ES2219637T3 - Proteasa del virus de la hepatitis c. - Google Patents
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- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
SE IDENTIFICA, SE CLONA Y SE EXPRESA LA PROTEASA NECESARIA PARA EL TRATAMIENTO POLIPROTEICO DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C. SE DESCRIBEN PROTEASAS, PROTEASA TRUNCADA Y PROTEASAS ALTERADAS QUE SON UTILES PARA LA DISOCIACION DE POLIPEPTIDOS ESPECIFICOS Y PARA EL ANALISIS Y EL DISEÑO DE AGENTES ANTIVIRICOS ESPECIFICOS RESPECTO AL VHC.
Description
Proteasa del virus de la hepatitis C.
Esta solicitud es una solicitud de continuación
en parte de la serie de EE.UU. Nº 07/505.433, presentada el 4 de
abril de 1990.
Esta invención se refiere a la biología molecular
y la virología del virus de la hepatitis C (HCV). Más concretamente,
esta invención se refiere a una nueva proteasa producida por el
HCV, métodos de expresión, proteasa recombinante, mutantes en la
proteasa, e inhibidores de la proteasa del HCV.
La hepatitis no A, no B (NANBH) es una enfermedad
(o familia de enfermedades) transmisible que se cree que está
inducida por virus, y que se puede distinguir de otras formas de
enfermedades del hígado asociadas a virus, tales como las causadas
por el virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV),
virus de la hepatitis delta (HDV), citomegalovirus (CMV) o virus de
Epstein-Barr (EBV). Las evidencias epidemiológicas
sugieren que puede haber tres tipos de NANBH: el tipo epidémico
contenido en el agua; el tipo asociado con la sangre o las agujas;
y el tipo que aparece esporádicamente (adquirido en la comunidad).
Sin embargo, el número de agentes causales es desconocido.
Recientemente, sin embargo, se ha identificado una nueva especie
vírica, el virus de la hepatitis C (HCV) como la causa primaria (si
no la única) de la NANBH asociada a la sangre
(BB-NANBH). Véase por ejemplo, el documento PCT
WO89/046699; la serie de solicitudes de patentes de EE.UU. Nº
7/456.637, presentada el 21 de diciembre de 1989; y la serie de
solicitudes de patentes de EE.UU. Nº 7/456.637, presentada el 21 de
diciembre de 1989, que se incorporan en la presente memoria como
referencia. La hepatitis C parece ser la forma principal de
hepatitis asociada a transfusiones en numerosos países, incluidos
los Estados Unidos y Japón. También hay evidencias que implican al
HCV en la inducción del carcinoma hepatocelular. Así, existe una
necesidad de un método efectivo para tratar la infección por el
HCV: en la actualidad, no hay ninguno.
Muchos virus, incluidos adenovirus, baculovirus,
comovirus, picornavirus, retrovirus, y togavirus, dependen de
proteasas específicas, codificadas por el virus, para procesar
polipéptidos desde su forma inicial traducida para dar proteínas
maduras y activas. En el caso de los picornavirus, se cree que
todas las proteínas virales surgen de la escisión de una
poliproteína única (B.D. Korant, CRC Crit. Rev. Biotech
(1988) 8:149-57).
S. Pichuantes et al., en "Viral
Proteinases As Targets For Chemotherapy" (Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989), pag. 215-22, describieron
la expresión de una proteasa viral encontrada en el
HIV-1. La proteasa del HIV se obtuvo en forma de
proteína de fusión, fusionando DNA que codificaba un precursor de
la proteasa del HIV con DNA que codificaba la
superóxido-dismutasa humana (hSOD), y expresando el
producto en E. coli. Las células transformadas expresaron
productos de 36 y 10 kDa (que correspondían a la proteína de fusión
hSOD-proteasa y a la proteasa sola), lo que sugiere
que la proteasa se expresó en una forma capaz de producir una
proteolisis autocatalítica.
T. J. McQuade et al., Science
(1990) 247: 454-56, describieron la
preparación de un péptido imitador capaz de inhibir específicamente
la proteasa del HIV-1. En el HIV, se cree que la
proteasa es responsable de la escisión del tránscrito inicial
precursor del gag p55 para dar las proteínas estructurales del
núcleo (p17, p24, p8, y p7). Añadir 1 \muM de inhibidor a
linfocitos de sangre periférica en cultivo infectados con el HIV
redujo la concentración de la p24 procesada del HIV en alrededor
del 70%. La maduración viral y los niveles de virus infecciosos se
redujeron mediante el inhibidor de la proteasa.
R. H. Miller y R. H. Purcell (P.N.A.S. USA
87, pag. 2057-2061, 1990) informan sobre la
relación del HCV con miembros del grupo de los pestivirus.
Se proporciona ahora un método para ensayar en
compuestos su actividad frente al HCV, método que comprende:
proporcionar una composición que contiene una
proteasa purificada del dominio NS3 del HCV codificada en el dominio
NS3 del genoma del HCV, o sus formas truncadas que tienen actividad
como proteasas;
poner en contacto dicha proteasa con un compuesto
capaz de inhibir la actividad como proteasa; y
medir la inhibición de la actividad proteolítica
de dicha proteasa.
La Figura 1 muestra la secuencia de la proteasa
del HCV.
La Figura 2 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C20c.
La Figura 3 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C26d.
La Figura 4 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C8h.
La Figura 5 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C7f.
La Figura 6 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C31.
La Figura 7 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C35.
La Figura 8 muestra la secuencia de
polinucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del clon
C33c.
La Figura 9 ilustra esquemáticamente el
ensamblaje del vector C7fC20cC300C200.
La Figura 10 muestra la secuencia del vector
cf1SODp600.
Las expresiones "virus de la hepatitis C" y
"HCV" se refieren a la especie de virus que es el principal
agente etiológico de la BB-NANBH, cuyo aislado
prototípico está identificado en el documento PCT WO89/046699; la
publicación de la EPO 318.216; los documentos USSN 7/355.008,
presentado el 18 de mayo de 1989; y USSN 7/456.637, las
descripciones de los cuales se incorporan en la presente memoria
como referencia. "HCV" tal como se utiliza en la presente
memoria incluye las cepas patógenas capaces de provocar hepatitis
C, y cepas atenuadas o partículas defectivas interferentes
derivadas de ellas. El genoma del HCV se compone de RNA. Se sabe
que los virus que contienen RNA tienen tasas relativamente altas de
mutación espontánea, según las publicaciones del orden de 10^{-3}
a 10^{-4} por nucleótido incorporado (Fields & Knipe,
"Fundamental Virology" (1986, Raven Press, N.Y.)). Como la
heterogeneidad y la fluidez del genotipo son características
inherentes a los virus RNA, habrá múltiples cepas/aislados, que
pueden ser virulentos o no virulentos, dentro de la especie del
HCV.
