KR100946997B1

KR100946997B1 - 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR100946997B1
Application number: KR1020070121947A
Authority: KR
Inventors: 유창연; 이강열; 이찬옥; 김명조
Original assignee: 강원도 인제군
Priority date: 2007-11-28
Filing date: 2007-11-28
Publication date: 2010-03-10
Also published as: KR20090055168A

Abstract

본 발명은 황태(Theragra chalcogramma) 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 본 발명의 황태의 가용성 단백질에 효소를 처리하여 얻은 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 과산화지질 형성 억제 활성, 앤지오텐신 전환 효소(angiotensin-converting enzyme, ACE) 저해 활성 또는 프로테아제(protease) 활성을 나타냄으로써 항산화제 또는 고혈압 치료제에 유용하게 이용될 수 있다.

황태, 가수분해물, 항산화 활성, ACE 저해 활성, 프로테아제 활성

Description

황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물{A composition containings hydrolysates, second hydrolysates or isolated active peptides of Theragra chalcogramma as an active ingredient}

본 발명은 황태(Theragra chalcogramma) 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 고혈압 치료제에 관한 것이다.

현재 기능성 식품은 영양학적 요구와 건강학적 요구를 만족하는 생산품을 얻고자하는 두 개의 명확한 명제를 가지고 있다. 건강학적 요구는 여러 가지 임상적 질병에 의한 위험을 줄이고 신체의 기능을 향상시키도록 하는 것을 반영하여야 한다. 영양적으로 중요하며 다른 생리활성을 가진 물질로부터 얻는 기능성 식품은 생선 및 '황태'와 같이 어류를 가공한 산물을 통해서 얻을 수 있다. 이들은 생리학적으로 중요한 비타민 D 또는 칼슘(bone health promotein)을 충당하여 주며 이 들로부터 얻을 수 있는 지방산은 혈관계질환에 걸릴 확률을 줄여준다. 이러한 지방산은 염증, 체중조절, 대사적 질환, 및 대장암 등과 같은 질병에 대하여 예방 또는 치료적인 측면에 사용되어질 수 있으나 보다 과학적인 근거를 강화할 필요성이 있다. 이들로부터 얻을 수 있는 단백질들은 그들 자체가 매우 높은 소화능력(digestibility)을 가지고 있기 때문에 대장에 대하여 매우 높은 효과를 가질 수 있으며 다른 효소들에 의한 발효(fermentation)를 줄일 수 있다. 또한 생물학적으로 활성을 가지는 펩티드들은 더욱 높은 효과를 가지는 것으로 보여진다. 또한, 이들은 타우린(taurine), 키토산(chitosan), 글루코사민(glucosamin) 및 인지질(pholipid)과 같은 많은 생물학적 활성을 가진 물질을 함유하고 있으므로 기능성 식품을 제조하기 위한 생리활성재료로서 잠재성을 가진다고 할 수 있다.

황태는 내장을 빼낸 명태를 영하 10℃ 이하의 고랭지에서 낮에는 녹이고 밤에는 얼리는 과정을 3개월 내지 5개월간 반복하여 명태로부터 서서히 수분을 제거함으로써 건조시킨다. 이렇게 수개월간의 건조 과정을 거쳐 제조된 황태는 동의보감에도 각종 해독작용이 뛰어난 것으로 기재되어 있는 우리 몸에 좋은 식품으로써, 특히 숙취 해독 효과나 연탄가스 중독의 해독, 두통 등에 대한 진통 효과가 우수한 것으로 알려져 있다. 또한 황태는 콜레스테롤이 거의 없고 영양가가 높아 신체 각 기관이 신진대사를 활성화하여 머리를 맑게 하고 특히 단백질이 56%나 되는 고단백 영양식품으로 남녀노소 누구나 즐겨 먹을 수 있는 식품이다. 또한, 여성들의 다이어트와 미용에도 효과가 있으며 지방 함량이 2%로 다른 생선에 비해 극히 적으며, 메티오닌 등 아미노산이 풍부해 해장용으로 쓰이며 그 국물은 일산화탄소 중독까지 중화시키는 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 황태는 맛과 영양이 뛰어날 뿐만 아니라, 각종 해독효과를 갖추고 있다.

하이드록시프롤린(hydroxyproline)은 체내에서 프롤린(proline)의 수화로 합성되는 것으로 DNA에 코딩된 아미노산은 아니며 프롤린은 교원질을 이루는 콜라겐의 주요 성분으로 콜라겐 삼중 나선 구조를 수소 결합으로 안정화시키는데 중요한 역할을 한다. 콜라겐 외에서는 하이드록시프롤린은 거의 존재하지 않는다(Miller M. et. al., Journal of Polymer Science symposium. 54: 171-200, 1976). 콜라겐이라는 것은 원래 피부와 힘줄, 뼈, 연골에서 연결조직을 구성하는 단백질로서 역기능을 향상시키고, 세포의 재생작용을 촉진시켜 관절을 튼튼하게 해주며, 피부의 신진대사 활성화 및 보습력 유지를 통하여 피부미용에 탁월한 효과를 나타낸다. 비타민C는 콜라겐(Collagen) 생합성과 유지시 필수적인 아미노산인 하이드록시프롤린과 하이드록시라이신(hydroxylycine)의 하이드록시(Hydroxy)기의 제공자로서 작용을 하고 있기 때문에 비타민(vitamine) C와 하이드록시프롤린을 화장품에 첨가제로 사용하고 있다(Campbell M.K. et. al., Biochemistry Fifth edition . LifeScience p.89, p436, 2006). 실제로 일본의 도키와제약은 이러한 하이드록시프롤린을 아세틸화(acetyl)화하여 새로운 제형을 만듦으로써 아세틸 히드록시프롤린 함유 크림을 개발하였고 피부의 노화를 억제하는데 괄목할만한 효과가 눈에 띄었음을 시사하였으며(JCN network Tokiwa Pharmaceutical Confirms Anti-aging Property of Acetyl Hydroxyproline-based Cream Apr 19, 2005; http://www.japancorp.net/Article.Asp?Art_ID=9881) 이러한 것은 황태를 이용한 화장품의 개발 가능성을 시사한다고 할 수 있다. 단백질을 구성하는 모든 아미노산은 프롤린과 하이드록시프롤린을 제외하고는 모두 α- 아미노산이다. 프롤린과 하이드록시프롤린은 아미노기의 니트로젠(nitrogen)이 5번째 고리에 보완적으로 결합된 아미노산이다. 아미노산 사이의 차이점은 R 기의 성질에 있다(Campbell M.K. et. al., Biochemistry Fifth edition . LifeScience p.89, p436, 2006).

