CZ2003195A3 - Peptidové inhibitory serinové proteázy NS3 a farmaceutický prostředek - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových inhibitorů proteázy 5 hepatitidy C („HCV“), farmaceutických prostředků s obsahem jednoho nebo více těchto inhibitorů a použití pro léčení hepatitidy C a souvisejících onemocnění. Vynález zvláště popisuje nové peptidové sloučeniny jako inhibitory serinové proteázy NS3/NS4a viru HCV.

Dosavadní stav techniky

Virus hepatitidy C (HCV) je pozitivní jednořetězcový RNA virus, který je podle předpokladů hlavním činitelem vyvolávajícím non-A, non-B hepatitidu (NANBH), zvláště s krví asociovanou NANBH (BBNANBH) (viz mezinárodní patentová přihláška No. WO 89/04669 a evropská patentová přihláška No. EP 381 216). NANBH je třeba odlišovat od jiných typů jaterních onemocnění indukovaných viry, jako je onemocnění vyvolané virem hepatitidy A (HAV), virem hepatitidy B (HBV), virem hepatitidy delta (HDV), cytomegalovirem (CMV) a virem Epstein-Barrové (EBV), stejně jako od jiných forem jaterních onemocnění jako je alkoholismus a primární cirrhosa jater. V nedávné době byla identifikována, klonována a exprimována proteáza HCV nezbytná pro zpracování (processing) polypeptidů a replikaci viru; viz například US patent No. 5,712,145. Tento polyprotein o přibližné délce 3000 aminokyselin obsahuje, od aminového konce ke karboxylovému konci, protein nukleokapsidy (C), proteiny obalu (E1 a E2) a několik nestrukturních proteinů (NS1, 2, 3, 4a, 5a a 5b). NS3 je protein o velikosti přibližně 68 kDa kódovaný přibližně 1893 nukleotidy genomu HCV, který obsahuje dvě odlišné domény; (a) doménu serinové • ·

proteázy, která se skládá z přibližně 200 N-koncových aminokyselin; a (b) doménu RNA-dependentní ATPázy na C-konci proteinu. Předpokládá se, že proteáza NS3 patří do skupiny chymotrypsinových proteáz z důvodů své podobnosti v sekvenci proteinu, celkové trojrozměrné struktuře a mechanismu katalýzy. Jiné enzymy podobné chymotrypsinu jsou elastáza, faktor Xa, thrombin, trypsin, plasmin, urokináza, tPA a PSA. Serinová proteáza viru HCV NS3 je odpovědná za proteolýzu polypeptidu (polyproteinu) ve spojeních NS3/NS4a, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a a NS5a/NS5b a je tedy odpovědná za vytvoření čtyř virových proteinů v průběhu replikace viru. Serinová proteáza NS3 viru HCV je tedy přitažlivým cílem pro antivirovou chemoterapii.

Bylo zjištěno, že protein NS4a, což je polypeptid o délce přibližně 6 kDa, je kofaktorem aktivity serinové proteázy u proteázy NS3. Autologní štěpení spojení NS3/NS4a serinovou proteázou NS3/NS4a probíhá intramolekulárně (tj. cis), zatímco jiná místa štěpení jsou zpracována intermolekulárně (tj. trans).

Analýza přirozených štěpících míst proteázy HCV odhalila přítomnost cysteinu v místě P1 a šeřinu v místě ΡΓ a skutečnost, že tyto zbytky jsou ve spojeních NS4a/NS4b, NS4b/NS5a a NS5a/NS5b přísně konzervovány. Spojení NS3/NS4a obsahuje threonin v místě P1 a serin v místě P1’. Substituce Cys->Thr v místě NS3/NS4a podle předpokladů odpovídá za požadavek cis namísto trans zpracování v místě tohoto spojení, viz např. Pizzi a další (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 91: 888 - 892, Failla a další (1996), Folding & Design 1: 35 - 42. Štěpící místo NS3/NS4a je také tolerantnější vůči mutagenezi než jiná místa, viz např. Kollykhalov a další (1994), J. Virol. 68: 7525 7533. Bylo také zjištěno, že pro účinné štěpení jsou nezbytné kyselé zbytky v oblasti proti směru transkripce vzhledem k místu štěpení, viz např. Komoda a další (1994), J. Virol. 68: 7351 - 7357.

- 3 - ····

Mezi již popsané inhibitory proteázy HCV patří antioxidanty (viz mezinárodní patentová přihláška No. WO 98/14181), některé peptidy a peptidové analogy (viz mezinárodní patentová přihláška No. WO 98/17679, Landro a další (1997), Biochem. 36: 9340 - 9348, lngallinella a další (1998), Biochem. 37: 8906 - 8914, Llinas- Brunet a další (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett. 8: 1713 - 1718), inhibitory založené na polypeptidu o délce 70 aminokyselin eglin c (Martin a další (1998), Biochem. 37: 11459 - 11468), inhibitory afinitně selektované z lidského pankreatického sekrečního inhibitoru trypsinu (hPSTI-C3) a miniprotilátky, tzv. minibody repertoires (MBip) (Dimasi a další (1997), J. Virol, 71: 7461 - 7469), cV_HE2 („kamelizovaná“ variabilní doména fragmentu protilátky) (Martin a další (1997), Protein Eng. 10: 607 - 614), a cd-antichymotrypsin (ACT) (Elzouki a další (1997), J. Hepat. 27: 42 - 28). Nedávno byl popsán ribozym navržený pro selektivní ničení RNA viru hepatitidy C (viz BioWorld Today 9 (217: 4 (10. listopadu 1998)).

Je možno odkázat také na zveřejněné přihlášky PCT No. WO 98/17679, zveřejněná 30. dubna 1998 (Vertex Pharmaceuticals Incorporated); WO 98/22496 zveřejněná 28. května 1998 (F. Hoffmann-La Roche AG); a WO 99/07734, zveřejněná 18. února 1999 (Boehringer Ingelheim Canada Ltd.).

Předpokládá se, že virus HCV se účastní cirrhosy jater a indukce hepatocelulárního karcinomu. Prognóza pro pacienty trpící infekcí HCV je v současnosti špatná. Infekci HCV je možné léčit obtížněji než jiné formy hepatitidy v důsledku nedostatku inuminy nebo návratu onemocnění v souvislosti s infekcí HCV. Současné údaje ukazují, že po diagnóze cirrhosy je míra přežití po čtyřech letech 50 %. Pacienti s diagnózou lokalizovaného resektovatelného hepatocelulárního karcinomu mají míru přežití 5 let 10 až 30 %, zatímco pacienti s lokalizovaným neresektovatelným hepatocelulárním karcinomem mají míru přežití 5 let nižší než 1 %.

-4 Odkazuje se také na článek A. Marchetti a další, Synleff, S1, 1000 - 1002 (1999), ve kterém se popisuje syntéza bicyklických analogů inhibitoru proteázy NS3 viru HCV. Tam popisovaná sloučenina má vzorec:

Je možno také odkázat na Článek autorů W. Han a další, Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. (2000) 10, 711 - 713, který popisuje přípravu některých a-ketoamidů, α-ketoesterů a a-diketonů obsahujících allylové a ethylové funkční skupiny.

Je také možno odkázat na WO 00/09558 (Přihlašovatel:

Boehringer Ingelheim Limited; zveřejněno 24. února 2000), kde se popisují peptidové deriváty vzorce:

R₂ \

přičemž v uvedené přihlášce jsou definovány různé skupiny v tomto vzorci. Ilustrativní sloučenina této řady je:

- 5 • ·«

Je možno také odkázat na dokument WO 00/09543 (přihlašovatel: Boehringer Ingelheim Limited; zveřejněný 24. února 2000), kde se popisují peptidové deriváty vzorce:

Ai \

a kde se definují různé substituenty obsažené v tomto vzorci. Pro ilustraci této řady sloučenin je možno uvést sloučeninu:

- 6 • · · ·

Současné způsoby léčení hepatitidy C zahrnují léčbu interferonem-α (INFa) a kombinovanou terapii ribavirinem a interferonem, viz např. Beremguer a další (1998), Proč. Assoc. Am. Physicians 110 (2): 98 - 112. Tyto způsoby léčení však mají nízkou míru trvalé odezvy a časté vedlejší účinky, viz např. Hoofnagle a další (1997), N. Engl. J. Med. 336: 347. V současnosti není k dispozici žádná vakcina proti infekci HCV.

V některých dalších US patentových přihláškách se popisují různé typy peptidů jako inhibitorů serinové proteázy NS-3 viru hepatitidy C.

Je tedy zapotřebí nalézt nové způsoby léčení a ošetření infekce virem HCV. Předmětem tohoto vynálezu je tedy poskytnutí sloučenin použitelných při léčení nebo prevenci nebo odstranění jednoho nebo více příznaků hepatitidy C.

Dalším předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu léčení nebo prevence nebo odstranění jednoho nebo více příznaků hepatitidy C.

- 7 • · · · ·

Ještě další předmět předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobů modulace aktivity serinových proteáz, zvláště serinové proteázy NS3/NS4a viru HCV, s použitím popisovaných sloučenin.

Dalším předmětem je poskytnutí způsobů modulace zpracování 5 (processingu) polypeptidu HCV s použitím popisovaných sloučenin.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje ve svých mnoha provedeních novou skupinu inhibitorů proteázy HCV, farmaceutické prostředky s obsahem jedné nebo více těchto sloučenin, způsoby přípravy farmaceutických prostředků s obsahem jedné nebo více těchto sloučenin a způsoby léčení, prevence nebo odstranění jednoho nebo více příznaků hepatitidy C. Poskytují se také způsoby modulace interakce polypeptidu HCV s proteázou HCV. Mezi zde poskytovanými sloučeninami jsou výhodné sloučeniny, které inhibují aktivitu serinové proteázy NS3/NS4a viru HCV. Předkládaný vynález poskytuje různé peptidové sloučeniny obsahující uspořádání aminokyselin od P3 do P2’.

V prvním provedení poskytuje předkládaný vynález sloučeninu

2o vzorce I:

vzorec I kde:

G, J a Y jsou nezávisle zvoleny ze skupin: H, alkyl, alkylaryl, heteroalkyl, heteroaryl, arylheteroaryl, alkylheteroaryl, cykloalkyl, alkyloxy, alkylaryloxy, aryloxy, heteroaryloxy, heterocykloalkyloxy, cykloalkyloxy, alkylamino, arylamino, alkylarylamino, arylamino, heteroarylamino, cykloalkylamino nebo heterocykloalkylamino s podmínkou, že skupina Y může být popřípadě substituována X¹¹ nebo X¹²;

X¹¹ je alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, heterocyklyl, heterocyklylalkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, heteroaryl, alkylheteroaryl, nebo heteroarylalkyl, s podmínkou, že skupina

X¹¹ může být navíc popřípadě substituována skupinou X¹²;

X¹² je hydroxy, alkoxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino, arylamino, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkylsulfonamido, arylsulfonamido, karboxy, karbalkoxy, karboxamido, alkoxykarbonylamino, alkoxykarbonyloxy, alkyiureido, arylureido, halogen, kyano, nebo nitro, s podmínkou, že skupina alkyl, alkoxy, a aryl může být navíc popřípadě substituována skupinami zvolenými ze skupiny X¹²;

R¹ je COR⁵ nebo B(OR)2, kde R⁵ je H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF3,

2o C₂F₅, C₃F₇, CF₂R₆, R₆ nebo COR⁷, kde R⁷ je H, OH, OR⁸,

CHR⁹R¹⁰, nebo NR⁹R¹⁰, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, CH(R¹’)COOR¹¹, CH(R¹’)CONR¹²R¹³,

CH(R¹')CONHCH(R²’)COOR¹¹,

CH(R¹’)CONHCH(R²')CONR¹²R¹³,

CH(R¹')CONHCH(R²')R’,

CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³’)COOR¹¹,

CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONR¹²R¹³,

CH(R¹’)CONHCH(R²')CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)COOR¹¹,

CH(R¹ )CONHCH(R² )CONHCH(R³ )CONHCH(R⁴)-CONR¹²R¹³,

CH(R¹’)CONHCH(R²')CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴')CONHCH5 -(R⁵)COOR¹¹, a

CH(R¹ )CONHCH(R² )CONHCH(R³ )CONHCH(R⁴ )CONHCH-(R⁵)CONR¹²R¹³, kde

R¹', R², R³, R⁴, R⁵, R¹¹, R¹², R¹³ a R’ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, io alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl a heteroaralkyl;

Z je zvoleno z O, N, nebo CH;

W může být přítomna nebo nepřítomna, a pokud je W přítomna, je W zvolena ze skupiny C=O, C=S, nebo SO2; a

R, R², R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H; C1 -C10-alkyl; C215 C10-alkenyl; C3-C8-cykloalkyl; C3-C8-heterocykloalkyl, alkoxy, aryloxy, alkylthio, arylthio, amino, amido, ester, karboxylové kyselina, karbamát, močovina, keton, aldehyd, kyano, nitro; atom kyslíku, atom dusíku, atom síry a fosforu (kde počet uvedených atomů kysiíku, dusíku, síry nebo fosforu může být 0 až 6);

(cykloaikyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, kde uvedený cykloalkyl je vytvořen ze 3 až 8 atomů uhlíku, a 0 až 6 atomů kyslíku, dusíku, síry nebo fosforu, kde uvedený alkyl má 1 až 6 atomů uhlíku; aryl; heteroaryl; alkylaryl; a alkylheteroaryl;

kde uvedené skupiny alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl mohou být popřípadě substituovány, přičemž termín „substituovaný“ označuje případnou a chemicky vhodnou substituci jednou nebo více

skupinami zvolenými ze skupiny alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocykl, halogen, hydroxy, thio, alkoxy, aryloxy, alkylthio, arylthio, amino, amido, ester, karboxylové kyselina, karbamát, močovina, keton, aldehyd, kyano, nitro, sulfonamid, sulfoxid, sulfon, sulfonylmočovina, hydrazid, a hydroxamát.

Mezi výše uvedenými definicemi různých skupin vzorce I jsou výhodné skupiny následující:

Výhodná definice pro R¹ je COR⁵, kde R⁵ je H, OH, COOR⁸ nebo io CONR⁹R¹⁰, kde R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou definovány výše. Výhodná skupina pro R¹ je COCONR⁹R^W, kde R⁹ je H a R¹⁰ je H, CH(R¹’)COOR¹¹, CH(R¹')CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹,

CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONR¹²R¹³ nebo CH(R¹')CONHCH(R²')(R'). Mezi těmito skupinami jsou výhodné skupiny ve významu R¹⁰:

CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R^r)CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')(R’), kde R^r je H nebo alkyl, heteroalkyl a R² je fenyl, substituovaný fenyl, heteroatomem substituovaný fenyl, thiofenyl, cykloalkyl, heteroatomem substituovaný cykloalkyl, piperidyl a pyridyl. Výhodnější skupiny pro R¹’ je H, a pro R¹¹ je H nebo terc20 butyl; R’ je hydroxymethyl; a

R² je zvoleno ze skupiny:

kde:

• «· ·· · » ώ · · • · « • 4 «··

U¹ a U² mohou být stejné nebo různé a jsou zvoleny ze skupiny H, F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂CONH₂, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, azido, amino, hydroxyl, substituovaný amino, substituovaný hydroxyl;

U³ a U⁴ mohou být stejné nebo různé a znamenají O nebo S;

U⁵ je zvoleno ze skupiny zahrnující alkylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, alkoxykarbonyl, aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylmainokarbonyl, heteroarylaminokarbonyl nebo jejich kombinace; a

NR¹²R¹³ je zvoleno ze skupiny:

NH₂, NHMe, N(Me)OMe, NMe₂,

Me

		JL-Me HN^Me
	hn^Y°h PJe	Me Me

O O O O' kde U⁶ je H, OH, nebo OH₂OH.

Výhodné skupiny ve významu R² jsou:

• ·

Výhodné skupiny ve významu R³ jsou:

O “COOH • · » · · · ·

COOH

X

O CH₃

CH₃ ch₃H3C

COOH ch₃J

H₃c ^SCHs H₃ř^S^^C00B ch_3xI

cf₃

CH₃ i _hCH3 f₃c· kde R³¹ = OH, nebo O-alkyl.

Navíc může mít skupina R³ také význam:

kde Y¹⁹ je zvoleno z následujících skupin:

X ^h₃

Ještě dále může mít skupina R³ význam:

γ2Ω kde Y²⁰ je zvoleno z následujících skupin:

Nejvýhodnější skupiny ve významu R³ jsou:

OOH

Ό0Η

CH₃'

ČFs

Navíc může být skupina Z-C-R³ ve vzorci I, kde R⁴ není přítomno, reprezentována následujícími strukturami:

nzuw

- 15 Některé další výhodné skupiny jsou: pro Z je výhodná skupina N, pro R⁴ je H, a pro W je C=O, nebo SO₂. Výhodné skupiny ve významu Y jsou:

Mi

Me'

H' θ'³ ' 0-3 °~¹

Mi

Me'

Mé

Me'

kde:

• · · «

- 16 • · · ·

Y¹¹ je zvolena ze skupiny H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)₂, 1-triazolyl, 1-imidazolyl a NHCH₂COOH;

Y¹² je zvoleno ze skupiny H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl, 5 nebo Br.

Skupina Y může také znamenat:

kde:

Y¹³ je zvoleno z následujících skupin

a Y¹⁴ je zvoleno z MeSO₂, Ac, Boc, 'Boc, Cbz, nebo Alloc. Další výhodné struktury pro skupinu Y jsou:

^CH3Vý/ chatv how/vv

CH3 CHs 1-2. CHa

- 1710

CH₃ ch₃ <?3H7

C₃H₇<Z

COOH ^H3<kHy πθθθα^ΟΗ?'

Λ ** *

0-2

CHsCH₃

HaCH₃

HsCOOC^^^V“

HOOHOOC'

HOO ch₃

Hooc^y %ry

0-4 —y H₃COO(X^y

COOH hooc y >* ch₃ ch₃ ^ΗηΛ

HOO

COOH

kde

Y¹⁵ a Y¹⁶ mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny alkyl, aryl nebo heteroalkyi, nebo heteroaryl.

Ještě další významy skupiny Y jsou:

Cl ‘cooch₃

‘Cl

kde:

Y¹⁷je CF₃, N0_2i CONH_2i OH, COOCH₃, OCH₃, OC₆H₅, C₆H₅, COC₆H₅, NH₂, nebo COOH;

Y¹⁸ je COOCH3, NO₂, N(CH₃)₂, F, OCH3, CH2COOH, COOH, SO₂NH₂, nebo NHCOCH3.

Výhodné skupiny ve významu J jsou:

ch₃.

SnOOC-s^y HOOC-x^y w

ch₃

Výhodné skupiny ve významu G jsou:

H3 ’ch₃

:O.OH • · · · ?h₃

ch₃

Pokud není definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny používané v předkládané přihlášce mají stejný význam běžně používaný odborníky v oboru, do kterého předkládaný vynález patří.

Tak například termín alkyl (včetně alkylových částí skupiny alkoxy) označuje jednovaznou skupinu odvozenou od přímého nebo rozvětveného nasyceného uhlovodíku odstraněním jednoho atomu, s obsahem 1 až 8 atomů uhlíku, s výhodou od 1 do 6;

aryl znamená karbocyklickou skupinu obsahující od 6 do 14 atomů uhlíku a alespoň jeden benzenoidní kruh, přičemž jako místa navázání substituentů jsou možné všechny dostupné substituovatelné aromatické atomy uhlíku karbocyklické skupiny. Výhodné arylové skupiny zahrnují fenyl, 1-naftyl, 2-naftyl a indanyl, zvláště fenyl a substituovaný fenyl;

aralkyl znamená skupinu obsahující arylovou skupinu navázanou přes nižší alkyl;

alkylaryl znamená skupinu obsahující nižší alkyl navázaný přes arylovou skupinu;

cykloalkyl znamená nasycený karbocyklický kruh s 3 až 8 atomy uhlíku, s výhodou 5 nebo 6, popřípadě substituovaný;

heterocykl znamená navíc k dále definovaným heteroarylovým skupinám nasycené a nenasycené cyklické organické skupiny obsahující alespoň jeden atom O, S a/nebo N přerušující strukturu karbocyklického kruhu, který se skládá z jednoho kruhu nebo dvou fúzovaných kruhů, kde každý kruh je 5-, 6- nebo 7-členný a může nebo nemusí obsahovat dvojné vazby postrádající delokalizované pi elektrony, kde tato kruhová struktura má od 2 do 8, s výhodou od 3 do 6 atomů uhlíku, např. 2- nebo 3-piperidinyl, 2- nebo 3-piperazinyl, 2nebo 3-morfolinyl, nebo 2- nebo 3-thiomorfolinyl;

halogen znamená fluor, chlor, brom a jod;

heteroaryl znamená cyklickou organickou skupinu obsahující alespoň jeden atom O, S a/nebo N přerušující strukturu karbocyklického kruhu a obsahující dostatečný počet delokalizovaných pi elektronů pro poskytnutí aromatického charakteru, přičemž aromatická heterocyklylová skupina obsahuje od 2 do 14, s výhodou 4 nebo 5 atomů uhlíku, např. 2-, 3- nebo 4-pyridyl, 2- nebo 3-furyl, 2nebo 3-thienyl, 2-, 4- nebo 5-thiazolyl, 2- nebo 4-imidazolyl, 2-, 4nebo 5-pyrimidinyl, 2-pyrazinyl, nebo 3- nebo 4-pyridazinyl, atd. Výhodné heteroarylové skupiny jsou 2-, 3- a 4-pyridyl; takové heteroarylové skupiny mohou také být popřípadě substituovány. Navíc, pokud není zvláště definováno, znamená termín „substituovaný nebo nesubstituovaný“ nebo „popřípadě substituovaný“, že příslušná skupina je popřípadě a chemicky vhodně substituována skupinou náležející k R¹² nebo R¹³.