En la presente memoria se divulga información
sobre diferentes cepas/aislados de HCV, en particular la cepa o
aislado CDC/HCVI (también llamada HCV1). La información de una cepa
o aislado, tal como una secuencia genómica parcial, es suficiente
para permitir a los expertos en la técnica que utilizan técnicas
estándar aislar cepas/aislados nuevos e identificar si tales
cepas/aislados nuevos son HCV. Por ejemplo, más adelante se
describen varias cepas/aislados diferentes. Estas cepas, que fueron
obtenidas a partir de numerosos sueros humanos (y de zonas
geográficas diferentes), se aislaron utilizando la información de
la secuencia genómica del HCV1.
La información proporcionada en la presente
memoria sugiere que el HCV puede estar lejanamente relacionado con
los flaviviridae. La familia de los Flavivirus contiene un gran
número de virus que son pequeños, poseen cubierta y son patógenos
para el hombre. La morfología y composición de las partículas de
los Flavivirus es conocida, y se discute en M.A. Brinton, en "The
Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae" (serie de los editores
Fraenkel-Conrat y Wagner, volumen de los editores
Schlesinger y Schlesinger, Plenum Press, 1986), pag.
327-374. Por lo general, con respecto a la
morfología, los Flavivirus contienen una nucleocápsida central
rodeada por una bicapa lipídica. Los viriones son esféricos y
tienen un diámetro de alrededor de 40-50 nm. Sus
núcleos son de alrededor de 25-30 nm de diámetro. A
lo largo de la superficie externa de la cubierta del virión hay
proyecciones que miden alrededor de 5-10 nm de
longitud con protuberancias terminales de alrededor de 2 nm de
diámetro. Los ejemplos típicos de la familia incluyen el virus de la
fiebre amarilla, el virus del Nilo Occidental, y el virus de la
Fiebre del Dengue. Poseen genomas de RNA de cadena positiva (11.000
nucleótidos aproximadamente) que son ligeramente más grandes que el
del HCV y que codifican un precursor poliproteico de alrededor de
3500 aminoácidos. Las proteínas virales individuales se escinden a
partir de este polipéptido precursor.
El genoma del HCV parece ser RNA de cadena única
que contiene 10.000 nucleótidos aproximadamente. El genoma es de
cadena positiva, y posee un marco abierto de lectura (ORF) continuo
traducible que codifica una poliproteína de alrededor de 3.000
aminoácidos. En el ORF, las proteínas estructurales parecen estar
codificadas aproximadamente en el primer cuarto de la región
N-terminal, con la mayor parte de la poliproteína
atribuida a proteínas no estructurales. Cuando se compara con todas
las secuencias virales conocidas, se observan homologías colineales
pequeñas pero significativas con las proteínas no estructurales de
la familia de los Flavivirus, y con los pestivirus (que ahora se
consideran también parte de la familia de los Flavivirus).
En la Figura 1 se muestra un alineamiento
esquemático de posibles regiones de una proteína de flavivirus
(utilizando el Virus de la Fiebre Amarilla como ejemplo), y una
supuesta poliproteína codificada en el ORF principal del genoma del
HCV. En la figura se indican posibles dominios de la poliproteína
del HCV. La poliproteína del Virus de la Fiebre Amarilla contiene,
desde el extremo amino al extremo carboxilo, la proteína de la
nucleocápsida (C), la proteína de la matriz (M), la proteína de la
cubierta (E), y las proteínas no estructurales 1, 2 (a+b), 3, 4
(a+b), y 5 (NS1, NS2, NS3, NS4, y NS5). Basándose en los
hipotéticos aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos
del HCV1, un pequeño dominio del extremo amino de la poliproteína
del HCV parece similar tanto en tamaño como en el alto contenido de
residuos básicos a la proteína de la nucleocápsida (C) que se halla
en el extremo amino de las poliproteínas de los flavivirus. Las
proteínas no estructurales 2, 3, 4 y 5 (NS2-5) del
HCV y del virus de la fiebre amarilla (YFV) parecen tener regiones
comparables de tamaño e hidropatía similares, aunque la secuencia
de aminoácidos diverge. Sin embargo, la región del HCV que se
correspondería con las regiones de la poliproteína del YFV que
contiene las proteínas M, E y NS1 no sólo difiere en la secuencia,
sino que también parece ser bastante diferente en tamaño e
hidropatía. Así, mientras que en la presente memoria puede hacerse
referencia a ciertos dominios del genoma del HCV como, por ejemplo,
NS1 y NS2, debería entenderse que estas denominaciones se hacen por
conveniencia en la referencia solamente; puede haber diferencias
considerables entre la familia del HCV y los flavivirus que todavía
están por apreciarse.
Debido a la relación evolutiva de las cepas o
aislados del HCV, las supuestas cepas y aislados de HCV se pueden
identificar mediante su homología a nivel de polipéptidos. Con
respecto a los aislados descritos en la presente memoria, se espera
que las nuevas cepas o aislados del HCV sean homólogos al menos en
un 40%, algunos homólogos en más de un 70% aproximadamente, y
algunos homólogos incluso en más de un 80%: algunos pueden ser
homólogos en más de un 90% aproximadamente a nivel de los
polipéptidos. Las técnicas para determinar la homología de las
secuencias de aminoácidos son conocidas en la técnica. Por ejemplo,
la secuencia de aminoácidos se puede determinar directamente y
compararse con las secuencias proporcionadas en la presente memoria.
De forma alternativa se puede determinar la secuencia de
nucleótidos del material genómico del supuesto HCV (habitualmente
por medio de un cDNA intermediario), se puede determinar la
secuencia de aminoácidos en ella codificada, y comparar las regiones
correspondientes.
La expresión "proteasa del HCV" se refiere a
una enzima derivada del HCV que exhibe actividad proteolítica,
específicamente al polipéptido codificado en el dominio NS3 del
genoma del HCV. Al menos una cepa del HCV contiene una proteasa que
se cree que está codificada esencialmente por o dentro de la
siguiente secuencia:
Los extremos N y C anteriores son hipotéticos,
definiéndose los extremos reales mediante la expresión y el
procesamiento en un huésped apropiado de una construcción de DNA
que codifica la totalidad del dominio NS3. Se comprende que esta
secuencia puede variar de cepa en cepa, pues se sabe que los virus
RNA como el HCV exhiben un alto grado de variación. Además, los
extremos N y C reales pueden variar, puesto que la proteasa se
escinde de una poliproteína precursora: las variaciones en la
secuencia de aminoácidos de la proteasa pueden dar como resultado
la escisión de la poliproteína en puntos diferentes. Así, los
extremos amino y carboxilo puede diferir de cepa en cepa del HCV.
El primer aminoácido mostrado anteriormente corresponde al residuo
60 de la Figura 1. Sin embargo, la secuencia mínima necesaria para
la actividad se puede determinar mediante métodos rutinarios. La
secuencia se puede truncar en cualquier extremo tratando un vector
de expresión apropiado con una exonucleasa (tras una escisión en el
extremo 5' o 3' de la secuencia codificante) para separar cualquier
número de pares de bases que se desee. Luego se expresa el
polinucleótido codificante resultante y se determina la secuencia.
