JP5916387B2 - ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤およびその製造方法に関する。さらに、本発明は該ジペプチジルペプチダーゼ−４阻害剤を含有する糖尿病の予防及び／又は改善剤に関する。

ジペプチジルペプチダーゼ−４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４、以下「ＤＰＰ−４」と記載する）は、セリンプロテアーゼの１つであり、ペプチドのＮ末端から２番目のプロリン又はアラニンを認識して切断する酵素である。ＤＰＰ−４は哺乳動物組織中に広く分布し、特に腎臓、肝臓、腸管上皮、胎盤および血漿中に存在することが知られている。哺乳類におけるＤＰＰ−４の役割は完全には明らかになっていないが、神経ペプチドの代謝、Ｔ細胞の活性化、ガン細胞の内皮細胞への接着やＨＩＶの細胞内への侵入等において重要な役割を演じていると考えられている。ＤＰＰ−４の基質としては、栄養、代謝、免疫系および痛覚などに関連するペプチドが知られている。なかでも、グルコース依存的なインスリンの分泌亢進作用を示すグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ−１：以下、「ＧＬＰ−１」と記載する）や胃抑制ポリペプチド（Ｇａｓｔｒｉｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅまたはＧｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を、不活性化する酵素として、ＤＰＰ−４は注目されてきている（非特許文献１）。

ＧＬＰ−１の生理作用としては、膵臓のβ細胞からのグルコース依存的なインスリンの分泌作用の他に、グルカゴンの分泌抑制作用、膵臓β細胞の保護及び増殖作用、胃排泄の抑制、肝臓でのグリコーゲン合成酵素促進作用などがある。さらに中枢においては視床下部の満腹中枢に作用して摂食量の減少を引き起こす（非特許文献２）。

ＤＰＰ−４活性を阻害することなどによってＧＬＰ−１の分解を抑制すれば、グルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進するなどＧＬＰ−１の有する生理活性が増強される事も知られている。これらの事実からＤＰＰ−４阻害作用を有する化合物は、１型糖尿病及び２型糖尿病などにおいて認められる耐糖能不全、食後高血糖、空腹時高血糖やそれに伴う肥満・糖尿病性合併症などに効果を示すことが期待される。また、インスリン分泌を促進し、筋肉への糖の取り込みを促進することから、運動時の筋肉へエネルギー供給を助ける作用も期待される。

ＤＰＰ−４は、ニューロペプチドＹ、エンドモルフィン１、エンドモルフィン２、サブスタンスＰといった神経ペプチドの代謝にも関与している。したがって、ＤＰＰ−４を阻害する化合物は、これらの生理活性ペプチドの分解を抑制することにより、精神分裂病、鬱、不安、てんかん、ストレス性疾患の治療薬や鎮痛薬としても期待できる。さらにＤＰＰ−４は、種々のサイトカイン類やケモカイン類の代謝や、免疫担当細胞であるＴ細胞の活性化、癌細胞の内皮への接着、血液細胞の増殖等に関与していることが知られているので、これらの作用を介して、ＤＰＰ−４を阻害する化合物は、糖尿病の他に、関節リウマチ、自己免疫疾患、喘息や食物アレルギー等のアレルギー疾患、癌、癌転移、ＨＩＶ感染、貧血、血小板減少症等の予防及び／又は改善に有用であると考えられている。

ＤＰＰ−４阻害剤としては化学合成によって得られる化合物が多数報告されている（特許文献１，２，３，４）。これらの内いくつかのものは既に糖尿病治療薬として実用化されている。一方、天然物由来のＤＰＰ−４阻害剤としては、ゼラチン由来のペプチド（特許文献５）、乳カゼイン由来のペプチド（特許文献６）、加水分解型タンニン（特許文献７）、パプリカなどの植物抽出物（特許文献８）などが知られている。また、ＤＰＰ−４を介した症状を予防及び／又は治療するために、蛋白質を公知の方法で加水分解して得られる物が使用できることが報告されている（特許文献９）。

特表２００５−５００３２１号公報 特表２００４−５３５４５５号公報 特表２００４−５３６１１５号公報 特開２０００−３２７６８９号公報 ＷＯ２００８／０６６０７０号公報 特開２００７−３９４２４号公報 特開２００８−２８０２９１号公報 特開２００７−２７７１６３号公報 特表２００８−５００３０４号公報

