E2 (PGE2) to initiate an inflammatory response.
  • Immune cells migrated to the damaged site were cytokines such as tumor necrosis factor- ⁇ , interleukin-1 ⁇ , or interleukin-6, MIP-1, IL Chemokines such as -8 or MCP-1 secrete chemokine to destroy direct external invaders or other immune cells to initiate an inflammatory response.
  • Inflammatory substances such as interferon- ⁇ , lipoteichoic acid, and lipopolysaccharide (LPS), which cause the inflammatory response, or when exposed to various inflammation-inducing cytokines, iNOS (inducible Nitric Oxide synthase) and COX-2 (cyclooxygenase-2) is expressed, producing excess NO and PGE2.
  • iNOS inducible Nitric Oxide synthase
  • COX-2 cyclooxygenase-2
  • Many of these inflammatory initiators iNOS, COX-2, TNF- ⁇ , IL-6, etc.
  • NF- ⁇ B When NO is produced more than necessary, vasodilation by shock, It causes tissue damage, mutagenesis, and nerve tissue damage caused by inflammatory reactions.
  • Nitric oxide is made by L-arginine and molecular oxygen by NO synthase (NOS).
  • NOS NO synthase
  • nNOS and eNOS are constitutively expressed in neutrophils and endothelial cells.
  • iNOS is inducibly produced in macrophages or monocytes by exposure to LPS or the pro-inflammatory cytokine (Vane et al., 1994).
  • NO produced in iNOS acts as a proliferation inhibitor or cytotoxic agent of pathogens that invade cells by causing inflammation or immune response.
  • NF- ⁇ B Nuclear factor kappa B
  • NF- ⁇ B activation promotes the expression of iNOS and several proinflammatory genes (Kim et al., 2005; Makarov, 2001).
  • the activation pathway of NF- ⁇ B is the phosphorylation of inhibitor of kB (I ⁇ B) - ⁇ kinase by LPS followed by phosphorylation of I ⁇ B- ⁇ and degradation of I ⁇ B- ⁇ , which is phosphorylated by ubiquitine, to move free NF-kB to the nucleus.
  • I ⁇ B inhibitor of kB
  • MAPKs mitogen-activated protein kinases
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • Akt protein kinase B pathway
  • MAPKs include extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), and p38 MAPK, which are involved in the transcriptional regulation of inflammatory genes through NF- ⁇ B activation (Bhat et al., 1998 Kao et al., 2005; Shin et al., 2010).
  • PI3K is also involved in the production of inflammatory cytokines through NF-kB activation (Cremer et al., 2011; Sheu et al., 2005).
  • PI3K activation phosphorylates phosphatidylinositide to activate Akt protein.
  • Activated PI3K / Akt plays a major role in the activation of macrophages (MacMicking et al., 1997; Sheu et al., 2005). Therefore, in order to develop an anti-inflammatory agent, many studies have been conducted to find a substance that inhibits the activation of NK-kB or inhibits the activation of MAPKs and Akt that activates NF-kB.
  • MMPs are proteolytic enzymes that destroy the matrix components of bone and cartilage, and are expressed in cartilage tissue stimulated by inflammatory cytokines during inflammatory diseases, increasing their activity.
  • MMPs comprise at least 21 enzymes: collagenase (MMP-1,8,13), stromelysin (MMP-3,10,11), gelatinase (MMP-2,9), and matrix type-1 metalloproteinase (MMP-14).
  • MMP-1,8,13 collagenase
  • MMP-3,10,11 stromelysin
  • MMP-2,9 matrix type-1 metalloproteinase
  • MMP-14 matrix type-1 metalloproteinase
  • MMP-2 and MMP-9 are gelatinase subfamily, which is an important enzyme for collagen breakdown of cartilage tissue. Both enzymes degrade other substrates, including fibrous collagen I and II and aggrecan, which are present in large amounts in cartilage.
  • Rheumatoid and degenerative arthritis are characterized by inflammatory cell infiltration into the synovial tissue of the joint, which is mediated by chemokine.
  • Chemokines such as monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) are expressed in the synovial tissue of arthritis, and these are known to be produced in synovial fibroblasts. Excess MCP-1 produced by arthritis induces monocytes and macrophages into the inflammatory site, and activates these cells to promote the production of inflammatory cytokines, thereby acting to worsen inflammation.
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1
  • Cytokines in the synovial tissue of rheumatoid and degenerative arthritis stimulate the expression of adhesion molecules such as vascular cellular adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin in vascular endothelial cells. Increase to induce infiltration of inflammatory cells. Overexpressed ICAM-1 and VCAM-1 are associated with chronic inflammation, such as rheumatoid arthritis and degenerative arthritis.
  • Rheumatoid and degenerative arthritis are chronic systemic inflammatory diseases that cause symmetry and multiple arthritis, resulting in joint damage and deformation. When not treated for such arthritis, the progress is poor, indicating a disorder of joint function, and if further persisted, it interferes with daily life due to the disorder of joint function. It is estimated that about 1% of the population in Korea is suffering from rheumatoid arthritis. The incidence of rheumatoid arthritis is three times higher in women than in men, and it is known to occur mainly in the 20s and 40s.
  • Autoimmunity is a phenomenon in which chronic inflammation occurs in various parts of the body continuously and continuously due to abnormal immune control function of our body.
  • the drugs used to treat arthritis may be classified based on the main mechanism of action, such as a decrease in inflammation, a delay in disease progression, and a decrease in uric acid concentration.
  • Many drugs for treating arthritis reduce inflammation. Inflammation is a pathological process that causes pain, swelling, heat, seizures, and stiffness.
  • Drugs that relieve inflammation rapidly include nonsteroidal anti-inflammatory drugs, including aspirin, and steroidal anti-inflammatory drugs, including cortisone.
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs can reduce pain and relax the nerve joints and relieve inflammation, but can also cause gastrointestinal upsets and abdominal pain, so people with active peptic ulcers or hemorrhagic history of the gastrointestinal tract Use is prohibited. Steroidal anti-inflammatory drugs are not used for degenerative neuroarthritis due to their serious side effects such as weight gain and high blood pressure.
  • steroidal anti-inflammatory drugs have nothing to do with treating the cause of the disease, and may simply reduce pain temporarily, leading to overuse of the joint, which can destroy nerve joints and worsen disorders. Requires attention.
