JP5887630B2 - ジペプチジルペプチダーゼ−ｉｖ阻害剤の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、インスリン分泌増強作用などを有するインクレチンを不活性化するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶを阻害するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤及びその製造方法に関する。

国民の４０歳代以上の男性の３人に１人は、代謝異常症候群いわゆるメタボリックシンドロームの予備群であると、厚生労働省より発表されている。この代謝異常症候群の上流にある症状は肥満であり、特に内臓脂肪から生ずるアディポサイトカインによって高血圧、高脂血症、糖尿病を引き起こす。この中でも糖尿病は、インスリンというホルモンの作用不足によって高血糖状態が長く続く代謝疾患群であり、冠状心疾患、脳卒中、末梢血管疾患、高血圧、腎症、神経障害、アルツハイマー症及び網膜症を含めた大血管及び微小血管合併症を併発する危険性が高い。

厚生労働省の２００２年の糖尿病実態調査の速報値によると、II型糖尿病予備群は成人の６．３人に１人に当たる約１６２０万人にのぼると発表され、毎年数百万人の勢いで増加している。したがって、血糖値を適切に管理することが重要である。そして、糖尿病予防・改善効果を目指した食品を摂取しうる対象人口は今後ますます高まることが想定される。

通常、人体内においては、食物の摂取後、膵臓からのインスリン分泌を促進するホルモンであるインクレチンが消化管から放出されている。このインクレチンは、血中の酵素ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（以下、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶを「ＤＰＰ−ＩＶ」と略称することがある。）によって分解され、その能力を失う。したがって、糖尿病の改善・予防において、血糖値を適切に管理するには、このインクレチンを分解する酵素であるＤＰＰ−ＩＶの酵素活性を緩やかに抑えることが重要である。

これまで、このようなＤＰＰ−ＩＶ阻害効果を有する食品として報告されているのは、熟成ナチュラルチーズ成分中のペプチド（特許文献１及び非特許文献１参照）や、食肉の乳酸菌発酵物（非特許文献２参照）、海藻・茶類・クルミ・ザクロ・ブドウ種子・黄杞葉・カカオ・ブドウ新芽・グアバ・生コーヒー豆・コタラヒムブツ・タマリンドの各抽出物から得られるもののみである（特許文献２参照）。

しかしながら、特許文献１、非特許文献１及び非特許文献２に記載のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、チーズの水溶性画分や食肉の乳酸菌発酵物を有効成分とするものであり、高カロリーであるため長期的に連続して摂取することは好ましいことではない。また、乳酸菌発酵物は発酵の条件を厳しくコントロールしなければならないなど製造が容易であるとはいえない。また、特許文献２に記載の各抽出物から得られるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、収率が極めて低いため大量に入手するという点で難点がある。

また、ＤＰＰ−ＩＶの酵素活性を抑えるＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、小腸を通って吸収されるが、小腸からの高い吸収という観点から検討された食品由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は見当たらない。さらに、食品由来のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は血中での安定性が必要であるが、かかる点から検討された報告もない。

特開２００７−３９４２４号公報 特開２０１０−１３４２３号公報

冠木敏秀，Milk Science, Vol. 55, No.2, p.91-92, 2006 田口真理他，日本畜産学会大会要旨，Vol. 107, p.135, 2007

本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、長期に連続して使用しても安全であり、小腸からの吸収性に優れ、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用が強く、しかも血中での安定性に優れたＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及びその製造方法を提供することを目的とするものである。

上記課題は、ペプチドを有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法であって、該ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１５ｍｇ／ｍｌ以下であり、米糠由来のタンパク質を、アスペリギルス オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて加水分解して米糠由来加水分解物を得ることを特徴とするジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法を提供することによって解決される。

このとき、アルカリ溶液を用いて米糠から米糠由来のタンパク質を抽出することが好適である。

本発明により、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤及びその製造方法を提供することができる。本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分とするもので、長期に連続して使用しても安全であり、小腸からの吸収性に優れ、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用が強く、しかも血中での安定性に優れている。したがって、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、血糖値を容易に管理することができ、糖尿病の予防・改善に有用である。また、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、米糠タンパク又は玄米タンパクをタンパク質分解酵素で分解して製造されるので、効率よく大量に生産することができる。