日薬理誌 １２５，３７９〜３８４（２００５） Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｄｒｕｇｓ １０９１−１１０２ （２００４）

本発明は、食経験のある天然物を原料とし、ＤＰＰ−４阻害活性だけでなく、味、吸収性の点からも経口摂取用途に適した、ＤＰＰ−４阻害剤および該ＤＰＰ−４阻害剤を含有する糖尿病を予防及び／又は改善する組成物（飲食品、機能性食品、医薬品、経腸栄養剤、飼料等）を提供することを課題とする。

本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定の豆類中の蛋白質のペプチド結合を、微生物や微生物由来の蛋白質分解酵素によって加水分解して得られるものに、ＤＰＰ−４阻害作用があり、また味の点でも優れていることを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤に関する。上記微生物としては、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上が好ましく、蛋白質分解酵素としては、麹菌、乳酸菌および納豆菌からなる群より選ばれる１種以上の微生物を由来とする酵素であるのが好ましい態様である。また、本発明は、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られることを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤にも関する。

さらに本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤の製造方法にも関する。

本発明によれば、食経験のある特定の豆類を、同じく食品に一般に使用されてきた微生物や微生物由来の酵素によって処理することで、優れたＤＰＰ−４阻害活性を有するＤＰＰ−４阻害剤や、それを有効成分として含有する飲食品、機能性食品、医薬品、飼料等が提供される。本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、上記の点から安全性の上でも優れているだけでなく、味覚や吸収性の点でも特に経口摂取用途に適している。本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、糖尿病を予防及び／又は改善するための組成物の有効成分として有用である。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られるものである。すなわち本発明は、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤の製造方法でもある。本発明においては、上記豆類中の蛋白質のペプチド結合が加水分解されて断片化（低分子化）したものがＤＰＰ-４阻害剤の有効成分として関与していると考えられる。従って、小豆またはインゲン豆由来の蛋白質の加水分解物を有効成分とする、ＤＰＰ−４阻害剤もまた本発明に含まれる。

本発明において、小豆またはインゲン豆を処理するのに使用される微生物としては特に限定されないが、蛋白質分解酵素を産生する微生物が好ましく、安全性の観点からは食品製造に使用されている微生物が好ましい。そのような微生物として、具体的には麹菌、乳酸菌、納豆菌などが挙げられる。この中でも麹菌が特に好ましい。

また本発明において、小豆またはインゲン豆を処理するのに使用される蛋白質分解酵素としては、ペプチド結合を加水分解できる微生物由来の蛋白質分解酵素であれば特に限定されないが、麹菌、乳酸菌または納豆菌を由来とする蛋白質分解酵素が好ましく、麹菌を由来とする蛋白質分解酵素がより好ましい。

さらに本発明においては、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られるものもＤＰＰ−４阻害剤として使用できる。

本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、麹菌は、国内外で食品の製造に関係し、安全なものであれば特に限定されず、例えば、醤油、味噌、酒などの生産に用いられるものを使う事ができる。そのような麹菌としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・タマリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔａｍａｒｉ）、アスペルギルス・グラウカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）などのアスペルギルス属の他、紅麹菌などが挙げられる。この中でも、プロテアーゼ活性が高い点で醤油用麹菌を使うのが好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅやＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅなどがより好ましく、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅが特に好ましい。また上記のような麹菌を、豆、米、麦、ふすまなどに着生させた、いわゆる麹、種麹を利用しても良い。

本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、乳酸菌としては、代謝により乳酸を生成する細菌類であれば特に限定されず、具体的には、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属などが挙げられる。

また、本発明において使用される、または使用される酵素の由来となる、納豆菌としては、バチルス・サブチリス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖａｒ． ｎａｔｔｏ）が挙げられる。

一般に蛋白質分解酵素には、ペプチドのペプチド結合を加水分解するペプチダーゼや蛋白質のペプチド結合を加水分解するプロテアーゼなどがある。本発明で使用される蛋白質分解酵素は、精製された単一のペプチダーゼや単一のプロテアーゼでも良いし、複数のペプチダーゼやプロテアーゼなどを含む組成物であっても良い。また、ペプチダーゼやプロテアーゼの活性を損なわない程度に他の酵素を含む組成物であっても良い。使用される蛋白質分解酵素としては、後述するように市販品を利用することもできるし、蛋白質分解酵素を産生する微生物を破砕したり、部分精製したりして得られる菌体処理物や部分精製酵素を利用しても良い。さらに、蛋白質分解酵素を産生する組換え菌の菌体処理物や該組換え菌を由来とする酵素でも良い。組換え菌の作製は通常の遺伝子工学的手法を用いることが出来る。

