KR20140089315A - 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갯방풍 추출물은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6 또는 TNF-의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 파골세포 분화를 감소시키는 효과가 우수하여 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

Description

갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating ostarthritis comprising Glehnia littoralis}

본 발명은 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.

인체는 약 200 여개의 관절로 이루어져 있다. 관절이란 뼈와 뼈가 만나는 부위이다. 관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록, 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다.

이러한 관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균 감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염, 결합조직의 퇴행성 변화로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.

퇴행성 관절염, 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여, 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형II 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1(interleukin-1) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라, 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.

또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다.

류마티스성 관절염은 만성 전신성 염증 질환으로 대칭성, 다발성의 관절염과 이에 따른 관절의 손상 및 변형이 생기는 질환이다. 류마티스성 관절염에 대한 치료를 받지 않을 경우에는 경과가 불량하여 관절 기능의 장애를 나타내며, 더 지속되면 관절 기능의 장애로 인하여 일상생활에 지장을 받는다. 국내에서는 전인구의 약 1%가 류마티스성 관절염으로 고생하고 있을 것으로 추정되는데, 류마티스성 관절염의 발생률은 남성보다 여성이 3배 정도 높으며 주로 20 ~ 40대에서 발생하는 것으로 알려져 있다.

류마티스성 관절염의 주요 원인이 점차 밝혀지고 있으며, 유전적인 요인과 감염, 호르몬의 이상 등이 원인 인자로 생각되고 있다. 이러한 원인 인자로 인하여 '자가면역' 현상이 생기는데, 자가면역이란, 우리 몸의 면역조절 기능 이상으로 인해 만성 염증이 몸의 여러 부위에서 다발적, 지속적으로 일어나는 현상이다.

한편, 상기 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 신경관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발작, 경직을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.

비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증을 완화시키는 효과가 있으나, 위장장애가 나타나거나 복통을 유발하는 경우도 있기 때문에, 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해 체중 증가나 고혈압 등의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다.

특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고, 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며, 이는 신경관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.

따라서, 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 동안 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제656571호 한국등록특허 제585562호

이에 본 발명자들은 갯방풍(Glehnia littoralis)이 염증성 사이토카인을 억제하고 파골세포를 감소시킨다는 것을 규명함으로써 관절염 또는 골다공증의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다 .

나아가 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 파골세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 메탄올을 이용하여 수득한 메탄올 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6, 인터페론-감마 또는 TNF-α의 활성 및 생성을 감소 또는 억제할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 연골파괴 인자인 MMP1(metalloproteinase 1), MMP3(metalloproteinase 3), MMP13(metalloproteinase 13)의 발현을 억제하여 연골파괴를 감소시키고, 연골재생 인자인 Timp1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 및 Timp3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현은 촉진시켜 연골재생 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관절염은 노인성 관절염, 퇴행성 관절염, 자가면역관절염, 골관절염, 류마티스관절염 및 비만이나 고지혈증을 동반한 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 코엔자임 Q10을 더 포함하는 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 파골세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갯방풍 추출물은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6 또는 TNF-α의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 파골세포 분화를 감소시키는 효과가 우수하여 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.