De esta manera la actividad del producto resultante se puede
correlacionar con la secuencia de aminoácidos: una serie limitada
de tales experimentos (separar progresivamente un número mayor de
pares de bases) determina la secuencia interna mínima necesaria
para la actividad de la proteasa. Los autores de la presente
invención han encontrado que la secuencia puede estar truncada de
forma sustancial, particularmente en el extremo carboxilo,
aparentemente con una retención total de la actividad de la
proteasa. En la actualidad se cree que una porción de la proteína
del extremo carboxilo puede exhibir actividad helicasa. Sin
embargo, la actividad helicasa no es un requerimiento de las
proteasas del HCV de la invención. El extremo amino se puede
truncar también hasta un cierto grado sin pérdida de actividad de la
proteasa.
Se cree que los aminoácidos subrayados
anteriormente son los residuos necesarios para la actividad
catalítica, basándose en la homología de secuencia con supuestas
proteasas de serina de flavivirus. La Tabla 1 muestra el
alineamiento de tres residuos catalíticos de proteasas de serina
correspondientes a la proteasa del HCV y a la proteasa obtenida del
Virus de la Fiebre Amarilla, el Virus de la Fiebre del Nilo
Occidental, el Virus de la Fiebre de Valle Murray, y el virus
Kunjin. Aunque las otras cuatro secuencias de proteasas de los
flavivirus exhiben una mayor homología entre ellas que con la del
HCV, se observa todavía un grado de homología con el HCV. Esta
homología, sin embargo, no es suficiente para su indicación por el
software de alineamiento disponible en la actualidad. Los
aminoácidos indicados aparecen numerados como His_{79},
Asp_{103}, y Ser_{161} en la secuencia anteriormente indicada
(His_{139}, Asp_{163}, y Ser_{221} en la Figura 1).
Alternativamente, se pueden hacer asignaciones
como residuos catalíticos basándose en la homología estructural. La
Tabla 2 muestra el alineamiento del HCV frente a los sitios
catalíticos de varias proteasas de serina bien caracterizadas
basado en consideraciones estructurales: la proteasa A de
Streptomyces griseus, proteasa
\alpha-lítica, tripsina bovina, quimotripsina, y
elastasa (M. James et al., Can. J. Biochem. (1978)
56:396). De nuevo, se observa un grado de homología. Los
residuos del HCV identificados aparecen numerados como His_{79},
Asp_{125}, y Ser_{161} en la secuencia anteriormente
indicada.
La manera más directa de verificar qué residuos
son esenciales para el sitio activo es reemplazar cada residuo de
forma individual por un residuo de tamaño estérico equivalente.
Esto se consigue fácilmente mediante mutagénesis específica de
sitio y métodos similares conocidos en la técnica. Si el reemplazo
de un residuo concreto por un residuo de tamaño equivalente tiene
como resultado una pérdida de actividad, se confirma la naturaleza
esencial del residuo reemplazado.
"Análogos de la proteasa del HCV" se refiere
a polipéptidos que derivan de la secuencia de la proteasa de
longitud completa mediante deleción, alteración y/o adición a la
secuencia de aminoácidos de la proteasa nativa. Los análogos de la
proteasa del HCV incluyen las proteasas truncadas anteriormente
descritas, así como las formas mutantes de las proteasa del HCV y
las proteínas de fusión que contienen la proteasa del HCV, una
proteasa truncada o formas mutantes de la proteasa. Las
alteraciones para dar lugar a formas mutantes de la proteasa del
HCV son preferiblemente sustituciones conservativas de aminoácidos,
en las que el aminoácido se reemplaza por otro aminoácido presente
en la naturaleza de características similares. Por ejemplo, se
consideran "conservativas" las siguientes sustituciones:
| Gly \leftrightarrow Ala; | Lys \leftrightarrow Arg; |
| Val \leftrightarrow Ile \leftrightarrow Leu; | Asn \leftrightarrow Gln; y |
| Asp \leftrightarrow Glu; | Phe \leftrightarrow Trp \leftrightarrow Tyr. |
Los cambios no conservativos son por lo general
sustituciones de uno de los aminoácidos anteriores por un aminoácido
de un grupo diferente (por ejemplo, sustituir Glu por Asn), o
sustituir cualquiera de los aminoácidos anteriores por Cys, Met,
His, o Pro. Las sustituciones que implican aminoácidos comunes se
llevan a cabo convenientemente mediante mutagénesis específica de
sitio de un vector de expresión que codifica la proteína deseada, y
la expresión subsiguiente de la forma alterada. También se pueden
alterar aminoácidos mediante métodos sintéticos o semisintéticos.
Por ejemplo, se pueden convertir residuos de cisteína o serina en
selenocisteína mediante un tratamiento químico apropiado de la
proteína aislada. De forma alternativa, se pueden incorporar
aminoácidos no comunes mediante métodos estándar de síntesis de
proteínas in vitro. Típicamente, el número total de residuos
cambiados, delecionados o añadidos a la secuencia nativa de la forma
mutante no será de más de aproximadamente 20, preferiblemente no
más de aproximadamente 10, y con la máxima preferencia no más de
aproximadamente 5.
La expresión proteína de fusión se refiere por lo
general a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos
extraída de dos o más proteínas individuales. En la presente
invención se utiliza "proteína de fusión" para hacer
referencia a un polipéptido que contiene la proteasa del HCV,
truncada, en forma mutante o una de sus porciones funcionales,
fusionada con una proteína o un polipéptido que no sea del HCV
("compañero en la fusión"). Las proteínas de fusión se
producen de la forma más conveniente mediante la expresión de un gen
fusionado, que codifica una porción de un polipéptido en el extremo
5' y una porción de un polipéptido diferente en el extremo 3', en
el que las diferentes porciones están unidas en un marco de lectura
que se puede expresar en un huésped adecuado. En la presente
invención se prefiere (aunque no se requiere) situar la proteasa
del HCV o su análogo en el extremo carboxilo de la proteína de
fusión, y emplear un fragmento enzimático funcional en el extremo
amino. Como la proteasa del HCV se expresa normalmente dentro de
una gran poliproteína, no es de esperar que incluya señales de
transporte celular (por ejemplo, señales para ser exportada o
secretada). Los fragmentos enzimáticos funcionales adecuados son
aquellos polipéptidos que exhiben una actividad cuantificable
cuando se expresan fusionados con la proteasa del HCV. Las enzimas
que puede servir como ejemplos incluyen, sin limitaciones,
\beta-galactosidasa (\beta-gal),
\beta-lactamasa, peroxidasa de rábano (HRP),
glucosa-oxidasa (GO),
superóxido-dismutasa humana (hSOD), ureasa, y otras
similares. Estas enzimas son convenientes porque la cantidad de
prroteína de fusión producida se puede cuantificar por medio de
ensayos colorimétricos sencillos. De forma alternativa, se pueden
emplear proteínas o fragmentos antigénicos, para permitir una
detección y cuantificación sencillas de las proteínas de fusión
utilizando anticuerpos específicos para el compañero en la fusión.
El compañero en la fusión que se prefiere en la presente invención
es la hSOD.
La práctica de la presente invención emplea
generalmente técnicas convencionales de biología molecular,
microbiología, DNA recombinante, e inmunología, que entran dentro de
la práctica habitual de la técnica. Tales técnicas están explicadas
en su totalidad en la literatura. Véase por ejemplo J. Sambrook
et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989);
"DNA Cloning", Vol. I y II (D. N. Glover ed. 1985);
"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait ed, 1984); "Nucleic
Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);
"Transcription And Translation" (B. D. Hames & S. J.