과산화지질은 불포화 지방산이 산소를 흡수하여 산화된 물질로서 이때 발생되는 유리기는 인체에서 맹독성 물질로 작용하여 몸 안에 쌓이면 노화가 빨라지고, 동맥 경화 또는 간질환이 생긴다. 과산화지질의 작용은 여러가지가 있으며 대표적으로 다음과 같다. 유리기의 연쇄반응을 일으켜 세포막과 생체막의 구조장애를 가져오므로 암 및 여러 성인병의 원인물질로 작용하고 단백질 변성을 일으킨다. 또한, 효소 또는 비타민과 결합하여 이들의 활성을 저하시키고, 신진대사에 중요한 알파 지단백(알파-Lipoprotein) 활성을 저하시킨다. 또한, 혈소판을 이상 응집시켜 혈전을 형성시키고 노인성 치매, 기억력 감퇴를 초래한다. 또한, 주름살, 기미, 주근깨, 노인성 반점(Lipofuscin) 등을 초래한다. 아울러, 적혈구를 파괴하여 용혈 현상을 초래한다. 이런 과산화지질의 생성을 방지하는 물질을 항산화제라고 한다(Pannala AS, et. al., Free Radie Biol Med 24(4): 594-606, 1998).

ACE(angiotensin-converting enzyme)는 혈압상승과 관련된 기전의 일부로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 불활성 형인 앤지오텐신(angiotensin) Ⅰ의 C 말단에 존재하는 히스티딘-류신(His-Leu)을 절단하여 앤지오텐신(angiotensin) Ⅱ를 생성하고 혈압을 감소시키는 브래디키닌(bradykinin)을 불활성화시키는 효소이다(Skeggs LT, et. al., J. Exp. Med. 103: 295-299, 1956). ACE 저해재는 ACE의 작용을 저해함으로써 앤지오텐신 Ⅱ를 생성을 저해하고 알도 스테론(aldosteron) 분비 감소, 혈관 확장제인 브래디키닌의 증가 등의 과정을 통하여 신장혈관을 확장시켜 나트륨(sodium)의 배설을 촉진함으로써 혈압을 낮추어주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Lieberman J., Am. J. Med. 59: 365-372, 1975). 1960년 Bothrops jararaca 독사의 독에서 BPFs가 발견되었고 1977년 이후 ACE의 강력한 저해제인 캡토프릴(captopril), 엔날라프롤(Enalaprol), 베나제프릴(Benazepril) 등 수종의 ACE 저해제가 상품화되어 고혈압 치료제로서 이용되고 있다. 그러나 현재 사용되는 합성 ACE 차단제는 브래디키닌의 증가의 과정에서 발생되는 기침과 같은 흔한 부작용으로 사용이 제한되고 있는 실정이다. 식품을 통한 대체 의약적 측면에서의 ACE 저해제로는 단백질 가수분해물, C 말단에 프롤린(proline)을 가지는 펩티드, 감귤류 및 과실류의 플라보노이드(flavonoid) 배당체류 등이 소재로서 평가되어지고 있는데 이들은 일반 합성 의약품보다 그 활성이 매우 낮은 수준에 머무르고 있으나 천연물이라는 측면에서 매우 높은 안전성을 가지고 있다(Actis-Goretta L, et.al., FEBS Lett. 555: 597-600, 2003).

ACE(Agiotensin-converting enzyme) 저해제(inhobitor)는 순환기계 질병의 원인이 되는 동시에 뇌출혈, 심장병, 신장병 등과 합병증이 나타날 경우 치사율이 매우 높은 고혈압을 직접적으로 억제할 수 있는 물질이다. ACE 활성을 억제하는 인자들은 대부분 저분자의 물질이며 이는 열에 안정하고 체내에 흡수가 용이한 것이 일반적인 특징이라고 할 수 있다. 이들은 기존의 합성 혈압 강하제에 비해 낮은 활성을 가지고 있지만 섭취량이 대량인 측면과 식품이라는 안정적인 측면에서 그 유용성이 높다고 할 수 있다. 이러한 식품 내의 ACE 활성 억제 인자는 다양한 동물, 식물 및 어류의 단백질 가수분해물에 존재한다(Wagner H, et. al., Pharm Pharmacol Letters 1: 15-18, 1991).