도 1은 마우스로부터 비장세포를 수득하여 갯방풍 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 인간 전혈에서 분리한 PMBC 세포에 갯방풍 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스 비장세포에 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 농도별로 처리하여 배양 후 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정한 결과이다.
도 4는 인간 전혈에서 분리한 PMBC 세포를 anti-CD3 0.5 g/mL로 배양한 뒤 IL-17과 IL-6의 양을 ELISA 로 측정한 결과이다.
도 5는 갯방풍 추출물에 의한 관절염 억제 효과를 알아보기 위하여 마우스의 골수세포를 MCSF 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화하도록 유도한 뒤 파골세포 분화 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 파골세포 억제 효과를 관찰하기 위하여 파골세포와 관련된 분자를 Real time PCR로 관찰 한 결과이다.
도 7은 6주령 마우스와 35주령 마우스 비장세포에 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양 후 IL-17, IFN-r의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 8은 마우스 비강세포에 anti-CD 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 250 g/mL 농도로 처리하여 배양 후 IL-17, IFN-r와 TNF-α의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9는 인간 전혈세포에서 분리한 PMBC 세포를 anti-CD3 0.5 g/mL에서 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 250 g/mL 농도로 처리하여 48시간 배양 후 IL-17, IL-6, IFN-r의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 10은 갯방풍 추출물에 의한 골관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 골관절염 유도 마우스를 대상으로 통증측정을 한 결과이다.
도 11은 연골파괴 Catabolic pathway 관련 분자와 Anabolic pathway 관련 분자의 발현을 Realtime PCR로 조사한 결과이다.
도 12는 갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물 모델 치료 효과 및 항체 조절 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 갯방풍 추출물에 의한 류마티스 관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)의 관절에 H&E 염색으로 염증세포의 침윤정도 및 Safranin O로 연골의 파괴정도를 관찰한 결과이다.
도 14는 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)에서 얻은 비장세포의 CD-4 세포에서 IL-17 발현양을 FACS로 조사한 결과이다.
도 15는 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)에서 얻은 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 TRAP 양성 세포를 조사한 결과이다.
도 16은 마우스의 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 처리하여 세포를 자극한 후, 코엔자임 Q10 단독처리, 갯방풍 추출물 단독 처리 및 코엔자임 Q10과 갯방풍 추출물 병용처리에 따른 TRAP 양성 세포를 조사한 결과이다.

본 발명은 갯방풍(Glehnia littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.

본 발명자들은 관절염 치료를 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 갯방풍에 주목하였는데 갯방풍은 바닷가 모래땅에서 잘 자라는 산형과의 풀로 바닷가의 모래땅에서 자란다. 전체에 흰색 털이 나고 뿌리는 모래 속에 묻히며 높이는 20cm 정도이다. 잎자루는 길고 잎은 깃꼴겹잎으로 삼각형이나 달걀 모양 삼각형이다. 작은 잎은 타원형 또는 달걀 모양 원형으로 두껍고 윤이 나며 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 흰색으로 6 ~ 7월에 피는 것으로 알려져 있다.

생약으로 쓰이는 해방풍은 뿌리를 말린 것이며 한방에서는 발한해열진통약으로 쓰이고, 유주성 다발성 신경통, 건위 강장의 특효약이기도 하며 매일 먹으면 중풍에 걸리지 않는다. 또한, 어지럼증, 두통, 눈에서 괜히 눈물이 줄줄 흘러내릴 때, 사지관절이 아프고 경련이 날 때도 효과가 있다. 나아가 여성의 냉증, 대하증, 부정기적 자궁 출혈에도 좋고 발한 작용이 강해서 감기에도 효과가 있다고 알려져 있다.

그러나, 종래에는 갯방풍을 관절염의 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다.

따라서 본 발명에서는 갯방풍 추출물이 관절염의 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였으며, 특히 갯방풍 추출물이 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6, 인터페론 감마 또는 TNF-α를 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 파골세포 분화를 감소시키는 작용도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 마우스 비장세포와 인간 PBMC 세포를 대상으로 MTT분석을 한 결과 세포독성이 관찰되지 않았다(도 1 및 도 2 참조).

또한 본 발명자들은 다른 일실시예를 통해 마우스 비장세포를 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였고, 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 Th17과 Th1 타입의 사이토카인인 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정한 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17과 TNF alpha 2가지 사이토카인 모두 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었으며(도 3 참조), 인간 전혈에서 분리한 PBMC 세포에서도 IL-17과 IL-6 생성이 감소된다는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

나아가 본 발명자들은 골수 마크로파지의 파골세포로의 분화에 대한 갯방풍의 영향을 확인 한 결과, M-CSF 및 RANKL에 의해 유도된 TRAP 양성인 다핵 파골세포의 형성은 갯방풍 추출물을 10 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비하여 절반정도까지 감소되었으며, 100 ug/ml 및 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한 파골세포 억제 실험을 진행 한 세포에서 얻은 RNA에서 파골세포와 관련된 분자인 TRAP, MMP9, CTR 및 NFATc1 을 Real time PCR 로 분석 한 결과 갯방풍 추출물의 농도별로 감소됨을 확인 하였고, 특히 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 관찰 할 수 있었으며(도 6 참조), 연골파괴와 관련된 인자들에 대한 발현에도 갯방풍 추출물이 영향을 미치는지 조사한 결과, 연골파괴와 관련이 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13의 발현은 갯방풍에 의해 억제되는 것으로 나타나나 반면, 연골재생에 관련된 Anabolic pathway 관련 분자인 TIMP1, TIMP3의 발현은 갯방풍에 의해 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 11 참조).