  • the present inventors have confirmed that the sawtooth maban inhibits inflammatory cytokines and improves arthritis in arthritis experimental animals, thereby confirming that it can be used as a therapeutic agent for arthritis and completed the present invention.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis which includes Sawtooth Mavan extract ( Sargassum serratifolium ) as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or improving arthritis, including sawtooth mavan extract ( Sargassum serratifolium ) as an active ingredient.
  • sawtooth mavan extract Sargassum serratifolium
  • the present invention is sawtooth mavan extract Sargassum Serratifolium ) provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis comprising as an active ingredient.
  • the sawtooth mavan extract may be an extract obtained using water or an organic solvent.
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, acetone, ether, benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane.
  • the sawtooth mavan extract can reduce or inhibit the activity of the inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a.
  • the arthritis may be degenerative arthritis, rheumatoid arthritis or lupus arthritis.
  • the present invention is sawtooth mavan extract Sargassum Serratifolium ) provides a dietary supplement for the prevention or improvement of arthritis comprising as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of arthritis comprising the sawtooth mavan extract as an active ingredient.
  • Sawtooth Mavan extract according to the present invention is excellent in reducing or inhibiting the activity of the inflammatory cytokines IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a, and excellent in improving arthritis in arthritis animal models, the composition for treating arthritis It can be usefully used.
  • Figure 1 shows the results of measuring the cytotoxicity to the cells after the treatment of the alcohol extract (EtOH) of the sawtooth maban by concentration.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the production process of rheumatoid arthritis experimental animal model.
  • Figure 3 shows the result of confirming the weight change for 6 weeks after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals.
  • Figure 4 is a result of confirming the change in foot thickness after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals.
  • Figure 7 is a result of confirming the degree of arthritis with the naked eye after administration of the sawtooth capillary extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals.
  • FIG. 8 shows the degree of inhibition of the production of inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a) in the serum after sacrificing the experimental animals at 6 weeks after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals. The result is.
  • IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a inflammatory cytokines
  • Figure 9 shows the degree of inhibition of the production of inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a) in the hind paw tissue after sacrificing the test animals 6 weeks after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals. This is confirmed by Western blot.
  • IL-1 ⁇ , IL-6 or TNF-a inflammatory cytokines
  • 11 is a result of confirming the degree of suppression of expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2) in the hind paw tissue after sacrifice of the experimental animals 6 weeks after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals.
  • proinflammatory proteins iNOS, COX-2
  • FIG. 12 shows the degree of phosphorylation of NF-kB, which is responsible for transcriptional regulation of proinflammatory proteins and cytokines in hind paw tissue, after sacrifice of the experimental animals 6 weeks after administration of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals. The result is.
  • FIG. 13 is a top protein involved in the activation of NF-kB, a transcription factor that modulates inflammation in hind paw tissue after 6 weeks after sacrifice of the sawtooth mavan extract of the present invention to rheumatoid arthritis experimental animals (Akt, JNK, p38 protein) is the result of checking the degree of phosphorylation.
  • the present invention relates to a novel use of the sawtooth mavan extract, which has been found to have excellent arthritis therapeutic activity in the sawtooth mavan extract.
  • the sawtooth mavan extract which is a perennial large brown alga that is 1 to 4 m as a plant that grows in the intertidal zone over lunch.
  • Roots are 4 ⁇ 5cm in diameter, conical, rubbery, with rings, stems are circumferential, short, divided into a number of central branches, and pressed.
  • both edges of the stem are thin, vertically ridged to one side, with short branches at the edges, the stem leaves toward the base, with double teeth on the edge, and the bubble is round and close to the top.
  • House or spiny spines In particular, it is known to grow on the southern coast of Korea and Jeju, and it is known to have a function of lipid lowering, blood pressure lowering, and radioisotope emission, and there is no known effect related to arthritis.
  • the sawtooth mavan extract has therapeutic activity for arthritis, according to an embodiment of the present invention, the degree of inflammatory cytokine expression associated with arthritis according to the sawtooth mavan extract treatment
  • inflammatory cytokines increased rapidly in the experimental animal group induced by rheumatoid arthritis, but inflammatory cytokine expression to TNF- ⁇ , IL-6 or IL-1 ⁇ was significantly increased in the sawtooth mavan extract treatment group. It can be seen that it is suppressed.
  • the sawtooth mavan extract treatment can improve the arthritis of rheumatoid arthritis experimental animals.
  • the present inventors have found that the sawtooth mavan extract has therapeutic activity against arthritis, and the sawtooth mavan extract exhibits superior anti-arthritis therapeutic activity compared to other mother extracts. Therefore, the present inventors have found that the saw tooth hatch of the present invention is a more useful material for treating arthritis than other mother disease species.
  • composition comprising the sawtooth mavan extract of the present invention as an active ingredient can effectively prevent or treat arthritis.
  • arthritis refers to degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, or lupus arthritis, but is not limited thereto, and most preferably, rheumatoid arthritis and degenerative arthritis.
  • the sawtooth mavan may be obtained by extraction and separation from nature using extraction and separation methods known in the art, and the 'extract' defined in the present invention may be obtained from the sawtooth mavan using an appropriate solvent. It is extracted, and for example, may include all of the hot water extract, polar solvent soluble extract or non-polar solvent soluble extract of the sawtooth cap.
  • any solvent that is acceptable in the art may be used, and water or an organic solvent may be used.
  • Solvents such as benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination. It is not limited.
  • any one of hot water extraction method, cold leaching extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method and compression method can be used.
  • the desired extract may further be subjected to a conventional fractionation process, it may be purified using conventional purification methods.
  • any known method may be used.
  • the sawtooth mavan extract included in the composition of the present invention may be prepared in a powder state by an additional process such as distillation under reduced pressure, freeze drying or spray drying, which is extracted by the hydrothermal extraction or solvent extraction method described above.
  • the primary extract may be further purified using various chromatography such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, and the like. You can also get
  • the sawtooth mavan extract is a concept including all the extracts, fractions and purified products obtained in each step of extraction, fractionation or purification, their dilutions, concentrates or dried products.
  • composition of the present invention comprising such a sawtooth mavan extract as an active ingredient may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient, and the adjuvant may include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, Lubricants, flavors and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredient for administration.
  • Formulation forms of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions.
  • the active ingredient may be combined with an oral, nontoxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include but are not limited to natural and synthetic gums such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, corn sweeteners, acacia, trackercance or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium Benzoate, sodium acetate, sodium chloride and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA can be formulated according to each disease or component, as appropriate in the art.