이에 본 발명자들은 황태의 가용성 단백질(soluble protein)로부터 효소를 처리하여 얻은 가수분해물, 2차 가수분해물 및 이로부터 분리한 활성 펩티드(peptide)가 과산화지질 형성 억제 활성, ACE(angiotensin-converting enzyme) 저해 활성 또는 프로테아제(protease) 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 고혈압 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황태 가용성 단백질에 효소를 처리하여 얻은 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 황태 가수분해물에 추가적으로 효소를 처리하여 얻은 2차 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 나타내는 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2로 나타내는 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 황태 가용성 단백질에 효소를 처리하여 얻은 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 황태 가수분해물에 추가적으로 효소를 처리하여 얻은 2차 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 2차 가수분해물을 크기배제 세파덱스(Sepahadex) 컬럼 크로마토그래피에서 0.01M 인산나트륨 완충용액에 NaCl 용액의 농도를 0.5에서 3.5M까지 증가시키는 농도구배를 적용하여 0.5M NaCl이 80 ~ 100 ㎖에서 얻을 수 있는 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 황태의 가용성 단백질에 효소를 처리하여 얻은 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 과산화지질 형성 억제 활성, ACE(angiotensin-converting enzyme) 저해 활성 또는 프로테아제(protease) 활성을 나타냄으로써 항산화제 또는 고혈압 치료제에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 하기의 단계들을 포함하는 분리정제 방법에 의해 제조된다.

1) 황태(Theragra chalcogramma)로부터 가용성 단백질(souble protein)을 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 가용성 단백질에 효소를 가하여 가수분해물을 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 가수분해물에 추가적으로 효소를 가하여 2차 가수분해물을 제조하는 단계; 및

4) 단계 3)의 2차 가수분해물에 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 활성 펩티드를 분리하는 단계,

상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 황태는 생산한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 황태를 5 ~ 20 mm로 분쇄하여 사용하는 것이 바람직하고 10 ~ 15 mm로 분쇄하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 분쇄된 황태에 증류수를 혼합하는데, 이때 증류수는 황태와 동일한 양을 사용하는 것이 바람직하며, 온도는 15 ~ 30 ℃인 것이 바람직하고 20 ~ 25 ℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 혼합물은 믹서를 통해서 고압균질화(homogenization)하는데, 이때 믹서의 온도는 75 ~ 95 ℃인 것이 바람직하고 80 ~ 90 ℃인 것이 더욱 바람직하며, 시간은 40 ~ 80분인 것이 바람직하고 50 ~ 70분인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 균질화한 혼합물을 원심분리한 후 분리된 3개의 층 중에서 중간층(liquid middle layer)을 분리한 후 동결건조하여 가용성 단백질을 수득할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 2)의 효소는 펩신(Pepsin)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 가용성 단백질에 펩신(Pepsin)을 단백질 함량의 0.5 ~ 2%를 첨가하는 것이 바람직하나 1%를 첨가하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 온도는 30 ~ 40 ℃인 것이 바람직하고 37 ℃인 것이 더욱 바람직하며, pH는 2 ~ 4인 것이 바람직하고 3인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 진탕항온조에서 30분 ~ 2시간 동안 반응시키는 것이 바람직하고 1시간 동안 반응시키는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 효소반응의 정지는 끓는 물(100 ℃)에서 중탕하여 효소를 실활시킨 후 원심분리 및 여과하여 황태 가수분해물을 제조할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 효소는 알카라제(Alacase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로나제 E(Pronase E) 또는 트립신(trypsin)으로 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 효소들은 온도가 30 ~ 60 ℃인 것이 더욱 바람직하고 35 ~ 55 ℃인 것이 더욱 바람직하며, pH는 7 ~ 8인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스(Sephadex), LH-20, ODS(octadecylsilane) 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성화합물을 분리 및 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.

본 발명에서는 황태의 2차 가수분해물을 세파덱스(Sephadex) 컬럼을 사용한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 분리하였고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하 여 확인하였다. 상기 2차 가수분해물을 여과한 후 0.1M NaCl을 함유한 0.01M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)로 평형화시킨 세파덱스(Sephadex) G-50을 사용한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하였다. 각 분획을 크기에 따라 세파덱스(Sephadex) 레진(resin)의 농도를 달리하여 크로마토그래피(chromatography) 과정을 수행하였다. 2차 가수분해물을 컬럼 도입하고 0.01M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)에 NaCl 용액의 농도를 0.5에서 3.5M까지 증가시키면서(0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.5 M NaCl) 용출시켰으며 각각의 용출된 분획물을 대상으로 하여 페놀과 황산으로 반응시켜 양성반응이 나오지 않을 때까지 실시하였다. 얻어진 각 분획물을 0.1몰 피리딘 아세테이트용액(pH 5 ~ 5.4)에서 투석하여 농축하였으며 각각에서 얻은 분획농축물을 UF막을 사용하여 분리 및 정제하였다. 0.5M NaCl이 100 ~ 120 ㎖에서 활성 펩티드(APO-1), 0.5M NaCl이 140 ~ 160 ㎖에서 활성 펩티드(APO-2), 0.5M NaCl이 80 ~ 100 ㎖에서 활성 펩티드(APACE1) 및 2.5M ~ 3.0M NaCl이750 ~ 860 ㎖에서 활성 펩티드(APG1, APG2)를 각각 분리하였다.