또한, 본 발명자들은 어린 마우스와 노령 마우스를 대상으로 마우스의 비장 세포를 분리하여 anti-CD3 또는 LPS로 세포를 자극시켜 염증성 사이토카인의 생성을 촉진시킨 후, 이들 세포에 갯방풍 추출물을 처리한 다음 염증성 사이토카인의 생성 정도를 분석하였는데, 그 결과, 갯방풍 추출물을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것으로 나타났다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 갯방풍 추출물이 노인성 관절염의 치료에도 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).

나아가 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물이 파골세포 이상으로 유발되는 골다공증도 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었는데, 특히 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스로부터 골수세포를 얻은 후, 골수세포에 RANKL 또는 M-CSF를 처리하고 이후 갯방풍 추출물을 투여한 경우, 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 파골세포 인자인 TRAP 양성 세포수가 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 15 참조).

그러므로 본 발명자들은 하기 본 발명의 실시예에서 입증된 실험 결과를 토대로 본 발명의 갯방풍 추출물이 관절염을 치료하기 위한 약학적 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

구체적으로 본 발명의 갯방풍 추출물이 적용될 수 있는 상기 관절염으로는 이에 제한되지는 않으나, 노인성 관절염, 퇴행성 관절염, 자가면역관절염, 골관절염, 류마티스관절염 및 비만이나 고지혈증을 동반한 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

나아가 이 외에도 본 발명의 갯방풍 추출물은 면역과 관련된 염증제어 기능이 있고, 미토콘드리아의 기능을 회복하는 작용을 하여 미토콘드리아 관련 증후군을 치료할 수 있고, 자가면역질환을 예방 및 치료할 수 있으며, 골다공증을 예방 및 치료할 수 있다.

참고로 골다공증은 골대사 질환 중 하나로서, 골 대사는 골 형성을 담당하는 조골세포와 골 흡수를 담당하는 파골세포의 작용으로 이루어져 있으며, 이들 세포의 기능이 균형을 이루어 항상성을 유지한다. 그러나 조골세포 활성이 저하되거나 파골세포 활성이 증가되면 골밀도가 감소하여 골다공증이 유발될 수 있다. 골다공증의 유발 요인으로는 여성의 폐경, 갑상선 기능항진, 당뇨병, 스트레스, 흡연 및 운동 부족, 신체적 노화와 glucocorticoid 계열 약물의 복용 등이 알려져 있다. 또한, 파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화되는데, 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다. 분화한 파골세포는 NF-B, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt MITF 활성화등을 통하여 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase) cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진하게 된다.

따라서 골다공증과 같은 골질환의 치료를 위해서는 파골세포의 분화를 억제하거나 파골세포 특이 단백질의 발현을 억제하는 물질이 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서 본원의 갯방풍 추출물은 파골세포의 분화를 억제할 수 있고 TRAP 양성 세포수를 감소시킬 수 있어 골다공증의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명에서는 보다 효과적인 골다공증 치료를 위해 갯방풍 추출물과 함께 병용할 수 있는 물질로서 코엔자임 Q10을 함께 사용할 수 있다는 것 규명하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스의 골수세포를 대상으로 M-CSF와 RANKL을 이용하여 세포를 자극시킨 후, 갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10을 함께 처리한 결과, 이들을 각각 처리한 군에 비해 함께 처리한 군이 매우 효과적으로 TRAP 양성 세포수가 감소되는 것으로 나타났다.

또한 코엔자임 Q10을 갯방풍 추출물과 함께 사용할 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 사용하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 함께 사용하는 것이 치료에 효과적임을 알 수 있었다.

이 외에도 본 발명은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 골수세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공한다.