蛋白質が分解され、腸管から吸収され易くなるためには、蛋白質はより低分子のペプチドに分解された方が好ましく、その様な観点から、本発明に用いる蛋白質分解酵素はペプチダーゼを含むものが好ましい。

また、蛋白質のプロリン残基周辺は一般にプロテアーゼ、ペプチダーゼが作用しにくいことが知られている。Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼは、アミノ末端のＸ−プロリン（Ｘは任意のアミノ酸残基）をジペプチド単位で特異的に遊離する酵素であり、この酵素活性を有する蛋白質分解酵素は、蛋白質をより低分子化しやすいと考えられる。そのような観点から、本発明で使用される微生物または蛋白質分解酵素は、Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものがより好ましい。なお、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅは、Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼを産生することが報告されている（Ｈ． Ｔａｃｈｉ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１（１１），３７０７−３７０９（１９９２））。

本発明で市販品の蛋白質分解酵素を使用する場合、その種類は特に限定されないが、食品添加物として市販されているものを好適に用いることが出来る。例えば、ウマミザイムＧ、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ、プロテアーゼＭ「アマノ」ＳＤ（以上、天野エンザイム株式会社製）、スミチーム ＬＰ、スミチーム ＦＰ、スミチーム ＬＰＬ（以上、新日本化学工業株式会社製）、パンチダーゼ ＮＰ−２（ヤクルト薬品工業株式会社製）、オリエンターゼ ＯＮＳ（エイチビイアイ株式会社製）などが挙げられる。なお、上記の蛋白質分解酵素は、形状を変更したものであっても、本発明に用いることができる。形状は、顆粒状であってもよいし、粉末状や液状であってもよい。蛋白質を加水分解しうる限り、本発明に使用することができる。

上記の蛋白質分解酵素の中でも、Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性の強さの点から、ウマミザイムＧがより好適に用いられる。

本発明のＤＰＰ−４阻害剤の原料となる小豆は、ササゲ属小豆（Ｖｉｇｎａ ａｎｇｕｌａｒｉｓ）、大豆は、ダイズ属大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、インゲン豆は、インゲン属インゲン豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）を示し、インゲン豆には、とら豆、大手亡、うずら豆、大福豆等の品種も含まれる。また、大豆に関しては、遺伝子組換え大豆（ＧＭＯ大豆）の蛋白質を、微生物や微生物由来のプロテアーゼで加水分解したときの、安全性やアレルギー原性についての十分なデータがない事から、非遺伝子組換え（ｎｏｎＧＭＯ）大豆を用いることが好ましい。また、ｎｏｎＧＭＯ大豆は、ＤＰＰ−４阻害活性や味などの点からも、ＧＭＯ大豆に比べより好適に用いることができる。

上記の本発明で使用される豆類は、豆そのものを原料とすることも出来るし、納豆、醤油、豆乳、餡やその類似品などのように豆類を原料として製造される組成物やオカラや脱脂豆などのように豆類から他の食品を作った後の残渣等を原料として利用することも出来る。

上記豆類は、そのまま本発明のＤＰＰ−４阻害剤を作製するための原料として使うことも出来るが、乾燥、破砕、粉砕、加熱、加圧、脱脂、酸処理、アルカリ処理、搾汁、抽出等の前処理を行っても良い。またこれら前処理は２種以上組み合わせて実施することもできる。さらに、上記豆類材料から蛋白質や蛋白質を多く含む成分を分離した後、本発明のＤＰＰ−４阻害剤を作製するための原料とすることも出来る。
本発明において、上記豆類を微生物で処理する方法は特に限定されない。例えば、豆類材料を必要に応じて上記前処理した後、その表面に微生物を生育させることや、微生物を生育させた後に水を添加しさらに反応させることによって、豆類中の蛋白質のペプチド結合を加水分解させる方法が挙げられる。さらに、豆類材料やその処理物を水などの液体に懸濁及び／又は溶解した状態で微生物を生育させる方法や、液体の豆類加工物に微生物を生育させる方法なども挙げられる。
また、本発明において、上記豆類を蛋白質分解酵素で処理する方法も特に限定されない。豆類材料を必要に応じて上記前処理した後、その表面に蛋白質分解酵素を振りかけたり、豆類材料やその処理物を水などの液体に懸濁及び／又は溶解した状態で蛋白質分解酵素を作用させることで、類中の蛋白質のペプチド結合を加水分解させる方法の他、液体の豆類加工物に蛋白質分解酵素を添加する方法などが挙げられる。