実施例２で得られた米糠由来加水分解物をゲル濾過カラムで分画したクロマトグラムである。 実施例２におけるフラクションナンバー２４のＳＩＭ分析結果を示すマスクロマトグラムである。 標品のプロテインシークエンサーによるアミノ酸の測定結果を示すクロマトグラムである。 実施例２におけるフラクションナンバー２４をさらに分画して得たフラクションナンバー１８（１サイクル目）のＳＩＭ分析結果を示すクロマトグラムである。 実施例２におけるフラクションナンバー２４をさらに分画して得たフラクションナンバー１８（２サイクル目）のＳＩＭ分析結果を示すクロマトグラムである。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分として含有するものである。米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分として含有することにより、長期に連続して使用しても安全であり、小腸からの吸収性に優れ、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用が強く、しかも血中での安定性に優れたＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を得ることができる。以下、本発明において、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを米糠由来加水分解物又は玄米由来加水分解物と呼ぶことがある。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に含まれるペプチドとしては、Ｘａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドであることが好ましい。本発明において、Ｘａａとは任意のアミノ酸を示す。このように、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤がＸａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドを含有することにより、ＤＰＰ−ＩＶ阻害効果を増加させることができ、しかも血中での安定性の点でも優れるので好ましい。Ｘａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドとしては、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（メチオニン−プロリン）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ（バリン−プロリン）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ（アルギニン−プロリン）、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（スレオニン−プロリン）、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ロイシン−プロリン）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（リシン−プロリン）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ヒスチジン−プロリン）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（チロシン−プロリン）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ（フェニルアラニン−プロリン）、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（トリプトファン−プロリン）、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（プロリン−プロリン）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（セリン−プロリン）、Ａｌａ−Ｐｒｏ（アラニン−プロリン）などが挙げられる。中でも、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に含まれるペプチドとしては、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（メチオニン−プロリン）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ（バリン−プロリン）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ（アルギニン−プロリン）、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（スレオニン−プロリン）、及びＬｅｕ−Ｐｒｏ（ロイシン−プロリン）からなる群から選択される少なくとも１種のＸａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドであることが好ましく、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）及び／又はＬｅｕ−Ｐｒｏ（ロイシン−プロリン）で示されるジペプチドであることがより好ましく、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）で示されるジペプチドであることが更に好ましい。また、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（バリン−プロリン−グリシン）のようなトリペプチドを含有させていてもよい。

また、後述する実施例における市販ジペプチドを用いたＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定結果から分かるように、特定のＸａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドを含有することにより、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が強くなることが本発明者らにより確認された。したがって、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有するＩｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（メチオニン−プロリン）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ（バリン−プロリン）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ（アルギニン−プロリン）、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（スレオニン−プロリン）、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（ロイシン−プロリン）、Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（リシン−プロリン）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ（ヒスチジン−プロリン）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（チロシン−プロリン）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ（フェニルアラニン−プロリン）、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（トリプトファン−プロリン）、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（プロリン−プロリン）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（セリン−プロリン）、及びＡｌａ−Ｐｒｏ（アラニン−プロリン）からなる群から選択される少なくとも１種のＸａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドが本発明の実施態様である。中でも、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（イソロイシン−プロリン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ（メチオニン−プロリン）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ（バリン−プロリン）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ（アルギニン−プロリン）、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（スレオニン−プロリン）、及びＬｅｕ−Ｐｒｏ（ロイシン−プロリン）からなる群から選択される少なくとも１種のＸａａ−Ｐｒｏで示されるジペプチドが好適である。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、米又は玄米から抽出した米糠又は玄米由来のタンパク質を原料とするが、米としては、品種、種類、精米方法に限定されず、ジャポニカ米、インディカ米など種々の米を用いることができる。米糠は、通常大量に廃棄されるものであるので、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用に優れることに加え、原料ソースの点でも好ましい。原料として米糠を用いる場合は脂質成分を除去することが好ましい。