본 발명에서는 상기 분리된 단일 펩티드에 대하여 자동 서열 분석기를 통하여 서열결정(sequencing)을 수행하였고 단백질 통계 장치(Protein statistics tool)를 사용하여 분자량, 등전점(Isoelectric point) 및 전하(charge)를 결정하였다. 활성 펩티드(APO-1)은 16개(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly: 서열번호 1)의 아미노산 서열로 구성되어 있고 1362.48 달톤(Daltons)의 분자량을 가지며 앞쪽에 강한 산성 아미노산을 가지고 있어 등전 점(Isolectric Point)이 3.754로 나타났고 전하(charge)는 pH 7.0에서 -1.088로 나타났다. 또한, APO-2는 13개(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly: 서열번호 2)의 아미노산 서열로 구성되어 있고 분자량은 1079.20 달톤(Daltons)의 분자량을 가지며, 등전점(Isolectric Point)이 5.550로 나타났고 전하(charge)는 pH 7.0에서 -0.091로 나타났다. 이들은 서로 유사한 서열을 나타내며 프롤린(proline)을 풍부하게 포함하고 있다. 상기 활성펩티드 APO-1 및 APO-2는 모두 하이드록시프롤린(hydroxyproline) 풍부 단백질로 밝혀졌으며 일반적으로 구조단백질에 속하여 있다. 이들은 매우 반복적인 구조를 지니거나 매우 높은 비율로 글리코실레이션(glycosylation)되어 있는 것이 특징이다.

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

상기 항산화제는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료하는 것이 바람직하다. 활성산소가 과량으로 축적되어 발병하는 질환은 간장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스, 암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APO-1 또는 APO-2)이 과산화지질 형성 억제 효과가 있는지 알아보기 위해, 리놀레인산(linoleic acid)을 이용하여 자동산화를 진행시킨 후 과산화물의 양을 티오인산철(ferric thiocyanate) 방법으로 측정하였다. 그 결과, 황태 가수분 해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APO-1 또는 APO-2)은 대조구인 BSA 펩티드보다 약 3.5 ~ 2배의 높은 항산화 활성을 나타내었고 강력한 항산화제인 BHT와 거의 유사한 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APO-1 또는 APO-2)는 항산화제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

자연적인 항산화제는 2가지 유형의 항산화제(antioxidant)가 있는 것으로 알려져 있다. 첫 번째 유형은 산화과정 초기에 자유 라디칼(free radical)의 형성을 직접적으로 막고 플라보노이드(flavonoid)와 같이 금속 이온(metal ion)의 킬레이트제(chelator)로서 작용하는 것이고, 두 번째 유형은 자유 라디칼 사슬의 프로파게이션(porpagation) 반응을 억제함으로써 퍼록시데이션(peroxidation) 초기에 펜톤 반응(Fenton reaction)을 방해하여 라디칼 사슬을 끊는(breacking) 것이 항산화제이다. 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 및 이로부터 분리한 활성 펩티드 APO-1 또는 APO-2는 펜톤반응(fenton reaction)을 방해하여 라디칼 사슬(radical chain)을 끊는 항지질과산화작용을 하는 것으로 나타났을 뿐 아니라 높은 라디칼 소거활성을 가지는 것으로 보아 플라보노이드에서 보여주는 것과 같이 금속이온에 대한 킬레이션 효과(chelation effect)로도 작용할 것으로 예측된다(Simic, M.G. et. al., In Food phytochemicals for cancer prevention II , ACS Symposium Series 547, pp. 20-31. American Chemical Society, Washington DC, 1994).

또한, 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명에서는 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)가 ACE 저해 활성이 있는지 알아보기 위하여, 공지의 방법(Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, Biochemistry 16: 5484, 1977)으로 ACE 저해율을 측정하였다. ACE 저해활성을 IC₅₀ 값으로 검정한 결과, 명태껍질을 기질로 하여 황태 가수분해물의 ACE 저해활성은 0.7㎎/㎖ ~ 0.6㎎/㎖으로 나타난 반면, 2차 가수분해물 및 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)는 0.4㎎/㎖ ~ 0.2㎎/㎖로 높은 활성을 나타내었다. 동일한 종에서 ACE 저해능의 차이는 황태의 저장상태 및 가공상태에서 변형된 펩티드의 아미노산 구성의 차이에 기인한다고 할 수 있으며 명태에서 황태로의 가공과정에서 오랜 기간 동안의 동결과 해동, 건조의 과정이 이들의 아미노산 조성을 변화시켰고 변형된 아미노산 조성에 기인하는 상기 가수분해물, 2차 가수분해물, 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)가 더 높은 ACE 저해활성을 가지게 하는 것으로 사료되어진다. 따라서 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)는 고혈압 예방 및 치료제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 프로테아제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.

일반적인 황태의 제조가공 과정에서의 동결과 융해, 건조의 과정을 거치면서 단백질 사슬의 아마이드(amide) 결합이 끊어져 매우 다양한 펩티드를 형성하고 이성질체(isomer)로 강하게 결합되어 있는 활성 펩티드들이 서로 결합이 끊어져 더 높은 프로테아제 활성을 나타내는 것으로 사료되므로 이들에 대한 프로테아제 활성을 검정하였다.