Vynález také zahrnuje tautomery, rotamery, enantiomery a jiné optické isomery sloučenin vzorce I, stejně jako jejich farmaceuticky přijatelné soli, solváty a deriváty.

Další předmět vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující jako účinnou složku sloučeninu vzorce I (nebo její sůl, • 4 4 44 · ···«««>

444« · 4 · 4 «4 · solvát nebo isomery) spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo pomocnou látkou.

Vynález také poskytuje způsoby přípravy sloučenin vzorce I, stejně jako způsob léčení onemocnění jako je například HCV a související stavy. Způsoby léčení zahrnují podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny vzorce I nebo farmaceutických prostředků s obsahem sloučeniny vzorce I pacientovi v případě potřeby.

Popisuje se také použití sloučeniny vzorce I pro výrobu io farmaceutického prostředku pro léčení HCV a souvisejících stavů.

Podrobný popis výhodných provedení

V jednom provedení popisuje předkládaný vynález sloučeniny vzorce I jako inhibitory proteázy HCV, zvláště serinové proteázy HCV

NS3/NS4a nebo jejich farmaceuticky přijatelný derivát, přičemž různé definice se uvádějí výše.

Reprezentativní sloučeniny podle vynálezu s vynikající inhibiční aktivitou na proteázu HCV jsou uvedeny níže v tabulce 1 spolu s jejich * aktivitou (rozmezí hodnot K, v nM).

Tabulka 1: Sloučeniny a výsledky kontinuálního testu s proteázou HCV

Sloučenina z příkladu No.	Rozmezí Ki*
1	C
2	B
3	C
4	C
5	B

-24«· • · ··« ·

6	C
7	C
8	C
9	C
10	C
11	A
12	C
13	B
14	C
15	B
16	A
17	B
18	A
19	není dostupné
20	C
21	B
22	C
23	C
24	B
25	A
26	C
27	C
28	B
29	C
30	B
31	C
32	B

• 4 · « ·» ·

4« • · • 44

4· 444 • t «

4 4

4< « * 4 4 4

4« 44 ·» 4

9999

33	C
34	Β
35	C
36	C
37	C
38	B
39	C
40	C
41	B
42	C
43	A
44	C
45	C
47	C
48	B
49	A
50	C
51	B
52	B
53	B
54	B
55	C
56	B
57	B
58	C
59	B
60	C

- 26”-* • · · · ·

61	C
62	A
63	C
64	B
65	C
66	B
67	C
68	B
69	B
70	B
71	B
72	B
73	A
74	B
75	B
76	B
77	C
78	B
79	C
80	B
81	B
82	C
83	C
84	C
85	C
86	C
87	B

- 27·• · β · · '

88	Β
89	C
90	Β
91	Β
92	C
93	C
94	Β
95	Β
96	Α
97	Α
98	Α
99	Β
100	Β
101	Β
102	Β
103	C
104	C
105	Β
106	Α
107	C
108	Β
109	Β
110	Α
111	Β
112	Β
113	Α
114	Α

• * • · · · · ·

- 28·-·'

115	C
116	B
117	B
118	B
119	B
120	A
121	B
122	A
123	C
124	B
125	A
126	A
127	A
128	B
129	C
130	A
131	C
132	B
133	B

Rozmezí Ki* kontinuálního testu HCV:

Kategorie A = 0 - 100; B = 101 - 1000; C = >1000 nM.

Dále jsou uvedeny některé typy sloučenin podle vynálezu a 5 potom schematicky popsány způsoby výroby různých typů sloučenin podle vynálezu vzorce I a následují ilustrativní příklady.

OH

°Ó

X = O^lBu Χ = ΟΗ Χ = ΝΗ₂ X = NMeOMe X = NMe₂

Ό °V. ^Η

Χ = O^řBu Χ = ΟΗ

Me

ΜβνίχΜβ

HOOC

Ί ⁰

Me

ΟΗ

X = Η, Y = tBu; X = tBu, Y = Η

R = Propargyl R = Allyl

X= O -butyl X= OH

X = 0‘Butyl X = OH

X = 0‘Butyl X = OH X = NMe₂

X = O^lBu X = OH

R = *Bu R = H R = Me

X = Η, Y = COOH X = COOH, Y = H

- 33 -·

-34----

Me

V závislosti na své struktuře mohou tvořit sloučeniny podle vynálezu farmaceuticky přijatelné soli s organickými nebo anorganickými kyselinami, nebo organickými nebo anorganickými bázemi. Příklady vhodných kyselin pro tvorbu takových solí jsou kyselina chlorovodíková, sírová, fosforečná, octová, citrónová, malonová, salicylová, jablečná, fumarová, jantarová, askorbová, maleiová, methansulfonová a jiné minerální a karboxylové kyseliny, dobřez námé odborníkům v oboru. Pro tvorbu solí s bázemi jsou vhodné báze například NaOH, KOH, NH₄OH, tetraalkylamonium-hydroxid, apod.

V dalším provedení poskytuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky s obsahem peptidů podle vynálezu jako účinné složky. Tyto farmaceutické prostředky obecně dále obsahují farmaceuticky přijatelné nosné ředivo, pomocnou látku nebo nosič (souhrnně zde označované jako nosné materiály). Pro svou inhibiční aktivitu na HCV jsou takové farmaceutické prostředky použitelné při léčení hepatitidy C a souvisejících onemocnění.

V ještě dalším provedení poskytuje předkládaný vynález způsoby přípravy farmaceutických prostředků s obsahem sloučenin podle vynálezu jako účinných složek. Ve farmaceutických prostředcích a způsobech podle předkládaného vynálezu budou účinné složky typicky podávány spolu s vhodnými nosnými materiály vhodně volenými s ohledem na zamýšlenou formu podávání, tj. orální tablety, kapsle (buď s pevnou, polotuhou nebo kapalnou náplní), prášky pro rekonstituci, orální gely, elixíry, dispergovatelné granule, sirupy, suspenze apod., a v souladu s běžnou farmaceutickou praxí. Například pro orální podávání ve formě tablet nebo kapslí může být účinná složka léčiva kombinována s jakýmkoli orálním netoxickým farmaceuticky přijatelným inertním nosičem jako je laktóza, škrob, sacharóza, celulóza, stearan hořečnatý, fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, talek, mannitol, ethylalkohol (kapalné formy) apod. Navíc mohou být do směsi v případě potřeby nebo nutnosti přidány vhodná pojivá, kluzné látky, rozvolňovadla a barviva. Prášky a tablety mohou obsahovat od přibližně 5 do přibližně 95 % hmotnostních prostředku podle vynálezu. Mezi vhodná pojivá patří škrob, želatina, přírodní cukry, kukuřičná sladidla, přírodní a syntetické gumy jako je akácie, alginát sodný, karboxymethylcelulóza, polyethylenglykol a vosky.

Mezi kluznými látkami je možno zmínit pro použití v těchto dávkových formách kyselinu boritou, benzoan sodný, octan sodný, chlorid sodný, apod. Rozvolňovadla zahrnují škrob, methylcelulózu, guarovou gumu apod.

V případě potřeby mohou být také přidána sladidla a ochucovací látky. Některé výše uvedené kategorie, zvláště rozvolňovadla, řediva, kluzné látky, pojivá apod. jsou podrobněji diskutovány dále.

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být dále formulovány ve formě s prodlouženým uvolňováním, aby se dosáhlo uvolňování kterékoli složky nebo více složek nebo účinných látek řízenou rychlostí pro optimalizaci léčebných účinků, například inhibiční aktivity na HCV apod. Vhodné dávkové formy pro prodloužené uvolňování zahrnují vrstvené tablety obsahující vrstvy s různými rychlostmi rozpadávání, nebo polymerní matrice pro řízené uvolňování impregnované účinnými složkami a tvarované do tablet nebo kapslí s obsahem těchto impregnovaných nebo zapouzdřených porézních polymerních matric.

Preparáty v kapalné formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad lze uvést vodu nebo roztoky voda-propylenglykol pro parenterální injekce nebo přidávání sladidel a sedativ pro orální roztoky, suspenze a emulze. Preparáty v kapalné formě mohou také zahrnovat roztoky pro intranazální podávání.

Aerosolové prostředky vhodné pro inhalaci mohou obsahovat roztoky a pevné látky ve formě prášku, které mohou být v kombinaci

s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je inertní stlačený plyn, např. dusík.

Pro přípravu čípků se nejprve nízkotající vosk jako je směs glyceridů mastných kyselin jako kakaové máslo nejprve roztaví a účinná složka se v tomto základu homogenně disperguje mícháním nebo podobným způsobem míšení. Roztavená homogenní směs se potom vlije do forem běžné velikosti, ponechá se ochladit a tím ztuhne.

Zahrnuty jsou také prostředky v pevné formě, které jsou určené pro převedení na kapalné prostředky buď pro orální nebo parenterální podávání krátce před použitím. Takové kapalné formy zahrnují roztoky, suspenze a emulze.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být také podávány transdermálně. Transdermální prostředky mohou mít formu krémů, omývacích roztoků, aerosolů a/nebo emulzí a mohou být obsaženy v transdermální náplasti typu matrice nebo zásobníku, jak je v oboru k tomuto účelu běžné.

S výhodou se sloučenina podává orálně, intravenózně nebo subkutánně.

Farmaceutický prostředek je s výhodou v jednotkové dávkové formě. V takové formě je prostředek rozdělený do jednotkových dávek vhodné velikosti obsahujícících příslušná množství účinných složek, například účinné množství pro dosažení požadovaného účelu.

Množství účinné sloučeniny podle vynálezu v jednotkové dávce prostředku se může obecně lišit nebo nastavit od přibližně 1,0 mg do přibližně 1000 mg, s výhodou od přibližně 1,0 do přibližně 950 mg, výhodněji od přibližně 1,0 do přibližně 500 mg, a typicky od přibližně 1 do přibližně 250 mg, podle konkrétního použití. Použitá účinná dávka se může lišit v závislosti na věku, pohlaví a hmotnosti pacienta a vážnosti léčeného stavu. Tyto techniky jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Orální dávková forma s obsahem účinných složek se obecně může podávat člověku 1 nebo 2 x za den. Množství a četnost podávání se bude upravovat podle úsudku ošetřujícího lékaře. Doporučený denní dávkový režim pro orální podávání může být obecně v rozmezí od přibližně 1,0 mg do přibližně 1000 mg za den, v jednotlivých nebo rozdělených dávkách.

Některé použitelné termíny jsou popsány dále:

Kapsle označuje zvláštní zásobník nebo obal vyrobený z methylcelulózy, polyvinylalkoholů nebo denaturovaných želatin nebo škrobu pro uchovávání obsažených prostředků s účinnými složkami. Kapsle (tobolky) s tvrdým obalem se typicky vyrábějí ze směsí želatin z kostí a vepřové kůže s vysokou pevností gelu. Samotná kapsle může obsahovat malá množství barviv, zakalovacích prostředků, plastifikátorů a ochranných látek.

Tableta označuje lisovanou nebo odlévanou pevnou dávkovou formu obsahující účinné složky s vhodnými ředivy. Tableta se může připravovat lisováním směsí nebo granulátů získaných granulací za mokra, granulací za sucha nebo kompaktizací.

Orální gely jsou účinné složky dispergované nebo solubilizované v hydrofilní polotuhé matrici.

Prášek pro rekonstituci označuje práškové směsi obsahující účinné složky a vhodná řediva, které mohou být suspendovány ve vodě nebo ovocných šťávách.

Ředivo označuje látky, které obvykle tvoří hlavní část prostředku nebo dávkové formy. Mezi vhodná řediva patří cukry jako je laktóza, sacharóza, mannitol a sorbitol; škroby odvozené z pšenice, kukuřice, rýže a brambor; a celulózy jako je mikrokrystalická celulóza. Množství řediva v prostředku může být v rozmezí od přibližně 10 do přibližně % hmotnostních z celkového prostředku, s výhodou od přibližně 25 do přibližně 75 %, výhodněji od přibližně 30 do přibližně 60 % hmotnostních, ještě výhodněji od přibližně 12 do přibližně 60 %.

Rozvolňovadlo označuje materiály přidávané do prostředku, aby napomáhaly jeho rozpadu (desintegraci) a uvolnění účinných látek. Mezi vhodná rozvolňovadla patří škroby; „za studená rozpustné“ modifikované škroby jako je sodný karboxymethylškrob; přírodní a syntetické gumy jako je karubová guma, karaya, guar, tragakant a agar; deriváty celulózy jako je methylcelulóza a sodná sůl karboxymethylcelulózy; mikrokrystalické celulózy a zesítěné mikrokrystalické celulózy jako je sodná sůl kroskarmelózy; algináty jako je kyselina alginová a alginát sodný; jíly jako jsou bentonity; a šumivé směsi. Množství rozvolňovadla v prostředku může být v rozmezí od přibližně 2 do přibližně 15 % hmotnostních z prostředku, výhodněji od přibližně 4 do přibližně 10 % hmotnostních.

Pojivo označuje látku, která váže nebo „lepí“ prášky dohromady a přivádí je do kohezivního stavu vytvářením granulí, a ve formulaci slouží jako „adhezivní látka“. Pojivá zvyšují kohezivní pevnost, která je již získána pomocí řediva nebo objemotvorného prostředku. Vhodná pojivá zahrnují cukry jako je sacharóza; škroby odvozené od pšenice, kukuřice, rýže a brambor; přírodní gumy jako je akácie, želatina a tragakant; deriváty mořských řas jako je kyselina alginová, alginát sodný a alginát vápenatoamonný; celulózové materiály jako je methylcelulóza a sodná sůl karboxymethylcelulózy a hydroxypropylmethylcelulóza; polyvinylpyrrolidon; a anorganické látky jako je křemičitan hlinitý. Množství pojivá v prostředku může být v rozmezí od přibližně 2 do přibližně 20 % hmotnostních z prostředku, výhodněji od přibližně 3 do přibližně 10 % hmotnostních, ještě výhodněji od přibližně 3 do přibližně 6 % hmotnostních.

Mazadlo označuje látku přidanou k dávkové formě pro umožnění uvolnění tablet, granulí atd. po lisování z raznice nebo matrice • ·

snížením tření nebo otěru. Vhodná mazadla zahrnují kovové stearany jako je stearan hořečnatý, stearan vápenatý nebo stearan draselný; kyselinu stearovou; vysokotající vosky; a ve vodě rozpustná mazadla jako je chlorid sodný, benzoan sodný, octan sodný, olean sodný, polyethylenglykoly a d/l-leucin. Mazadla se obvykle přidávají až v posledním kroku před lisováním, protože musí být přítomná na površích granulí a mezi nimi a částmi tabletovacího lisu. Množství mazadla v prostředku může být v rozmezí od přibližně 0,2 do přibližně 5 % hmotnostních z prostředku, s výhodou od přibližně 0,5 do přibližně 2 %, výhodněji od přibližně 0,3 do přibližně 1,5 % hmotnostních.

Kluzná látka je materiál, který zabraňuje shlukování a zlepšuje tokové vlastnosti granulátů, takže se dosáhne hladkého a stejnoměrného toku. Mezi vhodné kluzné látky patří oxid křemičitý a talek. Množství kluzné látky v prostředku může být od přibližně 0,1 % do přibližně 5 % hmotnostních z celkového prostředku, s výhodou od přibližně 0,5 do přibližně 2 % hmotnostních.

Barviva jsou pomocné látky, které poskytují prostředku nebo dávkové formě zbarvení. Tyto pomocné látky mohou zahrnovat potravinářská barviva a potravinářská brviva adsorbovaná na vhodný adsorbent jako je jíl nebo oxid hlinitý. Množství barviva se může lišit od přibližně 0,1 do přibližně 5 % hmotnostních z prostředku, s výhodou od přibližně 0,1 do přibližně 1 %.

Biologická dostupnost označuje rychlost a míru, ve které se účinná složka nebo terapeutická část absorbuje do systémového oběhu z podané dávkové formy ve srovnání se standardem nebo kontrolou.

Běžné způsoby přípravy tablet jsou známé. Tyto metody zahrnují suché metody jako je přímé lisování nebo lisování granulátu vyrobeného kompaktizací, nebo mokré metody nebo jiné speciální postupy. Běžné metody pro výrobu jiných forem pro podávání, jako jsou například kapsle, čípky apod., jsou rovněž dobře známé v oboru.

Další provedení vynálezu popisuje použití popisovaných farmaceutických prostředků pro léčení onemocnění jako je například hepatitida C apod. Tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství farmaceutického prostředku podle vynálezu pacientovi trpícímu takovým onemocněním v případě potřeby.

V ještě dalším provedení mohou být sloučeniny podle vynálezu používány pro léčbu HCV u člověka v monoterapii nebo při kombinační terapii, jako například v kombinaci s antivirovými prostředky jako např. ribavirin a/nebo interferon jako je například α-interferon apod.

Jak bylo uvedeno výše, předkládaný vynález zahrnuje tautomery, rotamery, enantiomery a jiné stereoisomery sloučenin. Jak bude tedy odborníkovi v oboru zřejmé, některé ze sloučenin podle vynálezu mohou existovat ve vhodných isomerních formách. Tyto varianty rovněž spadají do rámce předkládaného vynálezu.

Další provedení vynálezu popisuje způsob přípravy popisovaných sloučenin. Tyto sloučeniny se mohou vyrábět různými v oboru známými způsoby. Reprezentativní ilustrativní postupy se uvádějí v následujících reakčních schématech. Je zřejmé, že i když následující ilustrativní schémata popisují přípravu pouze několika reprezentativních sloučenin podle vynálezu, vhodná náhrada jakékoli z obou nepřírodních aminikyselin povede k vytvoření požadovaných sloučenin založených na této substituci. Také tyto variace spadají do rámce vynálezu.

V popisu schémat, příprav a příkladů se používají následující zkratky:

THF Tetrahydrofuran

DMF N.N-Dimethylformamid

EtOAc Ethylacetát

AcOH Kyselina octová

	HOOBt	3-Hydroxy-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-on
	EDCI	Hydrochlorid 1 -(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbod -imidu
	DEC	Hydrochlorid 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbod
5		-imidu
	NMM	N-Methylmorfolin
	ADDP	1,1’-(Azodikarbobyl)dipiperidin
	DEAD	Diethylazodikarboxylát
	MeOH	Methanol
10	EtOH	Ethanol
	Et2O	Diethylether
	DMSO	Dimethylsulfoxid
	HOBt	N-Hydroxybenzotriazol
	PyBrOP	Brom-řr/s-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfát
15	Bn	Benzyl
	Bzl	Benzyl
	Et	Ethyl
	Ph	Fenyl
	iBoc	Isobutoxykarbonyl
20	iPr	Isopropyl

^fBu nebo Bu‘ terc-Butyl

Boc	terc-Butyloxykarbonyl
Cbz	Benzyloxykarbonyl
Cp	Cyklopentyldienyl
25 TS	p-Toluensulfonyl
Me	Methyl
THP	Tetrahydropyranyl
iBoc	Isobutyloxykarbonyl
Chg	Cyklohexylglycin

• ·

-43 Příklady provedení vynálezu

Obecná schémata přípravy

Následující schémata popisují způsoby syntézy stavebních bloků, které slouží jako meziprodukty.

Schéma 1

HCl-HaN-Phg-OBi?

OH _H (¹·²⁾

BocHN-^Xz-N___COOH HOOBt i lf znri

EDCI

NMM (1.1)

BocHN

Η θ Ph t ^{4N HCI} N COOBu dioxan dioxan í min *

Ci₂CHCO₂H

DMSO

DCC

O _H ° Ph í ° | 4NHCI dioxan 7 min

Dl OH H II 1 :^Ν'γ^χγ^Νχ/><Ν^>Χ0ΟΟΒυ^ι | ° (1-4)

HCI 8 ^H U Γ ^Η2^Νγ'γ^Ν'~^/Ή iDOOBu¹

J ⁰ (1-6)

HCI

H₂t

Schéma 2

Schéma 3

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-OH+ 1 ₀Bzl MeHN

3.1

HCI 'Ύ

HOOBt

EDCI

NMM

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-N^Y°^Bzl ® O

3.2

3.3

Ph

COOBu

3.5

-45 Schéma 4

Meso₂H₂c _H OH H o ™

Boc-Chg-N'\^^NV¹Y^NvzU'N COOBu^{f Me} O < O ^H ’ 3.5

MeSO_:

H-Chg·

4N HCI dioxan min 2 Ph

I 4Γ 1 di<

7i ^2^2? H OH H ji ig-NSr'^NvSfcoobu¹ Me o r O H

A 4 lboc-CI

NaHCO, h₂o

MeSO₂H₂C h OH H S ?^h

Iboc-Chg-N^>Sr^NV^A7r^NxxW'a OOOE Me o / O ^H

2

Dess-Martinův perjodistan

MeSO₂H₂C H 2 H » Ph jť yVⁿ'^aAcoob_u> 3£t *so₂h₂c „ O _h <

' 4.4

MeSO₂H₂C _H O _H O p_h lboc-Chg-N^V^NY^íy^N^f_;jA

HOOBt EDCi, NMM

Me £

CONMe,

4.5

Příprava meziproduktů Preparativní příklad 1 Krok A: Sloučenina (1.1)

⁰ Ua

N CO'

»· · · · · · · · » * · · * · ·

K míchanímu roztoku sloučeniny (1.08) (3,00 g, 12,0 mmol; Harbeson, S. L.; Abelleira, S. M.; Akiyama, A.; Barrett, R.; Carroll, R. M.; a další.; J. Med. Chem.; 37(18) 1994; 2918 - 2929;) v DMF (15 ml) a CH2CI2 (15 ml) se při -20 °C přidá HOOBt (1,97 g, 12,0 mmol), N5 methyimorfolin (4,0 ml, 36,0 mmol) a EDCI (2,79 g, 14,5 mmol) a směs se míchá 10 min, a potom se přidá HCI.H₂N-Gly--OBn (2,56 g, 13,0 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 2 hod, přes noc byl udržován v chladicím boxu a potom zakoncentrován do sucha, následovalo zředění EtOAc (150 mi). Roztok EtOAc byl potom dvakrát promyt nasyceným NaHCO₃, H₂O, 5% H3PO4, roztokem soli, sušen nad Na₂SO₄, zfiltrován a zakoncentrován do sucha, za získání sloučeniny (1.09) (4,5 g, 94 %). LRMS m/z MH⁺= 395,1.