脱脂の方法としては特に制限されるものではなく、機械搾油、溶剤による抽出方法などを用いることができる。食品に用いられるためには、残留してはならないヘキサンなどの溶剤を用いることは避けるべきであり、かかる観点からは、機械搾油やエタノールを用いた抽出により脂質を除去することが好ましい。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に使用される米糠又は玄米由来の加水分解物を製造するには、まず、米糠又は玄米から、米糠タンパク又は玄米タンパクをアルカリ溶液で溶出させる。アルカリ溶液としては、ｐＨを１２．５近辺に調整したＮａＯＨ水溶液を用い、この溶液に米糠又は玄米などを添加し、４０℃〜６０℃の温度で撹拌しながら２〜５時間程度抽出する。次いで、遠心分離機などの分離手段でろ液とろ過物とに分離し、１〜２Ｎの希塩酸でろ液のｐＨを４に調整し、タンパク質を沈殿させ、減圧乾燥などで乾燥させて米糠タンパク又は玄米タンパクを得ることができる。タンパク質を得る方法はこれに限定されるものではなく、酵素により糖質、セルロース等を水溶化して得ても良い。

得られた米糠タンパク又は玄米タンパクを蒸留水に懸濁し、５ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨを７．０〜８．０に調整した後、タンパク質分解酵素を加え、４０℃〜５０℃で１２〜２４時間反応を行う。次いで、酵素を失活させ、液体窒素で凍結乾燥して米糠又は玄米由来の加水分解物を得ることができる。

タンパク質分解酵素としては、ペプシン、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢなど市販のタンパク質分解酵素を使用することができるが、具体的には、ビオプラーゼＳＰ、デナチームＡＰ、プロテアーゼＰ、ペプチターゼＲ、ウマミザイムＧなどを挙げることができる。なかでも、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタンパク質分解酵素は、イソロイシン−プロリン（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ）、ロイシン−プロリン（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ）などのジペプチドを容易に導入することができ好ましい。

アスペルギルス オリゼ由来のタンパク質分解酵素としては、ペプチターゼ及びプロテアーゼを有する上述の市販のウマミザイムＧ（至適ｐＨ８．０、中性付近で有効に作用し、至適温度４５℃）、及びアスペルギルス オリゼが生産するプロテアーゼを製剤化したデナチームＡＰ（至適ｐＨ７．０、至適温度５０℃）を挙げることができる。これらの酵素を用いることにより、高い阻害作用を示すＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を得ることができる。また、これらの酵素を用いると、加水分解物の収率が６０％以上を示す点でも好ましい。したがって、アルカリ溶液を用いて米又は玄米から抽出した米糠又は玄米由来のタンパク質を、アスペリギルス オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法が本発明の好適な実施態様である。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、前述のように、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分として含有する。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に含まれる米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドのピーク分子量が５０００以下であることが好ましい。小腸からの吸収性を高めることができる観点から、前記ピーク分子量が２０００以下であることがより好ましく、１０００以下であることが更に好ましく、３００以下であることが特に好ましい。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が２０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。５０％阻害濃度が２０ｍｇ／ｍｌを超える場合、阻害効果が期待できないおそれがある。５０％阻害濃度は、１５ｍｇ／ｍｌ以下であることがより好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ以下であることが更に好ましく、５ｍｇ／ｍｌ以下であることが特に好ましい。

本発明において、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤に含まれる米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドの含有量としては特に限定されないが、米糠又は玄米由来の加水分解物１ｍｇあたり、０．０１μｇ以上含有することが好ましく、０．１μｇ以上含有することがより好ましく、０．５μｇ以上含有することが更に好ましい。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、例えば経口的に投与して、生体におけるＤＰＰ−ＩＶを阻害することにより血糖値を低下させることができる。経口投与に用いる本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の剤形は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、タブレット剤、トローチ剤、舌下剤、液剤などが可能である。また、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、各種食品、各種飲料に添加して用いることもできるし、サプリメントとして用いてもよい。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤の経口投与量としては、治療や予防の目的、投与対象の症状、体重、年齢、性別などの諸条件を考慮して適宜決定されるが、通常、成人を対象とした場合、一日あたり、有効成分量として、５ｍｇ〜５０００ｍｇ摂取すればよい。