본 발명에서는 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APG1 또는 APG2)이 프로테아제 활성(protease activity)이 있는지 알아보기 위해, SDS-젤라틴 PAGE를 통하여 측정하였다. 그 결과, 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APG1 또는 APG2)은 높은 프로테아제 활성이 있음을 알 수 있었다. 단백질 사슬에 있어서 아마이드(amide) 결합을 분열(cleavage)시키는 것은 서로 다른 수의 아미노산으로 구성된 펩티드 또는 자유 아미노산(free amino acid)을 형성시킨다. 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APG1 또는 APG2)은 높은 프로테아제 활성을 가지고 있어 단백질 분자의 말단에서 아미노산을 분리하여 자유 아미노산(free amino acid)을 형성할 수 있고, 이렇게 형성된 짧은 단편의 펩티드 또는 자유 아미노산은 인체에 용이하게 흡수되어질 수 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들은 약학적 조성물 또는 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에서는 상기 활성 펩티드들(APG1 및 APG2)의 활성이 서로 다른 메커니즘을 가지고 독립적으로 작용하는 것인지 아니면 서로 상승 또는 타감적으로 작 용하는 것인지를 알아보았다. 그 결과, APG1와 APG2를 분리한 상태에서 APG1은 프로테아제 활성이 소실되었으며, 이는 APG1과 APG2가 서로 협력적인 상태에서 강력한 프로테아제 활성을 가지게 되는 것을 알 수 있었으며, APG2가 주 활성을 가지는 펩티드임을 알 수 있었다. 또한 칼슘(calcium)을 함유하지 않는 상태에서 프로테아제 활성이 완전히 소실되었으므로 이들 활성 펩티드는 칼슘 의존적 프로테이나제(calcium dependent proteinase)임을 알 수 있었다. 황태와 같은 저장생선(stock fish) 상태에서는 생태보다 많은 칼슘(calcium)을 함유하고 있으며 이러한 칼슘(calcium) 농도가 이들 펩티드들의 활성을 더욱 높여주는 역할을 한 것을 알 수 있다. APG2는 프로테아제 처리에 의하여 30kDa 및 40kDa인 두 개의 다이머(dimer)로 분리되었으며 두 개중 30kDa이 프로테아제 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

본 발명의 약학적 조성물은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들에 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들에서 하나 이상을 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식 물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APO-1 또는 APO-2)을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품을 제공한다.

아울러, 본 발명은 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 황태 가수분해물,2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드는 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기의 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 황태 가수분해물의 제조

<1-1> 가용성 단백질의 분리

황태를 12mm까지 분쇄(Hobart grinder, 4℃, overnight)한 후 분쇄된 500g의 샘플을 동일양의 증류수(23℃)에 혼합하고 고압균질화(homogenization)한다(Waring blender, 2분). 상기 혼합물을 85℃에서 60분간 연속 교반한다. 원심분리(2560×g, 15분)한 후 분리된 3개의 층 중 중간층(liquid middle layer)을 수집하여 동결건조하여 분말상태로 준비하고 분석에 사용될 때까지 4℃에 보관하였다.

<1-2> 가수분해물의 제조

상업적 효소들 중에서 알라카제(Alacase)2.4(2.4 AU/g 이하 알카라제(alcalase)로 명명), 플라보자임(Flavourzyme) 500MG(500 LAPU/g 이하 플라보자임으로 명명), 프로나제(Pronase) E 1.5 MG(1.5 AU/g 이하 프로나제로 명명)는 Nivizymes(Novonordisk Bioindustrial, Inc., Denmark)에서, 펩신(Pepsin) 570 unit/mg solid, 이하 펩신으로 명명), 트립신(trypsin) 12,800 unit/mg(이하 트립신으로 명명)은 sigma사(sigma Chemical Co., USA)에서 구입하여 사용하였다.

상기 가용성단백질을 단백질 함량에 대하여 1%에 해당하는 펩신을 첨가한 후 각 효소의 제조 회사에서 제안된 최적온도 및 pH(37℃, pH 3.0)를 조정한 다음 진탕항온조에서 1시간 동안 반응시켰으며, 효소반응의 정지는 끓는 물(100 ℃)에서 10분간 중탕하여 효소를 실활시키고 이를 원심분리(3000×g, 20min) 및 여과하여 황태 가수분해물을 제조하였다. 또한 동일한 조건으로 생태를 대상으로 가수분해물을 제조하였다.

< 실시예 2> 황태 2차 가수분해물의 제조

<2-1> 2차 가수분해물의 제조

상기 <실시예 1>에서 제조한 황태 가수분해물을 알카라제(55℃, pH 7.0), 플라보자임(50℃, pH 7.0), 프로나제 E(40℃, pH 7.0) 및 트립신(37℃, pH 8.0)로 처리하여 2차 가수분해물을 얻었으며 가수분해 시간별로 가수분해율을 구하고 이를 다시 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다.

<2-2> 가수분해율 측정

가수분해율은 황태 가수분해물 및 2차 가수분해물에 동량의 20%(w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)를 넣고 혼합하여 제 단백한 다음 원심분리(3000×g, 20min)한 상층액을 시료로 하여 세미마이크로 킬달(semimicro Kjeldahl)법으로 질소를 정량한 후 측정하였다. 가수분해율의 계산은 가수분해물의 총 질소량에 대하여 10% TCA 가용성 질소의 상대비율(%)로 나타내었다(도 2 참조).

상기 결과, 가수분해율은 펩신만을 처리한 대조구의 경우 약 10.2%이었다. 이를 3종의 상업적 효소로 가수분해는 하는 경우 효소 가수분해율은 효소의 종류에 관계없이 2시간까지는 시간이 경과함에 따라 급격히 증가하여 25.3 ~ 31.5% 범위를 나타내었다. 그 이상의 시간에서는 완만한 증가를 나타내었으며 6시간 이후에는 32.4 ~ 41.6% 범위, 12시간 이후에는 43.6 ~ 46.9%범위를 나타내었다. 상업적 효소를 1시간 처리한 가수분해물의 가수분해율은 프로나제 및 알카라제의 가수분해물이 각각 28.1% 및 29.7%를 나타냈으며 다음으로 플라보자임이 25.5%로 가장 낮게 나타났다. 트립신의 경우 가수분해물의 가수분해율은 1시간까지는 급격히 증가하여 22.1%를 나타냈으나 이후 미미한 증가율을 나타내어 6시간 이후에는 26.2%를 12시간 이후에는 27.3%를 나타내었다. 따라서 황태에 대한 가수분해능은 알카라제 및 프로나제와 같은 엔도프로테아제(enodprotease)가 엔도(endo) 및 엑소(exo)가 혼합 된 형태인 플라보자임보다 우수하였으며 상업적 효소의 사용이 소화효소와 같은 트립신보다 우수한 결과를 나타내었다.