Krok B: Sloučenina (1.1)

(1.09) (1.1)

Roztok sloučeniny (1.09) (7,00 g, 17,8 mmol) v absolutním ethanolu (300 ml) byl míchán při teplotě laboratoře v atmosféře vodíku v přítomnosti Pd-C (300 mg, 10 %). Postup reakce byl monitorován tle. Po 2 hod byla směs zfiltrována přes lože celitu a získaný roztok byl zakoncentrován ve vakuu za získání sloučeniny (1.1) (5,40 g, kvantitativní). LRMS m/z MH⁺ = 305,1.

·« · • 4 44

4

4 * · ·

4 · • · · · <· *

-47 4444 444

Preparativní příklad 2

Krok A: Sloučenina (1.3)

(1.2) (1-3)

Směs sloučeniny (1.1) z preparativního příkladu 1, krok B (1 ekv.), sloučeniny (1.2) (Novabiochem, No. 04-12-5147) (1,03 ekv.), io HOOBt (1,03 ekv.), N-methylmorfolinu (2,2 ekv.), a dimethylformamidu (70 mi/g) byla míchána při -20 °C. Bylo přidáno EDCI (1,04 ekv.) a reakční směs byla míchána 48 hod. Reakční směs byla vlita do 5% vodného KH2PO4 a extrahována ethylacetátem (2 x). Spojené organické podíly byly promyty chladným 5% vodným K2CO3, potom 5% vodným KH2PO4, potom roztokem soli, a organická vrstva byla sušena nad bezvodým MgSO₄. Směs byla zfiltrována, potom odpařena a filtrát byl usušen ve vakuu, zbytek byl smísen se směsí Et2O-hexan a zfiltrován, za získání v názvu uvedené sloučeniny (1.3) (86% výtěžek), C25H39N3O7 (493,60), hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 494,3.

Krok B: Sloučenina (1.4)

*HCI

H₂N

H 9 ?^h

CO OBu¹ (1-4)

Sloučenina (1.3) z preparativního příkladu smísena se směsí 4N HCI/dioxan (36 ml) a

2, krok A (3,0 g) byla míchána při teplotě • · · · · · · · · • · · · · · ·

laboratoře 7 min. Směs byla vlita do 1,5 I chladného (5 °C) hexanu a míchána, potom ponechána stát při 0 °C 0,5 hod. Směs byla zfiltrována odsátím v suché atmosféře, a oddělená pevná látka byla dále čištěna za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny (1.4) (2,3 g, 88% výtěžek), C₂₀H₃iN₃O₅.HCI, ¹H NMR DMSO-d₆/NaOD) δ 7,38 (m, 5H), 5,25 (m, 1H), 4,3 - 4,1 (m, 1H), 3,8 (m, 2H), 3,4 - 3,3 (m, překrytý HDO), 1,7 - 1,1 (m, 4H), 1,35 (s, 9H), 0,83 (m, 3H).

Preparativní příklad 3

Sloučenina (1.5)

Sloučenina (1.3) z preparativního příkladu 2, krok A, byla zpracována v podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 7, krok A dále, za poskytnutí sloučeniny (1.5).

Preparativní příklad 4

Sloučenina (1.6)

Sloučenina (1.5) z preparativního příkladu 3 byla zpracována v podstatě stejným způsobem jako bylo popsáno v preparativním příkladu 2, krok B, za poskytnutí sloučeniny (1.6).

Preparativní příklad 5

Krok A: Sloučenina (2.09)

(2.08) (2.09)

K roztoku hydrochloridu dimethyiaminu (1,61 g, 19,7 mmol), Nio -Boc-fenylglycinu, sloučeniny 2.08 (4,50 g, 17,9 mmol, Bachem Co. #A-2225), HOOBt (3,07 g, 18,8 mmol) a EDCI (4,12 g, 21,5 mmol) v bezvodém DMF (200 ml) a CH2CI2 (150 ml) byl při -20 °C přidán NMM (5,90 mi, 53,7 mmol). Po 30 min míchání při této teplotě byla reakční směs uchována v mrazicím boxu přes noc (18 hod). Potom byla ponechána ohřát na teplotu laboratoře a byly přidány EtOAc (450 ml), roztok soli (100 ml) a 5% H3PO4 (100 ml). Po oddělení vrstev byla organická vrstva promyta 5% H3PO4 (100 ml), nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 150 ml), vodou (150 mi) a roztokem soli (150 ml), sušena (MgSO4), zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu za poskytnutí sloučeniny (2.09) (4,86 g) jako bílé pevné látky, která byla použita bez dalšího čištění.

Krok B: Sloučenina (2.1)

CH, (2.09)

(2.1)

-50.Sloučenina (2.09) z preparativního příkladu 5, krok A (4,70 g, surové látky) byla rozpuštěna v 4N HCI (60 ml, 240 mmol) a získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře. Postup reakce byl monitorován TLC. Po 4 hod byl roztok zakoncentrován ve vakuu za 5 získání sloučeniny (2.1) jako bílé pevné látky, která byla použita v příští reakci bez dalšího čištění. LRMS m/z MH⁺= 179,0.

Preparativní Příklad 6

Krok A: Sloučenina (2.2)

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok A, s použitím hydrochloridu fenylglycin-N,N-dimethylamidu namísto hydrochloridu fenylglycin-t-butylesteru byla připravena sloučenina (2.2), hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 465,3.

Krok B: Sloučenina (2.3)

Sloučenina (2.2) z kroku A (1,85 g) byla ponechána reagovat s 4N HCI/dioxanem (50 ml) při teplotě laboratoře 1 hod. Směs byla

-31.-

odpařena ve vakuu ve 20 °0 vodní lázni, rozetřeba pod isopropyletherem, zfiltrována a sušena, za poskytnutí sloučeniny (2.3) (1,57 g, 98 % výtěžek), C18H28N4O4.HCI, hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 365,3.

Preparativní příklad 7

Krok A: Sloučenina (2,4)

CONMez

Roztok sloučeniny (2.2) z preparativního příkladu 5, krok A (2,0 g) v dichlormethanu (60 ml) byl smísen s dimethylsulfoxidem (3,0 ml) a kyselinou 2,2-dichloroctovou (0,70 ml). Míchaná směs byla ochlazena na 5 °C a potom byl přidán roztok 1M dicyklohexylkarbodiimid/dichlormethanu (8,5 ml). Chladná lázeň byla odstraněna a směs byla míchána 22 hod. Potom byl přidán 2-propanol (0,5 ml) a míchání pokračovalo 1 hod. Směs byla zfiltrována, potom promyta ledově chladným 0,1 N NaOH (50 ml), potom ledově chladným 0,1 N HCI (50 ml), potom 5% vodným ΚΗ₂ΡΟ₄, potom nasyceným roztokem soli. Organický roztok byl sušen nad bezvodým síranem hořečnatým, potom zfiltrován. Filtrát byl odpařen a čištěn chromatografii na silikagelu s elucí ethylacetátem, za poskytnutí sloučeniny (2.3) (1,87 g, 94% výtěžek), C23H34N4O6, hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 463,3.

-52.-

Krok B: Sloučenina (2.5)

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok B byla připravena sloučenina (2.5).

io Preparativní příklad 8

Krok A: Sloučenina (3.3)

Krok A-1: Sloučenina 3.02

Me-S

Me-S

Me-N COOH

I

Boc (3-01)

Me-N^COOBzl

Boc (3.02)

Roztok sloučeniny 3,01 (4,6 g, připravené z N-Boc-Smethylcysteinu, Bachem Biosciences lne., postupem podle Boger, J.

Org. Chem., 1988, 53(3), 487) v DMF (150 ml) byl smísen s CS2CO3 (6,1 g), benzylbromidem (2,3 ml), a směs byla míchána při teplotě laboratoře 4 hod. Směs byla zakoncentrována ve vakuu a zbytek suspendován v EtOAc (200 ml). Potom byla směs promyta vodným 5% KH2PO4, potom roztokem soli, a organický extrakt byl sušen nad bezvodým MgSO4. Směs byla zfiltrována a filtrát odpařen za získání produktu sloučeniny 3.02 (6,2 g); [ajo-33,7 (c 1,3, CHCI₃).

Krok A-2: Sloučenina 3.03

Me-S

Me—N COOBzl l

Boc (3.02)

-J33.-

O₂

Me-S

Me-N COOBzi I

Boc (3.03)

Použitím postupu podle U. Larsson, a další, Acta Chem. Scan., 1994, 48(6), 517 - 525, byl roztok oxonu® (16,4 g, Aldrich Chemical io Co.) ve vodě (90 ml) pomalu přidán k 0 °C roztoku sloučeniny 3.02 (6,1 g) v MeOH (150 mi). Směs byla míchána při teplotě laboratoře 4 hod, potom zakoncentrována na poloviční objem na rotační odparce, byla přidána chladná voda (100 ml), a směs byla extrahována EtOAc. Extrakt byl promyt roztokem soli a sušen nad bezvodým MgSO4. Směs byla zfiltrována a filtrát byl odpařen za poskytnutí produktu 3.03 (5,9 g); [a]_D -26,3 (c 0,9, CHCI₃).

Krok A-3: Sloučenina 3.2

O₂

Me~S

Me-N l

Boc

COOBzl

O₂

Me—S^

Me-N^XOOBzI

H-HCI (3.03) (3-2)

Produkt 3.03 z předcházejícího kroku byl smísen s 4N

HCI/dioxanem a směs byla ponechána reagovat 0,5 hod za poskytnutí ·· ··· ···

*..* ,ζ, *..**..* produktu 3.2, C^H^NCUS.HCI (307,79); hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 272,0.

Příprava sloučeniny 3.3

Boc-Chg-OH + (3.1)

MeSCy-^C

MeHísAjf⁰⁶²¹

HCI ° (3.2)

MeSCy-feC n _kA/OBzi Boc-Chg-N π

Me (3.3) w Sloučenina (3.2) (hydrochlorid benzylesteru S-methylcystein-sulfonu) a sloučenina (3.1) (N-Boc-cyklohexylglycin) byly ponechány reagovat v podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok A, za poskytnutí sloučeniny (3.3) C25H38N2O7S (510,64).

Krok B; Sloučenina (3.4)

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-l/^Y'⁰⁶²¹ Me i,

3.3 >·

CH₂SO₂Me

Βοο-ΟΙια-Ν'γ'θΠ Me £

3.4

Směs sloučeniny (3.3) z kroku A výše (0,7 g), 10% Pd/C (0,05 g) a směs EtOH-dioxan (100 ml) byla míchána za tlaku 0,3 MPa H₂ 5 hod. Směs byla zfiltrována a odpařena do sucha ve vakuu, za poskytnutí sloučeniny (3.4) (0,56 g, 97% výtěžek), C-18H32N2O7S (420,52) hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 421,2.

Krok C: Sloučenina (3.5)

Boc-Chg-I

Me

CH₂SO₂Me OH

HCI

Η,Ν

OH

COOBu¹ (3.4)

Sloučenina (3.4) z kroku B výše byla ponechána reagovat se sloučeninou (1.4) z preparativního příkladu 2, krok B v podstatě w stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok A, za poskytnutí sloučeniny (3.5), C3_SH₆₁N₅0iiS (795,98), hmotnostní spektrum (FAB) M+1 = 796,3.

Preparativní příklad 9

Sloučenina 4.1

MeSO₂H₂C

Boc-Chg-N

Me £

2Ϋ H °H H O ?^h ,ν Λ ΆΛ⁰⁰⁶“· (3.5)

MeSO₂H₂C

H-Chg-N HCI ^Me Ó

Ph * H ?H H 2 }· (4.1)

COOBu

Sloučenina (3.5) z preparativního příkladu 8, krok C se ponechá reagovat v podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok B, za získání sloučeniny (4.1) C33H53N5O9S.HCI (732,33).

Preparativní příklad 10

Sloučenina (4.2)

(4.1) - (4.2)

Smísí se roztok sloučeniny (4.1) z preparativního příkladu 9 (0,7 g), dimethylformamidu (15 ml) a diisopropylethylaminu (0,38 ml) io při 5 °C s isobutylchlorformátem (0,15 ml). Odstraní se chladná lázeň a směs se míchá 6 hod. Reakční směs se vlije do 5% vodného KH2PO4 (100 ml) a extrahuje ethylacetátem (2 x 100 ml). Spojené organické podíly se promyjí chladným 5% vodným K2CO3, potom 5% vodným KH2PO4, potom roztokem soli, a suší nad bezvodým MgSO4.

Směs se zfiltruje, filtrát se odpaří ve vakuu, zbytek se smísí se směsí Et₂O-hexan, a zfiltruje, za získání sloučeniny (4.2).

Preparativní příklad 11

Sloučenina (4.3)

COOBu^ř

UX_O.„

Sloučenina (4.2) se ponechá reagovat v podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 14, krok H dále, za získání sloučeniny (4.3).

Preparativní příklad 12

Sloučenina (4.4)

COOBu¹

Sloučenina (4.3) z preparativního příkladu 11 (přibližně 0,10 g) io se smísí s roztokem bezvodé kyseliny trifluoroctové-dichlormethanu (1 : 1, přibližně 10 ml) přibližně 2 hod. Roztok se zředí xylenem (přibližně 50 ml) a odpaří ve vakuu. Zbytek se rozetře s Et₂O a zfiltruje za získání sloučeniny (4.4).

Preparativní příklad 13

Sloučenina (4.5)

H

CONMe₂

Sloučenina (4.4) z preparativního příkladu 12 se ponechá reagovat s dimethylaminem v podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 2, krok A, za získání sloučeniny (4.5).

-as

Preparativní příklad 14

Krok A: Sloučenina (5.2)

K míchanému chlazenému roztoku sloučeniny (5.01) (1,11 g, 7,0 mmol) v bezvodém DMF (10 ml) a bezvodém CH2CI2 (10 ml) při

0 °C byl přidán HOBT (1,19 g, 7,25 mmol), N-methylmorfolin (2,3 ml,

21,0 mmol) a DEC (1,6 g, 8,4 mmol). Získaný roztok byl míchán při 0 °C 15 min, byl přidán H-Val-O^Bu (1,54 g, 7,35 mmol). Roztok byl udržován v mrazicím boxu přes noc. Bylo pozorováno vytvoření velkého množství sraženiny a roztok byl zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla potom promyta 5% roztokem H3PO4, H₂O, roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována, za poskytnutí surového produktu 5.1 (2,4 g, 98% výtěžek).

Roztok surového produktu (získaný výše) ve směsi 4N

HCI/dioxan byl míchán při teplotě laboratoře 7 hod a zakoncentrován do sucha za poskytnutí sloučeniny (5.2).

Krok B: Sloučenina (5.4)

BOC I

N

N

H II O

OH. 2HCI

N'

I

BOC O

OH.

(5.3) (5.4)

K míchanému roztoku sloučeniny (5.3) (F. L. Bach, Jr. a další, J. Amer. Chem. Soc., (1955) 77, 6049) (17,5 g, 0,086 mmol) v 50% MeOH/50% H₂O (300 ml) byl přidán anhydrid Boc (47,0 g, 0,215 mol). Roztok byl potom upraven na pH = 9,5 přikapáváním 50% 5 koncentrovaného roztoku NaOH. Získaný roztok byl míchán přes noc při teplotě laboratoře a potom neutralizován koncentrovanou HCI na pH = 8 a okyselen kyselinou citrónovou na pH = 2,94, potom extrahován CH₂CI₂. Spojená organická vrstva byla sušena nad MgSCL za získání sloučeniny (5.4) (27,16 g, 95% výtěžek).

Krok C: Sloučenina (5.5)

Roztok thionylchloridu (3,37 ml, 0,046 mmol) v DMF (3,59 ml, 0,046 mol) při 0 °C byl zahřát na teplotu laboratoře a míchán 35 min. Roztok byl potom ochlazen na 0 °C, byla přidána sloučenina (5.4)

2o z kroku B výše (15,0 g, 0,045 mol) v CH₃CN (150 ml) a pyridin (3,73 ml, 0,046 mol). Získaný roztok byl ohřát na laboratorní teplotu a míchán přes noc. Roztok byl potom vlit do ledové vody (700 ml) a extrahován třikrát EtOAc (150 ml). Spojená organická vrstva byla promyta roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha za získání sloučeniny (5.5) (10,8 g).

Krok D: Sloučenina (1.08)

(6.6) (1.08)

K míchanému roztoku sloučeniny (6.6) z preparativního příkladu 14, krok D níže (6,5 g, 0,044 mol) v ΟΗ₂ΟΙ₂ (130 ml) byly přidány anhydrid Boc (9,65 g, 0,044 mol) a DMF (50 ml). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře přes víkend a zakoncentrován do sucha, byla přidána H2O (120 ml) a 50% NaOH pro nastavení pH = 10 až 11. Roztok byl potom míchán 2 hod a bylo přidáno více anhydridu Boc (1,93 g, 8,8 mmol) a směs byla míchána přes noc při teplotě laboratoře. Roztok byl potom extrahován CH2CI2 a vodná vrstva byla okyselena na pH = 4 při 0 °C 1N HCI a potom extrahována třikrát CH₂CI₂. Spojená organická vrstva byla potom promyta roztokem soli, sušena nad Na2SO4, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (1.08) (4,50 g, 41% výtěžek, M-t-butyl +2 = 192).

K míchanému roztoku sloučeniny (1.08) z výše popsaného kroku (4,5 g, 0,018 mol) v DMF (22 ml) a CH2CI2 (22 ml) byly přidány HOBT (2,7 g, 0,02 mol), N-methylmorfolin (6 ml, 0,054 mol), DEC (4,17 g,

- ©l·-

0022 mol) a allylglycin.TsOH (6,1 g, 0,02 mol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře přes víkend a zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta 10% H3PO4, roztokem soli, sušena nad Na2SO₄ a zfiltrována, za získání surového produktu (5,7 g). Roztok surového produktu v 4N HCI/dioxanu (50 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 50 min a zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (5.7) (4,79 g, 94% výtěžek, MH+ = 245,1).

Krok F: Sloučenina (5,8)

(5.7) (5.8)

K míchanému roztoku sloučeniny (5.7) z kroku E výše (3,1 g, 0,011 mol) v bezvodém CH₂CI₂ (55 ml) byla po kapkách přidána TEA (1,69 ml, 0,012 mol) v průběhu 13 min a sloučenina (5.5) z kroku C (2,83 g, 0,011 mol) v bezvodém CH2CI2 (55 ml). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 1,5 hod. Organická vrstva byla potom promyta nasyceným NaHCO₃, roztokem soli, sušena nad Na₃SO₄ a zfiltrována, za získání sloučeniny (5.8) (4,67 g, MH+ = 457,2).

Krok G: Sloučenina (5.9)

BOC 1

(5.8)

(5-9) * · · · · ·

K míchanému roztoku sloučeniny (5.2) z kroku A (0,34 g, 1,31 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) byly při 0 °C přidány HOBT (0,214 g, 1. 31 mmol), N-methylmorfolin (0,43 ml, 3,9 mmol) a DEC (0,5 g, 1,09 mmol). Směs byla míchána při teplotě laboratoře 15 min, byla přidána sloučenina (5.8) z kroku F (0,5 g, 1,09 mmol). Získaný roztok byl udržován v mrazicím boxu přes noc, potom zakoncentrován do sucha, extrahován EtOAc-H₂O. Spojená organická vrstva byla promyta dvakrát nasyceným NaHCO₃, 5% H₃PO₄, a roztokem soli, sušen nad Na₂SO₄, potom zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (5.9) (0,65 g, MH+ = 697,4).

(5-9)

H ν'/t

K míchanému roztoku sloučeniny (5.9) z kroku G (0,6 g,

0,8 mmol) v bezvodém CH₂CI₂ (8 ml) bylo přidáno Dess-Martinovo činidlo (0,732 g, 1,72 mmol) a směs byla míchána při teplotě laboratoře 1 hod, po kapkách byla přidána H₂0 (0,031 ml) a DessMartinovo činidlo (0,373 g, 0,86 mmol) v CH₂CI₂ (12 mi). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 2,5 hod, byl přidán roztok směsi 50% nasycený NaHCO₃/50% nasycený Na₂S₂O₃ (20 ml) a směs byla důkladně míchána 1,5 hod při teplotě laboratoře. Roztok byl potom promyt H₂O a roztokem soli, sušen nad Na₂SO₄ a zakoncentrován do sucha, za získání sloučeniny (5.10) (0,588 g, 100% výtěžek, MH⁺ = 695,2).