한편, 본 발명에 따른 갯방풍(Glehnia littoralis)은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된추출물은 적절한 용매를 이용하여 갯방풍으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 갯방풍의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.

갯방풍으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 갯방풍 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 갯방풍 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 갯방풍 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

이러한 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 갯방풍 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 갯방풍 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 갯방풍 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료를 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 갯방풍 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

통계처리

실험결과는 평균 표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

<실시예 1>

갯방풍 추출물의 제조

본 실시예에 사용한 갯방풍 (Glehnia littoralis)은 2012년 9월 강릉에서 직접 채집하였으며 응달에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25 에서 보관하였다가 해빙 후, 잘게 잘랐으며 80% 메탄올(MeOH)로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축함으로써 갯방풍의 메탄올 가용성 분획(즉, 추출물)을 수득하였다.

<실험예 1>

MTT 분석

<1-1> 마우스 비장세포

갯방풍 추출물의 관절염 치료 효과 여부를 알아보기 위하여 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였으며, 37, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 그리고 100 g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 마우스의 비장세포를 anti-dinitrophenyl(DNP) IgE(0.1 g/mL)로 22시간 동안 반응시키고 HSA(1 g/mL)로 반응시키기 15분 전에 37에서 갯방풍 추출물을 처리하였다. 또한, 갯방풍 추출물의 세포독성 능력을 관찰하기 위해, Mosmann의 방법에 따라 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 확인하였다. 간략하게 말하면, 마우스의 비장세포에 갯방풍 추출물을 24시간 동안 반응시킨 후 MTT stock solution(5 mg/mL)을 더해 37, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 96 well multi plates에 acidic isopropanol을 더해 SpectraCount(Packard Instrument Co. Downers, III., Meriden, CT, USA)을 사용하여 560 nm에서 읽었다.

그 결과, 갯방풍 추출물의 가장 높은 농도인 500 g/mL를 처리하였을 때에도 세포독성이 관찰되지 않았다(도 1 참조).

<1-2> 인간 PBMC 세포

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)에 37, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 그리고 100 g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 마우스의 비장세포를 anti-dinitrophenyl(DNP) IgE(0.1 g/mL)로 22시간 동안 반응시키고 HSA(1 g/mL)로 반응시키기 15분 전에 37에서 갯방풍 추출물을 처리하였다. 또한, 갯방풍 추출물의 세포독성 능력을 관찰하기 위해, Mosmann의 방법에 따라 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 확인하였다. 간략하게 말하면, 마우스의 비장세포에 갯방풍 추출물을 24시간 동안 반응시킨 후 MTT stock solution(5 mg/mL)을 더해 37, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 96 well multi plates에 acidic isopropanol을 더해 SpectraCount(Packard Instrument Co. Downers, III., Meriden, CT, USA)을 사용하여 560 nm에서 읽었다.

그 결과, 갯방풍 추출물의 가장 높은 농도인 500 g/mL를 처리하였을 때에도 세포독성이 관찰되지 않았다(도 2 참조).

<실험예 2>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 IL-17 생성억제 활성 분석

본 발명자들은 갯방풍 메탄올 추출물이 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 다음과 같은 방법으로 조사하였다.

<2-1> 마우스 비장세포

먼저, 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였는데, 즉, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심 분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 Th17과 Th1 타입의 사이토카인인 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17과 TNF alpha 2가지 사이토카인 모두 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었으며, 갯방풍 추출물을 25 ug/ml 처리하였을 때에도 염증성 사이토카인 억제 활성이 커 적은 용량을 처리하였을 때에도 효과가 큼을 알 수 있었다(도 3 참조).

<2-2> 인간 PBMC 세포

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell) 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 0.5 g/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 사이토카인인 IL-17과 IL-6의 양을 ELISA 로 측정하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 갯방풍 추출물에 의해 확연히 억제되는 것으로 나타났으며, 염증성 사이토카인인 IL-6의 경우는 갯방풍 추출물의 농도에 의존적으로 IL-6의 생성이 감소되는 것으로 나타났다(도 4 참조).