本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水分解してなるペプチドを有効成分として含有する。前記ペプチドは、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有する高血糖防止剤等として利用可能な、安全性が高く、副作用のない画分であり、数々の医薬品、特定用保健食品、機能性食品等への利用が期待できる。また、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、安価に入手することができるという利点があり、実用上極めて利用価値が高い。

以下、実施例を用いて本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、本発明において、ピーク分子量の測定、ＤＰＰ−ＩＶの活性測定及び阻害活性測定方法は以下の方法により行った。

（ピーク分子量の測定）
ピーク分子量は、ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いて分析した。溶媒として、０．１５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に、米糠由来又は玄米由来加水分解物を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように溶解し、その２００μｌを流速０．７ｍｌ／分で上記ゲル濾過カラムに注入する。別途、表１に示す標品の溶出位置をもとに検量線を作成し、２１５ｎｍの吸光度を測定することによってピーク分子量を求めた。

（ＤＰＰ−ＩＶの調製）
ＤＰＰ−ＩＶの組み換え体の作出については、メタノール資化性酵母による系での例が報告されている（W. Metzler et al. Protein Sci.,17: 240-250 (2008)）。この方法をもとに、市販されているｈｕｍａｎ ｃＤＮＡ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅを鋳型に、ヒトジペプチジルベプチダーゼ−ＩＶ遺伝子をＰＣＲにより増幅し、発現ベクター・形質転換酵母を作出し、菌体外発現させた。この培養上清を水に対し透析して得た液をＤＰＰ−ＩＶ酵素液とした。

（ＤＰＰ−ＩＶの活性測定）
基質として、Ａｌａ（アラニン）−Ｐｒｏ（プロリン）−ｐＮＡ（パラニトロアニリン）（バッケム社製）を使用した。すなわち、あらかじめ３７℃に加温した２ｍＭのＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）７２０μｌを、３７℃で加温したホルダーに装着したプラスチックセルに加え、前記酵素液を８０μｌ加え、４０５ｎｍの１分間当たりの吸光度変化を求めた。１ユニットを１分間あたり１マイクロモルのパラ−ニトロアニリンを遊離させる活性を１ユニットと定義し、４０５ｎｍにおけるパラ−ニトロアニリンのミリモル分子吸光係数が１０．６であることから、当該酵素液の活性を測定したところ、０．２９ユニット／ｍｌと見積もられた。

（ＤＰＰ−ＩＶ阻害率の測定方法）
基質として上記Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを使用し、酵素として前記酵素液を使用した。具体的操作としては、まず、下記実施例１〜３で調製した３種の米糠由来又は玄米由来加水分解物を超純水で５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、同じく超純水にて、２５、１２．５、６．２５、３．１２５ｍｇ／ｍｌになるように２倍希釈溶液を調製した。９６穴透明マイクロプレートに、あらかじめ３７℃に加温した２ｍＭのＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）８０μｌおよび米糠由来又は玄米由来加水分解物溶液１０μｌあるいは超純水を１０μｌ／ウェル添加し撹拌した後、ＳＨ−８０００マイクロプレートリーダー（コロナ社製）にて、３７℃、５分間加温した。この後、ＤＰＰ−ＩＶ酵素液を１０μｌ／ウェル添加し攪拌した後、前記マイクロプレートリーダーにて１分間当たりの４０５ｎｍ吸光度変化を求めた。超純水を加えたものの吸光度変化を１００％とし、米糠由来又は玄米由来加水分解物溶液を添加した際の相対的な活性を算出した。各サンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。