- 63'

Preparativní příklad 15

Krok A: Sloučenina (6.2) boc-n®_oh boc-K^A^

(6.2) (6.1)

K míchanému roztoku sloučeniny (6.1) (5,0 g, 19,89 mmol) v CH2CI2 (20 ml) a DMF (10 ml) při -20 °C byly přidány HOBT (3,25 g, 19,89 mmol), EDCI (4,58 g, 23,87 mmol), a N-methylmorfolin (6,56 ml, 59,69 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 10 min, byl přidán NH₄CI (1,38 g) a roztok byl udržován při teplotě 0 °C přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován a extrahován směsí EtOAcH₂O. Spojená organická vrstva byla promyta dvakrát NaHCO3, H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na₂SO4, zfiltrována a zakoncentrována do sucha. Surový produkt byl čištěn chromatografii na koloně s elucí 2,5% MeOH/97,5% CH₂CI₂, za získání sloučeniny (6.2) (1,95 g, MH⁺ = 251,1).

Krok B: Sloučenina (6.3)

H

BOC-N

O

O

HCL H(6.3) (6.2)

Roztok sloučeniny (6.2) z kroku A (12,32 g, 49,28 mmol) v 4N HCI/dioxanu (270 ml, 43,08 mmol) byl míchán při teplotě laboratoře ··· ·

Ojí* * · · * ···«

- Φ4»·.· ««· ·· «· _ββ hod, potom zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (6.3) (8,40 g, 100% výtěžek).

Krok C: Sloučenina (1.08) (alternativní syntéza)

ίο K míchanému roztoku 1-nitrobutanu (16,5 g, 0,16 mol) a kyseliny glyoxylové.H₂O (28,1 g, 0,305 mol) v MeOH (122 ml) byl při 0 °C až 5 °C po kapkách přidán triethylamin (93 ml, 0,667 mol) v průběhu 2 hod. Roztok byl ohřát na laboratorní teplotu, míchán přes noc, potom zakoncentrován do sucha za získání oleje. Olej byl potom smísen s H₂O a okyselen na pH 1 10% HCI, extrahován EtOAc. Spojená organická vrstva byla promyta roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.5) (28,1 g, 99% výtěžek).

Krok D: Sloučenina (6.6)

(6-5) (6.6)

K míchanému roztoku sloučeniny (6.5) z kroku C (240 g, 1,35 mmol) v kyselině octové (1,25 I) bylo přidáno 10% Pd/C (37 g). Získaný roztok byl hydrogenován při 59 psi (407 kPa) 3 hod a potom • · · · • ·

- 65·-* · při 60 psi (414 kPa) přes noc. Kyselina octová byla potom odpařena a zbytek byl azeotropně destilován třikrát s toluenem, potom smísen s MeOH a etherem. Roztok byl potom zfiltrován a azeotropně destilován dvakrát s toluenem, za získání sloučeniny (6.6) (131 g, 66% výtěžek).

Krok E: Sloučenina (1.08)

K míchanému roztoku sloučeniny (6.6) z kroku D (2,0 g,

0,0136 mol) v dioxanu (10 ml) a H₂O (5 ml) byl při 0 °C přidán roztok

1N NaOH (vodný) (4,3 ml, 0,014 mol). Získaný roztok byl míchán 10 min, byl přidán anhydrid Boc (0,11 g, 0,014 mol) a roztok byl míchán při 0 °C 15 min. Roztok byl ohřát na laboratorní teplotu, míchán 45 min, udržován v chladícím boxu přes noc a potom

2o zakoncentrován do sucha, za získání surového materiálu. K roztoku surového materiálu v EtOAc a ledu byly přidány KHSO₄ (3,36 g) a H₂O (32 ml) a směs byla míchána 4 až 6 min. Organická vrstva byla potom oddělena a vodná vrstva byla extrahována dvakrát EtOAc. Spojená organická vrstva byla promyta H₂O, roztokem soli, sušena nad

Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (1.08) (3,0 g, 89,2% výtěžek).

Krok F: Sloučenina (1.09)

K míchanému roztoku sloučeniny (1.08) z kroku E (3,0 g, 0,012 mol) v DMF (15 ml) a CH2CI2 (15 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (1,97 g, 0,012 mol), N-methylmorfolin (4,0 ml, 0,036 mol) a

EDCI (2,79 g, 0,0145 mol). Reakční směs byla míchána 10 min, byl přidán H-Gly-OBZ.HCI (2,56 g, 0,013 mol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 2 hod, udržován v chladicím boxu přes noc, potom zakoncentrován do sucha, zředěn EtOAc. Roztok EtOAc byl dvakrát promyt nasyceným NaHCO3, H₂O, 5% H3PO4, roztokem soli, sušen nad Na₂SO₄, zfiltrován a zakoncentrován za získání sloučeniny (1.09) (4,5 g, 94% výtěžek, MH⁺= 395,1).

Krok G: Sloučenina (6.9)

(1.09) (6.9)

Roztok sloučeniny (1.09) z kroku F (4,5 g, 0,0114 mol) v 4N 25 HCI/dioxanu (45 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 45 min, potom zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (6.9) (4,5 g, MH⁺ =

295,1).

• · · · · · • · *

Krok H: Sloučenina (6.11)

K míchanému roztoku sloučeniny Boc-fenylglycinu (6.1) (0,398 g, 1,58 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) ve 100 ml kulové baňce byly při -20 °C přidány HOBT (0,258 g, 1,58 mmol), EDCI (0,364 g, 1,903 mmol) a N-methylmorfolin (0,523 ml, 4,759 mmol). Směs byla míchána 5 min, byla přidána sloučenina (6.9) z kroku G (0,5 g, 1,51 mmol) a CH2CI2 (5 ml). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min a potom udržován v mrazicím boxu přes noc. Reakční směs byla zakoncentrována do sucha, extrahována směsí EtOAc-nasycený NaHCC>3. Spojená organická vrstva byla potom promyta dvakrát 5% H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.11) (0,75 g, 94% výtěžek, MH⁺ =528,1).

Krok J: Sloučenina (6.12)

(6.11)

(6.12) • · · · · · • · ·

- &$·Roztok sloučeniny (6.11) z kroku H (0,75 g, 1,423 mmol) v 4N HCI/dioxanu (21 mi) byl míchán při teplotě laboratoře 3 hod, potom zakoncentrován do sucha, za získání sloučeniny (6.12) (0,68 g, 100% výtěžek).

Krok K: Sloučenina (6.14)

K míchanému roztoku (6.13) (0,44 g, 1,725 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) byly při -20 °C přidány EDCI (0,39 g, 2,07 mmol), HOBT (0,18 g, 1,725 mmol), a N-methylmorfolin (0,523 ml, 4,76 mmol). Reakční směs byla míchána 5 min, byla přidána sloučenina (6.12) z kroku J (0,68 g, 1,64 mmol) v CH₂CI₂ (7 mi). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min a udržován v mrazicím boxu přes noc, potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta dvakrát 5% H3PO4, roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.14) (0,59 g, 54% výtěžek, MH⁺ = 667,3).

Krok L: Sloučenina (6.15)

H ° BOC-N^A

N‘

H

(6.14)

H ⁰ boc-n^A_n Ξ H

(6.15)K míchanému roztoku sloučeniny (6.14) z kroku K (0,593 g, 0,89 mmoi) v CH₂CI₂ (20 ml) byl přidán Dess-Martinův perjodinan (0,76 g, 1,784 mmol). Získaný roztok byi míchán při teplotě laboratoře 2 hod, potom byla přidána směs H₂O/CH₂CI₂. Směs byla míchána 45 min, potom byla přidána směs 50% nasycený NaHCO3/50% Na₂S₂O₃ (10 ml) a směs byla míchána další 1,5 hod. K roztoku byl přidán CH₂CI₂ a organická vrstva byla promyta roztokem soli, sušena nad Na₂SO4, zfiltrována, zakoncentrována do sucha a čištěna io chromatografii na koloně s elucí směsí 2,5% MeOH/97,5% CH₂CI₂, za získání sloučeniny (6.15) (0,48 g, 82% výtěžek).

Krok M: Sloučenina (6.16)

K míchanému roztoku sloučeniny (6.15) z kroku L (0,16 g, 20 0,24 mmol) v absolutním EtOH (10 ml) bylo přidáno Pd/C (40,8 mg).

Získaný roztok byi důkladně míchán, byla přidána 1 kapka AcOH. Roztok byl potom míchán v atmosféře H₂ 2 hod a potom zfiltrován přes celit, za získání sloučeniny (6.16) (0,133 g, 95% výtěžek, MH⁺ =

575,3).

• · • · • · · ·

-7-0« .

Krok N: Sloučenina (6.18)

O

(6.17)

K míchanému roztoku (6.17) (0,5 g, 1,59 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,259 g, 1,59 mmol), NMM (0,48 g, 4,77 mmol) a EDCI (0,366 g, 1,91 mmol). Směs byla míchána min, byla přidána sloučenina (6.9) z kroku G (0,5 g, 1,51 mmol) a CH2CI2 (5 ml). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min, udržován v mrazicím boxu přes noc, potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla potom promyta dvakrát 5% H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.18) (0,95 g, MH⁺ = 592,1).

Krok O: Sloučenina (6.19)

(6.18) (6.19)

Roztok sloučeniny (6.18) z kroku N (0,93 g, 1,58 mmol) v 4N HCI/dioxanu (26 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod, potom

-73., .

zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (6.19) (0,96 g, 100% výtěžek, MH = 492,1).

Krok P: Sloučenina (6.20)

ó (6.13)

K míchanému chlazenému roztoku sloučeniny (6.13) (0,51 g, 2,02 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,33 g, 2,02 mmol), N-methyimorfolin (0,61 g, 6,06 mmol) a EDCI (0,46 g, 2,42 mmol). Reakční směs byla míchána 5 min, byla přidána sloučenina (6.19) z kroku O (0,94 g, 1,92 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min, potom uchován v chladicím boxu přes noc, zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla promyta 5% H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.20) (1,29 g, 87% výtěžek).

(6.20)

(6.21) • · «

« · · 5 « ·

72Í

K míchanému roztoku sloučeniny (6.20) z kroku P (1,27 g, 1,74 mmol) v absolutním EtOH (50 ml) bylo přidáno Pd/C (100 mg). Získaný roztok byl důkladně míchán, byly přidány 2 kapky AcOH. Roztok byl potom hydrogenován 2 hod a zfiltrován přes celit, za získání sloučeniny (6.21) (1,07 g, 96% výtěžek, MH⁺ = 641,1).

OH

NH₂

K míchanému roztoku sloučeniny (6.21) z kroku Q (0,25 g, 0,39 mmol) v CH2CI2 (5 ml) a DMF (5 ml) byly při -25 °C přidány HOBT (0,06 g, 0,39 mmol), N-methylmorfolin (0,12 g, 1,17 mmol), EDCI (0,089 g, 0,469 mmol) a směs byla míchána 10 min, byla přidána sloučenina (6.3) z kroku B (0,069 g, 0,37 mmol). Získaný roztok byl míchán při 25 °C 15 min, udržován v chladicím boxu přes noc, potom extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta 5% H₃PO₄, roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (6.22).

Krok S: Sloučenina (6,23)

(622) (6.23) ·· φφφφ

Κ míchanému roztoku sloučeniny (6.22) z kroku R (0,23 g, 0,302 mmol) v CH2CI2 (10 ml) byl přidán Dess-Martinův perjodinan (0,256 g, 0,60 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře

2 hod, byla přidána směs H2O/CH2CI2 a míchání pokračovalo 45 min.

K reakční směsi byla potom přidána směs 50% nasycený NaHCC>3/50% Na2S2C>3 (10 ml) a směs byla míchána 1,5 hod. K roztoku byl přidán CH2CI2 a organická vrstva byla promyta roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována, zakoncentrována do sucha a čištěna chromatografií na koloně silikagelu, s elucí 1% až 3% MeOH/99% až 97% CH₂CI₂ za poskytnutí sloučeniny (6.23) (0,08 g, 34% výtěžek, MH⁺ = 771,2)

Preparativní příklad 16

(7.2)

K míchanému roztoku sloučeniny (7.1) (0,476 g, 1,51 mmol) v CH2CI2 (60 ml) a DMF (60 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,246 g, 1,51 mmol), N-methylmorfolin (0,458 g, 4,53 mmol) a EDCI (0,351 g, 1,81 mmol). Reakční směs byla míchána 5 min, byla přidána sloučenina (6.8) z preparativního příkladu 15, krok F (0,5 g, 1,51 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 3 hod, potom udržován v mrazicím boxu přes noc, zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta dvakrát 5% H3PO4, H₂O, roztokem soli, sušana nad Na2SO₄ a • · · · zakoncentrována do sucha za získání sloučeniny (7.2) (0,82 g, 94% výtěžek, MH⁺ = 592,1).

io Roztok sloučeniny (7.2) z kroku A (0,82 g, 1,39 mmol) v 4N

HCI/dioxanu (20 ml) byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod a potom zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (7.3) (0,84 g, 100% výtěžek, MH⁺ = 492,3).

K míchanému roztoku sloučeniny (6.13) (0,36 g, 1,40 mmol) v CH2CI2 (60 ml) a DMF (60 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,228 g, 1,40 mmol), NMM (0,425 g, 4,20 mmol) a EDCI (0,322 g, 1,68 mmol).

Reakční směs byla míchána 5 min, byla přidána sloučenina (7.3) z kroku B (0,84 g, 1,40 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 3 hod a potom udržován v mrazicím boxu přes noc, zakoncentrován do • ·

• · · ·

- 75 » · · · · · · sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla promyta 5% H3PO4, H₂O, roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (7.4) (0,57 g, 57% výtěžek, MH⁺ = 731,3).

Krok D: Sloučenina (7,5) u O f w O u O

(7.5) (7.4)

K míchanému roztoku sloučeniny (7.4) z kroku C (0,55 g, 0,75 mmol) v CH2CI2 (5 ml) byl přidán Dess-Martinův perjodinan (0,64 g, 1,50 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod, byla přidána směs H2O/CH2CI2. Ke směsi míchané 45 min byly potom přidány 50% nasycený NaHCC>3/50% Na₂S₂O₃ a směs byla míchána další 1,5 hod. K roztoku byl přidán CH2CI2 a organická vrstva byla potom promyta roztokem solí, sušena nad Na₂SO₄ a zakoncentrována do sucha, za poskytnutí sloučeniny (7.5) (0,24 g, 44% výtěžek, MH⁺ =

729,5).

(7.5)

- 76 K míchanému roztoku sloučeniny (7.5) z kroku D (0,10 g, 0,14 mmol) v absolutním EtOH (20 ml) bylo přidáno Pd/C (20 mg). Získaný roztok byi důkladně míchán ve 100 ml kulové baňce, probublán H₂ a míchán v atmosféře H₂ přes noc. Roztok byl potom 5 zfiltrován přes celit, promyt EtOH a zakoncentrován do sucha za získání sloučeniny (7.6) (93 mg, 100% výtěžek, MH⁺ = 639,1).

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 16, kroky A - E, s použitím sloučeniny (8.1) místo sloučeniny (7.1) v kroku A, byly připraveny sloučeniny (8.2) a (8.3).

Preparativní příklad 18

Krok A: Sloučenina (9.2)

K míchanému roztoku (S)(+)-2-fenylglycinu (9.1) (15,0 g, 0,099 mol) v benzenu (350 ml) byla přidána kyselina p-toluen25

-77-sulfonová.H₂O (20,76 g, 0,116 mol) a benzylalkohol (30 ml, 0,29 mol). Získaný roztok byl zahříván pod zpětným chladičem přes noc a roztok se změnil na kaši. Roztok byl potom ochlazen na teplotu laboratoře a byl přidán ether. Pevné podíly byly zfiltrovány přes nálevku opatřenou sintrem a dvakrát promyty Et₂O, potom sušeny v atmosféře dusíku, za získání pevné látky (35,4 g). Pevná látka byla potom rozpuštěna v CH₂CI₂ a promyta nasyceným NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla potom sušena nad Na₂SO₄ a zakoncentrována do sucha za získání volného aminu (18,1 g, 75,7% výtěžek). Volný amin byl potom rozpuštěn v etheru a probublán 1N HCI za vytvoření bílé sraženiny. Sraženina byla zfiltrována, promyta etherem a sušena ve vakuu za získání sloučeniny (9.2) (15,2 g).

Krok B: Sloučenina (9.4)

ΒοσΗΝ'^γ-θΗ

O (9-3)

K míchanému roztoku Boc-gly-OH (9.3) (11,35 g, 0,0648 mol) v bezvodém DMF (100 ml) a bezvodém CH₂CI₂ (100 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (10,5 g, 0,065 mol), EDCI (13,6 g, 0,0712 mol) a Nmethylmorfolin (21,3 ml, 0,194 mol). Získaný roztok byl míchán při teplotě -20 °C 10 min, byla přidána sloučenina (9.2) z kroku A (18,0 g, 0,065 mol). Reakční směs byla míchána 45 min při -20 °C a potom byla udržována v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta H₂O, potom roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄ a zakoncentrována do sucha, za poskytnutí sloučeniny (9.4) (26,48 g, 100% výtěžek, MH⁺= 399,2).

• ·

-78 - ·

Krok C: Sloučenina (9.5)

BocHN

(9.4)

Roztok sloučeniny (9.4) z kroku B (26,4 g, 0,065 mol) ve směsi 4N HCI/dioxan (100 ml) byi míchán při teplotě laboratoře 1 hod a io potom zakoncentrován do sucha za poskytnutí sloučeniny (9.5) (22,69 g, 100% výtěžek, MH⁺ = 299,1).

(1.08) (9.6)

K míchanému roztoku sloučeniny (1.08) z preparativního příkladu 15, krok E (15,5 g, 0,0627 mol) v DMF (150 ml) a CH₂CI₂ (150 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (10,22 g, 0,0626 mol), EDCI (13,2 g, 0,069 mol) a NMM (20,67 g, 0,188 mol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min, následovalo přidání sloučeniny (9.5) z kroku C (21,0 g, 0,063 mol). Reakční směs byla míchána při -20 °C 1 hod a potom byla udržována v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla promyta H₂O, 5% H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do

- 79 sucha za poskytnutí sloučeniny (9.6) (30,3 g, 92% výtěžek, MH⁺ = 528,1).

Krok E: Sloučenina (9.7)

BOC

H

(9-6)

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 18, krok C výše, byla připravena sloučenina (9.7) (30,0 g, 100% výtěžek, MH⁺ = 428,1).

Krok F: Sloučenina (9.9)

K míchanému roztoku Boc-His(Z)-OH (9.8) (0,5 g, 1,28 mmol) v DMF (5 ml) a CH2CI2 (5 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,209 g, 1,28 mmol), EDCI (0,27 g, 1,41 mmol) a NMM (0,42 ml, 3,85 mmol).

Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min, byla přidána sloučenina (9.7) z kroku E (0,673 g, 1,28 mmol) a směs byla míchána při -20 °C 2 hod a potom byla udržována v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl

- 80 potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta H₂O, 5% H₃PO₄ a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována, za poskytnutí sloučeniny (9.9) (0,858 g, 84% výtěžek, MH⁺ = 799).

(9.1 í)

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 18, krok C, byla připravena sloučenina (9.11) (0,76 g, 100% výtěžek, MH⁺ = 699,2).

Krok H: Sloučenina (9.12)

HCI

O \ O H O OH^h

BOC

^H O OH

/?

(9.11) (9.12)

K míchanému roztoku N-Boc-cyklohexylglycinu (0,263 g,

1,026 mmol) v DMF (5 ml) a CH₂CI₂ (5 ml) byly při -20 °C přidány

HOBT (0,167 g, 1,026 mmol), EDCI (0,216 g, 1,13 mmol) a NMM (0,338 g, 3,078 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min,

- 81 byla přidána sloučenina (9.11) z kroku G (0,754 g, 1,03 mmol). Reakční směs byla míchána při -20 °C 1 hod a potom byla udržována v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován do sucha, extraován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla potom promyta H₂O, 5% H₃PO₄ a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za poskytnutí sloučeniny (9.12) (0,735 g, MH⁺ = 938,4).

K míchanému roztoku sloučeniny (9.12) z kroku H (0,367 g, 0,377 mmol) v bezvodém CH₂CI₂ (10 ml) byl přidán Dess-Martinův perjodinan (0,32 g, 0,75 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 2 hod. K roztoku byly přidány CH₂Cl₂, nasycený Na₂S₂O₄ a nasycený NaHCO₃ a roztok byl ponechán míchat při teplotě laboratoře 1 hod. Organická vrstva byla potom oddělena a promyta H₂O a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání surového produktu (340 mg). Surový produkt byl potom čištěn chromatografii na koloně s elucí CH₂CI₂ a potom 4% MeOH/CH₂CI₂, za získání sloučeniny (9.13) (150 mg, MH⁺ = 936,3).

- 82 Krok J: Sloučenina (9.14)

K míchanému roztoku sloučeniny (9.13) z kroku I (0,15 g,

1,6 mmol) v absolutním EtOH (40 ml) bylo přidáno 10% Pd/C v 50% io H₂O (hmotn./hmotn.). Roztok byl probublán N₂ a míchán pod balonem H₂ 45 min. Katalyzátor byl potom zfiltrován přes celit, promyt EtOH/CH₂CI₂ a potom zakoncentrován do sucha, za získání sloučeniny (9.14) (0,116 g, MH⁺ = 712,2).