本発明においては、上記方法によって得られる、微生物、または、蛋白質分解酵素の処理物を、そのままＤＰＰ−４阻害剤として利用することもできるが、ＤＰＰ−４阻害活性を失わない範囲で脱臭、脱色などを行ってもよい。また、ＤＰＰ−４阻害活性成分を濃縮するために、抽出、沈殿、ろ過、限外ろ過、カラムクロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法の組合せによる分画を行ってもよい。

ＤＰＰ−４活性は、例えば、ヒトＤＰＰ−４酵素に基質としてＧｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ ４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを加えてインキュベートし、生成した７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎの量を蛍光光度計で定量することで測定できる。本発明においては、上記アッセイにおいて、ＤＰＰ−４阻害活性の評価の対象である検体が存在する場合（サンプル）と存在しない場合（溶媒対照）のＤＰＰ−４活性を比較し、溶媒対照のＤＰＰ−４活性に対し、有意にＤＰＰ−４活性を低下させたサンプルを、「ＤＰＰ−４阻害活性あり」と評価する。本発明のＤＰＰ−４阻害剤としては、溶媒対照のＤＰＰ−４活性を１００％としたときの、サンプルのＤＰＰ−４活性が、７０％以下となるものが好ましく、６０％以下となるものがより好ましく、５０％以下となるものが特に好ましい。

また、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、ＤＰＰ−４阻害活性だけではなく、好ましい態様においてはα−グルコシダーゼ阻害活性を有する場合もある。α−グルコシダーゼ活性は、例えば酵母由来α−グルコシダーゼに、基質としてスクロースを加えてインキュベートし、生成したグルコースを市販のグルコース定量キットで定量することで測定できる。本発明においては、上記アッセイにおいて、α−グルコシダーゼ阻害活性の評価の対象である検体が存在する場合（サンプル）と存在しない場合（溶媒対照）のα−グルコシダーゼ活性を比較し、溶媒対照のα−グルコシダーゼ活性に対し、有意にα−グルコシダーゼ活性を低下させたサンプルを、「α−グルコシダーゼ阻害活性あり」と評価する。本発明のＤＰＰ−４阻害剤としては、溶媒対照のα−グルコシダーゼ活性を１００％としたときの、サンプルのα−グルコシダーゼ活性が、９０％以下となるα−グルコシダーゼ阻害活性を併せ持つものが好ましく、８０％以下となるα−グルコシダーゼ阻害活性を併せ持つものがより好ましい。
一般に、蛋白質を加水分解してペプチドを得る製法は、苦みや臭みが出やすいことが知られている。しかし、小豆またはインゲン豆を、微生物、または、微生物が産生する蛋白質分解酵素で処理して得られる本発明のＤＰＰ−４阻害剤、または、大豆を、麹菌または麹菌由来の蛋白質分解酵素で処理して得られる本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、苦みや臭みが少なく、特に、麹菌や麹菌由来の蛋白質分解酵素を用いた場合に、呈味性に優れたＤＰＰ−４阻害剤を作製することが出来る。従って、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、呈味性に優れていることが好ましい経口摂取用の組成物に特に好ましく利用できる。ここで言う経口摂取用組成物とは、人又は家畜、ペットなどが経口的に摂取する組成物のことを言い、具体的には飲食品、医薬品、飼料等のことを言う。

本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、上記のように経口摂取用組成物として用いることも出来るし、経腸栄養剤などのように直接消化管内に投与し、消化管から吸収させる組成物として用いることもできる。また、そのまま飲食用、医薬用、飼料用などとして利用することも出来るが、これを含有する組成物として飲食用、医薬用、飼料用などの用途に用いることも出来る。本発明のＤＰＰ−４阻害剤を上記のような用途で用いる場合、その形態は限定されず、例えば、飲食用として、一般食品の他に、機能性食品（保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品、スポーツサプリメントなど）などのサプリメントとして利用できる。あるいは、医薬用として医療用医薬品の他にＯＴＣなど容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品、化粧品などとして利用できる。