  • the sawtooth mavan extract of the present invention may be included in 0.001 to 20% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the composition of the present invention may also be a food composition, such a food composition is effective
  • various flavors, natural carbohydrates, and the like may be contained as additional components, as in general food compositions.
  • Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the aforementioned flavoring agents can advantageously be used natural flavoring agents (tautin), stevia extracts (for example rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition of the present invention may be formulated in the same manner as the pharmaceutical composition, used as a functional food, or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention may be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, candy, ice creams, alcoholic beverages, vitamin complexes, and health supplements. There is this.
  • the food composition is a nutrient, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavoring agents, colorants and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its Salts, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks and the like.
  • the food composition of the present invention may contain a fruit flesh for producing natural fruit juice and fruit juice beverage and vegetable beverage.
  • the sawtooth mavan extract is a natural substance and has almost no toxicity and side effects, so it can be used safely even for long-term administration for the purpose of preventing and treating arthritis.
  • the health functional food of the present invention may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like for the purpose of preventing and treating arthritis.
  • health functional food refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having functional properties useful for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6767, and nutrients for the structure and function of the human body. It is meant to be consumed for the purpose of regulating or obtaining a useful effect for health use such as physiological action.
  • the health functional food of the present invention may include a conventional food additive, and the suitability as a food additive, unless otherwise specified, in accordance with the General Regulations of the Food Additives and General Test Methods approved by the Food and Drug Administration, etc. Judging by the standards and standards.
  • Food Additive Reduction examples include chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; Natural additives such as dark blue pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigment and guar gum; And mixed preparations such as sodium L-glutamate, algae additives, preservatives and tar dyes.
  • a dietary supplement in the form of tablets is a mixture of a sawtooth mavan extract, an active ingredient of the present invention, with an excipient, a binder, a disintegrant, and other additives, and then granulated in a conventional manner, and then compressed with a lubricant and the like.
  • the mixture can be directly compression molded.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent or the like as necessary.
  • Hard capsules among the health functional foods in the form of capsules can be prepared by filling a mixture of additives, such as excipients, sawtooth mavan extract, which is an active ingredient of the present invention, into a conventional hard capsule, and soft capsules such as excipients such as excipients
  • the mixture mixed with the additive of may be prepared by filling in a capsule base such as gelatin.
  • the soft capsule agent may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, as necessary.
  • the health functional food in the form of a cyclic form may be prepared by molding a mixture of a sawtooth mavan extract, an active ingredient of the present invention, an excipient, a binder, a disintegrant, and the like by using a conventionally known method. It may be avoided, or the surface may be coated with materials such as starch, talc.
  • the health functional food in the form of granules can be prepared into a granular mixture of a sawtooth mavan extract, an active ingredient of the present invention, an excipient, a binder, a disintegrant, and the like by a conventionally known method. And the like.
  • the health functional food may be beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes and health supplements.
  • the sawtooth mavan used in the present invention was collected and used in Gijang-gun, Busan, and the spirit extract of the sawtooth mavan was obtained by the following method.
  • 2 kg of powder and alcohol (95% ethanol) obtained by natural drying after drying the sawn hatch in the shade or sunny place for the manufacture of alcohol extracts were added three times at 70 ° C. for 3 hours and equipped with a reflux cooler.
  • the ultrafiltration unit MWCO, 50 kDa
  • the inventors of the present invention first to prepare a test animal induced rheumatoid arthritis in order to determine whether the extract can treat rheumatoid arthritis.
  • the male DBA / 1J mouse (8 weeks old) was used to purify and breed for 1 week. After one week, DBA / 1J mice were treated with Complete Freund's Adjuvant (CFA) and Type 2 collagen (2 mg / mL). Mix and emulsify to form emulsion (CII / CFA). 100 ⁇ l of CII / CFA was injected subcutaneously by finding a vein in the lower part of the tail about 2-3 cm from the tail of DBA / 1J mice.
  • CFA Complete Freund's Adjuvant
  • Type 2 collagen 2 mg / mL
  • the body weights were measured weekly for up to 7 weeks in the control group treated with nothing, the arthritis animal group (CIA treated group), and the arthritis experimental animals treated with 0.01% and 0.05% of the sawtooth mavan extract. There was a slight increase in body weight at the 3rd and 4th week, but there was no significant change in body weight. (See Figure 3).
  • the present inventors measured the change in paw thickness, which is an index of arthritis, in order to confirm the therapeutic effect of rheumatoid arthritis by sawtooth moths extract.
  • the arthritis-induced experimental animals increased the foot thickness due to inflammation, whereas the foot thickness of the sawtooth mavan extract treatment group was significantly reduced compared to the arthritis-induced experimental animals group. After that, it was confirmed that the thickness was similar to the control group (see FIG. 4).
  • the present inventors observed the arthritis index with the naked eye in order to confirm the therapeutic effect of rheumatoid arthritis of the sawtooth mavan extract, arthritis index for each scored from 0 to 4 points, was measured by five non-testers.
  • the arthritis index was high in the arthritis-induced experimental animal group, but the arthritis evaluation index was significantly higher in the treatment group treated with the sawtooth mosaic extract of the present invention. It can be seen that the lower (see Figure 5).
  • the present inventors weighed the spleen to determine whether the sawtooth mavan extract can cure rheumatoid arthritis.
  • the spleen is a major tissue of the human immune system, and its relative weight is often used as a preliminary indicator to assess the immunomodulatory activity of the sample to be tested.
  • the present inventors visually observed the degree of arthritis treatment according to the treatment of the sawtooth mavan extract, the hind feet were severely swollen in the arthritis-induced experimental animal group, and showed erythema symptoms. However, in the treated group treated with 0.01%, 0.05% of the sawtooth mavan extract of the present invention for 19 days, it was confirmed that the swelling was reduced and erythema symptoms were alleviated (see FIG. 7).
  • inflammatory mediators such as interleukin (IL) and PGE 2 are released into joints and blood by activated immune cells that gather in the inflammatory area, especially TNF- ⁇ , IL-6, IL. -1 ⁇ can be used as an indicator to determine the degree of disease of rheumatoid arthritis.
  • IL interleukin
  • PGE 2 activated immune cells that gather in the inflammatory area
  • TNF- ⁇ , IL-6, IL. -1 ⁇ can be used as an indicator to determine the degree of disease of rheumatoid arthritis.