（脱脂米糠の製造）
精米工場からの生糠を７０〜１００℃に加熱することにより、生糠に残留するリパーゼを失活させ、油が絞りやすい状態にしてレイノルズ社（ドイツ）製の搾油機ＡＰ１４／２２を用いて搾油した。圧搾された油と（半）脱脂米糠を分離し、半脱脂米糠には３〜５倍量のエタノールを入れ、３０〜６０℃で０．５〜４時間撹拌し、その後５Ａの濾紙にてろ過した。この撹拌とろ過を再度繰り返し、半脱脂米糠を７０℃以下の通風乾燥機で半脱脂米糠の水分が５％以下になるように乾燥し、脱脂米糠を得た。

（米糠タンパクの調製）
２５０ｍｌの水に１．０ｇのＮａＯＨを溶解し、ｐＨを１２．５付近に調整したアルカリ溶液に上記のようにして得た脱脂米糠２５ｇを加え、４５℃の温度で攪拌しながら２時間抽出した。遠心分離機により、ろ液とろ過物に分け、ろ過物にさらに上記アルカリ溶液を２５０ｍｌ加え、同様に抽出した。得られたろ液を併せて１〜２規定の希塩酸でｐＨ４に調整することにより、タンパク質を溶液中に沈殿させた。これを再度、遠心分離機でろ液とろ過物に分けた後、ろ過物を４０℃で減圧乾燥して米糠タンパクとして回収した。得られた米糠タンパクのタンパク含量はデュマ法で７７．３％であった。

実施例１：（デナチームＡＰによる米糠由来加水分解物の調製）
上記で得た米糠タンパク２．５ｇをプラスチック製５０ｍｌコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．０に調整した。デナチームＡＰ（ナガセケムテックス社製）を２５ｍｇ加え、反応温度を４０℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、デナチームＡＰによる米糠由来加水分解物１．１ｇを得た。ピーク分子量は２３０であった。

（ＤＰＰ−ＩＶ阻害効果の評価）
上記説明したＤＰＰ−ＩＶ阻害率の測定方法にしたがって、実施例１のサンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。上記阻害活性とサンプル濃度（固形分濃度）の対数の関係式から逆算して、サンプルの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、デナチームＡＰによる米糠由来加水分解物（実施例１）のＩＣ５０は、９．０８±２．０４ｍｇ／ｍｌであった。

実施例２：（ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物の調製）
上記で得た米糠タンパク２．５ｇを、プラスチック製５０ｍｌコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。実施例１と同様の方法により、ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物１．２ｇを得た。ピーク分子量は２４５であった。

（ＤＰＰ−ＩＶ阻害効果の評価）
上記説明したＤＰＰ−ＩＶ阻害率の測定方法にしたがって、実施例２のサンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。上記阻害活性とサンプル濃度（固形分濃度）の対数の関係式から逆算して、サンプルの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物（実施例２）のＩＣ５０は、２．３４±０．１３ｍｇ／ｍｌであった。

（ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物中のＩｌｅ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏの定量）
上記ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物を、２００μg／ｍｌになるように、０．１％ギ酸を含む超純水に溶解した。また検量線を引く目的で、市販されているＩｌｅ−Ｐｒｏ（バッケム社製）を０．２５、０．５０、１．００μｇ／ｍｌになるように、同じく０．１％ギ酸を含む超純水に溶解した。これらサンプル各１μｌをＬＣ／ＭＳ分析した。装置は、高速液体クロマトグラフ装置ＮＥＸＥＲＡおよび質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（いずれも島津製作所製）を用い、カラムはジーエルサイエンス社製のＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ）を４０℃で使用した。溶出は、０〜１分、０．１％ギ酸を含む超純水を供給し、１〜１１分、０％から１００％へ、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルのグラジエント供給で、０．３ｍｌ／分の流速で行った。その結果、２１５ｎｍおよびＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）で、Ｉｌｅ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏに相当するＭ／Ｚ＝２２９．３を検出した。検量線から、ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物中１ｍｇあたり、２．９１±０．５２μｇのＩｌｅ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏが含まれていることが見積もられた。Ｎ末端解析の結果から、イソロイシンおよびロイシンの混合物が、４．２対５．８の割合で検出された。その結果、上記比率でＩｌｅ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏが含まれているものとして、ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物中１ｍｇあたり、Ｉｌｅ−Ｐｒｏが１．２２±０．２２μｇ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏが１．６９±０．３０μｇ含まれていると見積もられた。