<실험예 3>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 관절염 억제 효과 분석

파골세포 형성에 대한 갯방풍 추출물의 영향은 이미 공지된 방법을 약간 수정하여 마우스 골수 세포를 MCSF(macrophage colony-stimulating factor) 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화하도록 유도하여 확인되었다(Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67). 골수세포는 6주령의 DBA/1J 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 준비하였고, 37에서 8구 챔버 슬라이드(3×10⁵세포/구; Nalge Nunc International, Naperville, IL)에 M-CSF(30 ng/ml:R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재하에서 정치되었다. 3일 후에 림프구를 포함한 비접착성 세포를 제거하고, 접착성 파골세포 전구세포를 M-CSF(30 ng/ml) 및 RANKL(30 ng/ml; Strathmann, Hamburg, Germany)의 존재하에서 추가로 4일 동안 배양하여 파골세포를 생산하였다. 배지는 M-CSF 및 RANKL로의 정치 동안에 1차례 교환하였다. 세포를 고정하고 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)에 대하여 염색 키트(sigma)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 실시하였다. 각 챔버에서 현미경으로 (40배율)관찰한 결과 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP 양성 다핵세포는 파골세포로서 계수되었다(Sugatani. et al. 2003,J. Cell. biochem. 90, 59-67).

갯방풍 추출물의 세포독성이 골수세포와 분화된 파골세포에서 측정되었다. 골수세포(1×10⁵ 세포/구)를 9구판에 접종하였고 24시간 동안 정치하였다. 다양한 농도의 갯방풍 추출물을 첨가한 후 48시간 동안 정치하고, 생존한 세포를 수용성 테트라졸리움 염 WST-8(Cell Counting Kit-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan)로 제조업자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 분화된 파골세포에서 갯방풍 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 앞서 설명된 바와 같이 골수세포를 파골세포로 분화하고, M-CSF 및 RANKL의 존재하에서 다양한 농도의 갯방풍 추출물과 48시간 동안 정치하였다. 세포를 TRAP에 대하여 염색하고 TRAP 양성인 다핵 세포를 계수하였다.

파골세포가 관절염 관절의 뼈 파괴에서 상당한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 골수 마크로파지의 파골세포로의 분화에 대한 갯방풍 추출물의 영향을 확인하였다. M-CSF 및 RANKL에 의해 유도된 TRAP 양성인 다핵 파골세포의 형성은 갯방풍 추출물을 10 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비하여 절반정도까지 감소되었으며, 100 ug/ml 및 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한 파골세포 억제 실험을 진행 한 세포에서 얻은 RNA에서 파골세포와 관련된 분자인 TRAP, MMP9, CTR, NFATc1 을 Real time PCR 로 분석 한 결과 갯방풍 추출물의 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였고, 특히 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 관찰 할 수 있었다.(도 6 참조).

<실험예 4>

본 발명의 갯방풍 추출물에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 분석

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 염증성 사이토카인 억제 효과가 있는지를 다음과 같은 실험을 통해 조사하였다.

<4-1> young 마우스와 old 마우스의 비장세포를 대상으로 한 염증성 사이토카인 억제 분석

먼저, 6주령의 young 마우스와 35주령의 old 마우스로부터 비장(spleen) 세포를 수득하였는데, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드(teasing slide)를 이용하여 비장조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장 내의 적혈구를 제거하였다.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 48시간 배양하였고, 배양한 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 각 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 Th1 타입의 사이토카인인 IFN-r와 IL-6의 양을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 갯방풍 추출물을 처리한 군의 경우, IL-17, IFN-r와 IL-6 3가지 모두 유의성 있게 old 와 young 마우스에서 감소하는 것으로 나타났다(도 7 참조). 따라서 본 발명의 갯방풍 추출물은 young 마우스 뿐만 아니라 old 마우스에서도 염증성 사이토카인 억제효과가 뛰어나므로 노인성 관절염의 치료에도 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 질병 마우스(관절염 유발 마우스)로부터 비장(spleen)세포를 수득하였으며, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드(teasing slide)를 이용하여 비장조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장 내의 적혈구를 제거하였다. 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였다. 상기 세포에 갯방풍 추출물을 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 Th1 타입의 사이토카인인 IFN-r와 TNF alpha의 양을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17, IFN-r와 TNF alpha 3가지 모두 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다(도 8 참조).