< 실시예 3> 활성 펩티드의 제조

상기 <실시예 2>에서 본 발명에서는 황태의 2차 가수분해물을 세파덱스(Sephadex) 컬럼을 사용한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 분리하였고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 이용하여 확인하였다. 2차 가수분해물을 여과(microfilter, 0.45㎛)한 후 0.1M NaCl을 함유한 0.01M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)로 평형화시킨 세파덱스(Sephadex) G-50을 사용한 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하였다. 각 분획을 크기에 따라 세파덱스(Sephadex) 레진(resin)의 농도를 달리하여 크로마토그래피(chromatography) 과정을 수행하였다. 2차 가수분해물(1.1g in 50 ml)을 컬럼(30 × 1.7 cm)도입하고 0.01M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer)(pH 7.0)에 NaCl 용액의 농도를 0.5에서 3.5M까지 증가시키면서 (0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.5 M NaCl) 용출시켰으며 각각의 용출된 분획물을 대상으로 하여 페놀과 황산으로 반응시켜 양성반응이 나오지 않을 때까지 실시하였다. 얻어진 각 분획물을 0.1몰 피리딘 아세테이트용액(pH 5 ~ 5.4)에서 3일간 투석하여 농축하였으며 각각에서 얻은 분획농축물 UF막(MWCO)을 사용하여 분리 정제하였다. 농도(0.5M NaCl, 100-120 ㎖)에서 활성 펩티드(APO-1), 농도(0.5M NaCl, 140 ~ 160 ㎖)에서 활성 펩티드(APO-2), 농도(0.5M NaCl, 80 ~ 100 ㎖)에서 활성 펩티드(APACE1), 농도(2.5M ~ 3.0M NaCl, 750 ~ 860 ㎖)에서 활성 펩티드(APG1, APG2)를 분리하였다. 분자량의 분포는 표준단백질(아포티닌(apotinin), 6.5kDa; 사이토크롬(cytochrome), 12.4kDa; 탄산탈수화물(carbonic anhydrate), 29kDa; 소의 혈청 알부민(bovine serum albumin), 68kDa)을 사용하여 측정하였다. 분리한 활성 펩티드를 Showdex 806M 컬럼을 사용한 GPC(Gel permeation chromatography)를 통해서 정량화하였다. 사용된 기기장치는 시마즈(Shimadzu Co. LTD, Japan)사의 System Controller인 CBM-20A을 사용하였으며 검출기는 동사의 Refractive Index Detector, RID-10A를 사용하였고 분당 이동속도는 0.5ml/min으로 조정하였고 고정상은 Showdex 806M, 이동상은 물을 사용하여 분리하였다.

<3-1> APO -1 및 APO -2의 제조

세파덱스(Sephadex)를 사용한 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 약 1.5, 4.5kDa 정도의 범위에서 각 펩티드를 분리하였다. 분리된 단일 펩티드에 대하여 native-PAGE 및 막 농축(membrane concentration)을 이용하여 농축한 후 Biosystem 476A(Foster City, CA, USA)을 이용하여 서열결정(sequencing)을 수행하였다. 또한 DNA star(소프트웨어 임, DNA STAR Inc., WI, USA)의 단백질 통계 장치(protein statistics tool)을 사용하여 분자량을 결정하고 등전점(Isoelectric point) 및 전하(charge)를 결정하였다.

상기 결과, APO-1은 16개(Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro- Hyp-Gly-Pro-Hyp- Gly: 서열번호 1)의 아미노산 서열로 구성되어 있고 1362.48 달톤(Daltons)의 분자량을 가지며 앞쪽에 강한 산성 아미노산(acidic amino acid)를 가지고 있어 등전점(Isolectric Point)이 3.754로 나타났고 전하(charge)는 pH 7.0에서 -1.088로 나타났다. APO-2는 13개(Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly-Pro-Hyp-Gly: 서열번호 2)의 아미노산 서열로 구성되어 있고 분자량은 1079.20 달톤(Daltons)의 분자량을 가지고 등전점(Isolectric Point)이 5.550로 나타났고 전하(charge)는 pH 7.0에서 -0.091로 나타났다. 이들은 매우 유사한 서열을 나타내었으며 프롤린(proline)을 매우 풍부하게 포함하고 있었다. 상기 APO-1 및 APO-2는 모두 하이드로프롤린 풍부 단백질(hydroxyproline rich protein)로 밝혀졌으며 일반적으로 구조단백질에 속하여 있었다. 이들은 매우 반복적인 구조를 지니거나 매우 높은 비율로 당화(glycosylation)되어 있는 것이 특징이었다.

<3-2> APACE1 의 제조

세파덱스(Sephadex)를 사용한 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 약 0.1kDa 정도에서 1개의 펩티드(APACE1)을 분리하였다.

<3-3> APG1 및 APG2 의 제조

세파덱스(Sephadex)를 사용한 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 약 70kDa 정도에서 2개의 펩티드(APG1, APG2)을 분리하였다.