Preparativní příklad 19

Krok A: Sloučenina (10.2)

(10.1)

Suspenze L-3-(1-naftyl)alaninu (2,0 g, 9,34 mmol) v bezvodém EtOH (200 ml) byla vlita do 500 ml baňky. Do roztoku byl potom probubláván bezvodý koncentrovaný HCI (2 mi) pro rozpuštění všech pevných látek. Roztok byl ponechán ochladit na laboratorní teplotu 45 min a potom byl zakoncentrován do sucha, byly přidány EtOH • · (50 ml), 10% Pd/C (300 mg) a 5% Rh/C (300 mg). Získaný roztok byl umístěn v Parrově přístroji a hydrogenován při 60 psi (414 kPa). Reakční směs byla potom zfiltrována přes celit, promyta EtOH a zakoncentrována do sucha, za získání surového materiálu (2,4 g, MH⁺ = 254,2). Surový produkt byl rozpuštěn v CH2CI2 a potom promyt nasyceným NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla zakoncentrována do sucha a čištěna chromatografií na koloně silikagelu, s elucí 5% 20% EtOAc/CH₂Cl2, za poskytnutí sloučeniny (10.2) (0,65 g).

Krok B: Sloučenina (10.3)

(10.3)

K míchanému roztoku N-Boc-cyklohexylglycinu (0,643 g,

2,5 mmol) v DMF (5 ml) a CH2CI2 (5 ml) byly při -20 °C přidány HOBT (0,407 g, 2,5 mmol), EDCI (0,527 g, 2,75 mmol) a NMM (0,825 ml,

7,5 mmol). Získaný roztok byl míchán 10 min při -20 °C, byla přidána sloučenina (10.2) z kroku A a CH₂CI₂ (3 ml), a potom byl roztok udržován v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO₃. Spojená organická vrstva byla promyta H₂O, 5% H₃PO₄ a roztokem soli, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (10.3) (1,12 g, 92% výtěžek).

- 84 • · ·

(10.4)

K míchanému roztoku sloučeniny (10.3) z kroku B (1,1 g, 2,25 mmol) v MeOH (30 ml) a H₂O (7,5 ml) byl přidán LiOH (0,283 g, io 6,75 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře přes noc, následovalo přidání 5% H₃PO₄. Utvořila se sraženina a roztok byl odpařen pro odstranění většiny MeOH. Byi přidán CH₂CI₂ a vrstva CH₂CI₂ byla potom oddělena, sušena nad Na₂SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za získání sloučeniny (10.4) (1,068 g,

100% výtěžek, MH⁺= 459,1).

Krok D: Sloučenina (10.5)

K míchanému roztoku sloučeniny (10.4) z kroku C (1,0 g, 25 2,17 mmol) v DMF (10 ml) a CH₂CI₂ (10 ml) byly přidány HOBT (0,353 g, 2,17 mmol), EDCI (0,457 g, 2,38 mmol) a NMM (0,715 ml, 6,51 mmol). Získaný roztok byl míchán při -20 °C 10 min, byla přidána sloučenina (9.7) z preparativního příkladu 18, krok E (1,13 g, • ·

2,17 mmol). Reakční směs byla míchána 0,5 hod při -20 °C a potom byla udržována v mrazicím boxu přes noc. Roztok byl potom zakoncentrován do sucha, extrahován směsí EtOAc-nasycený NaHCO3. Spojená organická vrstva byla promyta H2O, 5% H3PO4 a roztokem soli, sušena nad Na2SO₄, zfiltrována a zakoncentrována do sucha, za poskytnutí sloučeniny (10.5) (1,8 g, M+Na = 890,4).

K míchanému roztoku sloučeniny (10.5) z kroku D (1,8 g,

2,07 mmol) v bezvodém CH2CI2 (40 ml) byl přidán Dess-Martinův perjodinan (1,76 g, 4,15 mmol). Získaný roztok byl míchán při teplotě laboratoře 1 hod, v průběhu 1,5 hod byl přikapáván bezvodý CH2CI2 (40 ml) a H2O (0,074 ml) a směs byla míchána další 2 hod. K tomuto roztoku bylo potom přidáno 40 ml směsi 50% nasycený NaHCC>3/50% nasycený Na₂S₂O₄ a získaný roztok byl důkladně míchán půl hodiny. Organická vrstva byla potom oddělena a promyta H₂O. Spojená organická vrstva byla zakoncentrována do sucha a čištěna chromatografií na koloně silikagelu, s elucí směsí 2% - 3%

MeOH/CH₂Cl2, za získání sloučeniny (10.6) (0,95 g, MH⁺ = 866,2).

Krok F: Sloučenina (10.7)

V podstatě stejným způsobem jako v preparativním příkladu 18, krok K, byla připravena sloučenina (10.7).

Příklady

S použitím postupů z preparativního příkladu 1, krok A, a preparativního příkladu 2, krok F pro vazebné reakce; preparativního příkladu 1, krok B, preparativního příkladu 1, krok F, preparativního příkladu 2, krok D, a preparativního příkladu 4, krok J pro odstraňování ochranných skupin esterů; preparativního příkladu 2, krok E a preparativního příkladu 4, krok J, pro odstraňování ochranných skupin aminů; a preparativního příkladu 4, krok H, pro oxidaci hydroxyamidů na ketoamidy - spolu s a-aminokyselinami z příkladů uvedených výše nebo komerčně dostupných nebo popsaných v literatuře v různých nezbytných kombinacích byly připraveny sloučeniny uvedené v přiložené tabulce 2.

Syntéza na pevné fázi

Obecný postup pro vazebné reakce na pevné fázi

Syntéza byla prováděna v reakční nádobě, která byla vytvořena z patrony z polypropylenové stříkačky opatřené u dna polypropylenovou fritou. Aminokyseliny chráněné Fmoc byly • ·

- 87 i* navazovány za standardních podmínek syntézy na pevné fázi. Do každé reakční nádoby bylo vloženo 100 mg výchozí pryskyřice FmocSieber (přibližně 0,035 mmol). Pryskyřice byla promyta 2 ml podíly DMF (2 x). Ochranná skupina Fmoc byla odstraněna působením 2 ml

20 % obj./obj. roztoku piperidinu v DMF 20 min. Pryskyřice byla promyta 2 ml podíly DMF (4 x). Vazebná reakce byla prováděna v DMF (2 ml), s použitím 0,12 mmol Fmoc-aminokyseliny, 0,12 mmol HATU [O-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát] a 0,24 mmol DIPEA (Ν,Ν-diisopropylethylamin). Po třepání po dobu io 2 hod byla reakční nádoba odsáta a pryskyřice byla promyta 2 ml podíly DMF (4 x). Vazebný cyklus byl opakován s další Fmocaminokyselinou nebo zakončovací skupinou.

Obecný postup Dess-Martinovy oxidace na pevné fázi

Tato syntéza byla prováděna v reakční nádobě vytvořené z patrony z polypropylenové stříkačky opatřené u dna polypropylenovou fritou. Hydroxysloučenina navázaná na pryskyřici (přibližně 0,035 mmol) byla zpracována působením roztoku 0,14 mmol Dess-Martinova perjodinanu a 0,14 mmol t-BuOH v 2 ml DCM 4 hod.

Pryskyřice byla promyta 2 ml podíly 20 % obj./obj. roztoku iPrOH v DCM, THF a 50 % obj./obj. roztoku THF ve vodě (4 x), THF (4 x) a DCM (4 x).

• ·

Preparativní příklad 20

N-Fmoc-2’,3’-dimethoxyfenylglycin, sloučenina (901)

CHO y OMe

OMe

901A

901B 901C

K roztoku kyanidu draselného (1,465 g, 22,5 mmol) a uhličitanu amonného (5,045 g, 52,5 mmol) ve vodě (15 ml) byl přidán roztok 2,3-dimethoxybenzaldehydu 901A (2,5 g, 15 mmol) v ethanolu (15 ml). Reakční směs byla zahřívána na 40 °C 24 hod. Objem roztoku byl redukován na 10 ml odpařením za sníženého tlaku. Byla přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková (15 ml) a sloučenina 901B byla získána jako bílá sraženina. Sloučenina 901B byla izolována filtrací (2,2 g, 9,3 mmol). Sloučenina 901B byla rozpuštěna v 10 % hmotn./hmotn. vodném roztoku hydroxidu sodného (15 ml) a získaný roztok byl zahříván pod zpětným chladičem 24 hod. Byla přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková a pH bylo upraveno na neutrální (pH 7). Získaný roztok s obsahem sloučeniny 901C byl odpařen za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn v 5 % hmotn./hmotn. vodném roztoku hydrogenuhličitanu sodného (150 ml). Roztok byl ochlazen na 0 °C v ledové lázni byly přidány 1,4-dioxan

- 89 - ·’··

(30 ml) a roztok 9-fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (2,7 g, 8 mmol) v 1,4-dioxanu (30 ml) při 0 °C. Reakční směs byla ponechána ohřát na laboratorní teplotu a byla míchána při teplotě laboratoře 24 hod. 1,4-dioxan byl odpařen za sníženého tlaku. Vodný roztok byl promyt diethyletherem. Byla přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková a pH bylo nastaveno do kyselé oblasti (pH 1). Byl přidán ethylacetát a organická vrstva byla promyta vodou a roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, za poskytnutí io požadované sloučeniny 901 jako bílé pěnovité pevné látky (3,44 g, 7,9 mmol). MS (LCMS-elektrorozprašování) 434,1 MH⁺.

Preparativní přiklad 21

Sloučenina (801)

K roztoku N-Fmoc-fenylalaninu 801A (5 g, 12,9 mmol) v bezvodém DCM (22 ml), ochlazenému na -30 °C v lázni suchý ledaceton, byly postupně přidány N-methylpyrrolidin (1,96 ml, 16,1 mmol) a methylchlorformát (1,2 ml, 15,5 mmol). Reakční směs byla míchána • ·

při -30 °C 1 hod a byly přidány roztok hydrochloridu N,Odimethylhydroxylaminu (1,51 g, 15,5 mol) a N-methylpyrrolidin (1,96 ml, 16,1 mmol) v bezvodém DCM (8 ml). Reakční směs byla ponechána ohřát na laboratorní teplotu a byla míchána při teplotě laboratoře přes noc. Byl přidán toluen a organická vrstva byla promyta zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, za poskytnutí sloučeniny 801B (4 g, 9,29 mmol).

K roztoku Red-AI (6,28 ml, 21,4 mmol) v bezvodém toluenu (8 ml) ochlazenému na -20 °C v lázni suchý led-aceton byl přidán roztok sloučeniny 801B (4 g, 9,29 mmol) v bezvodém toluenu (12 ml). Reakční směs byla míchána při -20 °C 1,5 hod. Organická vrstva byla promyta zředěnou kyselinou chlorovodíkovou, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku a surový produkt 801C byl použit v následující reakci bez dalšího čištění.

K roztoku sloučeniny 801C (přibližně 9,29 mmol) v hexanu (15 ml) byly postupně přidány roztok kyanidu draselného (24 mg, 0,37 mmol) a tetrabutylamoniumjodid (34 mg, 0,092 mmol) ve vodě (4 ml) a acetonkyanohydrin (1,27 ml, 13,9 mmol). Reakční směs byla míchána při teplotě laboratoře 24 hod. Byl přidán ethylacetát a organická vrstva byla promyta vodou a roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, za poskytnutí sloučeniny 801D (2,4 g, 6,03 mmol).

K roztoku sloučeniny 801D (2,4 g, 6,03 mmol) v 1,4-dioxanu (11 ml) byla přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková (11 ml). Reakční směs byla zahřívána na 80 °C 3 hod. Byly přidány ethylacetát (25 ml) a voda (25 ml). Organická vrstva byla promyta roztokem soli a

- 91 - ····

sušena nad bezvodým síranem sodným. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku za poskytnutí požadované sloučeniny 801 jako bílé pěnovité pevné látky (2 g, 4,8 mmol). MS (LCMS-elektrorozprašování) 418,1 MH⁺.

Příklad 101J

Sloučenina (101J)

Schéma 5

101F

ίου

Sloučeniny 101B, 101C, 101D, 101E, 101F a 101G navázané na pryskyřici byly připraveny obecným postupem pro vazebné reakce na pevné fázi, přičemž se vycházelo ze 100 mg pryskyřice Fmoc-Sieber (0,035 mmol). Sloučenina 101G navázaná na pryskyřici byla oxidována na sloučeninu 101H navázanou na pryskyřici podle obecného postupu pro Dess-Martinovu oxidaci na pevné fázi. Sloučenina navázaná na pryskyřici 101H byla zpracována působením 4 ml 2 % obj./obj. roztoku TFA v DCM 5 min. Filtrát byl přidán k 1 ml

AcOH a roztok byl zakoncentrován vakuovou centrifugací za poskytnutí sloučeniny 101J (0,011 g, 45% výtěžek). MS (LCMSelektrorozprašování) 703,2 MH⁺.

Použitím technik syntézy na pevné fázi popsaných výše byly připraveny následující skupiny, které byly použity v souladu s následujícím vzorcem:

P3 χΐ

O

P^a ^pi^b O

O

O • ·

O O • ·

Cl o

F O

P3:

O o

o

O

F

- 99 -Χ1:

-Ρ2:

Λ/V» ·

*νυ*

λλλ

h₃c • ·

- 100 -

'W'

I

Η

Jedna ze skupin -P1a a P1b je -H a druhá je zvolena ze skupiny:

-ΡΓ:

Η CH3

-Z-:

- 101 -···

- 102 -····

• ·

Ν'

Η ^ΝΗ₂ ( Ο

ΝΗ₂

S použitím výše popsaných postupů byly připraveny sloučeniny, které jsou spolu s příslušnými údaji o aktivitě uvedeny v tabulce 3.

Dále byly připraveny sloučeniny uvedené spolu s údaji o jejich aktivitě v tabulce 4. Jejich příprava se popisuje níže.

Obecné způsoby přípravy sloučenin uvedených v tabulce 4 na pevném nosiči

Syntéza na pevné fázi je použitelná pro výrobu malých množství některých sloučenin podle předkládaného vynálezu. Stejně jako je tomu v případě běžné syntézy peptidů na pevné fázi, reaktory pro syntézu peptidylketoamidů na pevné fázi jsou složeny z reaktorové nádoby, jejíž alespoň jeden povrch je propustný pro rozpouštědlo a rozpuštěná reakční činidla, ale není propustný pro syntetickou pryskyřici o zvolené velikosti zrna. Takovými reaktory jsou například reakční nádoby pro syntézu na pevné fázi ze skla opatřené fritou ze sintrovaného skla, polypropylenové trubičky nebo kolony opatřené fritami nebo reaktory Kans™ vyráběné firmou Irori lne., San Diego CA. Typ zvoleného reaktoru závisí na objemu potřebné pryskyřice pro syntézu na pevné fázi, a v různých stupních syntézy mohou být použity reaktory různých typů. Následující postupy se budou probírat v následujících příkladech:

- 104

Postup A

Vazebná reakce:

K pryskyřici suspendované v N-methylpyrrolidinu (NMP) (10 až 15 ml/g pryskyřice) byla přidána N-Fmoc- nebo N-Boc-aminokyselina (2 ekv.), HOAt (2 ekv.), HATU (2 ekv.) a diisopropylethylamin (4 ekv.).

Směs byla ponechána reagovat 4 až 48 hod. Reakční činidla byla odsáta a pryskyřice byla postupně promyta dimethylformamidem, dichlormethanem, methanolem, dichlormethanem a diethyletherem (použito 10 až 15 ml rozpouštědla/g pryskyřice).Pryskyřice byla potom io sušena ve vakuu.

Postup B

Odstranění ochranných skupin Fmoc:

Pryskyřice chráněná Fmoc byla zpracována působením 20% piperidinu v dimethylformamidu (10 ml činidla/g pryskyřice) 30 min.

Reakční činidla byla odsáta a pryskyřice byla postupně promyta dimethylformamidem, dichlormethanem, methanolem, dichlormethanem a diethyletherem (10 ml rozpouštědla/g pryskyřice).

Postup C

Odstranění ochranných skupin Boc:

Pryskyřice chráněná Boc byla zpracována působením směsi : 1 dichlormethanu a kyseliny trifluoroctové 20 až 60 min (10 ml rozpouštědla/g pryskyřice). Reakční činidla byla odsáta a pryskyřice byla postupně promyta dichlormethanem, dimethylformamidem, 5% diisopropylethylaminem v dimethylformamidu, dimethylformamidem, dichlormethanem a dimethylformamidem (10 ml rozpouštědla/g pryskyřice).

Postup D

Hydrolýza semikarbazonu:

• · · · · ·

- 105

Pryskyřice byla suspendována ve štěpícím koktejlu (10 ml/g pryskyřice) obsahujícím kyselinu trifluoctovou : kyselinu pyrohroznovou : dichlormethan : vodu v poměru 9 : 2 : 2 : 1 po dobu dvou hodin. Reakční činidla byla odsáta a postup byl opakován ještě třikrát. Pryskyřice byla postupně promyta dichlormethanem, vodou a dichlormethanem a sušena ve vakuu.

Postup E

Štěpení pomocí HF:

Vysušený peptid-nVal(CO)-G-O-PAM pryskyřice (50 mg) byl vložen do nádoby pro HF obsahující malou míchací tyčinku. Jako látka pro vychytávání radikálů byl použit anisol (10 % celkového objemu). V přítomnosti aminokyselin kyseliny glutamové a cysteinu byly také přidány thioanisol (10 %) a 1,2-ethandithiol (0,2 %). Nádoba pro HF byla potom zavěšena do zařízení HF (Immuno Dynamics) a systém byl proplachován dusíkem 5 min. Potom byl ochlazen na -78 °C lázní suchý led/isopropanol. Po 20 min byl HF destilován na požadovaný objem (10 ml HF/g pryskyřice). Reakce byla ponechána probíhat

1,5 hod při 0 °C. Další zpracování spočívalo v odstranění veškerého HF pomocí dusíku. Potom byl do pryskyřice přidán dichlormethan a směs byla míchána 5 min. Následovalo přidání 20% kyseliny octové ve vodě (4 ml). Po 20 min míchání byla pryskyřice zfiltrována na nálevce s fritou a dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku. Zbylý roztok byl promyt hexany (3 x) pro odstranění vychytávacích prostředků. Mezitím byla pryskyřice namočena v 1 ml methanolu. Vodná vrstva (20% HOAc) byla přidána zpět k pryskyřici a směs byla míchána 5 min a potom zfiltrována. Methanol byl odstraněn za sníženého tlaku a vodná vrstva byla lyofilizována. Peptid byl potom rozpuštěn v 10 až 25% methanolu (s obsahem 0,1% kyseliny trifluoroctové) a čištěn HPLC s reverzními fázemi.

• 4

- 106 • «

II) Syntéza meziproduktů

Příklad I. Syntéza Boc-3-alkylsulfinylalaninu

Ke směsi hydridu sodného (20 mmol, 800 mg 60% v oleji, promytý hexany) v tetrahydrofuranu (30 ml) byly při 0 °C přidány alkylthiol (20 mmol, R = Ph, R = 1-naftyl, R = 2-naftyl, R = PhCH₂CH₂ nebo R = Et) v průběhu 10 min. Chladicí lázeň byla odstraněna a míchání pokračovalo 10 min, a potom byl ihned přidán Boc-2S-aminopropionyllakton (reference: Synthetic Communications, (1995) 25(16), 2475 - 2482) (3,74 g, 20 mmol). Pro udržení teploty nižší než 30 °C byla použita ledová lázeň. Reakční směs byla míchána při teplotě laboratoře 16 hod, zakoncentrována a potom rozpuštěna v 1M vodném hydrogensíranu draselném (200 ml) a 1M HCI (40 ml). Směs byla extrahována dichlormethanem (2 x 200 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny (síran sodný), zfiltrovány a zakoncentrovány. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě (200 ml), methanoíu (30 ml) a uhličitanu draselném (40 mmol, 5,5 g). Po částech byl přidán oxon (21 mmol, 13,0 g) za chlazení pro udržení teploty na teplotě místnosti. Směs byla míchána 18 hod a potom zakoncentrována ve vakuu pro odstranění methanoíu. Roztok byl okyselen 2M hydrogensíranem draselným (pH = 1), extrahován ethylacetátem (2 x 100 ml). Spojené organické vrstvy byly sušeny (síran sodný), zfiltrovány a zakoncentrovány. Čištění bylo prováděno HPLC s reverzními fázemi. Po čištění byl produkt dále čištěn acidobazickou extrakcí pro odstranění materiálu s odstraněnými skupinami Boc a dále uchován ve formě diisopropylethylamoniové soli pro zabránění dalšího rozkladu (ztráta skupiny Boc).

- 107 -

Příklad II. Syntéza kyseliny 2-(1-methvlethvl)-7-methyl-okt-4-enové

OH

Výše uvedený meziprodukt byl syntetizován postupem zveřejněným v Wuts, P. G. M.; Ritter, A. R.; Pruitt, L. E., J. Org. Chem. (1992) 57, 6696 - 6700.