本発明のＤＰＰ−４阻害剤を一般食品または機能性食品として摂取する場合は、そのまま直接摂取することもできるし、また、公知の担体や助剤などの添加剤と混合された組成物として、カプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態に成型して摂取することもできる。また、栄養強化を目的として、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅなどの各種ビタミン類を添加、併用して用いることもできる。さらに、他の機能性食品などと合剤にすることも出来る。合剤とする他の機能性食品としては、特に限定されないが、血糖低下作用、脂質低下作用、抗肥満作用等の代謝調節作用や、血圧低下作用、骨粗鬆症予防及び／又は改善作用、等の知られている機能性食品を挙げることが出来る。

さらに、飲食物材料に混合して、チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；茶、清涼飲料、栄養ドリンク、美容ドリンクなどの飲料；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、はんぺんなどの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、ソースなどの調味料；マーガリン、バター、サラダ油などの油脂類；パン、ハム、スープ、レトルト食品、冷凍食品などの一般食品に使用することができる。

本発明のＤＰＰ−４阻害剤を医薬用として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、注射剤、座薬、貼付剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容される他の製剤素材、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。

さらに、本発明のＤＰＰ−４阻害剤を医薬用として用いる場合に、他の抗糖尿病薬、抗肥満薬、抗骨粗鬆症薬などの医薬品と合剤にしても良い。他の抗糖尿病薬や抗肥満薬としては特に限定されないが、例えば、スルホニル尿素系薬、ビグアナイド系薬、α−グルコシダーゼ阻害薬、インスリン製剤、イスリン分泌促進薬、インスリン増感薬、ＰＰＡＲ作動薬（ＰＰＡＲα作動薬、ＰＰＡＲγ作動薬、ＰＰＡＲα＋γ作動薬）、β３アドレナリン受容体作動薬、アルドース還元酵素阻害薬、ＤＰＰ−４阻害薬、ＡＭＰキナーゼ活性化薬、１型１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１１β−ＨＳＤ１）阻害薬、リパーゼ阻害薬、食欲抑制薬等などが挙げられる。抗骨粗鬆症薬としては活性型ビタミンＤ３製剤、エストロゲン製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、ビスホスホネート製剤、ビタミンＫ２製剤、カルシウム製剤などがあげられる。

α−グルコシダーゼは、腸内でマルトースやシュークロースなどの二糖類を単糖類に分解する酵素である。α−グルコシダーゼを阻害することにより、多糖類及び二糖類の吸収を抑制することができ、食後の過血糖を顕著に抑制することから、糖尿病の予防あるいは改善に有効である事が知られている。しかしながら、メカニズムから明らかなように、α−グルコシダーゼ阻害剤はグルコース摂取による血糖値上昇に対する効果は認められない。また、α−グルコシダーゼ阻害剤は食事直前に摂取しないとその効果が得られないなど、服用方法の制限もある。本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、グルコース摂取による血糖値上昇にも効果を有するだけでなく、服用時期を問わないという点でメリットが高い。さらに、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、上記の通り、より好ましくはＤＰＰ−４阻害活性とα−グルコシダーゼ阻害活性の両方を合わせ持つことから、より強い血糖値低下効果が期待できる。