Higgins eds. 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney ed.
1986); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B.
Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); la
serie "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Gene
Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. H: Miller y M.P. Calos
eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Meth. Enzymol.
(1987) 154 y 155 (Wu y Grossman, y Wu, eds.,
respectivamente); Mayer y Walker, eds. (1987), "Immunochemical
Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press,
Londres); Scopes, "Protein Purification: Principles and
Practice", 2ª Ed. (Springer-Verlag N. Y., 1987);
y "Handbook of Experimental Immunology", volúmenes
I-IV (Weir y Blackwell, eds., 1986).
Las células huésped tanto procarióticas como
eucarióticas son útiles para expresar las secuencias codificantes
deseadas cuando se utilizan secuencias de control apropiadas
compatibles con el huésped designado. Entre los huéspedes
procarióticos, E. coli es el que más frecuentemente se
utiliza. Las secuencias de control de la expresión en procariotas
incluyen promotores, que contienen opcionalmente porciones de un
operador, y sitios de unión a ribosomas. Los vectores de
transferencia compatibles con huéspedes procarióticos se derivan
por lo común de, por ejemplo, pBR322, un plásmido que contiene
operones que confieren resistencia a ampicilina y tetraciclina, y
los diversos vectores pUC, que contienen también secuencias que
confieren marcadores de resistencia a antibióticos. Estos plásmidos
están comercialmente disponibles. Los marcadores se pueden utilizar
para obtener los transformantes con los que se ha tenido éxito
mediante su selección. Las secuencias procarióticas de control
utilizadas habitualmente incluyen los sistemas de los promotores de
la \beta-lactamasa (penicinilasa) y de la lactosa
(Chang et al., Nature (1977) 198:1056), el
sistema del promotor del triptófano (trp) (Goeddel et al.,
Nuc. Acids Res. (1980) 8:4057) y el promotor P_{L}
derivado de lambda y el sitio de unión a ribosomas del gen N
(Shimatake et al., Nature (1981) 292:128) y el
promotor híbrido tac (De Boer et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA (1983) 292:128) derivado de las secuencias
de los promotores de trp y lac UV5. Los sistemas
anteriores son particularmente compatibles con E. coli; si
se desea, pueden utilizarse otros huéspedes procarióticos tales
como cepas de Bacillus o Pseudomonas, con las
correspondientes secuencias de control.
Los huéspedes eucarióticos incluyen sin
limitaciones células de levaduras y mamíferos en sistemas en
cultivo. Los huéspedes para la expresión en levaduras incluyen
Saccharomyces, Klebsiella, Picia, y otros similares.
Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces
carlsbergensis y K. lactis son las levaduras huéspedes
que se usan más habitualmente, y son huéspedes fúngicos
convenientes. Los vectores compatibles con levaduras portan
marcadores que permiten la selección de transformantes obtenidos
con éxito al conferir fototrofía a mutantes auxotróficos o
resistencia a metales pesados en cepas de tipo silvestre. Los
vectores compatibles con levaduras pueden emplear el origen de
replicación del plásmido de 2 \mu (Broach et al., Meth.
Enzymol. (1983) 101:307), la combinación de CEN3 y ARS1 u
otros medios para asegurar la replicación, tales como secuencias
que darán como resultado la incorporación de un fragmento apropiado
en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de control para
vectores de levaduras son conocidas en la técnica e incluyen
promotores para la síntesis de enzimas glucolíticas (Hess et
al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149; Holland
et al., Biochem. (1978), 17:4900), incluyendo
el promotor de la 3-fosfogliceeratoquinasa (R.
Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980)
255:2073). También pueden incluirse secuencias de
terminación, tales como las derivadas del gen de la enolasa
(Holland, J. Biol. Chem (1981) 256:1385). Son sistemas
de control particularmente útiles aquéllos que contienen el
promotor de la
gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa
(GAPDH) o el promotor regulable de la alcoholdeshidrogenasa (ADH),
secuencias de terminación derivadas también de la GAPDH, y si se
desea la secreción, una secuencia líder derivada del factor \alpha
de levaduras (véase la Patente de EE.UU. Nº 4.870.008, que se
incorpora en la presente memoria como referencia).
Un sistema de expresión que se prefiere en la
presente invención emplea la secuencia líder de la ubiquitina como
compañero en la fusión. La solicitud entramitación con la presente
USSN 7/390.599 presentada el 7 de agosto de 1989 describe vectores
para la expresión elevada de proteínas de fusión con la ubiquitina
de levaduras. La ubiquitina de levaduras proporciona un polipéptido
de 76 aminoácidos que se escinde automáticamente de la proteína de
fusión tras la expresión. La secuencia de aminoácidos de la
ubiquitina es la siguiente:
Véase también Ozkaynak et al.,
Nature (1984) 312:663-66. Los
polinucleótidos que codifican el polipéptido de la ubiquitina se
pueden sintetizar mediante métodos estándar, por ejemplo siguiendo
la técnica de Barr et al., J. Biol. Chem. (1988)
268:1671-78 utilizando un sintetizador de
DNA 380A de Applied Biosystem. Utilizando fragmentos enlazadores
apropiados, puede insertarse el gen de la ubiquitina en un vector
adecuado y ligarlo a una secuencia que codifique la proteasa del
HCV o a uno de sus fragmentos.
Además, la región de regulación de la
transcripción y la región de iniciación de la transcripción que
estén unidas de forma operativa pueden ser tales que no estén
asociadas de forma natural en el organismo de tipo silvestre. Estos
sistemas se describen con detalle en los documentos EPO 120.551,
publicado el 3 de octubre de 1984; EPO 116.201, publicado el 22 de
agosto de 1984; y EPO 164.556, publicado el 18 de diciembre de
1985, todos los cuales se reivindican conjuntamente con la presente
invención, y se incorporan por ello como referencia en su totalidad
en la presente memoria.
Las líneas de células de mamífero disponibles
como huéspedes para la expresión son conocidas en la técnica e
incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC: American Type Culture
Collection), incluyendo las células HeLa, células de ovario de
hámster chino (CHO), células de riñón de hámster lactante (BHK), y
otras numerosas líneas celulares. Los promotores adecuados para
células de mamífero son también conocidos en la técnica e incluyen
promotores virales tales como el del Virus de Simio 40 (SV40)
(Fiers et al., Nature (1978) 273:113), el virus
del sarcoma de Rous (RSV), adenovirus (ADV), y el virus del
papiloma bovino (BPV). Las células de mamífero pueden requerir
también secuencias de terminación y secuencias de adición de
poli-A. También se pueden incluir secuencias
potenciadoras que incrementan la expresión, y también pueden ser
deseables secuencias que promuevan la amplificación del gen (por
ejemplo genes de resistencia al metotrexato). Estas secuencias son
conocidas en la técnica.