（ゲル濾過カラムによる分画とＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定）
阻害活性成分を同定するため、実施例２で得たウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物を分取用ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社製HiLoad 26/60 Superdex 30 prep grade） で分画した。ウマミザイムＧによる米糠由来加水分解物６１７ｍｇを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）で１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、０．４５μｍのフィルターで濾過し、カラムに全量注入した。溶出液は、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を用い、流速１ｍｌ／分で溶出させ、１０ｍｌずつ分画した。フラクションナンバー２１から３４について、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を測定した。

具体的には、９６穴透明マイクロプレートに、各フラクションあるいは１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を９０μｌおよびＤＰＰ−ＩＶ酵素液を５μｌ／ウェル添加し撹拌した後、ＳＨ−８０００マイクロプレートリーダー（コロナ社製）にて、３７℃、５分間加温した。この後、２０ｍＭのＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡのＤＭＳＯ溶液を５μｌ／ウェル添加し撹拌した後、前記マイクロプレートリーダーにて１分間当たりの４０５ｎｍ吸光度変化を求めた。１５０ｍＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）を加えたものの吸光度変化を１００％とし、米糠由来加水分解物溶液を添加した際の相対的な活性を算出した。

表２に各フラクションのＤＰＰ−ＩＶ阻害率を示す。図１は、分取用ゲル濾過カラムの結果であり、１は２１５ｎｍにおける吸光度変化を、２はＤＰＰ−ＩＶ阻害率（％）を示す。各フラクションについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。表２に示すように、フラクションナンバー２４において、最も強い阻害活性を認めた。

（活性画分のＬＣ／ＭＳによる解析）
前記フラクションナンバー２４〜２７について、各溶液９ｍｌを、透析チューブ（家田紡績株式会社のＳＰＥＣＴＲＵＭ フロータライザーＧ２、容量１０ｍｌ、分画分子量１００〜５００）に入れ、脱塩のため蒸留水（４Ｌ×２回）で透析した後、得られた透析液をプラスチック製５０ｍｌコニカルチューブにとり、ボルテックスエバポレーター（ラブコンコ社製）にて乾固させ、フラクションナンバー２４〜２７について、各々４２、４７、５０、１９ｍｇの乾固物を得た。これを、０．１％ギ酸を含む超純水に１００μｇ／ｍｌの濃度になるよう溶解し、各１０μｌをＬＣ／ＭＳ分析した。

装置は、高速液体クロマトグラフ装置ＮＥＸＥＲＡおよび質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（いずれも島津製作所製）を用い、カラムはジーエルサイエンス社製のＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ）を４０℃で使用した。溶出は、０〜１分、０．１％ギ酸を含む超純水を供給し、１〜１１分、０％から１００％へ、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルのグラジエント供給で、０．３ｍｌ／分の流速で行い、２１５ｎｍおよびＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）で検出した。

ＳＩＭ分析における検出するＭ／Ｚの値は、市販されている１５種のＸａａ−Ｐｒｏジペプチドに相当する値、すなわち、１７３．２（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）、１８７．２（Ａｌａ−Ｐｒｏ）、２０３．２（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）、２１３．３（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）、２１５．３（Ｖａｌ−Ｐｒｏ）、２１７．３（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）、２２９．３（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕは、同じＭ／Ｚ＝２２９．３を与える)、２４４．３（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）、２４７．３（Ｍｅｔ−Ｐｒｏ）、２５３．３（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）、２６３．３（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）、２７２．３（Ａｒｇ−Ｐｒｏ）、２７９．３（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ）、３０２．４（Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）、計１４種のＭ／Ｚを測定した。その結果、フラクションナンバー２４に保持時間３．４分付近に、Ｍ／Ｚ＝２２９．３の顕著なピークが検出された。

図２にフラクションナンバー２４のＳＩＭ（Ｍ／Ｚ＝２２９．３）のマスクロマトグラムを示す。この条件でＩｌｅ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏの標品を分析したところ、全く同じ保持時間を与えた。また、この条件で、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕの標品を分析したところ、各々の保持時間は、２．２分、２．９分付近であった。