上記のことから、本発明のＤＰＰ−４阻害剤を含有する組成物は、糖尿病の予防及び／又は改善のための組成物として利用できる。また、本発明のＤＰＰ−４阻害剤は、血糖上昇抑制剤、血糖降下剤、インスリン分泌促進剤、活性型ＧＬＰ−１量増多剤、グルカゴン分泌抑制剤、膵β細胞再生促進剤及び／又は筋肉への糖の取り込み促進剤としても使用出来る。
また、本発明は、上記ＤＰＰ−４阻害剤を投与対象に投与する、糖尿病の予防及び／又は改善方法でもある。また本発明は、上記ＤＰＰ−４阻害剤を投与対象に投与する、血糖値の上昇抑制方法でもある。糖尿病の予防とは、糖尿病の発生リスクの軽減も含まれる。また、上記の場合の投与対象としては、糖尿病患者、糖尿病予備軍（正常域ではあるが血糖値が高めであるもの、遺伝的要因または生活習慣から糖尿病になるリスクが高いことが指摘されるもの）が好ましいが、健常者も含まれる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（ＤＰＰ−４阻害活性の測定法）
本発明においては、市販の測定キット（ＢＩＯＭＯＬ社製 ＤＰＰ−４ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｋｉｔ）を用いて、キット添付の説明書に準じてＤＰＰ−４活性を測定し、その値を比較することでＤＰＰ−４阻害活性を評価した。以下に、簡単に測定方法を示す。
測定キットに付属の白色の９６ハーフエリアプレートに、ブランクのウェルには５０μＬ、コントロールのウェルには３５μＬ、サンプルのウェルには２５μＬのバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）を入れた。次にサンプルウェルにサンプルを１０μＬ添加した後、コントロールとサンプルのウェルに酵素溶液（ヒトＤＰＰ−４酵素）を１５μＬ添加し、プレートミキサーで良く混合した。次に、全てのウェルにＤＰＰ−４の基質になるＧｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ ４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅを５０μＬ加えて（ウェル中の総液量１００μＬ）、３７℃でインキュベートし、酵素反応を行った。インキュベートは温度調節の出来る蛍光強度測定装置（ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ ＨＴ 大日本製薬製）の中で行い、インキュベート開始直後と１２分後に、励起波長３８０ｎｍ、測定波長４６０ｎｍで測定を行い、酵素反応の結果生成した７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを測定した。

なお、サンプルのＤＰＰ−４活性は、コントロールにおけるＤＰＰ−４活性の値を１００％として、以下のようにして算出した。

ＤＰＰ−４活性（％）＝｛（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝ｘ１００
式中Ａはインキュベート開始１２分後のサンプルウェルの蛍光強度、Ｂはインキュベート開始直後のサンプルウェルの蛍光強度、Ｃはインキュベート開始１２分後のコントロールウェルの蛍光強度、Ｄはインキュベート開始直後のコントロールウェルの蛍光強度を表す。この時、ＤＰＰ−４活性の値が低いほど阻害活性が強いことを表す。

（実施例１）豆類の麹菌処理物の調製
市販の大豆、小豆、大手亡、大福豆、紫花豆、しかく豆それぞれ１ｋｇを、蒸煮してからあらくつぶし、必要に応じて炒熬割砕処理したものを加えて水分量が約５０％となるように調整した後、フィルターを装備し無菌空気を供給することができる容器に入れ、１２１℃で３０分間高圧蒸気滅菌した。次に、滅菌した原料に、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＫＢＮ６１６；株式会社ビオック製）を用いて得られたふすま麹３ｇをクリーンベンチ内で麹菌以外の微生物が混入しないように接種し、無菌空気を容器内に供給しながら３１℃で４８時間、麹菌のみで発酵を行った。

その後、クリーンベンチ内で得られたそれぞれの発酵物７５ｇを滅菌したガラス容器に取り、滅菌蒸留水１５０ｍＬを加えてシリコン栓をし、食塩を添加せずに、麹菌以外の微生物が存在しない条件下において３０℃で３日間処理を行い、麹菌処理液を得た。

その後、それぞれの麹菌処理液を、９０℃で３０分加熱をした後、濾過して澄明な液を得た。これを分画分子量３０００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製 マイクロコン ＹＭ−３)を用いて１４０００ｇで１００分間遠心分画し、得られたろ液を凍結乾燥し、それぞれの豆類の麹菌処理物を得た。得られた豆類の麹菌処理物を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解してサンプルとし（ＤＰＰ−４活性測定時の濃度として１ｍｇ／ｍＬ）、各サンプルのＤＰＰ−４阻害活性を上述の方法で評価した。結果を表１に示す。

このように、大豆、小豆、およびインゲン豆の一種である大手亡と大福豆の麹菌処理物にＤＰＰ−４阻害活性があることと、その阻害活性は比較に用いた他の豆類（紫花豆、しかく豆）の麹菌処理物よりも高いことが確認された。