Příklad lil. Syntéza Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH (kroky 1 - 7 níže)

Krok 1. Syntéza allylisokyanoacetátu (kroky a - b níže)

a) Syntéza draselné soli isokyanoctové kyseliny

Ethylisokyanoacetát (96,6 ml, 0,88 mol) byl po kapkách přidán k chlazenému roztoku ethanolu (1,5 I) a hydroxidu draselného (59,52 g, 1,0 mol). Reakční směs byla pomalu ohřátá na laboratorní teplotu. Po dvou hodinách byl vysrážený produkt oddělen filtrací a ·· ·

Λ· • «

• » · » « · • · « • « · · • Φ ΦΦ promyt několika podíly chlazeného ethanolu. Draselná sůl kyseliny isokyanooctové, která byla získána, byla usušena ve vakuu na zlatohnědou pevnou látku (99,92 g, 91,8%).

b) Syntéza allylisokyanoacetátu ^CN-J^O- k⁺ ->· ^CbZ^Oailyl

K produktu z části a) (99,92 g, 0,81 mol) rozpuštěnému v acetonitrilu (810 ml) byl přidán allylbromid (92 ml, 1,05 mol). Po io zahřívání pod zpětným chladičem 4 hod byl získán tmavý hnědý roztok. Reakční směs byla zakoncentrována a zbytek byl rozpuštěn v etheru (1,5 I) a promyt vodou (3 x 500 ml). Organická vrstva byla sušena, zfiltrována a zakoncentrována na tmavě hnědý sirup. Surovina byla čištěna ve vakuu destilací při 7 mm Hg (933 Pa) (98 °C) za získání čirého oleje (78,92 g, 78 %). NMR ppm (CDCI₃): 5,9 (m, 1H),

5,3 (m, 2H), 4,7 (d, 2H), 4,25 (s, 2H).

Krok 2.

Syntéza 9-fluorenvlmethoxvkarbonylnorvalinalu (kroky a - c níže)

a) Syntéza methylesteru 9-fluorenylmethoxykarbonyl-Lnorvalinu (Fmoc-nVal-OMe)

Fmoc-HN

O

O ♦ · «·« «

- 109 -*

K chlazenému roztoku komerčně dostupného Fmoc-L-norvalinu (25 g, 73,75 mmol) v bezvodém methanolu (469 ml) byl přidán thionylchlorid (53,76 mi, 737,5 mmol) v průběhu 1 hod. TLC v ethylacetátu provedená o hodinu později potvrdila ukončení reakce (Rf = 0,85). Reakční směs byla zakoncentrována a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu. Organická vrstva byla promyta nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (3 x 200 ml), potom roztokem soli (200 ml). Organická vrstva byla sušena, zfiltrována a zakoncentrována, za poskytnutí Fmoc-norVal-OMe, jako bílé pevné látky (26,03 g) v kvantitativním výtěžku. NMR ppm (CD3OD): 7,7 (m,

2H), 7,6 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H), 4,3 (m, 2H), 4,1 (m, 2H),

3,7 (s, 3H), 1,7 (m, 1H), 1,6 (m, 1H), 1,4 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

b) Syntéza 9-fluorenylmethoxykarbonylnorvalinolu (Fmoc-nValinol)

Fmoc-HN'

O

Fmoc-HN' .OH

K Fmoc-nVal-OMe (26,03 g, 73,75 mmol) v tetrahydrofuranu (123 ml) a methanolu (246 ml) byl přidán chlorid vápenatý (16,37 g, 147,49 mmol). Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a byl přidán borohydrid sodný (11,16 g, 294,98 mmol) v několika dávkách. K získané husté pastě bylo přidáno 500 ml methanolu a reakční směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře 90 min. TLC v mobilní fázi 2 : 3 ethylacetát : hexan potvrdila ukončení reakce (Rf = 0,25). Reakce byla ukončena pomalým přidáváním 100 ml vody při 0 °C. Methanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbylá vodná fáze byla zředěna ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou (3 x

-1Ť0

500 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (3 x 500 ml) a roztokem soli (500 mol). Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným a zakoncentrována na bílou pevnou látku (21,70 g, 90,5 %). NMR ppm (CD₃OD): 7,8 (m, 2H), 7,7 (m, 2H), 7,4 (m, 2H), 7,3 (m, 2H),

4,3 - 4,5 (m, 2H), 4,2 (m, 1H), 3,6 (s, 1H), 3,5 (s, 2H), 1,5 (m, 1H), 1,3

- 1,4 (m, 3H), 0,99 (m, 3H).

c) Syntéza 9-fIuorenylmethoxykarbonylnorvalinalu (Fmoc-nValCHO)

Fmoc-HN „„ O

K roztoku Fmoc-norValinolu (21,70 g, 66,77 mmol) v dichlormethanu (668 ml) byl přidán triethylamin (37,23 ml, 267 mmol) a roztok byl ochlazen na 0 °C. K tomuto roztoku byla přidána suspenze komplexu pyridin - oxid sírový (42,51 g, 267 mmol) v dimethylsulfoxidu (96 ml). Po jedné hodině potvrdila TLC v mobilní fázi 2 : 3 ethylacetát : hexany ukončení reakce. Dichlormethan byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a promyt vodou (2 x 50 ml), 1N nasyceným hydrogensíranem sodným (2 x 50 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (2 x 50 ml) a roztokem soli (50 ml). Organická vrstva byla zakoncentrována za získání bílé pevné látky. Byl předpokládán teoretický výtěžek (21,57 g) a reakční směs byla použita v příštím kroku bez dalšího čištění.

Krok 3.

Syntéza trifluoracetátové soli difenylmethylsemikarbazidu (dpsc) (kroky a - b níže)

a) Syntéza Boc-semikarbazid-4-yl-difenylmethanu • ·

K roztoku karbonyldiimidazolu (16,2 g, 0,10 mol) v dimethyl-formamidu (225 ml) byl přidán roztok terc-butylkarbazátu (13,2 g, 0,100 mol) v dimethylformamidu (225 ml) po kapkách v průběhu 30 min. Difenylmethylamin (18,3 g, 0,10 mol) byl přidán během dalších 30 min. Reakční směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře io jednu hodinu. Byla přidána voda (10 ml) a směs byla zakoncentrována na přibližně 150 ml za sníženého tlaku. Tento roztok byl vlit do vody (500 ml) a extrahován ethylacetátem (400 ml). Ethylacetátová fáze byla promyta 1N HCI (2 x 75 ml), H₂O (2 x 75 ml), nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (2 x 75 ml) a chloridem sodným (2 x 75 ml), a sušena síranem hořečnatým. Směs byla zfiltrována a roztok byl zakoncentrován za získání 29,5 g (85% výtěžek) bílé pěny. Tento materiál mohl být čištěn rekrystalizací ze směsi ethylacetát/hexan, ale měl dostatečnou čistotu pro přímé použití v dalším kroku: teplota tání 142 - 143 °C. ¹H NMR (CDCH) d 1,45 (s,

9H), 6,10 (dd, 2H), 6,42 (s, 1H), 6,67 (bs, 1H), 7,21 - 7,31 (m, 10H).

Analyticky vypočteno pro: Ci9H₂₃N₃O₃: C, 66,84; H, 6,79; N, 12,31. Nalezeno: C, 66,46; H, 6,75; N; 12,90.

b) Syntéza trifluoracetátové soli difenylmethylsemi -karbazidu (dpsc)

- 112”-

Roztok Boc-semikarbazid-4-yl-difenylmethanu (3,43 g, 10 mmol) v dichlormethanu (12,5 ml) byl smísen s kyselinou trifluoroctovou (12,5 ml) při teplotě laboratoře a ponechán míchat 30 min. Roztok byl přidán po kapkách do 75 ml etheru a získaná pevná látka (2,7 g, 80 %) 5 byla oddělena filtrací. Teplota tání 182 - 184 °C. ¹H NMR (CD3OD) d 6,05 (s, 1H), 7,21 - 7,35 (m, 10H). ¹³C NMR (CD₃OD) d 57,6, 118,3 (q,

CF₃), 126,7, 127,9, 141,6, 156,9, 160,9 (q, CF₃CO₂H).

Krok 4. Syntéza Fmoc-nVal-(CHOH)-Glv-O-allylu

allyiisokyanoacetát

->

pyridin, kyselina trifluoroctová dichlormethan

K roztoku Fmoc-nVal-CHO (příklad III, krok 2c) (5,47 g, 16,90 mmol) v dichlormethanu (170 ml) byl přidán allyiisokyanoacetát (příklad III, krok 1b) (2,46 ml, 20,28 mmol) a pyridin (5,47 ml, 67,61 mmol). Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a po kapkách byla přidána kyselina trifluoroctová (3,38 ml, 33,80 mmol). Reakční směs byla míchána při 0 °C 1 hod a potom při teplotě laboratoře 48 hod. TLC v ethylacetátu potvrdila ukončení reakce. Reakční směs byla zakoncentrována a čištěna bleskovou chromatografií s použitím 20% až 70% ethylacetátu v hexanech. Frakce obsahující požadovaný produkt byly spojeny a zakoncentrovány na bílou pěnu (6,88 g,

87.3 %). TLC v poměru 1 : 1 ethylacetát/hexany ukázala jednu skvrnu (R_f = 0,37). NMR ppm (CD₃OD): 7,8 (m, 2H), 7,65 (m, 2H), 7,4 (m,

2H), 7,3 (m, 2H), 5,9 (m, 1H), 5,1 - 5,4 (m, 2H), 4,55 - 4,65 (m, 2H),

4.3 - 4,4 (m, 2H), 4,15 - 4,25 (m, 1H), 4,01 (s, 1H), 3,9 - 4,0 (m, 3H),

1,5 - 1,6 (m, 2H), 1,35 - 1,45 (m, 3H), 0,9 (m, 3H).

• · · ·

Krok 5. Syntéza Fmoc-nVal-(CO)-Glv-Qallylu

Fmoc-HN

dimethyisulfoxid, toluen

EDC, kyselina dichloroctová

Fmoc-HN

K roztoku Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O-allylu (krok 4) (5,01 g, 10,77 mmol) v dimethylsulfoxidu (100 ml) a toluenu (100 ml) byl přidán EDC (20,6 g, 107,7 mmol). Reakční směs byla ochlazena na 0 °C a po kapkách byla přidána kyselina dichloroctová (4,44 ml, 53,83 mmol).

Reakční směs byla míchána 15 min při 0 °C a 1 hod při teplotě laboratoře. Byla přidána voda (70 ml) při 0 °C a toluen byl odstraněn za sníženého tlaku. Zbytek byl zředěn ethylacetátem a několikrát promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a 1N hydrogensíranem sodným a roztokem soli. Organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a zakoncentrována. Byl předpokládán teoretický výtěžek 4,99 g a reakční směs byla použita v příštím kroku bez dalšího čištění. TLC v poměru 1 : 1 ethylacetát/hexany ukazuje jednu skvrnu (R_f = 0,73).

Krok 6. Syntéza Fmoc-nVal-(dpsc)-Glv-Oallylu

3C

Fmoc-HN

octan sodný, voda, ethanol difenylmethylsemikarbazid

Fmoc-HN'

NH-CH(Ph)2

- 1 Τ4·-

Κ roztoku Fmoc-nVal-(CO)-Gly-Oallylu (krok 5) (4,99 g,

10,75 mmol) v ethanolu (130 ml) a vodě (42 ml) byla přidána trifluoracetátová sůl difenylmethylsemikarbazidu (dpsc) (příklad III, krok 3b) (7,6 g, 21,5 mmol) a octan sodný.3H2O (1,76 g, 12,9 mmol).

Reakční směs byla zahřívána pod zpětným chladičem 90 min. Ukončení reakce bylo potvrzeno chromatografií na tenké vrstvě ve sněsi 1 : 1 ethylacetát : hexan. Ethanol byl odstraněn za sníženého tlaku a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a promyt 1N hydrogensíranem sodným (2 x 10 ml), nasyceným hydrogenuhličitanem sodným (2 x 10 ml) a roztokem soli (2 x 10 ml). Organická vrstva byla sušena, zfiltrována a zakoncentrována. Získaný zbytek byl čištěn bleskovou chromatografií v 20% až 50% ethylacetátu v hexanech za získání bílé pevné látky (5,76 g, 78 %). TLC v poměru 1 : 1 ethylacetát/hexany ukázala dvě skvrny (cis a trans isomery) s hodnotami Rf = 0,42 a 0,50.

Krok 7. Syntéza Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH

dimedon, katalyzátor ->

tetrahydrofuran

K roztoku Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-Oallylu (příklad III, krok 6) (4,53 g, 6,59 mmol) v tetrahydrofuranu (300 ml) byl přidán dimedon (4,62 g, 32,97 mmol), potom katalyzátor tetrakis(trifenylfosfin)30 -paladium(O) (0,76 g, 0,66 mmol). Po 90 min bylo ukončení reakce potvrzeno TLC (9 : 1 dichlormethan : methanol). Reakční směs byla zakoncentrována a zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu a promyt 0,1 M

dvojfosforečnanem draselným (3 x 50 ml). Organická vrstva byla smísena s 50 ml hydrogensíranu sodného a dvoufázový systém byl míchán 15 min. Fáze byly odděleny a postup byl opakován ještě dvakrát. Organická vrstva byla sušena, zfiltrována a zakoncentrována a čištěna bleskovou chromatografií na koloně (20% až 100% ethylacetát v hexanech, potom 9 : 1 dichlormethan : methanol), za získání bílé pevné látky (3,99 g, 94 %). TLC v poměru 9 : 1 dichlormethan : methanol ukazuje dvě skvrny (cis a trans isomery). NMR δ ppm (CD₃OD): 7,75 (m, 2H), 7,6 (m, 3H), 7,2 - 7,4 (m, 14H),

6,1 - 6,2 (m, 1H), 4,25 - 4,4 (m, 2H), 4,1 - 4,2 (m, 2H), 3,85 (s, 2H),

1,6 - 1,8 (m, 2H), 1,3 - 1,5 (m, 2H), 0,95 (t, 3H).

Příklad IV

Syntéza H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice (kroky 1-2 níže)

NH-MBHA pryskyřice

Komerčně dostupná pryskyřice MBHA (2,6 g, 1,12 mmol/g, 2,91 mmol) byla převedena do 250 ml reakční nádoby pro syntézu na • ·

pevné fázi opatřené fritou a vstupem dusíku. Pryskyřice byla důkladně promyta 30 ml podíly dichlormethanu, methanolu, dimethylformamidu a dichlormethanu a vázána po dobu 18 hod na komerčně dostupný Fmoc-Phg-OH (2,17 g, 5,82 mmol) použitím postupu A s 99,82% účinností. Z pryskyřice byly potom odstraněny ochranné skupiny Fmoc postupem B. Kvalitativní ninhydrinový test s malým alikvotem poskytl tmavě modrou pryskyřici a roztok, což ukazuje na úspěšnou reakci.

Krok 2, Syntéza H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice

Pryskyřice získaná v kroku 1 výše (2,6 g, 0,8 mmol/g, 2,91 mmol) byla ponechána reagovat s Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH (příklad III, krok 7) (5,82 mmol, 3,77 g) jako v postupu A. Po 18 hod ukázala kvantitativní ninhydrinová analýza 99,91 % účinnost reakce.

Praskyřice byla zbavena ochranných skupin Fmoc způsobem B. Kvalitativní ninhydrinový test na malém alikvotu poskytl tmavě modrou pryskyřici a roztok, což ukazuje na úspěšnou reakci.

lil) Sestavení reprezentativních cílů pro hepatitidu C na pevné fázi

Příklad V: Syntéza 2,5-difiuor-6-hydroxykarbonvlfenylkarbonvl-G(Chx)-Leu-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH2 na pevné fázi (kroky 1 - 5 níže)

- 117·-·

Krok 1. Syntéza Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice

N X YnH-MBHA pryskyřice

H

Fmoc—N

N A ‘ γΝΗ-ΜΒΗΑ pryskyřice

NH-CH(Phfe

Sloučenina H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice(příklad IV, krok 2) (1,5 g, 1,12 mmol/g, 1,68 mmol) byla převedena do polypropylenové zkumavky opatřené fritou a byla provedena reakce s N-Fmoc-Leu-OH (890 mg, 2,52 mmol) jako v postupu A. Po 18 hod ukázala kvalitativní ninhydrinová analýza bezbarvé kuličky a roztok.

- 1 1*8.....

Pryskyřice získaná v příkladu V, krok 1 (Fmoc-Leu-nVal(dpsc)15 -Gly-Phg-MBHA pryskyřice, 1,68 mmol) byla zbavena ochranných skupin Fmoc postupem B. Potom byla navázána komerčně dostupná Fmoc-G(Chx)OH (0,956 g, 0,2,52 mmol) jako v postupu A. Po 18 hod ukázala kvantitativní ninhydrinová analýza 98% účinnost reakce.

Krok 3. Syntéza 2,5-difluor-6-hvdroxykarbonvlfenylkarbonvl-G(Chx)Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice

NH-MBHA pryskyřice • ·

Pryskyřice získaná v příkladu V, krok 2 (pryskyřice Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-G-Phg-MBHA) byla zbavena ochranných skupin Fmoc způsobem B. Ninhydrinový test na malém alikvotů poskytl tmavě modrou pryskyřici a roztok, což ukazuje na úspěšnou reakci. K pryskyřici (150 mg, 0,168 mmol) suspendované v 1 ml NMP byl přidán anhydrid kyseliny 3,6-difluorftalové (91 mg, 0,42 mmol) a potom diisopropylethylamin (0,146 ml, 84 mmol), a reakční směs byla třepána 18 hod při teplotě laboratoře. Kvantitativní ninhydrinová analýza ukázala 97,8% účinnost reakce.

Krok 4. Syntéza 2,5-difluor-6-hvdroxvkarbonvlfenylkarbonvl-G(Chx)Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice

F

- 120·-·

Sloučenina z příkladu V, krok 3 (2,5-difluor-6-hydroxy-karbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice) (200 mg) byla podrobena semikarbazonové hydrolýze postupem D.

Krok 5. Syntéza 2,5-difluor-6-hvdroxvkarbonvlfenylkarbonvl-G-

hydroxykarbonylfenylkarbonyl-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice) (100 mg) byla vystavena podmínkám štěpení HF (postup E) za získání požadovaného surového produktu. Materiál byl čištěn HPLC s použitím kolony 2,2 x 25 cm s reverzními fázemi s obsahem pryskyřice C-18 s částicemi gelu velikosti 10 pm s velikostí pórů 300 Á, a s elucí gradientem s použitím 20 - 50% acetonitrilu ve vodě.

Analytická HPLC s použitím kolony s reverzními fázemi 4,6 x 250 mm s pryskyřicí C-18 s částicemi gelu velikosti 5 pm a velikostí pórů 300 A, s elucí směsí 10 - 60% acetonitrilu ve vodě (s obsahem 0,1 % kyseliny trifluoroctové) ukázala jeden vrchol v čase 17,2 min.

• · · ·

Hmotnostní spektrometrie s nízkým rozlišením potvrdila požadovanou hmotnost (MH⁺ 771,5).

Příklad VI

Syntéza iBoc-G(Chx)-Cvs((Q2)Et)-nVal-(CO)-Glv-Phg-NH₂ na pevné fázi (kroky 1 - 5 níže)

Krok 1. Syntéza Fmoc-Cys((Q2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phq-MBHA pryskyřice

NH-MBHA pryskyřice

O=(

NH-CH(Ph)₂

Boc—N.

NH-MBHA pryskyřice

NH-CH(Ph)₂

- 122*-

Sloučenina H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice(příklad IV, krok 2) (0,17 g, 0,8 mmol/g, 0,19 mmol) byla převedena do polypropylenové zkumavky opatřené fritou a byla navázána na BocCys((O2)Et)-OH (příklad I) (160 mg, 0,38 mmol) použitím postupu A. 5 Po 18 hod kvantitativní ninhydrinová analýza ukázala 99,98% průběh reakce.

Krok 2.

Syntéza Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-PhgMBHA pryskyřice

NH-MBHA pryskyřice

NH-CH(Ph)₂

Fmcc-HN

NH-MBHA pryskyřice

NH-CH(Ph)₂

Pryskyřice získaná v předcházejícím kroku (příklad VI, krok 1) (Boc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice, 0,19 mmol) byla zbavena ochranných skupin Boc postupem C. Potom byl navázán Fmoc-G(Chx)-OH (0,170 g, 0,45 mmol) postupem A. Po 18 hod ukázala kvantitativní ninhydrinová analýza 99,92% účinnost vazby.

• ·

- 123·-· *

Krok 3. Syntéza iBoc-G(Chx)-Cvs(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-PhqMBHA pryskyřice

Pryskyřice získaná v předcházejícím kroku (příklad VI, krok 2) (Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice) byla zbavena ochranných skupin Fmoc postupem B. Ninhydrinový test provedený s malým alikvotem poskytl tmavě modrou pryskyřici a roztok, což ukazuje na úspěšný průběh reakce. K pryskyřici (170 mg, 0,19 mmol) suspendované v 1 ml NMP byl přidán isobutylchloroformát (0,06 ml mg, 0,45 mmol), potom diisopropylethylamin (0,16 ml, 0,90 mmol), a reakční směs byla třepána 18 hod při teplotě laboratoře. Kvantitativní ninhydrinová analýza ukázala 99,35% účinnost reakce.

- 124’-’

Krok 4. Syntéza iBoc-G(Chx)-Cvs((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-PhqMBHA pryskyřice

Sloučenina z předcházejícího kroku (příklad VI, krok 3), iBocG(Chx)-Cys(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice (170 mg) byla vystvena semikarbazonové hydrolýze postupem D.