Los vectores adecuados para la replicación en
células de mamífero son conocidos en la técnica, y pueden incluir
replicones virales, o secuencias que aseguren la integración de las
secuencias apropiadas que codifiquen epitopos del HCV dentro del
genoma del huésped. Por ejemplo, otro vector utilizado para
expresar DNA exógeno es el virus Vaccinia. En este caso el DNA
heterólogo se inserta en el genoma de Vaccinia. Las técnicas para
la inserción del DNA exógeno en el genoma del virus Vaccinia son
conocidas en la técnica, y puede utilizarse, por ejemplo, la
recombinación homóloga. El DNA heterólogo se inserta generalmente
en un gen que no es esencial para el virus, por ejemplo, el gen de
la timidinaquinasa (tk), que también proporciona un marcador que
permite la selección. Se han descrito vectores plasmídicos que
facilitan en gran medida la construcción de los virus recombinantes
(véase, por ejemplo, Mackett et al., J. Virol. (1984)
49:857; Chakrabarti et al., Mol. Cell Biol. (1985)
5:3403; Moss, in GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS
(Miller y Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987),
pag. 10). La expresión del polipéptido del HCV sucede entonces en
células o animales que están infectados con el virus Vaccinia
recombinante vivo.
Para detectar si el polipéptido del HCV se
expresa o no a partir del vector de Vaccinia, pueden infectarse
células BSC 1 con el vector recombinante y hacerlas crecer sobre
portaobjetos para microscopios en condiciones que permiten la
expresión. Las células pueden entonces fijarse con acetona, y llevar
a cabo ensayos de inmunofluorescencia utilizando un suero que se
sepa que contiene anticuerpos anti-HCV que
reconozcan (un) polipéptido(s) codificado(s) en la
región del genoma del HCV a partir de la cual se ha obtenido el
segmento del HCV del vector recombinante de expresión.
Otros sistemas para la expresión de genomas
eucarióticos o virales incluyen células de insectos y vectores
adecuados para su uso en estas células. Estos sistemas son
conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, vectores de
transferencia para la expresión en insectos derivados del virus de
la polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), un
baculovirus, que es un vector para la expresión viral independiente
de adyuvantes. Los vectores de expresión derivados de este sistema
utilizan habitualmente el fuerte promotor viral del gen de
polihedrina para dirigir la expresión de genes heterólogos. En la
actualidad el vector de transferencia que con más frecuencia se
utiliza para introducir genes exógenos en el AcNPV es el pAc373
(véanse los documentos PCT WO89/046699 y USSN 7/456.637). Se han
diseñado también muchos otros vectores conocidos para los expertos
en la técnica para mejorar la expresión. Éstos incluyen, por
ejemplo, pVL985 (que cambia el codon de iniciación de la
polihedrina de ATG a ATT, e introduce un sitio de clonaje reconocido
por BamHI 32 pb aguas abajo respecto al ATT; véase Luckow y
Summers, Virol (1989) 17:31). Los vectores de
transferencia del AcNPV para la expresión elevada de proteínas
exógenas no fusionadas se describen en las solicitudes en
tramitación con la presente PCT WO89/046699 y USSN 7/456.637. Un
sitio único BamHI está localizado a continuación de la posición -8
con respecto al codon de iniciación de la traducción ATG del gen de
la polihedrina. No hay sitios de corte para SmaI, PstI, BglII, XbaI
o SstI. Una buena expresión de proteínas exógenas no fusionadas
requiere habitualmente genes exógenos que tienen idealmente una
secuencia líder corta que contiene señales adecuadas de iniciación
de la traducción precediendo una señal de inicio ATG. El plásmido
contiene también la señal de poliadenilación de la polihedrina y el
gen de resistencia a la ampicilina (amp) y un origen de
replicación para la selección y la propagación en E.
coli.
Los métodos para la introducción del DNA
heterólogo en el lugar deseado del virus baculovirus son conocidos
en la técnica. (Véase Summer y Smith, Texas Agricultural Experiment
Station Bulletin Nº 1555; Smith et al., Mol. Cell
Biol. (1983) 3:2156-2165; y Luckow y
Summers, Virol (1989) 17:31). Por ejemplo, el DNA
heterólogo puede insertarse en un gen tal como el gen de la
polihedrina mediante recombinación homóloga, o en un sitio de
reconocimiento para una enzima de restricción introducido mediante
técnicas de ingeniería genética en el gen deseado del baculovirus.
Las secuencias insertadas pueden ser aquéllas que codifican todos o
segmentos variables de la poliproteína, u otros ORF que codifiquen
polipéptidos virales. Por ejemplo, el inserto podría codificar los
siguientes números de segmentos de aminoácidos de la poliproteína:
aminoácidos 1-1078; aminoácidos
332-662; aminoácidos 406-662;
aminoácidos 156-328, y aminoácidos
199-328.
Las señales para las modificaciones
postraduccionales, tales como la escisión del péptido señal,
ruptura proteolítica, y fosforilación, parecen ser reconocidas por
células de insectos. Las señales requeridas para la secreción y la
acumulación nuclear también parecen estar conservadas entre las
células de invertebrados y las células de vertebrados. Los ejemplos
de las secuencias de señales de células de vertebrados que son
efectivas en células de invertebrados son conocidos en la técnica,
por ejemplo, la señal de la interleuquina-2
(IL2_{S}) humana que es una señal para la secreción de la célula,
es reconocida y apropiadamente separada en células de insectos.
La transformación puede hacerse mediante
cualquier otro método para introducir polinucleótidos en una célula
huésped, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un
virus y transducir el virus en una célula huésped, o mediante la
absorción directa del polinucleótido. El procedimiento de
transformación utilizado depende del huésped que se haya de
transformar. La transformación bacteriana mediante la absorción
directa emplea por lo general el tratamiento con cloruro de calcio
o rubidio (Cohen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1972)
69:2110; T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1982). La transformación de levaduras mediante absorción
directa se puede llevar a cabo utilizando el método de Hinnen et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929:
Las transformaciones en mamíferos mediante absorción directa se
pueden efectuar utilizando el método de la precipitación con fosfato
cálcico de Graham y Van der Eb, Virol. (1978) 52:546,
o sus diversas modificaciones conocidas. Otros métodos para
introducir polinucleótidos recombinantes en células,
particularmente en células de mamíferos, incluyen la transfección
mediada por dextrano, transfección mediada por fosfato cálcico,
transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, encapsulación del (de los)
polinucleótido(s) en liposomas, y la microinyección directa
de los polinucleótidos en los núcleos.
La construcción del vector emplea técnicas que
son conocidas en la técnica. Se obtiene una ruptura del DNA
específica de sitio tratándolo con enzimas de restricción adecuadas
en condiciones que generalmente están especificadas por el
fabricante de estas enzimas disponibles comercialmente. En general,
se escinde alrededor de 1 \mug de plásmido o secuencia de DNA con
1 unidad de enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón
mediante la incubación durante 1-2 horas a 37ºC.
Después de la incubación con la enzima de restricción, se separa la
proteína mediante la extracción con fenol/cloroformo y se recupera
el DNA mediante precipitación con etanol. Los fragmentos escindidos
pueden separarse utilizando técnicas de electroforesis en geles de
poliacrilamida o agarosa, de acuerdo con los procedimientos
generales descritos en Meth. Enzymol. (1980)
65:499-560.