<4-2> 인간 PBMC 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 억제효과

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell) 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 0.5 g/mL로 코팅(coating) 처리된 48 웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 250 ug/ml, 농도로 처리하여 48시간 배양 후 상등액(supernatant)에서 사이토카인인 IL-17과 IL-6, IFN-r의 양을 ELISA 로 측정하였다.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 갯방풍 추출물의 처리에 의해 확연히 생성량이 억제되는 것으로 나타났으며(약 10배 이상), 염증성 사이토카인인 IL-6과 IFN-r의 경우도 갯방풍 추출물 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다(도 9 참조).

<실험예 5>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 골관절염 치료 효과 분석

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 골관절염 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위하여 퇴행성 골관절염 유도 모델 마우스를 이용하여 갯방풍 추출물의 골관절염 개선도를 조사하였다.

퇴행성 골관절염 유도 모델 마우스에 갯방풍 추출물(GLE) 100 mg/kg을 투여하였으며, 양성대조군으로는 골관절염의 치료 약물로 사용되고 있는 Celecoxib를 5 mg/kg를 경구 투여한 군을 사용하였고 음성대조군으로는 GLE를 녹일때 사용한 Saline을 경구투여한 군을 사용하였다. 퇴행성 골관절염의 정도를 파악하기 위한 방법으로 Dynamic plantat aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 통증측정을 진행하였고, 기계의 통증측정 방법은 측정 기계위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 측정할 실험동물을 넣은 후 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러 주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(g)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 기입하여 통증 측정 그래프를 그렸다.

그 결과, 본 발명의 갯방풍 추출물을 주입한 군이 다른 군에 비해 골관절염 개선 정도가 가장 우수한 것으로 나타났고 이러한 개선 및 치료 정도는 종래 골관절염 치료제로 사용되고 있는 Celecoxib보다 더 우수한 효과임을 알 수 있었고, 특히 본 발명의 갯방풍 추출물은 투여 후 빠른 시간 안에(5일 만에) 통증의 정도가 50% 이상으로 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(도 10 참조).

<실험예 6>

THP-1 세포에서 갯방풍에 의한 동화(catabolic) 및 이화(catabolic) 경로분석

본 발명자들은 연골파괴와 관련 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13와 Anabolic pathway 관련 분자인 TIMP1, TIMP3의 발현에 본 발명의 갯방풍 추출물이 영향을 주는지 Realtime PCR로 조사하였다.

시험관내 실험으로 인간 유래 chondrocyte를 24시간 동안 전처리하여 세포 안정화를 시킨 후 IL-1b를 자극하여 세포의 활성을 촉진시킴과 동시에 갯방풍을 단독 처리한 후 24시간 배양한 다음 세포로부터 RNA를 수득하고 MMP1, MMP3, MMP13, TIMP1, TIMP3의 발현을 real time PCR로 관찰하였다. 이때 대조군으로는 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

그 결과, 갯방풍 추출물을 처리한 군의 경우, MMP1, MMP3, MMP13의 발현이 현저하게 감소되어 있었고 반면 연골 재상과 관련된 인자인 Timp1, Timp3의 발현은 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 11 참조).

<실험예 7>

본 발명의 갯방풍 추출물의 류마티스 관절염 치료 효과

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 류마티스 관절염 치료 효과를 확인하기 위해 IL-Ra가 결여되어 자연 발생적으로 관절염이 생기는 류마티스 관절염 지수가 6점인 12주령의 IL-1Rako 마우스를 사용하여 주 3회 갯방풍 추출물을 경구 섭취하여 관절염 치료효과를 다음과 같은 방법으로 조사하였다.

<7-1> 갯방풍에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인

상기 준비한 류마티스 관절염 동물 모델에 갯방풍을 투여하고 5주간 자가면역성 관절염 증상을 관찰하였다.

일반적인 관절염 유도 모델이 아닌 자연 발생적으로 관절염이 이미 생겨있는 관절염 모델이기 때문에 관절염의 갯방풍에 의한 치료활성이 큰 것으로 볼 수 있다(도 12 참조).