（分取用逆相カラムによる分画とＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定）
前記フラクションナンバー２４について、阻害活性成分を同定するため、上記活性画分のＬＣ／ＭＳによる解析における方法と同様にして４２ｍｇの乾固物を得た。この乾燥物を、１０ｍｇ／ｍｌになるように、０．１％ギ酸を含む蒸留水に溶解し、このうち５０μＬを高速液体クロマトグラフ装置（日本ウォーターズ社製）に注入し、分取用逆相カラムで分画した。カラムはジーエルサイエンス社製のＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（１０ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ）を４０℃で使用した。溶出は、０〜３分、０．１％ギ酸を含む超純水を供給し、３〜１３分、０％から１００％へ、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルのグラジエント供給で、３ｍｌ／分の流速で行い、１．５ｍｌずつ分画した。各フラクションについて、各１０μｌをＬＣ／ＭＳ分析した。

装置は、高速液体クロマトグラフ装置ＮＥＸＥＲＡおよび質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（いずれも島津製作所製）を用い、カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ、ジーエルサイエンス社製）を４０℃で使用した。溶出は、０〜１分、０．１％ギ酸を含む超純水を供給し、１〜１１分、０％から１００％へ、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルのグラジエント供給を、流速０．３ｍｌ／分の流速で行い、２１５ｎｍおよびＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）で検出した。Ｍ／Ｚ＝２２９．３(Ｉｌｅ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕは同じＭ／Ｚ＝２２９．３を与える)で検出したところ、フラクションナンバー１８に保持時間３．４分付近、Ｍ／Ｚ＝２２９．３の顕著なピークが検出された。

フラクションナンバー１８について、エドマン反応を利用した気相法プロテインシークエンサー（島津製作所製）にかけ、Ｎ末端に位置するアミノ酸を検出したところ、Ｎ末端には、イソロイシンおよびロイシンの混合物が、４．２対５．８の割合で検出され、Ｎ末端の次位置にはプロリンが検出された。よってこのフラクションナンバー１８には、Ｉｌｅ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏが含まれていることが判明した。

試験例３：（ウマミザイムＧによる玄米由来加水分解物の調製）
玄米タンパク（Nutribiotic社製）２．５ｇを、プラスチック製５０ｍｌコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。ウマミザイムＧ（アマノエンザイム社製）を２５ｍｇ加え、反応温度を４５℃に設定した。実施例１と同様の方法により、ウマミザイムＧによる玄米由来加水分解物１．４５ｇを得た。ピーク分子量は２２５であった。

（ＤＰＰ−ＩＶ阻害効果の評価）
上記説明したＤＰＰ−ＩＶ阻害率の測定方法にしたがって、試験例３のサンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。上記阻害活性とサンプル濃度（固形分濃度）の対数の関係式から逆算して、サンプルの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、ウマミザイムＧによる玄米由来加水分解物（試験例３）のＩＣ５０は、４．５８±０．７９ｍｇ／ｍｌであった。

試験例１：（市販ジペプチドによるＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定）
基質として、前記と同じＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを使用し、酵素としては前記酵素液を使用した。具体的操作としては、下記表３に示す１６種のジペプチドを超純水にて、６．２５、１２．５、２５、５０、１００ｍＭになるように２倍希釈溶液を調製した。９６穴透明マイクロプレートに、あらかじめ３７℃に加温した２ｍＭのＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを含む０．１Ｍトリス―塩酸バッファー（ｐＨ７．５）８０μｌおよびペプチド溶液１０μｌあるいは超純水１０μｌ／ウェル添加し撹拌した後、ＳＨ−８０００マイクロプレートリーダー（コロナ社製）にて、３７℃、５分間加温した。