Los fragmentos escindidos con extremos cohesivos
se pueden transformar en fragmentos con extremos romos utilizando la
polimerasa I de DNA (fragmento Klenow) de E. coli con los
desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) apropiados presentes en la
mezcla. También puede utilizarse el tratamiento con la nucleasa S1,
dando como resultado la hidrólisis de porciones de DNA de cadena
única.
Las ligaciones se llevan a cabo en condiciones
estándar para el tampón y la temperatura utilizando la ligasa de DNA
de T4 y ATP; las ligaciones de extremos cohesivos requieren menos
ATP y menos ligasa que las ligaciones de extremos romos. Cuando se
utilizan fragmentos de un vector como parte de una mezcla de
ligación, el fragmento del vector se trata a menudo con fosfatasa
alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina de intestino de
ternera para separar el fosfato de 5', impidiendo así la religación
del vector. De forma alternativa, puede utilizarse la digestión con
enzimas de restricción de los fragmentos no deseados para impedir
la ligación.
Con las mezclas de ligación se transforman
huéspedes adecuados para el clonaje, tales como E. coli, y se
seleccionan los transformantes obtenidos con éxito utilizando los
marcadores incorporados (por ejemplo, resistencia a antibióticos),
y se realiza un escrutinio para hallar la construcción correcta.
Los oligonucleótidos sintéticos se pueden
preparar utilizando un sintetizador automático de oligonucleótidos
como ha sido descrito por Warner, DNA (1984) 3:401.
Si se desea, las cadenas sintéticas se pueden marcar con ^{32}P
mediante el tratamiento con polinucleótido-quinasa
en presencia de ^{32}P-ATP en condiciones
normales de reacción.
Las secuencias de DNA, incluyendo las aisladas de
genotecas de cDNA, se pueden modificar mediante técnicas conocidas,
por ejemplo mediante la mutagénesis dirigida a un sitio (véase por
ejemplo, Zoller, Nuc. Acids. Res. (1982) 10:6487).
Brevemente, el DNA que ha de modificarse se empaqueta en un fago
como una secuencia de cadena única, y se convierte en DNA de doble
cadena con polimerasa de DNA, utilizando como iniciador un
oligonucleótido sintético complementario a la porción de DNA a
modificar, en donde la modificación deseada está incluida en la
secuencia del iniciador. Con el DNA de doble cadena resultante se
transforma una bacteria huésped que pueda alojar el fago. Los
cultivos de bacterias transformadas que contienen copias de cada
cadena del fago se plaquean en agar para obtener placas. En teoría,
el 50% de las nuevas placas contienen fago que tiene la secuencia
mutada, y el 50% restante tiene la secuencia original. Las réplicas
de las placas se hibridan con una sonda sintética marcada a
temperaturas y en condiciones que permiten la hibridación con la
cadena correcta, pero no con la secuencia no modificada. Se
recuperan las secuencias que han sido identificadas mediante
hidridación y se clonan.
Las genotecas de DNA se pueden analizar con
sondas utilizando el procedimiento de Grunstein y Hogness Proc
Nat. Acad. Sci. USA (1975) 73:3961. Brevemente, en este
procedimiento el DNA que se ha de analizar con sondas se inmoviliza
sobre filtros de nitrocelulosa, se desnaturaliza, y se prehibrida
con un tampón que contiene 0-50% de formamida, NaCl
0,75 M, citrato de Na 75 mM, 0,02% (p/v) tanto de albúmina de suero
bovino como de polivinilpirrolidona y de Ficoll®, NaH_{2}PO_{4}
50 mM (pH 6,5), SDS al 0,1%, y 100 \mug/ml de DNA portador
desnaturalizado. El porcentaje de formamida en el tampón, así como
las condiciones de tiempo y temperatura de la prehibridación y las
subsiguientes etapas de hibridación dependen de la astringencia
requerida. Las sondas oligoméricas que requieren condiciones de
baja astringencia se utilizan por lo general con bajos porcentajes
de formamida, temperaturas bajas, y tiempos de hibridación más
largos. Las sondas que contienen más de 30 ó 40 nucleótidos, tales
como las derivadas de cDNA o secuencias genómicas emplean por lo
general temperaturas más elevadas, por ejemplo, alrededor de
40-42ºC, y un alto porcentaje de formamida, por
ejemplo, 50%. A continuación de la prehibridación, se añade al
tampón una sonda de oligonucleótidos marcada en 5' con ^{32}P, y
se incuban los filtros en esta mezcla en condiciones de hibridación.
Después de lavar, se someten los filtros tratados a
autorradiografía para mostrar la localización de la sonda
hidridada; el DNA de las correspondientes localizaciones de las
placas de agar originales se utiliza como fuente del DNA
deseado.
Para las construcciones rutinarias de vectores,
con las mezclas de ligación se transforma la cepa HB101 de E.
coli, u otro huésped adecuado, y los transformantes obtenidos
con éxito se seleccionan por su resistencia a antibióticos u otros
marcadores. Se preparan entonces plásmidos a partir de los
transformantes de acuerdo con el método de Clewell et al.,
Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1969) 62:1159, normalmente
a continuación de una amplificación en cloranfenicol (Clewell,
J. Bacteriol. (1972) 110:667). Se aísla el DNA y se
analiza, normalmente mediante análisis con enzimas de restricción
y/o secuenciación. La secuenciación se puede llevar a cabo mediante
el método de los dideoxi de Sanger et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA (1977) 74:5463, tal como ha sido descrito
más ampliamente por Messing et al., Nuc. Acids. Res.
(1981) 9:309, o mediante el método de Maxam et al.,
Meth. Enzymol. (1980) 65:499. Los problemas con la
compresión de las bandas, que se observan algunas veces en las
regiones ricas en GC, se salvan utilizando
T-desazoguanosina de acuerdo con Barr et al.,
Biotechniques (1986) 4:428.
Puede utilizarse el ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA) para medir concentraciones tanto de
antígenos como de anticuerpos. Este método depende de la
conjugación de una enzima o bien con un antígeno o con un
anticuerpo, y utiliza la actividad de la enzima unida como una marca
cuantitativa. Para medir un anticuerpo, se fija el antígeno
conocido a una fase sólida (por ejemplo, una placa de
microtitulación, un vaso de plástico, varilla, perla de plástico, u
otros similares), se incuba con diluciones del suero de ensayo, se
lava, se incuba con anti-inmunoglobulina marcada con
una enzima, y se lava de nuevo. Las enzimas adecuadas para marcar
son conocidas en la técnica, e incluyen por ejemplo, la peroxidasa
de rábano (HRP). La actividad de la enzima unida a la fase sólida
se mide normalmente añadiendo un sustrato específico, y determinando
la formación del producto o la utilización del sustrato
colorimétricamente. La actividad de la enzima unida es función
directa de la cantidad de anticuerpo unido.
Para medir un antígeno, se fija a la fase sólida
un anticuerpo específico conocido, se añade el material de ensayo
que contiene el antígeno, se lava la fase sólida después de una
incubación, y se añade un segundo anticuerpo marcado con una
enzima. Después de lavar, se añade un sustrato, y se mide
colorimétricamente la actividad de la enzima, y se la relaciona con
la concentración del antígeno.