（実施例２）豆類の蛋白質分解酵素処理物の調製
市販の小豆、とら豆、大手亡それぞれ３ｇを、ミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これを容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社）、１％w/v水溶液）３ｍＬを添加した。これを４５℃で２４時間インキュベートした後、１８００ｇ、３０分間遠心して分解されなかった残渣を取り除いた。上清を回収し、９９℃で６０分間加熱した後、再度１８００ｇ、３０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量１００００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製 アミコンウルトラ−１５)を用いて１８００ｇ、６０分間遠心分画したろ液を凍結乾燥し、それぞれの豆類の蛋白質分解酵素処理物を得た。該酵素処理物を１０ｍｇ／ｍｌ、又は、３０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に溶解してサンプルとし（ＤＰＰ−４活性測定時の濃度としてそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ）、これらのサンプルのＤＰＰ−４阻害活性を上述の方法で評価した。得られた結果を表２に示す。

このように、小豆、とら豆、大手亡いずれの蛋白質分解酵素処理物も、ＤＰＰ−４阻害活性を有していた。

（実施例３）豆類の蛋白質分解酵素処理物の調製（経時変化サンプルの調製）
市販の小豆、とら豆、大手亡それぞれ３ｇを、ミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これを容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社）、１％ｗ／ｖ水溶液）３ｍＬを添加した。これを４５℃でインキュベートを開始した。インキュベート開始前、開始後２４時間後に１ｍＬずつ反応混合物をサンプリングし、それぞれを９９℃で６０分間加熱した後、１４０００ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量３０００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製 マイクロコン ＹＭ−３)を用いて１４０００ｇで１００分間遠心分画し、ろ液を得た。これらのろ液をそのまま用いて上述の方法でＤＰＰ−４阻害活性を評価し、酵素処理前後の阻害活性を比較した。結果を、表３に示す。

小豆、とら豆、大手亡、いずれも酵素処理前にはＤＰＰ−４阻害活性は認められず、酵素処理を２４時間実施したものにＤＰＰ−４阻害活性が認められた。すなわち、ＤＰＰ−４阻害活性は、小豆、インゲン豆の水抽出物に認められるわけではなく、小豆、インゲン豆をそれぞれ酵素処理することにより初めて出現することが明らかとなった。

（実施例４）動物評価試験
実施例２で作製した小豆、とら豆、大手亡の酵素処理物と、実施例２と同様の方法で調製した脱脂大豆の酵素処理物の、生体内での実際の血糖降下作用について、経口グルコース負荷試験を用いて評価した。実験動物はＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＳＰＦ雄性マウス (日本クレア社） を１０週齢で使用した。２０匹のマウスを各群５匹ずつ、４群に分けた。一回の実験でコントロール群（蒸留水投与）、ポジティブコントロール群（シタグリプチン投与）とサンプル群２つの合計４群で評価を行い、この実験を２回実施して計４つのサンプルの評価を行った。
前日夕方より絶食したマウスの尾静脈より採血を行い、簡易式血糖測定器（グルテストエース；三和化学研究所）を用いて血糖値を測定し、プレ値（０分）とした。ポジティブコントロールはシタグリプチン１００ｍｇ錠（メルク社製）を乳鉢ですりつぶし、シタグリプチン量に換算して０．１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように水に懸濁したものを使用した。投与サンプルは実施例２で（またはその方法に準じて）作製した各豆類の酵素処理物を蒸留水で４００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解したものを用いた。蒸留水（コントロール群）、シタグリプチン懸濁液（ポジティブコントロール群）または豆類酵素処理物水溶液（サンプル群）をそれぞれ１０ｍＬ／ｋｇ体重で経口投与した。蒸留水、シタグリプチン懸濁液またはサンプル投与３０分後に、４０％グルコース水溶液を５ｍＬ／ｋｇ体重で経口投与した。グルコース経口投与３０、６０、１２０分後に尾静脈から採血し、プレ値と同様に血糖値を測定した。血糖値の測定結果を表４に示す。

脱脂大豆、小豆、とら豆、大手亡、いずれの蛋白質酵素処理物も、グルコース負荷後の血糖値の上昇を有意に抑制した。なかでも小豆の蛋白質酵素処理物の血糖値上昇抑制効果が優れていることが確認された。