  • the present inventors measured by using an ELISA kit to measure the expression level of the inflammatory cytokine in the blood of the experimental animal, the inflammatory cytokine was rapidly increased in the experimental animal group induced by rheumatoid arthritis, but sawtooth mavan extract of the present invention It was found that the inflammatory cytokine expression to TNF- ⁇ , IL-6 or IL-1 ⁇ was significantly inhibited in the treatment group fed a 19 days (see FIG. 8).
  • the present inventors measured by Western blot in order to measure the level of inflammatory cytokine expression in the protein extracted by grinding the hind paw as an inflammation site.
  • the inflammatory cytokine was rapidly increased in the experimental animal group induced by rheumatoid arthritis, but the inflammatory cytokine expression to TNF- ⁇ , IL-6 or IL-1 ⁇ was significantly increased in the sawtooth mavan extract treatment group. It was found that it was suppressed (see FIG. 9).
  • NO and PGEs are synthesized from L-arginine and phospholipids by nitric oxide synthase (NOS) and cyclooxygenase (COX), respectively. Excessive increases in NO and PGE2 under pathological conditions stimulate the inflammatory process and synergize with other inflammatory mediators. Under these conditions, excess NO and PGE2 are synthesized by inducible NOS (iNOS) and COX-2. In addition, iNOS and COX-2 are strongly expressed when exposed to inflammatory cytokines and bacterial endotoxins.
  • NOS nitric oxide synthase
  • COX cyclooxygenase
  • NF- ⁇ B is normally inactivated in the cytoplasm by binding to inhibitory ⁇ B- ⁇ (I ⁇ B- ⁇ ).
  • I ⁇ B- ⁇ inhibitory ⁇ B- ⁇
  • NF- ⁇ B in the inactivated state of the cell is activated by phosphorylation and migrates into the nucleus, thereby contributing to transcription of inflammation-related proteins.
  • the present inventors mixed the feed sawn bar alcohol extract with feed for 19 days in experimental animals induced by CIA treatment in order to determine whether the toothed barn alcohol extract of the present invention affects the transfer of NF- ⁇ B into the nucleus. suddenly. Tissue lysates were obtained for each animal group used in the experiment, followed by Western blot using an antibody against NF- ⁇ B phosphorylation.
  • NF- ⁇ B phosphorylation induced by CIA treatment was reduced in concentration-dependent manner by the feeding of the cogwheel extract of Sawtooth Maban, and the phosphorylation level was similar to that of the control by the feeding of 0.05% alcohol extract. Levels were indicated.
  • the sawtooth maternal ethanol extract inhibits the phosphorylation of NF- ⁇ B in the joint tissues of experimental animals induced by CIA treatment, whereby NF- ⁇ B moves to the nucleus and acts as an inflammatory factor such as inflammatory cytokines.
  • Experimental animals were able to block the activation of.
  • Molecular signal transduction mechanisms that regulate the process of inducing the expression of iNOS, COX-2 or proinflammatory cytokines through activation of NF- ⁇ B transcription factors by various external stimuli are three enzymes belonging to the major MAPK subfamily: extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK), p38 MAPK and PI3K / Akt.
  • ERK extracellular-regulated protein kinase
  • JNK c-Jun NH2-protein kinase
  • p38 MAPK p38 MAPK
  • PI3K / Akt PI3K / Akt.
  • sawtooth maize alcohol extract showed the inhibition of phosphorylation (activation) of Akt, JNK, p38 MAPK. Therefore, it was found from the above results that the sawtooth cap ethanol extract inhibits the inflammatory response by blocking various signal protein pathways in the joint tissue.
  • Induction of rheumatoid arthritis with CIA increases the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-9 that break down cartilage tissue at the joint site, increases MCP-1 inducing inflammatory cell infiltration into articular synovial tissue, and joints Increasing ICAM-1 and VCAM-1 increase the invasion of inflammatory cells in the synovial tissue of.
  • the western blot was performed to confirm the effect of the sawtooth maternal ethanol extract of the present invention on the inhibitory effect of ICAM-1, VCAM-1, MCP-1, MMP-1, 2, 9 in the joint inflammation site.
  • the expression level of TNF- ⁇ in various inflammatory cytokines was measured using an ELISA kit.
  • the sawtooth mother extract of the present invention showed that the arthritis treatment effect is superior to other mother and child extracts.

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Abstract

본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 또는 TNF-a의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 관절염 동물모델에서 관절염을 개선하는 효과가 우수하여 관절염 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

Description

톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
인체는 약 200 여개의 관절로 이루어져 있다. 관절이란 뼈와 뼈가 만나는 부위이다. 관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록, 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다.
이러한 관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균 감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염, 결합조직의 퇴행성 변화로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.
퇴행성 관절염, 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화로 인한 퇴행이 발생하여, 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형II 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1β(interleukin-1β) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라, 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.
또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다.
생체에 있어서 염증반응은 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히, 면역세포에 의해 생산되는 염증반응과 관련된 다양한 효소에 의해 반응이 개시되거나 조절된다. 구체적으로, 상기 면역세포들은 히스타민(histamine), 일산화질소(nitric oxide, NO) 또는 프로스타글라딘 E2(prostaglandin E2, PGE2) 등의 도움으로 혈관을 통해 손상된 부위로 이동하여 염증반응을 개시한다. 상기 손상된 부위로 이동한 면역세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukin-1β) 또는 IL-6(interleukin-6)와 같은 사이토카인(cytokine)이나 MIP-1, IL-8 또는 MCP-1 등과 같은 케모카인(chemokine)을 분비하여 직접적인 외부침입물질을 파괴하거나 다른 면역세포들을 모아 염증반응을 개시한다.
상기 염증반응을 일으키는 인터페론-γ(interferon-γ), 리포테이코산(lipoteichoic acid), lipopolysaccharide(LPS) 등의 염증유발 물질이나 다양한 염증 유도 사이토카인에 노출될 경우, iNOS(inducible Nitric Oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)가 발현되어, NO와 PGE2가 과량 생성된다. 이들 여러 염증 개시인자들(iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 등)은 활성화된 NF-κB에 의해 전사가 촉진되며, 이로 인해 NO가 필요이상으로 생성되면 쇼크에 의한 혈관확장, 염증반응에 의해 유발되는 조직손상, mutagenesis, 신경조직의 손상 등을 일으킨다.