Se puede ensayar la actividad de las proteasas de
la invención mediante la escisión de un sustrato que proporciona
productos de escisión detectables. Como se cree que la proteasa del
HCV se escinde ella misma de la poliproteína genómica, se puede
emplear esta actividad autocatalítica para ensayar la expresión de
la proteína y determinar la actividad. Por ejemplo, si se une la
proteasa con su compañero de fusión de forma que se incluya la señal
de escisión N-terminal de la proteasa del HCV
(Arg-Arg), el producto de expresión se escindirá él
mismo para dar el compañero en la fusión y la proteasa del HCV
activa. Entonces se pueden ensayar los productos, por ejemplo
mediante una transferencia tipo Western, para verificar que las
proteínas producidas se corresponden por su tamaño con el compañero
de fusión y las proteínas proteasas por separado. En la presente
invención se prefiere emplear ésteres del
p-nitrofenilo de péptidos pequeños o metilcumarinas,
pues entonces la escisión puede ir seguida de ensayos
espectrofotométricos o de fluorescencia. Siguiendo el método
descrito por E.D. Matayoshi et al., Science (1990)
247:231-35, se puede unir un marcador
fluorescente a un extremo del sustrato y una molécula que para la
reacción en el otro extremo: la escisión se determina luego
midiendo el incremento resultante en la fluorescencia. Si se ha
empleado como compañero en la fusión una enzima o un antígeno
adecuados, la cantidad de proteína producida se puede determinar
fácilmente. De forma alternativa, se puede excluir la señal de
escisión N-terminal de la proteasa del HCV
(impediendo la autoescisión) y añadir un sustrato de escisión por
separado, tal como un fragmento de dominio NS3 del HCV que incluya
la señal nativa de procesamiento o un análogo sintético.
En ausencia de esta actividad como proteasa, la
poliproteína del HCV debería permanecer en su forma no procesada, y
convertir así el virus en no infeccioso. Así, la proteasa es útil
para ensayar agentes farmacéuticos para el control del HCV, pues
los compuestos que inhiban suficientemente la actividad de la
proteasa inhibirán también la infectividad viral. Tales inhibidores
pueden tomar la forma de compuestos orgánicos, particularmente
compuestos que mimeticen el sitio de escisión del HCV reconocido
por la proteasa. Tres de los supuestos sitios de escisión de la
poliproteína del HCV tienen las siguientes secuencias de
aminoácidos:
Estos sitios se caracterizan por la presencia de
dos aminoácidos básicos inmediatamente antes del sitio de escisión,
y son parecidos a los sitios de escisión reconocidos por otras
proteasas de los flavivirus. Así, se pueden preparar inhibidores
adecuados de la proteasa que mimeticen el motivo
básico/básico/neutro pequeño de los sitios de escisión del HCV, pero
sustituyendo el enlace peptídico que se escinde en el sustrato
natural por una unión no lábil. Los inhibidores adecuados incluyen
trifluorometilcetonas de péptidos, péptidos con ácido bórico,
\alpha-cetoésteres de péptidos, compuestos
difluorocetónicos de péptidos, aldehídos de péptidos, dicetonas de
péptidos, y otros similares. Por ejemplo, el aldehído de péptidos
N-acetil-fenilalanil-glicinaldehído
es un potente inhibidor de la proteasa papaína. Se pueden preparar
y ensayar convenientemente grandes mezclas de péptidos utilizando
los métodos descritos en la serie de solicitudes de patentes de
EE.UU Nº 7/189.318, presentada el 2 de mayo de 1988 (publicada como
el documento PCT WO89/10931), que se incorpora en la presente
memoria como referencia. Esta solicitud enseña métodos para generar
mezclas de péptidos hasta el nivel de los hexapéptidos que tienen
todas las posibles secuencias de aminoácidos, y enseña además
métodos de ensayo para identificar aquellos péptidos capaces de
unirse a proteasas.
Otros inhibidores de proteasas pueden ser
proteínas, particularmente anticuerpos y derivados de anticuerpos.
Los sistemas recombinantes de expresión pueden utilizarse parar
generar cantidades de proteasa suficientes para la producción de
anticuerpos monoclonales (MAb) específicos para la proteasa. Los
anticuerpos adecuados para la inhibición de la proteasa se unirán a
la proteasa de manera que reduzcan o eliminen la actividad
enzimática, típicamente ocultando el sitio activo. Se puede
utilizar Mab adecuados para generar derivados, tales como los
fragmentos Fab, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados,
anticuerpos univalentes, y anticuerpos con un único dominio,
utilizando métodos conocidos en la técnica.
Los inhibidores de la proteasa se escrutan
utilizando métodos de la invención. En general, se emplea un
sustrato que imita al sustrato natural de la enzima, pero que
proporciona una señal cuantificable cuando se escinde. Esta señal es
detectable preferiblemente por medios colorimétricos o
fluorimétricos: sin embargo, pueden ser útiles también otros
métodos tales como la HPLC o la cromatografía en gel de sílice,
GC-MS, resonancia magnética nuclear, y otros
similares. Después de que estén determinadas las concentraciones
óptimas del sustrato y de la enzima, se añade un candidato a
inhibidor de la proteasa a la mezcla de reacción en un intervalo de
concentraciones. Idealmente las condiciones del ensayo deberían
reproducir las condiciones en las que ha de inhibirse la proteasa
in vivo, es decir, a pH, temperatura, fuerza iónica, etc.,
fisiológicos. Los inhibidores adecuados exhibirán una fuerte
inhibición de la proteasa a concentraciones que no provoquen
efectos secundarios tóxicos en el sujeto. Los inhibidores que
compitan por unirse al sitio activo de la proteasa pueden requerir
concentraciones iguales a o mayores que la concentración del
sustrato, mientras que los inhibidores capaces de unirse
irreversiblemente al sitio activo de la proteasa pueden añadirse a
concentraciones del orden de la concentración de la enzima.
Los candidatos a inhibidores de la proteasa se
pueden escrutar utilizando una forma mutante inactiva de la proteasa
con preferencia sobre una enzima activa. Se ha encontrado que
reemplazar un residuo crítico dentro del sitio activo de la
proteasa (por ejemplo, reemplazar la Ser del sitio activo de una
proteasa de serina) no altera significativamente la estructura de
la enzima, y preserva así la especificidad de la unión. La enzima
alterada reconoce todavía y se une a su propio sustrato, pero no
consigue efectuar la escisión.
Así, se inmoviliza una proteasa inactiva del HCV,
y se añade una mezcla de candidatos a inhibidores. Los inhibidores
que más de cerca mimeticen la secuencia de reconocimiento preferida
por la enzima competirán con más éxito por la unión que otros
candidatos a inhibidores. Los candidatos con una pobre tasa de
unión pueden entonces separarse, y determinarse la identidad de los
inhibidores que se unen con fuerza. Por ejemplo, se puede preparar
una proteasa del HCV sustituyendo la Ser_{221} por Ala (Fig. 1),
proporcionando una enzima capaz de unirse al sustrato de la
proteasa del HCV, pero incapaz de escindirlo. La forma mutante de
la proteasa resultante se une entonces a un soporte sólido, por
ejemplo perlas de Sephadex®, y se empaqueta en una columna. Se hace
pasar entonces a través de la columna una mezcla de candidatos a
inhibidores de la proteasa en solución y se recogen las fracciones.