Krok 5. Syntéza iBoc-G(Chx)-Cvs((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2

Pryskyřice z předcházejícího kroku (příklad VI, krok 4) (iBocG(Chx)Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA pryskyřice) (170 mg) byla vystavena podmínkám štěpení HF (postup E) za získání požadovaného surového produktu. Materiál byl čištěn HPLC s použitím kolony 2,2 x 25 cm s reverzními fázemi s obsahem pryskyřice C-18 s částicemi gelu 10 pm a velikostí pórů 300 A, s elucí gradientem 20 50% acetonitril ve vodě. Analytická HPLC s použitím kolony 4,6 x 250 mm s reverzními fázemi s obsahem pryskyřice C18 s částicemi gelu 5 pm a velikostí pórů 300 A, s elucí 10 - 60% acetonitriiem ve vodě (s obsahem 0,1% kyseliny trifluoroctové) ukázala jeden vrchol v čase 16,94 min. Hmotnostní spektrum s nízkým rozlišením potvrdilo požadovanou hmotnost (MH⁺ 737,5).

Test inhibiční aktivity na proteázu HCV

Spektrofotometricky test

Spektrofotometrický test na serinovou proteázu HCV byl prováděn pro sloučeniny podle vynálezu postupem popsaným autory R. Zhang a další, Analytical Biochemistry, 270 (1999) 268 - 275, jehož obsah se zařazuje odkazem. Test je založen na proteolýze chromogenních esterových substrátů a je vhodný pro kontinuální monitorování aktivity HCV proteázy NS3. Substráty byly odvozeny od místa P sekvence spojení NS5A-NS5B (Ac-DTEDWX(Nva), kde X = A nebo P), jehož C-koncové karboxylové skupiny byly esterifikovány

- 128·-

jedním ze čtyř různých chromoforních alkoholů (3- nebo 4-nitrofenol, 7--hydroxy-4-methyl-kumarin, nebo 4-fenylazofenol). Dále je uvedena syntéza, charakterizace a použití těchto nových spektrofotometrických esterových substrátů pro screening velkého množství vzorků a podrobné kinetické vyhodnocení inhibitorů proteázy NS3 HCV.

Materiály a metody

Materiály: Chemická činidla pro pufry potřebné pro test byla získána od firmy Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Činidla pro syntézu peptidu byla od firmy Aldrich Chemicals, Novabiochem (San Diego, California), Applied Biosystems (Foster City, California) a Perseptive Biosystems (Framingham, Massachusetts). Peptidy byly syntetizovány ručně nebo na automatickém syntezátoru ABI model 431A (firmy Applied Biosystems). Spektrofotometr UV/VIS Spectrometer model LAMBDA 12 byl od firmy Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut) a 96-jamkové destičky pro UV byly získány od firmy Corning (Corning, New York). Předehřívací blok byi od firmy USA Scientific (Ocala, Florida) a míchačka pro 96-jamkové destičky byla od firmy Lablíne Instruments (Melrose Park, Illinois). Odečítací zařízení pro mikrotitrační destičky Spectramax Plus s monochromátorem bylo získáno od firmy Molecular Devices (Sunnyvale, California).

Příprava enzymu:

Rekombinantní heterodimerní proteáza HCV NS3/NS4A (kmen 1a) byla připravena použitím dříve zveřejněných postupů (D. L. Sáli a další, Biochemistry, 37 (1998) 3392 - 3401). Koncentrace proteinů byly zjišťovány metodou barvení Biorad s použitím standardů protézy HCV dříve kvantifikované analýzou aminokyselin. Před zahájením testu byl vyměněn pufr pro skladování enzymu (50 mM fosforečnan sodný pH • · · ·

- 127·- —

8,0, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% laurylmaltosid a 10 mM DTT) za testovací pufr (25 mM MOPS pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% laurylmaltosid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT) s použitím hotových kolon Biorad Bio-Spin P-6.

Syntéza a čištění substrátu

Syntéza substrátů byla prováděna podle autorů R. Zhang a další, (výše) a byla zahájena ukotvením Fmoc-Nva-OH na 2-chlortritylchloridovou pryskyřici s použitím standardního protokolu (K. Barlos a další, Int. J. Pept. Protein Res., 37 (1991), 513 - 520). Peptidy byly potom sestaveny použitím chemických reakcí Fmoc, buď ručně nebo na automatickém syntezátoru peptidů ABI model 431. Nacetylované a úplně chráněné fragmenty peptidů byly od pryskyřice odštěpeny bud 10% kyselinou octovou (HOAc) a 10% trifluorethanolem (TFE) v dichlormethanu (DCM) 30 min, nebo 2% kyselinou trifluoroctovou (TFA) v DCM 10 min. Spojený filtrát a promývací roztok DCM byl azeotropně odpařen (nebo opakovaně extrahován vodným roztokem Na2CO3) pro odstranění kyseliny použité při štěpení. Fáze DCM byla sušena nad Na₂SO₄ a odpařena.

Esterové substráty byly sestaveny použitím standardních reakčních postupů kyselina - alkohol (K. Holmber a další, Acta Chem. Scand., B33 (1979) 410 - 412). Fragmenty peptidů byly rozpuštěny v bezvodém pyridinu (30 až 60 mg/ml), co kterého bylo přidáno 10 molárních ekvivalentů chromoforu a katalytické množství (0,1 ekv.) kyseliny para-toluensulfonové (pTSA).

Byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (DCC, 3 ekv.) pro zahájení reakcí. Tvorba produktu byla monitorována HPLC a bylo zjištěno, že je u konce po 12 až 72 hod reakce při teplotě laboratoře. Pyridinové rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a dále azeotropním odpařením s toluenem. Ester peptidů byl zbaven ochranných skupin 95% TFA v DCM 2 hod a extrahován třikrát bezvodým ethyletherem pro

- 12«·odstranění přebytku chromoforu. Substrát bez ochranných skupin byl čištěn HPLC s reverzními fázemi na koloně C3 nebo C8 s gradientem 30% až 60% acetonitril (s použitím šesti objemů kolony). Celkový výtěžek po čištění HPLC byl přibližně 20 až 30 %. Molekulová hmotnost byla potvrzena hmotnostní spektroskopií s elektrorozprašovací ionizací. Substráty byly uchovány ve formě suchého prášku v exikátoru.

Spektra substrátů a produktů

Spektra substrátů a odpovídajících chromoforních produktů byla získána v testovacím pufru pH 6,5. Extinkční koeficienty byly zjištěny při optimální vlnové délce mimo vrchol v kyvetách 1 cm (340 nm pro 3Np a HMC, 370 nm pro PAP a 400 nm pro 4-Np) s použitím vícenásobného ředění. Optimální vlnová délka mimo vrchol byla definována jako vlnová délka, která poskytne maximální frakční rozdíl v absorbanci mezi substrátem a produktem (OD produktu - OD substrátu)/OD substrátu).

Test na proteázy

Testy na proteázu HCV byly prováděny při 30 °C s použitím 200 pl reakční směsi v 96-jamkové mikrotitrační destičce. Podmínky testovacího pufru (25 mM MOPS pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% laurylmaltosid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT) byly optimalizovány pro heterodimer NS3/NS4A (D. L. Sáli a další, výše)). Typicky bylo do jamek vloženo 150 μΙ směsí pufru, substrátu a inhibitoru (konečná koncentrace DMSO 4 % obj./obj.) a ponechány inkubovat při 30 °C přibližně 3 min. Pro zahájení reakce bylo potom použito 50 μΙ předehřáté proteázy (12 nM, 30 °C) v testovacím pufru (konečný objem 200 μΙ). Destičky byly monitorovány po celou dobu testu (60 min) pro zjištění absorbance při příslušné vlnové délce (340 nm ·· · ·« * ······ ··· · · · · · 4 • * ··« ··· pro 3-Np a HMC, 370 nm pro PAP a 400 nm pro 4-Np) s použitím odečítacího zařízení pro mikrotitrační destičky Spectromax Plus vybaveného monochromátorem (přijatelné výsledky lze také získat s odečítacími přístroji využívajícími spektrální filtry). Proteolytické štěpení esterové vazby mezi Nva a chromoforem bylo monitorováno při vhodné vlnové délce proti blanku bez přidaného enzymu jako kontrole pro neenzymatickou hydrolýzu. Vyhodnocení kinetických parametrů substrátu bylo prováděno v třicetinásobném rozmezí koncentrací (~6 až 200 μΜ). Počáteční rychlosti byly zjištěny metodou lineární regrese a kinetické konstanty byly získány proložením těchto údajů pomocí rovnice Michaelise-Mentenové pomocí nelineární regresní analýzy (Mac Curve Fit 1,1, K. Raner). Čísla přeměny (k_Cat) byla vypočtena za předpokladu úplné aktivity enzymu.

Vyhodnocení inhibitorů a inaktivátorů

Inhibiční konstanty (Κ;) pro kompetitivní inhibitory Ac-D-(D-Gla)-L-l-(Cha)-C-OH(27), Ac-DTEDVVA(Nva)-OH a Ac-DTEDWP(Nva)-OH byly zjištěny experimentálně při pevných koncentracích enzymu a substrátu vynesením poměru v₀/ví proti koncentraci inhibitoru ([l]o) podle přeuspořádané rovnice Michaelise-Mentenové pro kinetiku kompetitivní inhibice: vo/v, = 1 + [l]o/(K« (1 + [S]₀/K_m)), kde v₀ je neinhibovaná počáteční rychlost, v, je počáteční rychlost v přítomnosti inhibitoru při jakékoli dané koncentraci inhibitoru ([l]o) a [S]o je použitá koncentrace substrátu. Získané údaje byly proloženy metodou lineární regrese a výsledná směrnice, 1/(Κ,(1 + [S]₀/K_m) byla použita pro výpočet hodnoty K,*.

Získané hodnoty K* pro různé sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou uvedené v tabulce výše, kde byly sloučeniny uspořádány v pořadí podle rozmezí hodnot K*. Z výsledků těchto testů je zřejmé odborníkovi v oboru, že sloučeniny podle vynálezu jsou výborně použitelné jako inhibitory serinové proteázy NS3.

·· · ·· a >····*·· ··«· · 9 · · · » 9 • v · · * ·«· • ··«· · » · · · . _· - · · · · ·«·· _ Ί wQ ·_ a · · «· «· · · ·

I když byl předkládaný vynález popsán na uvedených konkrétních provedeních, odborníkovi v oboru budou zřejmé mnohé alternativy, modifikace a jiné variace těchto příkladů. Všechny takové alternativy, modifikace a variace mají spadat do rámce a podstaty předkládaného vynálezu.

** · ·· · ·· ··«· •»»r **·. _<t .

* * ·· · · ·· * * · * Φ · · Λ M A a

-131··-· ........

Tabulka 2

Sloučenina z příkladu č.	Struktura	Vzorec	LRMS (FAB) M+H
1	—x~0H. ύα-ΑΧ-Αζó ’ V	C44H68N6O8	809,5
2	/·», Q °«s/ 0 f 0 0 ó ’ v	C^HsoNgOg	753,5
3	ó ° V	C42H62N6O8	779,5
4	ΊΓ'0	C39H54N6O8	735,4
5	/CH’ SA. .0 ó 0 V 0	C35H54N6O8 J	687,4
6	ΑΑΧγ AA3r	CasHsiBrNeOs J	720,4

• · • · • ·

7	HjC 0	J w,	C38H47F5N6O8	811,3
	-CVy Ύ ·' ý° °ó
8	H_C CH, 0 .	£ 0 \	0 o o ’<γΛ^-^Λ>ΓΛγ-ΝΗ, =*s	C41H53N7O10	804,4
9	-•'/'Λh,c °		4--:/-0	C42H54N6O8	771,4
10	M,C 0	y. ° y	£ý	C38H49F3N6O8	775,4
		r F	/
11		H£	0	C35H53N5O9	688,4
	CH, 00 0	V o o OS
12		w i	XwA 0 0 A > M	C39FÍ51F3N6O8	789,4
13	J**5 j?	T/UW-	C42H57N5O9	776,4

- ιδβ -

14	* t*. ř, * „ o> M ,C —4 C H , \ - . <-o 0-^=0 M >c—y''* C Hj	C34H49F 3Νθθ8	727,4
15	Π ř I ř i° T ΓΊ Λό 0 v	C47H59N5O10	854,4
16	y Q x’ó °\° '0	C40H53N5O1O	764,4
17	ύ o S „ oQ λ y/γ^ΛγφΑΧΛΑ) U °Λ ° y ° M °Λ	C48H61N5O10	868,4
18	Y° .X .0 U »0 .ý 0	C4iH5SNsO10	778,4
19	oO f ff ř >’ °ů	C33H49N5O9S	692,3
20	ΓΊ r“ 0 >° n<0 H£ \JI	C42H59N5O9	778,4

• ·

- >34»·

21	Q τ « ' “0	C38H50FN5O9	740;4
22	/5. .Cl Λ ÍY 0 HsC 0 0 0 V ^YVxTyYyKÁ/yof °ó ° v 0	C38H50CIN5O9	756,3
23	H>C o (^0 0 Q vMr γγ^/γ^ Ό “V °	C38H50FN5O9	740,4
24	v, Π VyuQýjYo 1 0 A o t o o ^0 \	C4SH61N5O10	832,4
25	CH, Y-CHj (íY 1 0 / 0 o X 0 Á. 0 < 0 0 Λ“0 u	C38H57N5O10	744,4
26	.$=> <Z2	C/HssNsOg	861,5
27	.í=> 3=^-^¾	C43H68N6O9	813,5

-145·-

28	° ’-Ο :2·ο	C4iH56N6O10	793,4
29	° \ 0 0 Á r: Λ Η£ °*>	C37H57N5O9	716,4
30	Π··^’ °ο	C39H55N5O1O	754,4
31		C4SH59N5O1O	842,4
32	°ό 4° 0	036^55^5^9	702,4
33	ο, .λ. οΟ °ό 4°	C40H63N5O9	758,5
34	„ . / . .0 A-aWA°/\ ί 0 0 υ «,	C34H49N5O9	672,4

• ·

- >36·-

35	0 >. 0 > 0 0 CH, kJ	C38H57N5O9	728,4
36	CM, 0 ? 0 °	Csef-^NsOgS	990,5-
37	iÝkx ZvA' Η,ιγ/^Ο jU š Ά[α <0 0	C44H55N5O9	798,4
38	w\v. ·+-· ’é	C35H49N7O9	712,4
39	Λ .jlPí 1? 'γάΫΥ «,	C40H61N5O10S2	836,4
40	P í i^~s 0 °Q π^ΥρΛϋυ^Λλ^ °ΓΊ ° \ 0 v os	C39H59N5O9S2	806,4
41	p í ,? ?Q fsc/^AíV^<Y\\^ř^ArVCH 0 0 \ o 0	I C36H53N5O9S2	764,3

- 1Č7-

42	r* i? ^~s ř °Q °(J ° V ° CH,	£40^61 NsOgS2	820,4
43		C35H51N5O9S2	750,3
44	° W °n H,C	C4oHg4N60nSi	805,5
45	Λ F HAY-V^MVvMyVyVL M °>° “Q	C34H52NgOg	689,4
47	cAV v^° °ň O H,C 1^	C37H4SCI2N6O10	805,3
48	° ý^° °Λο Hp	C36H54FN5O9	720,4
49	ívVAaJ3 0 Ý<K, 0 °«Ao H,C	C35H52FN5O9	706,4

• ·

- 138.-

50	° >H’0 ° ó	C49H62N6O11	911,5
51	-γθ <N> ' ° -V ’ ° ó	C41H56N6O10	793,4
52	vOA • Ψ . /: τ >' ó	^42^55^60^	837,4
53	c> 0 Μ ψΟΓ“' „Z'1“' ó	C41H57N7O12S	872,4
54	'Ογ=Η5 ^Aa<w„ “ '>· '0	C36H54N6O10	731,4
55	Υύ% o o P o o ΗΙ<Νγ^ίΑΝ^γ'<γΑ(^γ\)χ^Λ^0Η ip 0	C40H62N6O10	787,5
56	’^’ ’Ó	C42H64N6O10	813,5

- 139’-

57			Ο,ιοΗθοΝδΟ-ιο	785,4
	CH,	Χ^κγ' VH, ° H,C	0 ó
58	Ο r^> ch.		C38H574N7O11	788,4
	*XV CH,	o A o V-,0 HjC	/γΛ ”0
59	CM, k1c'^> *γ\ CH, °	u° CH, AÁ ch,	o •Ó	C41H65N7O12	880,4
60	os 0 Α-νγχ 0 zX	0 z 0 0 t 0 os	0 0 T AX/ Ií UCH. 0 os ’	C4QH61N5O11	788,4
61	°S o >	y\X 0 l 0 OS	X Xx o ος 1	C39H51N5O9	742,4
62	χ-ύΧ 0 X	I 0 0 t 0 os	4 hXLÁ^CH 0	C35H514N5O9	686,4
63	CH, 0 Η,Λ^γγΧ 0 -Αχ.	4	χ	C41H55N5O9S2	826,4
		1 CH,

• · · ·

14U-

64	Ο η r1 » A ř 0 τ ΗΑ'^°γΗγ\Αγ\ζ\''η^^ίΑγι:Η 0 (i 0 \ 0 ο CH,	C35H53N5O11	732,4
65	r i Ρ ř “9 CH,	C39H59N5O11	774,4
66	r ί Ρ°» »9 ArAV-A	C35H51N5OH	718,4
67	/~V4 0 \_ck ° °Λ «τ 0	C45H53N5O9	808,4
68	JAVWA ΛΛΛ 0 \-ch, 0 0 A „r* 0	C38H47N5O9	718,3
69	(Pj CH, 0 0 0 ΑΑυϋυΑύζ, °Ó Ά ° ”	C39H61N5O9	744,5
70	A^W-XaA H.C V	C37H50N6O8	707,4

- 14Ϊ

71	I? 1 i? ? 0 L JL 0 V o 0 Λ ír 0	C37H49N5O9	708,4
72	Γ~\ r* ° Y ř \ i? 0 CH. 0 \ 0 °X Yw 0	C34H51N5O9	674,4
73	Π r 0 Y 0 ý 0 o \\ í o l 0 0 λ “> V“. Λ o^ KC V	C36H56N6O10S	765,4
74	Π r’ 0 V O ý 0 o o rMY Y01 °G	C36H48N6O10S	757,3
75	ř 1 U í i? ř c^p%	C37H47N5O10	722,3
76	Vl N]j ^''Aw ^Λ°°ν° °a CH Hp V*	C37H45CI2N5O10	790,3
77	0 9 I? Ϊ ? 0 > Ó	C34H51N5O10S	722,3

73	í? jAXyXw-A h£< A L ™ 0 \ 0 δ A ° y*· y<*’ a CH, Hp	Č36H5qNqO-|-]S2	813,4
79	VV ° X0 °A **0 h,c yj	C36H48N6O11S2	805,3
80	Ά ° X° ·ή CH H,C	C37H47N5O11S	770,3
81	0 íl wSkvjÍvA 0 \ 0 o X y-cH, Xs OH H,C	C37H45CI2N5O11 s	838,2
82	í? Ti·'043 i? í o o Yvy/yl-YBY οΛγθγγ Y CH HP V	C37H49CI2N5O10	818,3
83	0 ? 0 Υ,Λ 0 < 0 0 a y o	C37H57N5O8	700,4
84	vyxM-ΧύγΑ l 0 \ 0 0 Á ° γ* >«, A CH, HP M _	C38H60N6O10S	793,4

- 143”

85		αΆΑ / 0 'ýcn Ηρ	o o 0 o Á 0	CaeHszNgOioS	785,4
86			Γ5	C39H47F 4Ν5Ο10	822,3 -
	F	οΥΛ ο S	0 0
			ΛγΛ
	/γ· F	r° ° S~CHas h,c	•A 0
87		H>C	π		694,3
	0,33^^51 N5O9Ó
	ΟΗ,	0	0 0 γ
			ΑΛΑ
		0 Árx 0 H,C s°S	li Η \ ° °
		Hp
88		«£		C32H49N5O9S	680,3
	(Τι
		o A^	0 0 Υ
	r* ηΑ^	υυΆυ	ΑΑ^Αγ
		YÝ»· 0	V
		«,
89				C40H63N5O11S	822,4
¢^3	9 < 9	Ava
		° Ach. ° k H£ 's°i> l	0 Ο CH,
		«s
		/T-° 0 '-XH
90 Ί		H’\	Ω	C39H55N5O9S	770,4
	CHj	o /Ak,
			0 1 τ ^\Αγ
		° Ar» ° HA s“>	S 0 0
		(	CH,
		O
91		H,Q	ΙίΑ	C36H55N5O11S	766,4
	CH,	0 Ach,	0 ο Υ
		a-Ay	Ύ^άΑ^0”
		°HP>, °	< 0 0
		Y,	°s

- 14?·-· ·

92	>Λγ\ 0 τ'	0 \ °	0 ύυΜύ* <ο 0 αν> <Η	C38H57N5OK)	744,4
93	X/	0 <	0 0 0 ''‘τ	C34H51N5O11	706,4
	γ	rvVW oko σι
		J	«,
94		λ/ •	·9 \θ 0 ®ι’	C40H59N5O9	754,4
95	Λλ 0 τ'	Γ	ο οΜ	C38H55N5O9	726,4
	\ 0	Ιο ο <ν
			0¾
96	X/		γ«ΛαΧ° 0 ΐ 0 CH	C36H51N5O9	698,4
97	X/		? ο οΟ rvWl· oko CH	C34H47N5O9	670,3
98	KP4-OS		-<*, Π	C42H57N5O10	792,4
	Π
	CH 0	Λ	oko o
		J	<n