<7-2> 갯방풍에 의한 체액성 면역반응(Humoral response) 분석

갯방풍에 의한 류마티스관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응(humoral respone)을 관찰하기 위해서 갯방풍 투여 후 5주가 되었을 때 마우스를 치사시켜 혈청에서 Total IgG, IgG2a의 발현양을 ELISA를 통해 분석하였다. Total IgG와 Th1 response에 관여하는 IgG2a 모두 갯방풍 투여군에서 모두 감소되어 있는 것으로 확인 되었다(도 12 참조).

<7-3> 갯방풍에 의한 류마티스 관절염 치료 효과 조사

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 조직학적 소견으로 관찰하고자 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여 한 후 마우스를 치사 시켜 관절을 얻은 후, H&E 염색으로 염증세포의 침윤정도를 관찰하였다.

그 결과, 갯방풍 투여군에서 염증세포가 감소된 것을 확인하였다(도 13 참조).

또한, Safranin O로 연골의 파괴정도를 관찰하였고, 그 결과 갯방풍 투여군에서는 연골이 유지되어 있어 염색이 되었지만 대조군의 관절에서는 연골이 다 파괴되어 염색이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조).

<7-4> 갯방풍에 의한 IL-1Rako 마우스의 splenocyte에서 Th17 세포의 억제효과 확인

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 확인하기 위해 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여한 후 마우스를 치사시켜 비장세포를 얻었다. 획득한 비장세포의 CD4 세포에서 IL-17의 발현양을 FACS로 조사한 결과, 갯방풍을 투여한 마우스에서 병인 세포인 Th17 세포의 발현이 유의하게 감소된 것을 관찰 할 수 있었다(도 14 참조).

<7-5> 갯방풍에 의한 파골세포 분화 조절능 관찰

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하기 위해 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여 한 후 마우스를 치사 시켜 마우스의 골수세포를 얻었다. 각 군의 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 TRAP 양성 세포를 조사한 결과, TRAP 양성 세포가 갯방풍 투여군에서 감소되어 있음을 관찰 할 수 있었다(도 15 참조).

<실험예 8>

갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10 복합처리에 따른 파골세포 분화 억제

나아가 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물에 의한 파골세포 분화 억제효과를 더욱 향상시키고자 복합처리할 수 있는 물질을 찾던 중, 갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10을 함께 처리하였을 때 파골세포 인자인 TRAP의 양성 표지 세포수의 정도를 측정하였다.

즉 이를 위해 상기 실험예 7에서 사용한 세포인 골수세포에 M-CSF와 RANKL를 처리하여 세포를 자극시킨 후, 각 세포를 대상으로 코엔자임 Q10을 단독처리하고(5 uM), 다른 세포에는 갯방풍 추출물을 단독처리하고(250 ug/ml), 다른 군에는 코엔자임 Q10(5 uM)과 갯방풍 추출물(250 ug/ml)을 병용 처리한 다음, TRAP의 양성 표지된 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 코엔자임 Q10(5 uM)과 갯방풍 추출물(250 ug/ml)을 단독 처리한 군의 경우, 이들을 처리하지 않은 군에 비해 TRAP의 양성 표지세포수가 감소한 것으로 나타났지만, 이들을 병용 처리한 군의 경우에서는 TRAP의 양성 표지된 세포수가 거의 관찰되지 않았다.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물을 코엔자임 Q10과 함께 사용할 경우, 매우 효과적으로 파골세포 분화를 억제할 수 있으며 따라서 파골세포 분화로 인한 골질환인 골다공증과 같은 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 메탄올을 이용하여 수득한 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6, 인터페론-감마 또는 TNF-α의 활성 및 생성을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 연골파괴 인자인 MMP1(metalloproteinase 1), MMP3(metalloproteinase 3), MMP13(metalloproteinase 13)의 발현을 억제하여 연골파괴를 감소시키고, 연골재생 인자인 Timp1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 및 Timp3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현은 촉진시켜 연골재생 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 관절염은 노인성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 자가면역관절염, 류마티스관절염 및 비만이나 고지혈증을 동반한 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제1항에 있어서,
   상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   코엔자임 Q10을 더 포함하는 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    코엔자임 Q10을 더 포함하는 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
12. 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 골수세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법.
13. 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    

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