< 실험예 1> 과산화지질 형성 억제능 측정

리놀레인산(linoleic acid)을 자동산화 모델로 하여 측정하였다. 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 및 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APO-1 및 APO-2)을 대상으로 하여 20 ㎖ 유리병에 리놀레인산 용액(리놀레인산 2.5 mg을 1 M 인산 완충용액(phosphate buffer) 1 ㎖에 용해) 0.57 mL와 1 M 인산 완충용액(pH 7.0) 2.25 ㎖를 넣고, 각각의 시료를 30㎕를 첨가하였다. 자동 산화를 진행시키기 위해 시험액을 차광시킨 38℃의 배양기에 투입하여 하루 동안 배양하고 과산화물의 양을 FTC(ferric thiocyanate) 방법으로 측정하였다. 배양된 시험액 50 ㎕와 1 M 인산 완충용액 4.85 ㎖를 시험관에 넣고 잘 섞은 후, 30% 티오인산암모늄(ammonium thiocyanate) 50 ㎕를 반응액에 가한 3분 동안 반응시키고 3.5% 염산용액에 녹인 20 mM 염화 제 1철(ferrous chloride) 50 ㎕를 반응액에 가하여 나타나는 붉은색을 UV/VIS 분광 광도계를 이용하여 500 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 다음식으로부터 계산하였다.

상기 결과, 본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APO-1 또는 APO-2)은 대조구인 BSA 펩티드보다 약 3.5 ~ 2배의 높은 항산화 활성을 나타내었으며 강력한 항산화제인 BHT와 거의 유사한 활성을 나 타내었다.

가수분해물 , 2차 가수분해물 , 활성 펩티드들의 항산화 활성

종류	항산화 활성(%)
가수분해물	30 ± 0.4
2차 가수분해물	27 ± 0.8
APO-1	19 ± 0.9
APO-2	21 ± 1.4
양성대조구 BHT(Butylated hydroxytoluene)	12 ± 0.2
음성대조구 BSA(Bovine serum albumin)	67 ± 1.6

< 실험예 2> ACE 저해 활성 측정

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)의 ACE 저해활성을 구명하기 위하여 공지의 방법(Cushman, D.W., H.S. Cheung, E.F. Sabo, and M.A. Ondetti, Biochemistry 16: 5484, 1977)을 변형하여 실험하였다. 상기 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)(5 ~ 50 ㎕)에 300mM의 NaCl을 함유한 100mM sodium borate buffer(pH 8.3) 100 ㎕를 넣은 후 기질인 5mM hippuryl-histydyl-leucine 50 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분간 사전 배양(preincubation)하였다. 이어 ACE 조효소액 100 ㎕를 넣어 37℃에서 30분간 배양(incubation) 시킨 후, 1M HCl 200 ㎕를 넣어 반응을 정지시킨 후 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 2 ㎖를 넣어 15초간 보르텍싱(vortexing)하였다. 이어 1000 rpm에서 5분간 원심분리한 후 에틸 아세테이트층을 1.5 ㎖ 취하여 끓는 물에 중탕으로 휘발시킨 후 1N NaCl 1 ㎖를 넣고 보르텍싱(vortexing)하여 UV/VIS 편광분광기(Hewlett Packard 8452A, USA)로 228nm에서 흡광도를 측정하여 산출하였다. ACE 저해능은 ACE 활성을 50% 저해하는데 요구되는 저해제의 양인 IC₅₀(㎎/㎖)으로 나타내었다. 또한, 명태 껍질 및 생태의 연육을 대상으로 하여 동일한 방법으로 ACE 저해활성을 검정하여 비교하였다.

상기 결과, 명태껍질을 기질로 하여 황태 가수분해물의 ACE 저해활성은 0.7㎎/㎖ ~ 0.6㎎/㎖으로 나타난 반면, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드(APACE1)는 0.4㎎/㎖ ~ 0.2㎎/㎖로 높은 활성을 나타내었다.

가수분해물 , 2차 가수분해물 , 활성 펩티드들의 ACE 저해 활성

종류	IC₅₀(㎎/㎖)
생태에 가수분해물 처리	0.66 ± 0.04
황태에 가수분해물 처리	0.62 ± 0.08
황태에 2차 가수분해물 처리	0.38 ± 0.06
황태에 APACE1 처리	0.23 ± 0.07

< 실험예 3> 프로테아제 활성( Protease activity ) 측정

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 및 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APG1 및 APG2)을 대상으로 하여 SDS-젤라틴(Gelatin) PAGE를 수행하여 프로테아제 활성을 검정하였다. 일반적인 SDS-PAGE에 젤라틴 1% 첨가한 이동 겔(runnig gel)을 만든 후에 상기 시료를 각각 적재(loading)하고 전개한 후에 2.5% Triton X-100으로 1시간 동안 세척하여 SDS를 제거하고 배양액(incubation solution)(10mM 글리신(glycine), 2mM ATP, 2mM MgCl₂ pH7.5)에서 배양(incubation)(37℃, 24h)한 후에 0.2% 아미노 블랙 스테이닝(amido black staining)을 수행하였다. 겔에서 클리어존(clear zone)을 분리하여 프로테아제 활성을 측정하였다.

상기 결과, 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드들(APG1 또는 APG2)은 높은 프로테아제 활성이 있음을 알 수 있었다.

또한, 상기 활성 펩티드들(APG1 및 APG2)이 서로 다른 메커니즘(mechanism)을 가지고 독립적으로 작용하는 것인지 또는 서로 상승 혹은 타감적으로 작용하는 것인지는 각각의 단백질을 분리하여 검정하였다. APG1 및 APG2를 분리한 상태에서 APG1은 프로테아제 활성이 소실되었으며 이러한 것은 APG1 및 APG2가 서로 협력적인 상태에서 강력한 프로테아제 활성을 가지게 되는 것을 알 수 있었으며 APG2가 주 활성을 가지는 펩티드임을 확인할 수 있었다.

또한, 70kDa의 두개의 펩티드를 대상으로 하여 세파로즈(sepharose) 컬럼을 이용하여 서로 분리하고 프로테이나제(proteinase)를 처리하여 각 펩티드가 중합체(dimer) 함유 여부를 검정하였다. 상기 펩티드의 특징을 구명하기 위하여 가수분해 과정에서 칼슘(ca) 이온을 배제한 상태에서 각 펩티드의 활성을 검정하였다. 상기 칼슘을 함유하지 않는 상태에서 프로테아제 활성은 완전히 소실되었으며 이러한 것은 이들 펩티드가 칼슘 의존 프로테이아제(calcium dependent proteinase)임을 나타내는 것이라 할 수 있다. APG2는 프로테이아제의 처리에 의하여 30kDa과 40kDa인 2개의 중합체(dimer)로 분리되었으며 이중 다시 30kDa이 프로테아제 활성을 가지고 있었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

실시예 <3-1>의 활성 펩티드 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

실시예 <3-1>의 활성 펩티드 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

실시예 <3-1>의 활성 펩티드 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

실시예 <3-1>의 활성 펩티드 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

실시예 <3-1>의 활성 펩티드 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

< 제제예 2> : 식품의 제조

본 발명의 황태 가수분해물, 2차 가수분해물 또는 이로부터 분리한 활성 펩티드를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 20~95 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

4. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

5. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 황태 가수분해물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

실시예<1-2>의 가수분해물의 건조분말(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제제예 3> : 음료의 제조

1. 건강음료의 제조

실시예<1-2>의 가수분해물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

2. 야채쥬스의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3. 과일쥬스의 제조

본 발명의 실시예<1-2>의 가수분해물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

도 1은 황태에 효소를 처리하여 가수분해물, 2차 가수분해물 및 활성 펩티드를 분리하는 과정을 나타내는 그림이고,

도 2는 황태 가수분해물에 다양한 효소를 처리하여 가수분해율을 비교한 그래프이고,

도 3은 황태 2차 가수분해물물을 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 항산화 펩티드들(APO-1 및 APO-2)의 분리를 나타내는 그림이고,

도 4는 항산화 펩티드(APO-1)의 3D 구조를 나타내는 그림이고,

도 5는 황태 2차 가수분해물을 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 ACE 저해 활성 펩티드(APACE1)의 분리를 나타내는 그림이고,

도 6은 황태 2차 가수분해물을 크기배제 크로마토그래피를 이용하여 프로테아제 활성 펩티드들(APG1 및 APG2)의 분리를 나타내는 그림이다.

<110> kangwon univ. <120> A composition containings hydrolysates, second hydrolysates or isolated active peptides of Theragra chalcogramma as an active ingredient <130> 7p-10-11 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Amino acid sequence of APO-1 <220> <221> TRANSIT <222> (2) <223> Xaa is Glu. <220> <221> TRANSIT <222> (3) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (5) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (6) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (8) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (9) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (11) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (12) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (14) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (15) <223> Xaa is Hyp. <400> 1 Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Amino acid sequence of APO-2 <220> <221> TRANSIT <222> (2) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (3) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (5) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (6) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (8) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (9) <223> Xaa is Hyp. <220> <221> TRANSIT <222> (11) <223> Xaa is Pro. <220> <221> TRANSIT <222> (12) <223> Xaa is Hyp. <400> 2 Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Gly 1 5 10

Claims

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1) 황태(Theragra chalcogramma) 분쇄한 후 증류수를 혼합하여 믹서를 통해 고압균질화된 혼합물을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 혼합물을 원심분리한 후 분리된 3개의 층 중에서 중간층을 수득하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 중간층을 동결건조하여 가용성 단백질을 수득하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 가용성 단백질에 펩신을 처리하여 1차 가수분해물을 수득하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 1차 가수분해물을 추가로 알칼라제(alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로나제 E(pronase E) 및 트립신(trypsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 효소를 처리하여 2차 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 황태의 가용성 단백질의 2차 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제.
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제 10항의 2차 가수분해물을 세파덱스(Sepahadex)을 이용한 크기배제 크로마토그래피에서 0.01M 인산나트륨 완충용액에 NaCl 용액의 농도를 0.5에서 3.5M까지 증가시키는 농도구배를 적용하여 0.5M NaCl이 80 ~ 100 ㎖에서 얻은 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 치료제.
제 10항 또는 14항에 있어서, ACE(angiotensin-converting enzyme) 저해하는 것을 특징으로 하는 고혈압 예방 및 치료제.
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1) 황태(Theragra chalcogramma) 분쇄한 후 증류수를 혼합하여 믹서를 통해 고압균질화된 혼합물을 수득하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 혼합물을 원심분리한 후 분리된 3개의 층중 중간층을 수득하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 중간층을 동결건조하여 가용성 단백질을 수득하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 가용성 단백질에 펩신을 처리하여 1차 가수분해물을 수득하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 1차 가수분해물을 추가로 알칼라제(alcalase), 플라보르자임(Flavourzyme), 프로나제 E(pronase E) 및 트립신(trypsin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 효소를 처리하여 2차 가수분해물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된, 황태의 가용성 단백질의 2차 가수분해물, 또는 상기 2차 가수분해물을 세파덱스(Sepahadex)을 이용한 크기배제 크로마토그래피에서 0.01M 인산나트륨 완충용액에 NaCl 용액의 농도를 0.5에서 3.5M까지 증가시키는 농도구배를 적용하여 0.5M NaCl이 80 ~ 100 ㎖에서 얻은 활성 펩티드를 유효성분으로 함유하는 고혈압 예방 및 개선용 건강기능식품.