• · • ·

-143*-· *

. 99	•Ó •ώΟό	Η,« CH, ΗΛ V“C», *Μ**Ιι **τ ο 1	α «1, S ® CX,	»Τ ο ο 0	2 C40H61N5OW	772,4
100	XVÁ	4C		-řkjkj/γ01	C37H48FN5O8	710,4
	°ό		04	0
101		H£		Q	C36H49N5O8S	712,3
	fffA J oQ	/ 0 \	ιΓ 0 CK,	aJs/y 0
102	Ο ο—\ 5 ο.....+	Η£ 0	0 < C	X 0	C40H54CIN5O8	768,4
103				Α	C39H57N5O9	740,4
	α-t, ο ΧχΧτ 0	0 0 1	0	°τ ΑΧ^ ¥ γ°ι 0 Oý
104	Γ5 # κΛήτγ 0 ζ>	0 Λ	0 0	0 'l 0	C35H49N5O9	684,4
105	CHj 0 ηΛ-υΛ 0 ζ\	0 \	3 0	0 0 1 \Α Α/° O-CH,	C37H53N5O9	712,4

• »

-ΐ4δ*-

106	04 v ’ °η	C36H52N6O8	597,4
107	° Γι ° r>°	C48He6NaOio	915,5
108	7« »9 •νγ γ,<γΛ-Α<γ °0 ° V “	C44H58N8O10	859,4
109	Ό °ν X*	C48H65N5O10	872,5
110		CagELgNsOg	732,4
111	A 0 Οί 0 ( 0 0 \ 0 λ 0 Lo 0 °ΐ '	CayHsaNsOg	712,4
112	o λ oko 0	C33H4sNsOg	655,3

-14?·-

113	Ays 0 /	0 0 0 \ 0 \J?	f ř* γΆ 0	CsaHssNgOg	741,4
114	0 /	0 0 0^ S 0 X-?	0	C38H54N6O9	727,4
115				C41H61N5O9	768,5
	Αγ, 0 >	0 / 0 θ'· aAvW, i H a k CH, 0 1θ	Aí 0 OJ ’
116	Αγ 0	T r Ϊ T Ϊ X CH, 0 k 0	χγ 0	C37H53N5O9	7ΐ2,4
117			Ai	CggHsgNsOg	739,4
	Αγ 0	0 / 0 0 í I ί ř I i I T tl λ m, o k o	Y Αγ^ο·), 0
118	Αγ 0 .	o o a Aay 1 0 l 0	0 Αάα Ii Uch, 0 CH, ’	C40H60N5O8	753,5
119			A	C39H58N6O9	755,4
	Αγ ο .	0 0 0 řImí mí lilii A. CH, O k 0	Y 5* AyV* 0

• «

120	fh. o f <? ? Y 0 0 1 0 0	C38H58N6O8	725,4
121	P% 0 ( 0 0 [ U i Po l V	C38H57N5O9	728,4
122	0 í 0 l 0 0 v	C34H49N5O9	672,4
123	0 a o 0 o A oko o w, u ?	C40H55N5O9	750>
124	^wPywXy* o A o k o o CH	C39H53N5O9	736,4
125	^AyApAAp» Ό ’v 0	C39H53N5O9	736,4
126	‘ν'γ/Ργί'^Χ<Η Ό °v °	C35H45N5O9	680,3

14’δ·-

·· ·»·

127	h,c ο 0 0 0 Λ. 0 1 0 0	C36H47N5O9	694,3
128	L J Λα04· 9 OS ( «, HíiY^Oz\AyftY 2 α ^ν'04· 0 ΛΛγλ^γζθ ’ °ό '	CasHeoNeOs	729,5
129	0 °ό	C41H58N6O8	763,4
130	Δ Π « ? f ř ř 1 ο ο	C36H54N6O8	699,4
131	Υι^Υ 0 A. oko 0 CH,	C43H57N5O8	772,4
132	ο ο ο 0 Á. 0 1 0 0	C39H49N5O8	716,4
133	CH 0 A. oko 0 CH,	C42H55N5O9	774,4

·» • · »· ·

Tabulka 3

Struktura·	Třída Ki*
°ó~/yF	B
θ'*0 0 xJ> AJ	B
°^o ,ΧΡτήΎχ)	B
xo.	B
r\	B
°í]ítfřXl	B
AWo	B
%	B

15Ύ-· ·” *· · • · ·· • ·

• · ·1£ΤTabulka 4

. Struktura	Název	Rozmezí Kí*
W“·?10 °á CH, 0 CH, AA	(2-CO2.3Me)PhCO-G(Chx)L-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	a
áawXwa Uy^ o y% ° °á F 0 CH, %J>	(2,5-diF,6CO2>PhCO-G(Chx) L-nV-(CO)-GG{Ph)-Am	a
Λ «γ» °0	(2-CO2)SnCOG(Chx)-L-nV-{CO)G-G(Ph)-Am	c
,0 ./. . f^^sAr^XYV'·'*, U4°Y0 °G	(2-S03)PhCOG{Ctix)-L-nV-(CO)G-G(Ph)-Am	b
^iy/ZlvA Ύ5’?“ °ή 0 CH, ’ν’	(2CO2)cyciopentenoy (-G(Cfix)-L-nV(CO)-G-G(Ph)-Am	c
/444>//'ίΎΝγ^ ΚΎ °Q	(2-CO2.3OH)PhCO-G(Chx)L-nV-{CO)-GG(Ph)-Am	a
444-2-. ΧΑχ01 0 \γ<Η, 0 O Λ F 0	(2,3,4,5-tetraF,6CO2)PhCO-G(Chx) L-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	a

• · • · · ·

, Struktura	Název	Rozmezí Ki*
Λ »9 ΥγΗ'/'/γγγί*-'/γ··’’ Λ°ό \ ° °	(2CO2)PbCOG(Cbx)-C((02)Et)nV-(CO)-G-G(Ph)Am	b
9 Π Α”ό ϊ ” ”	(2CO2)PhCOG(Cbx)-C((02)Ph)nV-{CO)-G-G(Ph)Am	b
9 ουαίυς^ζ.. χΛ> 0 Ο J Ο Ο ’ ° 0 ί	(2CO2)PhCOG(Chx)C((02)EtPh)-nV(CO)-G-G(Ph)-Am	b
y^v't4X'vy4^-'*i ’ό Γ 0	iBoc-G(Cbx)C((02)Et)-nV-(CO)G-G(Ph)-Am	b
αΌ ϊ ° °	(2CO2)PhCOG(Chx)-C((02)1 Np)-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	b
Λό ί ° ’	(2CO2)PhCOG(Chx)-C((02)2Np}-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	b
Ό Γ °	iBoc-G(Chx)C((O2)Ph)-nV-(CO) G-G(Ph)-Am	b

• ·

— Struktura	Název	Rozmezí Ki*
°Ó °í ' °	((3-tetrahydrofuran) CH20)C0-G(Chx)L-nV-(CO)-GG(Ph)-Am	b
Ach, ° ý ° ° CH,	7-Me-2-iPr-Oct-4ene-(CO)-L-nV(CO)-G-G(Ph)-OH	c

Zastupuje:

-Vf<

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina včetně svých enantiomerů, stereoisomerů, 5 rotamerů a tautomerů, a farmaceuticky přijatelné soli nebo solváty této sloučeniny, vzorce i:

   vzorec I kde:

   G, J a Y mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny: H, alkyl, alkylaryl, heteroalkyl, heteroaryl, aryiheteroaryl, alkylheteroaryi, cykloalkyl, alkyloxy, alkyiaryloxy, aryloxy, heteroaryloxy, heterocykloalkyloxy, cykloalkyloxy, alkylamino, arylamino, alkylarylamino, arylamino,

   2o heteroarylamino, cykloalkylamino nebo heterocykloalkylamino s podmínkou, že skupina Y může být navíc popřípadě substituována skupinou X¹¹ nebo X¹²;

   X¹¹ je zvolena ze skupiny alkyl, alkenyl, alkinyl, cykloalkyl, cykloalkylalkyl, heterocyklyl, heterocyklylalkyl, aryl, alkylaryl, arylalkyl, heteroaryl, alkylheteroaryi, nebo heteroarylalkyl, s podmínkou, že skupina X¹¹ může být navíc popřípadě substituována skupinou X¹²;

   • ·

   X¹² je hydroxy, alkoxy, aryloxy, thio, alkylthio, arylthio, amino, alkylamino, arylamino, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, alkylsulfonamido, arylsulfonamido, karboxy, karbalkoxy, karboxamido, alkoxykarbonylamíno, alkoxykarbonyloxy, alkylureido, arylureido, halogen, kyano, nebo nitro, s podmínkou, že skupina alkyl, alkoxy, a aryl může být navíc popřípadě substituována skupinami nezávisle zvolenými ze skupiny X¹²;

   je COR⁵ nebo B(OR)2, kde R^s je zvoleno ze skupiny H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF3, C₂F₅, C₃F₇, CF₂R₆, R₆ a COR⁷, kde R⁷ je zvoleno ze skupiny H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰, a NR⁹R^W, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, CH(R¹’)COOR¹¹, CH(R¹’)CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹)CONHCH(R²’)CONR¹²R¹³, CH(R^r)CONHCH(R²')R’,

   CH(R¹')CONHCH(R²’)CONHCH(R³)COOR¹¹,

   CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³')CONR¹²R¹³,

   CH(R¹')CONHCH(R²')CONHCH(R³')CONHCH(R⁴’)COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)CONR¹²R¹³, CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³')CONHCH(R⁴’)CONHCH-(R⁵’)COOR¹¹, a

   CH(R¹’)CONHCH(R²')CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴')CONHCH-(R⁵')CONR¹²R¹³, kde

   R¹’, R², R³, R⁴, R⁵, R¹¹, R¹², R¹³ a R’ mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl a heteroaralkyl;

   je zvoleno z O, N, nebo CH;

   může být přítomno nebo nepřítomno, a pokud je W přítomno, je W zvoleno ze skupiny C=O, C=S, nebo SO₂; a

   R, R’, R², R³ a R⁴ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H; C1 -C10-alkyl; C2-C10-alkenyl; C3-C8-cykloalkyl; C3-C8-heterocykloalkyl, alkoxy, aryloxy, alkylthio, arylthio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, keton, aldehyd, kyano, nitro; atom kyslíku, atom dusíku, atom síry nebo atom fosforu, kde počet atomů kyslíku, dusíku, síry nebo fosforu může být 0 až 6; (cykloalkyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, kde cykloalkyl je složen ze 3 až 8 atomů uhlíku, a 0 až 6 atomů kyslíku, dusíku, síry nebo fosforu, kde alkyl má 1 až 6 atomů uhlíku; aryl; heteroaryl; alkylaryl; a alkylheteroaryl;

   kde skupiny alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl mohou být popřípadě substituovány, přičemž termín „substituovaný“ označuje případnou a chemicky vhodnou substituci jednou nebo více skupinami zvolenými ze skupiny alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocykl, halogen, hydroxy, thio, alkoxy, aryloxy, alkylthio, arylthio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, keton, aldehyd, kyano, nitro, sulfonamid, sulfoxid, suifon, sulfonylmočovina, hydrazid, a hydroxamát.

   2. Sloučenina podle nároku 1, kde R¹ je COR⁵, a R⁵ je H, OH, COOR⁸ nebo CONR⁹R¹⁰.

   3. Sloučenina podle nároku 2, kde R¹ je COCONR⁹R¹⁰, a R⁹ je H, R¹⁰ je zvoleno ze skupiny H, CH(R¹ )COOR¹¹, CH(R¹’)CONR¹²R¹³, CH(R¹')CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹’)CO-NHCH(R²')CONR¹²R¹³ a CH(R¹’)CONHCH(R²’)(R').

   • · · ·

   4. Sloučenina podle nároku 3, kde R¹⁰ je CH(R¹’)CONHCH(R²')COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, nebo CH(R¹')CONHCH(R²’)(R’), kde R¹ je H nebo alkyl, heteroalkyl a R² je fenyl, substituovaný fenyl, heteroatomem substituovaný fenyl, thiofenyl, cykloalkyl, piperidyl a pyridyl.

   5. Sloučenina podle nároku 4, kde R¹’ je H.

   6. Sloučenina podle nároku 5, kde io R¹¹ je H nebo ferc-butyl;

   R’ je hydroxymethyl; a R² je zvoleno ze skupiny:

   kde:

   U¹ a U² mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny H, F, CH₂COOH, CH₂COOMe, CH₂CONH₂, CH₂CONHMe, CH₂CONMe₂, azido, amino, hydroxyl, substituovaný amino, substituovaný hydroxyl;

   U³ a U⁴ mohou být stejné nebo různé a znamenají O nebo S;

   U⁵ je zvoleno ze skupiny zahrnující alkylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, alkoxykarbonyl, ‘•-•159”aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylmainokarbonyl a heteroarylaminokarbonyl nebo jejich kombinace; a

   NR¹²R¹³ je zvoleno ze skupiny: NH₂, NHMe, N(Me)OMe, NMe₂,

   Me

   L-Me HřťlMe ΗΝ^γ^Η Me Me ^hn'4x'¹ Me

   O 'O ^řO kde U⁶ je H, OH, nebo CH₂OH.

   7. Sloučenina podle nároku 1, kde R² je zvolena ze skupiny:

   fííe

   Me

   Me

   Me

   Me •S(0)o-z

   Me •S(0)o.₂

   Me •·»Ί·60

   8. Sloučenina podle nároku 7, kde R³ je zvolena ze skupiny:

   ^CH3chS^H3 ch₃ όη₃ ch₃.

   ch₃

   H₃C‘

   -A 'COR³¹

   COR 'COOH ^CH3Íh?^H3

   COOH 'COOH • · · ·

   461 • · ·

   X.

   h₃c ch₃.

   ^SCH3 h₃c 'S COOB γ19

   Y' kde R³¹ = OH, nebo O-alkyl;

   Y¹⁹ je zvoleno z následujících skupin:

   COOH

   Ao '«Achs

   6^H5 a Y²⁰ je zvoleno z následujících skupin:

   NHMs c₆h₅

   SO2NH2

   ΛΌ JO Λ ,ch₃ y%^^sí(ch₃)₃ V

   H₃ y\h₃

   NHAc

   Sloučenina podle nároku 8, kde R³ je zvolena z následujících struktur:

   -1Ό2

   10. Sloučenina podle nároku 9, kde Z je N a R⁴ je H

   11. Sloučenina podle nároku 10, kde W je C=O, nebo SO₂.

   12

   Sloučenina podle nároku 11, kde Y je zvolena z následujících skupin:

   Μθ^Ό_χ< MPI * Me Me Ms Me Me

   '0'

   Me Me MeAZH Me ^U0-8 * ci₃c\>^

   Mi

   CH<I f ³ ch₃ ^cha%v ch₃ CHj^^Ty 1-2 ηοοο^Ύ^/ ch₃ ch₃ ch₃ COOH ^H3^Ck^Áy 0-2 ? ^HOOCS>W^Z V Ηοοσγ C3H7 i* c,H<y CH3CH3 HaCOOC^^y ^H00cy®y/ ^k 0-4^Z JS~4

   //.

   COOH

   COOH hO ^N V

   N.

   COOH

   COOH • · kde:

   Y¹¹ je zvolena ze skupiny H, COOH, COOEt, OMe, Ph, OPh, NHMe, NHAc, NHPh, CH(Me)₂, 1-triazolyl, 1-imidazolyl a NHCH2COOH;

   Y¹² je zvoleno ze skupiny H, COOH, COOMe, OMe, F, Cl, nebo Br;

   Y¹³ je zvoleno z následujících skupin

   Me

   Me CbzHN

   CbzHN

   Y¹⁴ je zvoleno z MeSO₂, Ac, Boc, 'Boc, Cbz, nebo Alloc;

   Y¹⁵ a Y¹⁶ mohou být stejné nebo různé a jsou nezávisle zvoleny ze skupiny alkyl, aryl nebo heteroalkyl, nebo heteroaryl;

   Y¹⁷je CF₃, NO_2i CONH₂, OH, COOCH₃, OCH₃, OC₆H₅, C₆H₅, COC₆H₅, NH₂, nebo COOH; a

   Y¹⁸ je COOCH3, NO₂, N(CH₃)₂, F, OCH₃, CH₂COOH, COOH, SO₂NH₂, nebo NHCOCH₃.

   13. Sloučenina podle nároku 12, kde Y je zvoleno ze skupiny:

   COOH

   4

   -«*1*5 8 «“4 kde:

   Y¹⁷ je CF₃, N0_2i CONH₂, OH, NH₂, nebo COOH; Y¹⁸je F, COOH,

   14. Sloučenina podle nároku 13, kde J je zvoleno ze skupiny:

   CH₃OOC Y BnOOC^-^y/ HOOC^^^V ^0Hxrfy ch₃

   15. Sloučenina podle nároku 14, kde J je zvoleno ze skupiny H, CH₃ 20 nebo Bn.

   16. Sloučenina podle nároku 15, kde G je zvoleno ze skupiny:

   ch_3x.ch₃ >ch₃ r

   • · n=1-4

   - 170 - ?5^Η11 c₄h₉ ch₃^xh₃ :OO‘Bu

   CF₃

   - 171 -

   18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e jako účinnou složku obsahuje sloučeninu podle nároku 1.

   19. Farmaceutický prostředek podle nároku 18 pro použití při léčení onemocnění souvisejících s virem hepatitidy C.

   20. Farmaceutický prostředek podle nároku 18, vyznačující se tím, že dále obsahuje io farmaceuticky přijatelný nosič.

   21. Způsob léčení onemocnění souvisejících s proteázou HCV, který zahrnuje podávání farmaceutického prostředku s obsahem terapeuticky účinných množství sloučeniny podle nároku 1 pacientovi v případě potřeby.

   22. Způsob podle nároku 21, kde se podávání provádí subkutánně.

   23. Použití sloučeniny podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění souvisejících s proteázou

   HCV.

   24. Způsob výroby farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění souvisejících s proteázou HCV, vyznačující se tím, že sloučenina podle nároku 1 se přivede do dokonalého styku s farmaceuticky přijatelným nosičem.

   • · · ·

   - 172 25. Sloučenina s inhibiční aktivitou na proteázu HCV včetně enantiomerů, stereoisomerů, rotamerů a tautomerů této sloučeniny a jejích farmaceuticky přijatelných solí nebo solvátů, kterou je sloučenina zvolená z následujících struktur:

   o

   - 173 -

   R = Me

   R = Benzyl

   X = O^fBu X = OH X = NH₂ X = NMeOMe X = NMe₂

   - 174 -

   X = O^fBu X = OH

   X = Η, Y = tBu; X = tBu, Y = H

   R = Propargyi; R = Allyi

   X= Oku; X=OH

   175 -

   X = 0‘Butyí X = OH

   X = O^lButyl X = OH X = NMe₂

   X = O^lBu X = OH

   - 176 -

   R = Me

   X = Η, Y = COOH X = COOH, Y = H

   Me

   - 177 • · · ·

   26. Farmaceutický prostředek pro léčení onemocnění souvisejících s proteázou HCV, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství jedné nebo více sloučenin podle nároku 25 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   27. Farmaceutický prostředek podle ž e nároku 26, dále obsahuje vyznačující se antivirový prostředek. tím, io 28. Farmaceutický prostředek vyznačující se t interferon. podle i m , nároku 26 nebo 27, ž e ještě dále obsahuje 29. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, 15 vyznačující se tím, ž e jako antivirový

   prostředek obsahuje ribavirin a jako interferon obsahuje ainterferon.

   30. Sloučenina zvolená ze skupiny

   O o

   • · o

   - 179 - nebo její enantiomer, stereoisomer, rotamer nebo tautomer, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl nebo solvát, která má inhibiční účinky na HCV.

   31. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje jednu nebo více sloučenin podle nároku 30.

   32. Způsob léčení onemocnění souvisejícího s virem hepatitidy C, který zahrnuje podávání účinného množství jedné nebo více sloučenin podle nároku 30.

   33. Způsob modulace aktivity proteázy viru hepatitidy C, který zahrnuje uvedení proteázy HCV do styku s jednou nebo více sloučeninami podle nároku 30.

   34. Způsob léčení, prevence nebo zmírnění jednoho nebo více příznaků hepatitidy C, který zahrnuje podávání účinného množství jedné nebo více sloučenin podle nároku 30.

   35. Způsob podle nároku 33, kde proteázou HCV je proteáza NS3/NS4a.

   •φ · II · · * · • * · · · · · * φ φ · · «

   - 180 36. Způsob podle nároku 35, kde sloučenina nebo sloučeniny inhibují proteázu HCV NS3/NS4a.

   37. Způsob modulace zpracování polypeptidů viru hepatitidy C, který zahrnuje uvedení kompozice obsahující polypeptid HCV za podmínek, při kterých je polypeptid zpracováván, do styku s jednou nebo více sloučeninami podle nároku 30.

   38. Sloučenina podle nároku 7, kde R³ je cyklohexyl.

   o

   39. Sloučenina podle nároku 11, kde Y je zvoleno ze skupiny 2karboxy-3-hydroxyfenyl, 3-tetrahydrofurylmethoxy a 2-sulfofenyl.

   40. Sloučenina podle nároku 15, kde G je zvoleno ze skupiny 15 ethylsulfonylmethyl, fenylsuifonylmethyl, 2-fenylethylsulfonyi-methyl a 1-naftylsulfonylmethyl.

   Zastupuje: