KR20180138435A

KR20180138435A - 고혈압 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR20180138435A
Application number: KR1020170078639A
Authority: KR
Inventors: 전유진; 고주영; 이지혁; 강나래
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2018-12-31
Also published as: KR101991880B1

Abstract

본 발명은 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리된 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 펩티드가 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지므로, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.

Description

고혈압 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treating or preventing hypertension}

본 발명은 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드를 포함하는 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

고혈압은 전 세계적으로 성인의 15~20%가 겪고 있는 만성 순환기계 질환 중 발생빈도가 가장 높은 질환으로 비교적 증상이 없는 편이지만, 높은 혈압으로 인해 정상적인 기능을 유지하던 기관들이 서서히 그 기능을 상실하여 뇌졸중, 심부전, 관상동맥질환 등 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 보다 적극적이고 꾸준한 환자 관리와 치료가 요구되는 질환이다. 세계건강보건기구 (WHO)에서는 최고 혈압이 160 mmHg 이상이고 최저 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 고혈압으로 규정하고 있으며, 고혈압 질환의 종류로는 크게 원인이 불분명한 본태성 고혈압과 원인 질병에 의한 속발성 고혈압으로 구분되는데 이 중 90% 이상이 본태성 고혈압에 속하는 것으로 알려져 있으며, 전 세계적으로 약 6억명 이상의 사람들이 고혈압을 앓고 있으며, 이 고혈압 때문에 매년 3백만 명이 사망하고 있어 전 세계적인 과제로 떠오르고 있다.

생체 중에 존재하고 있는 불활성화 안지오텐신 I (Angiotensin I)은 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE)에 의하여 C-말단 His-Leu가 떨어져 나감으로써 혈관벽 수축 작용을 가지는 안지오텐신 II (Angiotensin II)로 전환되어 혈관을 수축하고, 신장에서 알도스테론의 분비를 증가시켜 체액량을 증가시킴으로써 혈압을 상승시키는 작용을 한다. 따라서 ACE의 활성을 억제시킴으로써 혈압상승의 원인이 되는 안지오텐신 II 생성 저하를 통해 혈압을 억제할 수 있다.

고혈압을 개선하기 위한 목적으로 에넬라프릴(enelapril)이나 라미프릴(Ramipril) 등의 ACE 저해제가 개발되어 상용되고 있으나 이러한 약제의 사용으로 인한 부작용으로 미각이상, 백혈구 감소, 혈관부종, 간기능 이상 등이 발견되었다.

따라서 천연물질로부터 항고혈압 효과를 가지는 연구에 대한 요구가 계속되었으며, 대두 단백질 가수분해물, 키토산, 밀크 카제인 등에서 분리된 ACE 저해제는 식품의약품안전처에 개별인정 기능성 식품으로 인정받았다.

생리활성 펩티드(Bioactive peptide)들은 다양한 단백질 가수분해효소를 통해 만들어질 수 있고, 천연물 유래의 펩티드들은 음식이 장내에서 소화되는 동안 신진대사 과정에서 잠재적인 생리적 조절자로 기능할 수 있다. 또한 구조, 조성, 아미노산 서열에 따라 항산화, 항균, 항고혈압 효능 등을 기대할 수 있다.

종래 화학 합성 방법 등을 통하여 제조되었던 고혈압 제제들이 부작용 등의 문제가 발생됨에 따라, 최근 세계 각국에서는 천연 물질로부터 항고혈압 효과를 갖는 물질을 얻기 위한 노력이 지속되고 있다. 또한, 각국에서는 의약품은 물론이고, 효소와 건강보조제와 같은 식품 소재 등 다양한 용도에 활용될 수 있는 새로운 물질을 탐색하기 위하여 자연 상태의 생물, 특히 대량 배양 및 번식이 용이한 생물에 대한 연구도 활발하게 진행하고 있다.

한편, 해양생물은 육상생물에 없는 특유의 대사과정과 독특한 환경으로 인하여 다양한 신규 생리활성물질의 탐색 기능성을 가지고 있다. 또한, 육상생물은 이미 많은 연구가 진행되었으나 해양생물은 아직 충분하게 연구되지 않아서 새로운 유용성을 가진 천연물질 개발에 대한 기대치가 높은 분야이기도 하다.

국내등록특허 제10-1150425호

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자는 가수분해 효소인 알파키모트립신(α-chymotrypsin)을 이용한 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물을 제조하였으며, 상기 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 특정 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성이 있는 것을 확인하였다.

따라서, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)로, 상기 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물은 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 추가로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 약학 조성물은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 Val-Cys-Ser-Val (VCSV)일 수 있다.

상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물에서 분리될 수 있으며, 상기 가수분해물은 알파키모트립신(α-chymotrypsin)의 가수분해물일 수 있다.

본 발명에서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 넙치의 알파키모트립신(α-chymotrypsin) 가수분해물을 제조하였으며, 가수분해물을 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만) 분자량별로 분리하였으며, <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물(fraction)에서 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효과를 보이는 IC₅₀ 값이 0.732 ㎍/ml로 가장 낮아서, 항고혈압 활성이 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물(fraction)에서 가장 우수한 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 ACE 저해 효능이 가장 좋았던 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물로 Sephadex G-25을 이용한 겔 크로마토그래피를 실시하여 총 4개의 fractions을 얻었으며(Fr.1 ~ Fr.4), 상기 4개의 fractions 중에서 fraction 4(Fr.4)에서 ACE 저해 효능을 갖는 IC₅₀ 값이 0.689 mg/ml로 가장 낮아서 ACE 저해 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 따라서, 상기 Fraction 4에서 ODS 컬럼을 이용하여 펩티드를 분리하고자, 0.1% FA/H2O와 0.1% FA/Acetonitrile 용액으로 선형상 농도구배법 (0-100% acetonitrile, 30 min)으로 용출(1 ml/min)시켜 분리한 결과, 3개의 분획물(Fr.4-1 ~ Fr.4-3)을 얻었으며, Fr.4-2와 Fr.4-3에서 우수한 ACE 저해 활성이 있음을 확인하여 이 둘의 fractions에서 상기 서열번호 1과 2으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 분리하였다.

상기 ACE(Angiotensin I converting enzyme)는 데카펩티드(decapeptide)인 안지오텐신I으로부터 다이펩티드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로써 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신Ⅱ로 전환시키는 역할을 하는 효소이다. 안지오텐신Ⅱ의 증가는 강한 혈압 상승 작용과 항이뇨 호르몬인 알도스테론(aldosterone)의 분비를 촉진하고 물과 나트륨의 배설을 억제하여 순환 혈액량을 증가시킴으로써 고혈압을 일으키게 한다. 또한 ACE는 혈관 이완 작용을 하는 브레디키닌(bradykinin)을 분해하여 불활성화시킴으로써 결과적으로 혈압 상승을 유발하는 역할을 한다.

본 발명에서 상기 넙치의 학명은 Paralichthys olivaceus이며, 몸길이는 60cm가량이며, 모양은 위아래로 넓적한 긴 타원형이다. 입이 크고 이빨이 잘 발달되어 있으며, 눈은 몸의 왼쪽에 있다. 눈이 있는 쪽은 진한 황갈색 바탕에 흑색 및 백색 반점이 흩어져 있으나, 눈이 없는 쪽은 백색이다. 수심 10-200m연안의 모래나 펄 지역에 서식하며, 2-6월에 산란한다. 우리나라 전 연안에 출현하며, 쿠릴 열도, 일본, 남중국해에 분포한다. 넙적한 체형 때문에 흔히 '광어'라고 부르며, 눈이 왼쪽에 있기 때문에 일반적으로 눈이 오른쪽에 있는 가자미류와 쉽게 구별된다.

본 발명의 용어 "고혈압(hypertension)"과 관련하여, 세계건강보건기구 (WHO)에서는 최고 혈압이 160 mmHg 이상이고 최저 혈압이 95 mmHg 이상인 경우를 고혈압으로 규정하고 있으며, 고혈압 질환의 종류로는 크게 원인이 불분명한 본태성 고혈압과 원인 질병에 의한 속발성 고혈압으로 구분되는데 이 중 90% 이상이 본태성 고혈압에 속하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 고혈압의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 고혈압 발병 의심 개체에 투여하여 고혈압에 의한 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서는 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 서열번호 1과 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드들이 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지는 것을 확인하여, 상기 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물에 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 상기 펩티드들을 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 펩티드는 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 고혈압 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물 을 제공한다.

본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)로, 상기 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물은 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서, 상기 식품 조성물은 추가로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서, 상기 펩티드와 고혈압, 넙치, 예방에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서의 용어, "개선"은 상기 서열번호 1과 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 이용하여 예방 또는 치료되는 고혈압과 같은 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 서열번호 1과 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 고혈압의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 상기 펩티드들을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.

상기 식품 조성물에는 상기 서열번호 1과 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있는 바, 본 발명에서 상기 식품 조성물은 건강기능식품일 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 상기 펩티드는 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 각 분자량별 분획물과 상기 분획물에서 분리된 펩티드는 안지오텐신 I 전환 효소 (Angiotensin I converting Enzyme, ACE) 저해 활성을 가지므로, 상기 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 분획물에서 분리된 펩티드들을 이용하여, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 사용할 수 있다.

도 1은 Sephadex G-25을 이용한 넙치 근육 가수분해물의 겔 크로마토그래프를 이용한 4개의 fractions의 분리 결과이다.
도 2는 ODS 컬럼을 이용한 넙치 근육 가수분해물의 5 kDa 미만 분획물에서 분리된 Fraction 4에서 다시 분리된 3개의 분획물을 나타낸다(Fr.4-1~Fr.4-3).
도 3은 Fr.4-2에서 분석된 펩티드의 아미노산 서열 분석 결과(Val-Cys-Ser-Val)와 분자량을 나타낸다.
도 4는 Fr.4-3에서 분석된 펩티드의 아미노산 서열 분석 결과 Cys-Ala-Ala-Pro 와 분자량을 나타낸다.
도 5는 넙치 근육 가수분해물 유래 펩티드의 Molecular docking 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 CAAP 펩티드의 효소 저해 패턴을 분석한 결과이다.
도 7은 CAAP 펩티드의 선천성 고혈압쥐에서의 혈압강하 효능을 나타낸다.
도 8은 CAAP 펩티드의 혈관내피세포에서의 NO 생성량을 나타낸다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1. 넙치 근육의 가수분해물의 제조

본 발명에 사용된 재료는 제주도 수산시장에서 구입한 넙치(Paralichthys olivaceus)를 사용하였으며, 넙치 근육의 뼈를 발라내고 저미고(fillet) 수세 및 동결건조 후 균일하게 되도록 마쇄한 후 -70℃에 보관하면서 사용하였다.

넙치 근육의 가수분해물은 넙치 근육의 동결 건조물을 단백질 가수분해 효소 α-chymotrypsin을 사용하여 최적조건으로(pH 8, 37) 기질 대 효소비 1000:1(중량비)로 18 시간 동안 가수분해하였다. 반응이 끝난 후에는 효소를 불활성화시키기 위해 100℃에서 10분간 끓이고, pH를 7.0으로 맞춰주었다. 3,500 rpm에서 20분간 원심분리하여 필터한 후에 동결건조하여 -70℃에 보관하면서 샘플로 사용하였다.

실시예 2: 넙치 근육의 가수분해물 유래 분자량별 분획물의 ACE 저해 활성

실시에 1에서 제조된 넙치 근육의 α-chymotrypsin 가수분해물에서 ACE 저해 효과를 가지는 펩티드를 함유하는 분획물을 분리하고자 하였다. 이에, 한외여과막을 이용하여 실시에 1에서 제조된 넙치 근육의 α-chymotrypsin 가수분해물을 >10 kDa(10 kDa 초과), 5-10 내지 kDa, <5 kDa(5 kDa 미만) 분자량별로 분리하였다.

표 1은 넙치 근육의 α-chymotrypsin 가수분해물의 분자량별 분획물(fraction)에 따른 ACE(Angiotensin I converting Enzyme) 저해 효능을 평가하여 항고혈압 활성을 측정한 결과이다. 그 결과 분자량에 따른 항고혈압 활성을 측정한 결과 분자량이 낮을수록 항고혈압 활성이 증가하는 것을 확인하였고, 5 kDa 미만의 분획물이 활성이 가장 좋았다.

실시예 3: 항고혈압 활성의 펩티드 분리 및 구조 분석

실시예 2에서 ACE 저해 효능이 가장 좋았던 <5 kDa(5 kDa 미만)의 분획물로 Sephadex G-25을 이용한 겔 크로마토그래피를 실시하여 총 4개의 fractions을 얻었으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다(Fr.1 ~ Fr.4). 도 1은 Sephadex G-25을 이용한 넙치 근육가수분해물의 겔 크로마토그래프 결과이다.

얻어진 4개의 fractions들의 항고혈압 활성 측정결과 fraction 4(Fr.4)에서 ACE 저해 효능을 가지는 IC₅₀ 값이 0.689 mg/ml로 가장 낮아서 ACE 저해 효과가 가장 우수함을 확인하였다.

상기 Fraction 4에서 ODS 컬럼을 이용하여 펩티드를 분리하고자, 0.1% FA/H2O와 0.1% FA/Acetonitrile 용액으로 선형상 농도구배법 (0-100% acetonitrile, 30 min)으로 용출 (1 ml/min)시켜 분리한 결과, 3개의 분획물을 얻을 수 있었다. 도 2는 ODS 컬럼을 이용한 넙치 근육 가수분해물의 5 kDa 미만 분획물에서 분리된 Fraction 4에서 다시 분리된 3개의 분획물을 나타낸다(Fr.4-1 ~ Fr.4-3).

이들 분획물들의 ACE 저해 효능을 측정하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

그 결과 Fr.4-2와 Fr.4-3에서 우수한 ACE 저해 활성이 있음을 확인하여 이 둘의 fractions의 아미노산 서열을 분석하기로 하였다. 펩티드들의 분자량 및 아미노산 서열을 Q-TOF mass spectrometer (Micromass, Altrincham, UK) electrospray ionization (ESI)을 사용하여 측정하고 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다. 도 3과 4는 Fr.4-2와 Fr.4-3의 펩티드 아미노산 서열 분석 결과를 나타낸다. 그 결과, Fr.4-2 분획물의 아미노산 서열은 Val-Cys-Ser-Val (VCSV)이였으며, 분자량은 406.1 Da, Fr.4-3 분획물은 Cys-Ala-Ala-Pro (CAAP)이였으며, 분자량은 360.1 Da으로 나타났다.

실시예 4: ACE 저해 펩티드의 Molecular docking 분석

Molecular docking 분석은 단백질(효소)-리간드(ACE 저해 펩티드) 복합체의 결합 가능성(효소 active site 결합위치 및 ACE 저해 펩티드의 결합위치) 및 결합 에너지 값을 예측할 수 있는 프로그램이다. Protein Data Bank (PDB, http://www.rcsb.org)에서 단백질의 3차원 구조를 제공받아 사용하고 (ACE, PDB: 1O86) Accelrys Discovery Studio (DS) 3.5 (Accelrys, Inc)의 Flexible Docking 프로그램을 활용하여 분석하였다.

도 5는 넙치 근육 가수분해물 유래 펩티드의 Molecular docking 분석 결과를 나타낸다. 상기, VCSV 펩티드는 ACE의 아미노산인 Glu 162, Gln 281, Lys 511, ASP 415과 수소결합을 하고 있으며, CAAP 펩티드는 Asp 358, Tyr 360과 수소결합, Phe 391과 Pi 결합, Zn과 결합하는 것으로 나타났다. 이들의 Binding energy는 각각 -199 kcal/mol, -242 kcal/mol이였으며, CDOCK interaction energy는 -59.94 kcal/mol, -52.56 kcal/mol로 CAAP 펩티드가 VCSV 펩티드 보다 ACE 효소를 더 잘 저해함을 확인할 수 있었다.

실시예 5: ACE 저해 펩티드( CAAP )의 효소저해패턴 분석

가장 ACE 저해활성이 좋았던 CAAP 서열을 갖는 펩티드의 효소저해패턴을 분석하였다. 이를 위해 0.01 mg/ml, 0.03 mg/ml 및 0.06 mg/ml 농도의 펩티드를 대상으로 효소 활성을 측정하였는데, 효소 활성은 기질(HHL)의 농도로 측정하였다. 저해제 존재하에서 ACE 저해활성 경향은 Lineweaver-Burk plot에 의해 결정하였다. 도 6은 CAAP 펩티드의 효소 저해 패턴을 분석한 결과이다. 그 결과, CAAP 펩티드는 농도의존적으로 ACE 저해활성을 갖는 것으로 나타났으며, 기질과 경쟁적 저해를 통해 ACE와 결합하는 것을 확인하였다. 참고로 도 6에서 1/V[uM/min]과 1/S[1/mM]는 각각 반응속도 및 기질의 역수를 의미한다.

실시예 6: ACE 저해 펩티드( CAAP )의 선천성 고혈압쥐(SHR)을 통한 혈압강하 효능 확인

꼬리 수축기 혈압이 180 mmHg 이상의 선천성 고혈압쥐 (10주령, specific pathogen-free, 체중 250-300 g, n=6)를 약 24℃, 12시간 명암 주기 조건의 사육실에서 개별 사육하였다. 혈압강하 효과는 CODATM blood pressure monitor (Kent Scientific Corp., Torrington, USA)를 이용하여 선천성 고혈압쥐의 꼬리 혈압의 시간별 변화로 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 CAAP 펩티드의 선천성 고혈압쥐에서의 혈압강하 효능을 나타낸다. 음성대조군으로는 생리식염수 (Saline), 양성대조군으로는 고혈압 치료제로 사용되고 있는 captopril을 40 mg/kg의 농도로 생리식염수에 녹여 경구투여 하였다. 그 결과, captopril과 CAAP 펩티드를 투여한 그룹에서 4시간까지 유의적으로 혈압이 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 7: ACE 저해 펩티드( CAAP )의 혈관내피세포를 통한 산화질소(Nitric oxide) 생성 확인

Huvec (Human Umbilical Vein Endothelial Cells)를 EGM-2 Bulletkit이 함유된 EBM-2 배지에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였고, 3 내지 6회 계대 배양한 세포만을 실험에 사용하였다. 혈관확장은 eNOS (Endothelial Nitric Oxide Synthase)에 의해 생성되는 NO(Nitric Oxide)에 의해 일어나므로 혈관내피세포에서 ACE 저해 펩티드가 NO를 생성할 수 있는지 확인하기로 하였다. 정확한 NO 생성량을 확인하기 위하여 특이적으로 NO를 형광 발현시키는 DAF-FM DA (4-amino-5-methylamino-2’, 7’-difluorofluorescein diacetate)를 이용하였다. 혈관내피세포를 96 well plate에 1ⅹ105 cells/well이 되도록 분주한 후 16시간 동안 배양하였다. CAAP 펩티드, 양성대조군으로 식품의약품안전처에 혈압강하 효과를 가진다고 개별인정기능성 식품으로 인정받은 정어리펩티드(VY) 및 가쓰오부시올리고 펩티드(LKPAM)를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양시킨 후, DAF-FM DA solution (500 μM)을 처리하여 형광 발현량을 측정(Excitation wavelength 485 nm, Emission wavelength 520 nm)하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 CAAP 펩티드의 혈관내피세포에서의 NO 생성량을 나타낸다. 그 결과, Control에 비해서 양성대조군과 CAAP 펩티드에서 NO 생성량이 현저히 발생함을 확인하였고, CAAP 펩티드의 경우 50 ㎍/ml 농도에서 NO가 가장 많이 발생함을 확인할 수 있었다. 따라서, CAAP 펩티드의 경우 혈관확장에 관여하는 NO(Nitric Oxide) 생성을 증가시켰는 바, 혈관수축을 억제하고 혈관을 확장 또는 이완하여 고혈압을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

통계처리

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error (SE) 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 Duncan test 분석방법을 사용하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

<110> Jeju National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for treating or preventing hypertension <130> DP20170045 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Paralichthys olivaceus <400> 1 Cys Ala Ala Pro 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Paralichthys olivaceus <400> 2 Val Cys Ser Val 1

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 추가로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물에서 분리된 것인, 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 가수분해물은 알파키모트립신(α-chymotrypsin)의 가수분해물인 것인, 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 넙치(Paralichthys olivaceus) 근육의 가수분해물의 5 kDa 미만의 분획물에서 분리된 것인, 약학 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 고혈압 개선 또는 예방용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 추가로 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 더 포함하는 것인, 식품 조성물.
제6항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물.