（実施例５）α−グルコシダーゼ阻害の測定
実施例２で作製した小豆の蛋白質分解酵素処理物と、実施例２と同様の方法で調製した脱脂大豆の酵素処理物を、それぞれ１６．７ｍｇ／ｍＬの濃度になるように アッセイバッファーである０．２５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶解しサンプルとした。α−グルコシダーゼ活性の測定は以下のように行った。すなわち、９６ウェルプレートにサンプルを６０μＬ、コントロールのウェルにはアッセイバッファーを６０μＬ添加した。その後、１．２５Ｕ／ｍＬ（１０μｇ蛋白／ｍＬ）に調製した酵母由来α−グルコシダーゼ（オリエンタル酵母）を２０μＬ添加し、３７℃で１０分間プレインキュベートした。次に、アッセイバッファーに溶解した２５０ｍＭスクロース溶液２０μＬを添加し、３７℃で２０分間インキュベートを行った（反応時の酵素処理物の濃度は１０ｍｇ／ｍｌ）。インキュベート終了後、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ添加して反応を停止した。反応停止後、各ウェルの反応液５０μＬを別の９６ウェルプレートに移し、グルコースＣＩＩテストワコー試薬（和光純薬）２００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。インキュベート終了後、５０５ｎｍの吸光度を測定し、グルコース標準液を用いて作製した検量線から生成したグルコース量を定量した。なお、α−グルコシダーゼ活性は、コントロールにおけるα−グルコシダーゼ活性の値を１００％として、以下のように算出した。

α−グルコシダーゼ活性（％）＝（Ａ／Ｂ）ｘ１００
式中Ａはサンプルのグルコース量、Ｂはコントロールのグルコース量の値である。この時、α−グルコシダーゼ活性（％）が低いほど阻害活性が強いことを表す。得られた結果を表５に示す。

このように、脱脂大豆の酵素処理物、小豆の酵素処理物ともにα−グルコシダーゼ阻害活性が認められた。

（実施例６）小豆、大豆の蛋白質分解酵素処理物の呈味性比較
市販の小豆６ｇをミルにて粉砕したのち、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した。これ２つに分け、それぞれ別の容器に入れた後、水３０ｍＬと別途調製した蛋白質分解酵素液（ウマミザイムＧ（天野エンザイム株式会社；麹菌由来プロテアーゼ）１％w/v水溶液、又は、ブロメラインＦ（天野エンザイム株式会社；パイナップル由来プロテアーゼ）１％w/v水溶液）それぞれ３ｍＬを添加した。これを４５℃で２４時間インキュベートした後、１８００ｇ、３０分間遠心して分解されなかった残渣を取り除いた。上清を回収し、９９℃で６０分間加熱した後、再度１８００ｇ、３０分間遠心し、上清を回収した。これを分画分子量１００００の遠心式限外ろ過デバイス(ミリポア製 アミコンウルトラ−１５)を用いて１８００ｇ、６０分間遠心分画したろ液を凍結乾燥し、それぞれの小豆酵素処理物を得た。大豆の２種類の酵素処理物についても同様に作製した。

苦味試験は、得られた酵素処理物について５人のパネラーによる官能検査で行った。評価は以下のように点数を付けて行い、５人の平均を計算した。
５：苦味を感じない。
４：ほとんど苦味を感じない。
３：どちらとも言えない。
２：やや苦味を感じる。
１：苦味を感じる。
得られた結果を表６に示す。

このように、小豆酵素処理物、大豆酵素処理物共に、麹菌由来である酵素（ウマミザイム）を用いた酵素処理物は、植物由来の酵素（ブロメライン）を用いた酵素処理物に比べ、苦味が少ない点で優れていた。また、小豆酵素処理物と大豆酵素処理物では、小豆酵素処理物の方が苦味が少ない点で優れていた。

Claims (4)

1. 小豆、インゲン豆、またはその処理物を、水に懸濁及び／又は溶解した状態で、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）が産生する蛋白質分解酵素で処理することを特徴とするＤＰＰ−４阻害剤の製造方法。
2. 水に懸濁及び／又は溶解した状態で、アスペルギルス・オリゼが産生する蛋白質分解酵素で処理する工程が、小豆、インゲン豆、またはその処理物にアスペルギルス・オリゼを生育させた後、水を添加し、さらに反応させる工程である、請求項１記載のＤＰＰ−４阻害剤の製造方法。
3. 蛋白質分解酵素がペプチダーゼを含むものである請求項１または２記載のＤＰＰ−４阻害剤の製造方法。
4. 蛋白質分解酵素が、Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するものである請求項１または２記載のＤＰＰ−４阻害剤の製造方法。