この後、ＤＰＰ−ＩＶ酵素液を１０μｌ／ウェル添加し攪拌した後、前記マイクロプレートリーダーにて１分間当たりの４０５ｎｍ吸光度変化を求めた。超純水を加えたものの吸光度変化を１００％とし、ペプチド溶液を添加した際の相対的な活性を算出した。各サンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。表３に結果を示す。表３に示された結果から分かるように、Ｉｌｅ−Ｐｒｏが最も阻害活性が強く、そのＩｌｅ−ＰｒｏのレトロペプチドであるＰｒｏ−ＩｌｅおよびＧｌｙ−Ｐｒｏは全く阻害を示さなかった。

比較例１：（ビオプラーゼＳＰによる米糠由来加水分解物の調製）
上記得られた米糠タンパク２．５ｇをプラスチック製５０ｍｌコニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨによりｐＨを８．０に調整した。ビオプラーゼＳＰ（ナガセケムテックス社製）を２５ｍｇ加え、反応温度を５０℃に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、ビオプラーゼＳＰによる米糠由来加水分解物０．６５ｇを得た。ピーク分子量は１１，５００であった。

基質として、前記と同じＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを使用し、酵素としては前記酵素液を使用した。具体的操作としては、まず、上記ビオプラーゼＳＰによる米糠由来加水分解物を超純水で８０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、同じく超純水にて、４０、２０、１０、５ｍｇ／ｍｌになるように２倍希釈溶液を調製した。９６穴透明マイクロプレートに、あらかじめ３７℃に加温した２ｍＭのＡｌａ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを含む０．１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．５）８０μｌおよび米糠由来加水分解物溶液１０μｌあるいはミリＱ水を１０μｌ／ウェル添加し撹拌した後、ＳＨ−８０００マイクロプレートリーダー（コロナ社製）にて、３７℃、５分間加温した。この後、ＤＰＰ−ＩＶ酵素液を１０μｌ／ウェル添加し撹拌した後、前記マイクロプレートリーダーにて１分間当たりの４０５ｎｍ吸光度変化を求めた。超純水を加えたものの吸光度変化を１００％とし、米糠由来加水分解物溶液を添加した際の相対的な活性を算出した。サンプルについてＤＰＰ−ＩＶ阻害率を３回測定して平均値を求めた。

上記阻害活性とサンプル濃度（固形分濃度）の対数の関係式から逆算して、サンプルの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果、ビオプラーゼＳＰによる米糠由来加水分解物のＩＣ５０は、２６．４±２．３ｍｇ／ｍｌであった。

ビオプラーゼＳＰによる米糠由来加水分解物を、２００μg／ｍｌになるように、０．１％ギ酸を含む超純水に溶解した。また検量線を引く目的で、市販されているＩｌｅ-Ｐｒｏ（バッケム社製）を０．１２５、０．２５、０．５０、１．００μｇ／ｍｌになるように、同じく０．１％ギ酸を含む超純水に溶解した。これらサンプル各１μｌをＬＣ／ＭＳ分析した。

装置は、高速液体クロマトグラフ装置ＮＥＸＥＲＡおよび質量分析計ＬＣＭＳ−２０２０（いずれも島津製作所製）を用い、カラムはジーエルサイエンス社製のＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（２．１ｍｍ ＩＤ×５０ｍｍ）を４０℃で使用した。溶出は、０〜１分、０．１％ギ酸を含む超純水を供給し、１〜１１分、０％から１００％へ、０．１％ギ酸を含むアセトニトリルのグラジエント供給で、０．３ｍｌ／分の流速で行った。２１５ｎｍおよびＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）で測定したところ、Ｉｌｅ-ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｐｒｏに相当するＭ／Ｚ＝２２９．３の値は検出限界以下であり測定できなかった。

１ ２１５ｎｍにおける吸光度変化
２ ＤＰＰ−ＩＶ阻害率（％）

Claims (2)

1. ペプチドを有効成分として含有するジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法であって、
   該ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１５ｍｇ／ｍｌ以下であり、
   米糠由来のタンパク質を、アスペリギルス オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて加水分解して米糠由来加水分解物を得ることを特徴とするジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法。
2. アルカリ溶液を用いて米糠から米糠由来のタンパク質を抽出する請求項１に記載のジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤の製造方法。

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