산화질소(Nitric oxide; NO)는 NO 합성효소 (NOS)에 의하여 L-arginine과 분자상의 산소로써 만들어진다. 포유동물에는 세가지 형태의 NOS가 존재한다; 즉, neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS) 및 inducible NOS(iNOS). nNOS와 eNOS는 센경세포와 내피세포에서 구성적으로 발현된다. 그러나, iNOS는 유도성으로 LPS나 전구성 염증 사이토카인(cytokine)의 노출에 의하여 거식세포나 단구세포에서 만들어진다 (Vane et al., 1994). iNOS에 생성된 NO는 염증이나 면역반응을 일으켜 세포로 침입한 병원체의 증식억제제나 세포독성물질로 작용한다. 그러나 iNOS의 과발현에 의하여 생성된 과잉의 NO는 병리적인 상태를 야기시키는 것으로 알려져 있다 (Kim et al., 2005; Pan et al., 2011). 세포내에서 과잉의 NO에 의한 유해한 효과는 자체로써 염증매개인자로 작용할 뿐만 아니라 superoxide와 반응하여 퍼옥시니트리트(peroxynitrite)를 생성한다. 퍼옥시니트리트는 단백질, 지방, DNA와 같은 세포내 분자의 산화적 손상을 야기시킬뿐만 아니라 정상적인 유전자 조절을 변형시키기도 한다. 따라서 다량의 NO 뿐만 아니라 iNOS의 과발현은 여러 가지 염증성 질환과 관련된 병리적인 상태와 밀접한 관련이 있다(MacMicking et al., 1997; Maeda and Akaike, 1998).
Nuclear factor kappa B (NF-κB)는 세포의 성장은 물론 면역과 급성 염증반응에 주요한 역할을 한다(Li and Verma, 2002; Makarov, 2001). NF-κB 활성화는 iNOS와 여러 가지 전구염증성 유전자들의 발현을 촉진한다(Kim et al., 2005; Makarov, 2001). NF-κB의 활성화 경로는 LPS에 의해 inhibitor of kB (IκB)-α kinase의 인산화 다음으로 IκB-α가 인산화되어 ubiquitine에 의해 인산화 된 IκB-α가 분해됨으로써 유리상태의 NF-kB가 핵으로 이동하게 되어 염증관련유 전자들의 발현을 조절한다(Chen et al., 1995). 또 다른 NF-kB의 활성화는 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (Guha and Mackman, 2001)나 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) 경로 (Sheu et al., 2005)를 통하여 일어난다. MAPKs에는 extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase(JNK) 및 p38 MAPK이 있으며, 이들은 NF-κB 활성화를 통한 염증 유전자들의 전사조절과 관련이 있다 (Bhat et al., 1998; Kao et al., 2005; Shin et al., 2010). PI3K 또한 NF-kB 활성화를 통한 염증성 사이토카인의 생성에 관여하고 있다 (Cremer et al., 2011; Sheu et al., 2005). PI3K 활성화는 포스파티딜인오시타이드(phosphatidylinositide)를 인산화시켜 Akt 단백질을 활성화 시킨다. 활성화된 PI3K/Akt은 거식세포의 활성화에 주요한 역할을 한다 (MacMicking et al., 1997; Sheu et al., 2005). 따라서, 항염증제를 개발하기 위하여 NK-kB의 활성화를 억제시키거나, NF-kB를 활성화시키는 MAPKs과 Akt의 활성화를 억제시키는 물질을 찾기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.
MMPs는 골 및 연골의 기질 구성요소를 파괴하는 단백질 분해효소로서, 염증질환상태일 때 염증성 사이토카인(cytokine)에 의해서 자극을 받은 연골조직에서 발현되어 활성이 증가한다. MMPs는 최소 21개의 효소를 구성하는데, collagenase (MMP-1,8,13), stromelysin (MMP-3,10,11), gelatinase (MMP-2,9)와 matrix type-1 metalloproteinase (MMP-14)의 하위그룹으로 세분화된다. 이 중 MMP-2와 MMP-9은 젤라틴나아제 서브패밀리(gelatinase subfamily)로써, 연골조직의 콜라겐 분해에 특히 중요한 효소이다. 이 두 가지 효소는 연골에 다량 존재하는 섬유성 콜라겐 I과 II 및 aggrecan을 포함한 다른 기질들을 분해한다.
류마티스와 퇴행성 관절염은 관절 활막조직 내로의 염증세포 침윤이 그 특징이며, 이는 chemokine에 의해서 매개된다. 관절염의 활막조직에는 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 등의 chemokine이 발현되며, 이들은 활막섬유아세포(synovial fibroblast) 등에서 생성되는 것으로 알려져 있다. 관절염에 의해 생성된 과잉의 MCP-1은 염증부위로 단구세포와 거식세포를 불러들이고, 이들세포들을 활성화함으로써 염증성 사이토카인의 생성을 촉진하여 염증을 더욱 악회시키는 역할을 한다.
류마티스와 퇴행성 관절염의 활막 조직에서 사이토카인에 의해 혈관 내피세포에서 vascular cellular adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)과 E-selectin 등과 같은 유착 분자 (adhesion molecule) 발현을 증가시켜 염증 세포의 침윤을 유도한다. 과발현된 ICAM-1과 VCAM-1은 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염과 같은 만성염증과 관련이 있다.
류마티스와 퇴행성 관절염은 만성 전신성 염증 질환으로 대칭성, 다발성의 관절염과 이에 따른 관절의 손상 및 변형이 생기는 질환이다. 이러한 관절염에 대한 치료를 받지 않을 경우에는 경과가 불량하여 관절 기능의 장애를 나타내며, 더 지속되면 관절 기능의 장애로 인하여 일상생활에 지장을 받는다. 국내에서는 전인구의 약 1%가 류마티스성 관절염으로 고생하고 있을 것으로 추정되는데, 류마티스성 관절염의 발생률은 남성보다 여성이 3배 정도 높으며 주로 20 ~ 40대에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
류마티스성 관절염의 주요 원인이 점차 밝혀지고 있으며, 유전적인 요인과 감염, 호르몬의 이상 등이 원인 인자로 생각되고 있다. 이러한 원인 인자로 인하여 '자가면역' 현상이 생기는데, 자가면역이란, 우리 몸의 면역조절 기능 이상으로 인해 만성 염증이 몸의 여러 부위에서 다발적, 지속적으로 일어나는 현상이다.
한편, 상기 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 신경관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발작, 경직을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.
비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증을 완화시키는 효과가 있으나, 위장장애가 나타나거나 복통을 유발하는 경우도 있기 때문에, 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해 체중 증가나 고혈압 등의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다.
특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고, 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며, 이는 신경관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.
따라서, 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 동안 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 톱니모자반이 염증성 사이토카인을 억제하고 관절염 실험동물에서 관절염을 개선시킨다는 것을 규명함으로써 관절염 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 톱니모자반 추출물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 또는 TNF-a의 활성을 감소 또는 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염일 수 있다.
또한, 본 발명은 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 톱니모자반 추출물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 또는 TNF-a의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 관절염 동물모델에서 관절염을 개선하는 효과가 우수하여 관절염 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.
도 1은 톱니모자반의 주정추출물(EtOH)을 농도별로 처리한 후, 세포에 미치는 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 류마티스 관절염 실험동물모델 제작 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주 동안의 체중 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 발 두께의 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 관절염 지수의 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 체중 당 비장의 무게를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 육안으로 관절염 정도를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 혈청 내 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 또는 TNF-a) 생성 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 뒷발 조직 내 염증성사이토카인(IL-1β, IL-6 또는 TNF-a) 생성 억제 정도를 웨스턴블랏으로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 뒷발 조직내 전염증성 단백질인(iNOS, COX-2)의 발현억제 정도를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 뒷발 조직내 전염증성 단백질인(iNOS, COX-2)의 발현억제 정도를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 뒷발 조직내 전염증성 단백질과 사이토칸의 전사조절을 담당하는 NF-kB의 인산화 정도를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 톱니모자반 추출물을 류마티스 관절염 실험동물에 투여한 후 6주째에 실험동물을 희생시킨 다음 뒷발 조직내 염증을 조절하는 전사인자인 NF-kB의 활성화에 관여하는 상위 단백질 (Akt, JNK, p38 단백질)의 인산화 정도를 확인한 결과이다.
본 발명은 톱니모자반 추출물에 관절염 치료 활성이 우수함을 규명한 톱니모자반 추출물의 신규 용도에 관한 것이다.
본 발명에서는 새로운 관절염 치료제로서의 소재로서 톱니모자반 추출물에 주목하였는데, 톱니모자반은 조간대에서 점심대에 걸쳐 생육하는 식물로서 1 ~ 4m인 다년생 대형 갈조류이다. 뿌리는 지름 4 ~ 5cm로 원뿔상이고, 고무와도 같으며 나이테가 있고, 줄기는 원주상으로 짧고 다수의 중심가지로 나뉘며 편압되어 있다. 또한 줄기의 양 가장자리가 얇고, 세로로 중륵처럼 한쪽으로 융기하며, 가장자리에서 짧은 가지를 내고 있으며 줄기잎은 기부로 향하여 있고, 가장자리에 2중으로 된 톱니가 있으며, 기포는 둥근 모양에 가까우며 그 꼭대기에 관엽 또는 가시 모양의 돌기가 있다. 특히 우리나라의 남해안과 제주에 생육하는 것으로 알려져 있으며, 지질강하, 혈압강하, 방사성 동위원소 배출작용에 대한 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐, 아직까지 관절염과 관련된 작용에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명자들은 톱니모자반 추출물이 관절염 치료 활성이 있다는 것을 본 발명의 일실시예를 통하여 확인하였는데, 본 발명의 일실시예에 의하면, 톱니모자반 추출물 처리에 따른 관절염과 관계되어 있는 염증성 사이토카인 발현 정도를 측정한 결과, 류마티스 관절염이 유도된 실험동물군에서는 염증성 사이토카인이 급격히 증가하였지만, 본 발명의 톱니모자반 추출물 처리군에서는 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β에 대한 염증성 사이토카인 발현이 유의적으로 억제되는 것을 알 수 있었다. 또한, 톱니모자반 추출물 처리가 류마티스 관절염 실험동물의 관절염을 개선할 수 있음을 실험으로 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 톱니모자반 추출물이 관절염에 대한 치료 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었으며, 다른 모자반 추출물에 비해 톱니모자반 추출물이 더 월등하게 관절염 치료 활성을 나타내고 있다. 따라서, 본 발명자들은 다른 모자반 종에 비해 본 발명의 톱니모자반이 관절염 치료제로 더 유용한 소재임을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 관절염을 효과적을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 “관절염”이란 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니지만 가장 바람직하게는 류마티스 관절염과 퇴행성 관절염을 의미한다.
본 발명에 따른 톱니모자반은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 톱니모자반으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 톱니모자반의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.
톱니모자반으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 톱니모자반 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 톱니모자반 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
따라서 본 발명에 있어서 톱니모자반 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
이러한 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 톱니모자반 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 톱니모자반 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 관절염의 예방 및 치료를 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 관절염의 예방 및 치료를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 톱니모자반 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 톱니모자반 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
톱니모자반 주정추출물의 제조
본 발명에서 사용한 톱니모자반은 부산시 기장군에서 채집하여 사용하였고, 아래와 같은 방법을 통해 톱니모자반의 주정추출물을 수득하였다. 먼저 주정추출물의 제조를 위해 톱니모자반을 음지 또는 양지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 2 kg과 주정(95% 에탄올)을 각각 8 L씩 넣고 70℃에서 3시간 동안 3회 반복하여 환류냉각기가 장착된 추출기로 추출한 후 한외여과장치 (MWCO, 50 kDa) 여과하여 이물질을 제거한 후, 여과된 추출물을 진공회전농축기로 40℃에서 용매를 제거한 다음 추출된 잔사로서 톱니모자반조추출물 (200 ± 25 g)을 수득하였다.
<실험예 2>
톱니모자반의 주정추출물의 류마티스 관절염 치료 효과
<2-1> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 체중 변화 측정
본 발명자들은 톱니모자반 추출물에 류마티스 관절염을 치료할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 류마티스 관절염이 유도된 실험동물을 제작하였다.
Male DBA/1J mouse (8 주령) 사용하여, 1주일간 순화 및 사육을 하였으며, 일주일 뒤에 DBA/1J mouse를 제2형 콜라겐 (Bovine type II collagen, 2 mg/mL)을 Complete Freund’s Adjuvant (CFA)와 혼합, 유화시켜서 emulsion(CII/CFA)을 만든다. DBA/1J mouse의 꼬리 끝으로부터 2 ~3 cm 정도 떨어진 꼬리의 아랫부분에 있는 정맥을 찾아 100 ㎕의 CII/CFA를 피하주사하였다. CII/CFA 투여 3 주 후 제 2형 콜라겐과 동량의 Incomplete Freund’s Adjuvant (IFA)를 혼합, 유화시켜 만든 유상액 CII/IFA 100 ㎕를 DBA/1J mouse의 엉덩이 부분과 꼬리 부분의 연결 부위인 근육에 2차 피하주사를 실시하였다. 2차 피하 주사하는 날부터 19일 동안 본 발명의 방법으로 제조된 톱니모자반 추출물을 0.01%(0.024 g/체중 kg), 0.05%(0.12 g/체중 kg)로 첨가하여 동물실험을 하였다. .
아무것도 처리하지 않은 대조군, 관절염 동물군(CIA 처리군), 관절염 실험동물에 0.01%, 0.05%의 톱니모자반 추출물을 처리한 처리군을 대상으로 7주까지 매주 체중을 측정하였는데, 그 결과 모든 군에서 3주째에서 4주째 넘어가는 시기에 체중이 약간 증가하였으나, 그룹별 체중변화는 유의적으로 나타나지 않았다. (도 3 참조).
<2-2> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 발 두께의 변화 측정
본 발명자들은 톱니모자반 추출물에 의한 류마티스 관절염 치료효과를 확인하기 위하여 관절염의 지표가 되는 발 두께(paw thickness) 변화를 측정하였다.
상기 <2-1>의 류마티스 관절염이 유도된 실험동물 제작 과정 중 2차 피하 주사 후 19일간 전자 caliper를 사용하여 3일마다 톱니모자반 추출물 처리에 따른 발 두께 변화를 측정하였다.
그 결과, 관절염이 유도된 실험동물은 염증에 의해 발 두께가 증가한 반면에, 톱니모자반 추출물 처리군의 발 두께는 관절염 유도 실험동물군에 비하여 유의적으로 두께가 감소하였음을 알 수 있었고, 19일 후에는 대조군과 비슷한 정도의 두께로 나타났음을 확인하였다(도 4 참조).
<2-3> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 관절염 지수 측정
본 발명자들은 톱니모자반 추출물의 류마티스 관절염 치료효과를 확인하기 위하여 육안으로 관절염 지수를 관찰하였으며, 각각에 대한 관절염 지수는 0 ~ 4점으로 점수를 매기고, 비실험자 5인에 의해 측정되었다.
관절염 지수는 한 마리당 각각의 발에 대한 점수를 합산하여 얻게 되었다(최고점수=16점).
-평가 기준-
0점: 아무 증상이 없음
0.5점: 하나의 손가락이 붉고 부음
1점: 2 ~ 5개의 손가락이 붉고 조금의 부음
2점: 2 ~ 5개의 관절의 붉음과 중도의 부음
3점: 전체 발의 붉음과 부음
4점: 감소된 부음과 기형
각각의 처리군을 대상으로 류마티스 관절염 평가점수를 확인한 결과, 관절염이 유도된 실험동물군에서는 관절염지수가 높게 나타났으나, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 처리한 처리군에서는 관절염 평가 지수가 유의적으로 낮아졌음을 알 수 있었다(도 5 참조).
<2-4> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 체중 당 비장의 무게 측정
본 발명자들은 톱니모자반 추출물이 류마티스 관절염을 치료할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 비장의 무게를 측정하였다.
비장은 인체 면역 시스템의 주요한 조직으로써, 상대적인 무게는 흔히 테스트하고자하는 샘플의 면역조정활성을 평가하기 위한 예비지표로써 많이 사용된다.
체중 당 비장의 무게를 측정한 결과, 관절염이 유도된 실험동물에서는 비종(비장이 부어서 커진 상태)을 드러냈지만, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 처리한 군에서는 비종이 나타나지 않았으며, 이는 톱니모자반 주정추출물에 의한 비장의 확장과 면역 세포의 침투성의 억제를 확인할 수 있었다(도 6 참조).
<2-5> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 관절염 치료 정도 육안 관찰
본 발명자들은 톱니모자반 추출물 처리에 따른 관절염 치료 정도를 육안으로 관찰한 결과, 관절염이 유발된 실험동물군에서는 뒷발이 심하게 부었으며, 홍반 증세를 보였다. 그러나, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 0.01%, 0.05%로 19일간 처리한 처리군에서는 붓기가 감소되었고, 홍반 증상이 완화되었음을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
<2-6> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 염증성 사이토카인 억제 효과
보통 류마티스 관절염이 발달하면 염증부위로 모여든 활성화된 면역세포에 의해 인터루킨(IL)과 PGE2와 같은 염증매개체(inflammatory mediator)들이 관절과 혈액으로 방출되는데, 특히 TNF-α, IL-6, IL-1β는 류마티스 관절염의 질병 정도 유무를 파악할 수 있는 지표로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 실험동물의 혈액 중 상기 염증성 사이토카인 발현 정도를 측정하기 위하여 ELISA kit를 사용하여 측정한 결과, 류마티스 관절염이 유도된 실험동물군에서는 염증성 사이토카인이 급격히 증가하였지만, 본 발명의 톱니모자반 추출물을 19일간 급이한 처리군에서는 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β에 대한 염증성 사이토카인 발현이 유의적으로 억제되는 것을 알 수 있었다(도 8 참조).
<2-7> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 염증성 사이토카인 억제 효과
본 발명자들은 염증부위인 뒷발을 마쇄하여 추출한 단백질 중 염증성 사이토카인 발현 정도를 측정하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하였다.
그 결과, 류마티스 관절염이 유도된 실험동물군에서는 염증성 사이토카인이 급격히 증가하였지만, 본 발명의 톱니모자반 추출물 처리군에서는 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β에 대한 염증성 사이토카인 발현이 유의적으로 억제되는 것을 알 수 있었다(도 9 참조).
<2-8> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 iNOS와 COX -2 단백질 생성억제 효과
NO와 PGEs는 nitric oxide synthase (NOS)와 cyclooxygenase (COX)에 의해 각각 L-arginine 및 인지질로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO와 PGE2의 과도한 증가는 염증 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타낸다. 이러한 상태 하에서 과도한 NO와 PGE2는 inducible NOS (iNOS)와 COX-2에 의해 합성된다. 또한, iNOS와 COX-2는 염증성 사이토카인과 박테리아성 내독소(endotoxin)에 노출되었을 때 강하게 발현된다.
따라서 CIA 처리로 유도된 실험동물의 염증부위인 뒷발조직에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 톱니모자반 주정추출물의 염증억제효과를 Western blot을 통하여 관찰하였는데, 즉 실험에 사용한 각 동물군을 대상으로 조직 용해물을 수득한 후, iNOS와 COX-2에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
분석 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 톱니모자반 주정추출물은 CIA 처리로 유도된 실험동물의 관절조직내 iNOS와 COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다. 이러한 결과는 톱니모자반 주정 추출물이 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 관절조직에서의 항염증 효과를 발휘하는 것을 알 수 있다.
<2-9> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 NF - kB 인산화 억제 효과
CIA 처리에 의한 iNOS와 COX-2 및 전구염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등은 전사인자인 NF-κB에 의하여 조절된다. NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory κB-α (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에서 불활성화 상태로 존재한다. 하지만 콜라겐과 같은 항원을 동물체내에 주입하면 거식세포, 단구세포 등의 면역세포들이 활성화되어 염증 작용을 일으킨다. 이러한 외부 자극에 의하여 세포내 불활성화 상태의 NF-κB는 인산화에 의하여 활성화되어 핵내로 이동하여 염증 관련 단백질의 전사작용에 기여하게 된다.
따라서 본 발명자들은 본 발명의 톱니모자반 주정추출물이 NF-κB가 핵으로 이동하는 것에 대한 영향을 주는지 확인하기 위해, CIA 처리로 염증이 유도된 실험동물에 톱니모자반 주정추출물을 19일 동안 사료와 섞어서 급이하였다. 실험에 사용한 각 동물군을 대상으로 조직 용해물을 수득한 후, NF-κB 인산화에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
분석결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, CIA 처리로 유도된 NF-κB 인산화는 톱니모자반 주정추출물의 급이에 의해 농도의존적으로 감소하였으며, 0.05%의 주정추출물 급이에 의하여 대조구와 비슷한 정도의 인산화 수준을 나타내었다.
따라서 상기 실험을 통해 톱니모자반 주정추출물은 CIA 처리로 유도된 실험동물의 관절조직내 NF-κB의 인산화를 억제함으로써 NF-κB가 핵으로 이동하여 염증성사이토카인 등의 염증인자로 작용하는 NF-κB의 활성화를 차단시킬 수 있다는 것을 실험동물을 통해 확인할 수 있었다.
<2-10> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 MAPKs와 Akt 활성화 억제 효과
다양한 외부자극에 의한 NF-κB 전사인자의 활성화를 통해 iNOS나 COX-2 또는 전구염증성 사이토카인의 발현을 유도하는 과정을 조절하는 분자신호 전달기전은 주요 MAPK 서브 패밀리에 속하는 세 가지 효소들, 즉 extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK), p38 MAPK와 PI3K/Akt들을 들 수 있다. 이에 관절내 단백질의 인산화에 관한 본 발명의 톱니모자반 주정추출물의 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타나 있듯이, CIA 처리로 유도된 실험동물의 염증 반응에서 톱니모자반 주정추출물은 Akt, JNK, p38 MAPK의 인산화(활성화)억제를 보였다. 따라서 상기 결과를 통해 톱니모자반 주정 추출물은 관절조직내 다양한 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 저해한다는 것을 알 수 있었다.
<2-11> 톱니모자반 추출물 처리에 따른 ICAM -1, VCAM -1, MCP -1, MMP -1, 2, 9의 생성억제 효과
CIA로 류마티스 관절염을 유도하면 관절부위의 연골조직을 분해하는 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9의 발현의 증가, 관절 활막조직 내로의 염증세포 침윤을 유도하는 MCP-1의 증가, 그리고 관절의 활막조직에 염증세포의 침윤을 증가시키는 ICAM-1과 VCAM-1 들이 증가한다. 이에 관절 염증부위의 ICAM-1, VCAM-1, MCP-1, MMP-1, 2, 9의 생성억제효과에 관한 본 발명의 톱니모자반 주정추출물의 효과를 확인하기 위해 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 13에 나타나 있듯이, CIA 처리로 유도된 실험동물의 염증 반응에서 톱니모자반 주정추출물은 ICAM-1, VCAM-1, MCP-1, MMP-1, 2, 9의 생성억제효과를 보였다. 따라서 이러한 결과를 통해 톱니모자반 주정 추출물은 관절조직내 다양한 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 저해한다는 것을 알 수 있었다.
< 실험예 3>
다양한 모자반 추출물에서의 관절염 치료 효과 확인
본 발명의 톱니모자반 추출물과 비교하여 다른 모자반 종에서도 관절염 치료 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여 다양한 염증성 사이토카인 중 TNF-α의 발현 정도를 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 류마티스 관절염이 유도된 실험동물군에서는 염증성 사이토카인인 TNF-α가 급격히 증가하였지만, 다양한 모자반 추출물을 처리하였을 때에는 TNF-α의 발현이 감소하였다. 관절염 실험동물군에 참모자반, 괭생이모자반, 왜모자반, 알쏭이모자반, 큰잎모자반, 큰열매모자반, 엔도오모자반 또는 외톨개모자반을 처리하고 TNF-α 발현양을 확인 결과, 몇몇 모자반 추출물에서 모자반 추출물을 처리하지 않은 군에 비하여 TNF-α 발현양이 억제되었으며, 본 발명의 톱니모자반에서는 다른 종의 모자반 추출물에 비해 염증성사이토카인을 확연하게 억제할 수 있음을 알 수 있었다(표 1 참조).
Figure PCTKR2016001371-appb-I000001
따라서, 본 발명에서는 모자반 추출물에 관절염 치료 효과가 있음을 알 수 있었고, 특히 본 발명의 톱니모자반 추출물에서는 다른 모자반 추출물 보다 관절염 치료 효과가 더 월등함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 톱니모자반 추출물은 물 또는 유기용매를 이용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에테르, 벤젠, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산 및 시클로헥산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 톱니모자반 추출물은 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 또는 TNF-a의 활성을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 관절염은 퇴행성 관절염, 류마티스 관절염 또는 루푸스(Lupus) 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 톱니모자반 추출물(Sargassum serratifolium)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 개선용 건강기능식품.
PCT/KR2016/001371 2015-10-30 2016-02-11 톱니모자반 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 WO2017073849A1 (ko)

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