Las últimas fracciones en eluir contendrán los compuestos que se
unan con más fuerza, y proporcionarán los candidatos preferidos a
inhibidores de la proteasa.
Los inhibidores de la proteasa se pueden
administrar mediante diversos métodos, tales como por vía
intravenosa, oral, intramuscular, intraperitoneal, bronquial,
intranasal, y así sucesivamente. La ruta de administración preferida
dependerá de la naturaleza del inhibidor. Los inhibidores
preparados como compuestos orgánicos pueden a menudo administrarse
oralmente (que es lo que generalmente se prefiere) si se absorben
bien. Los inhibidores basados en proteínas (tales como la mayor
parte de los derivados de anticuerpos) deben administrarse
generalmente por rutas parenterales.
Los ejemplos presentados a continuación se
proporcionan como una guía adicional para el profesional que tenga
una destreza ordinaria en la técnica, y no deben considerarse como
limitantes de la invención de ninguna manera.
Se preparó una genoteca de cDNA de HCV como está
descrito en los documentos PCT WO89/046699 y USSN 7/456.637. Esta
genoteca, con número de acceso en la ATCC 40394, ha sido depositada
en ella como se expone más adelante.
(A) El polipéptido del HCV codificado dentro del
clon 5-1-1 (véase el ejemplo 1) se
expresó como un polipéptido de fusión con la
superóxido-dismutasa (SOD) humana. Esto se
consiguió subclonando el inserto de cDNA del clon
5-1-1 en el vector de expresión
pSODCF1 (K.S. Steimer et al., J. Virol. (1986)
58:9; documento EPO 138.111) como sigue. Se transformaron
células de E. coli D1210 con el vector de expresión
SOD/5-1-1. Estas células,
denominadas Cf1/5-1-1 en E.
coli, se depositaron como se expone posteriormente más adelante
y tienen el número de acceso en la ATCC 67967.
En primer lugar, el DNA aislado del pSODCF1 se
trató con BamHI y EcoRI, y se ligó el siguiente fragmento enlazador
con el DNA lineal creado mediante las enzimas de restricción:
GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT
AA
Después del clonaje, se aisló el plásmido que
contenía el inserto.
El plásmido que contenía el inserto se sometió a
digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. Se escindió con
EcoRI el inserto de cDNA del HCV del clon
5-1-1, y se ligó con este DNA del
plásmido linearizado por EcoRI. Se utilizó la mezcla de DNA para
transformar la cepa D1210 de E. coli (Sadler et al.,
Gene (1980) 8:279). Los recombinantes con el cDNA del
5-1-1 en la orientación correcta
para expresar el ORF mostrado en la Figura 1 se identificaron
mediante mapeo de restricción y secuenciación de nucleótidos.
Las bacterias recombinantes de un clon se
indujeron a expresar el polipéptido
SOD-HCV_{5-1-1}
haciendo crecer las bacterias en presencia de IPTG.
Se crearon por separado tres vectores de
expresión, pcf1AB, pcf1CD, y pcf1EF ligando tres nuevos fragmentos
enlazadores, AB, CD, y EF a un fragmento
BamHI-EcoRI obtenido digiriendo por completo el
vector pSODCF1 con EcoRI y BamHI, seguido del tratamiento con
fosfatasa alcalina. Los fragmentos enlazadores se crearon a partir
de seis oligómeros, A, B, C, D, E y F. Cada oligómero fue
fosforilado mediante el tratamiento con quinasa en presencia de ATP
previamente al apareamiento con su oligómero complementario. Las
secuencias de los fragmentos enlazadores sintéticos fueron las
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cada uno de los tres fragmentos enlazadores
destruye el sitio EcoRI original, y crea un nuevo sitio EcoRI dentro
del fragmento enlazador, pero dentro de un marco de lectura
diferente. Así, los fragmentos EcoRI de cDNA del HCV aislados de
los clones, cuando se insertaron en los vectores de expresión,
estaban en tres marcos de lectura diferen-
tes.
tes.
Los fragmentos de cDNA del HCV de los clones
denominados gt11 se escindieron mediante digestión con EcoRI; cada
fragmento se insertó en pcf1AB, pcf1CD, y pcf1EF. Se transformaron
luego células de E. coli D1210 con estas construcciones para
la expresión, se clonaron los transformantes y se expresaron los
polipéptidos como se describe posteriormente en la parte B.
(B) Se ensayó la antigenicidad de los productos
de expresión de los cDNA del HCV indicados mediante escrutinio
inmunológico directo de las colonias, utilizando una modificación
del método descrito en Helfman et al., Proc. Nat. Acad.
Sci USA (1983), 80:31. Brevemente, se plaqueron las
bacterias sobre filtros de nitrocelulosa colocados sobre placas de
ampicilina para dar aproximadamente 40 colonias por filtro. Se
hicieron réplicas de las placas de las colonias sobre filtros de
nitrocelulosa, y se hicieron crecer las réplicas de nuevo durante
toda la noche en presencia de IPTG 2 mM y ampicilina. Se lisaron
las colonias de bacterias suspendiendo los filtros de nitrocelulosa
durante alrededor de 15 a 20 minutos en una atmósfera saturada con
vapor de CHCl_{3}. Cada filtro se colocó entonces en una placa
Petri individual de 100 mm que contenía 10 ml de Tris HCl 50 mM, pH
7,5, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 5 mM, BSA al 3% (p/v), 40 \mug/ml de
lisozima y 0,1 \mug/ml de DNasa. Las placas se agitaron
suavemente durante al menos 8 horas a temperatura ambiente. Los
filtros se lavaron abundantemente con TBST (Tris HCl 50 mM, pH 8,0,
NaCl 150 mM, Tween® 20 0,005%). Después de la incubación, se
lavaron los residuos de las células y se incubaron durante una hora
en TBS (TBST sin Tween®) que contenía suero de oveja al 10%. Se
incubaron entonces los filtros con sueros pretratados en TBS de
individuos con NANBH, que incluían 3 chimpancés; 8 pacientes con
NANBH crónica cuyos sueros eran positivos con respecto a los
anticuerpos frente al polipéptido C100-3 del HCV
(también llamado C100); 8 pacientes con NANBH crónica cuyos sueros
eran negativos con respecto a los anticuerpos
anti-C100; un paciente convaleciente cuyo suero era
negativo con respecto a los anticuerpos anti-C100;
y 6 pacientes con NANBH adquirida en la comunidad, incluido uno cuyo
suero era fuertemente positivo con respecto a los anticuerpos
anti-C100, y uno cuyo suero era marginalmente
positivo con respecto a los anticuerpos anti-C100.
Los sueros, diluidos en TBS, se pretrataron mediante preabsorción
con la hSOD durante al menos 30 minutos a 37ºC. Tras la incubación,
se lavaron los filtros dos veces durante 30 minutos con TBST. Las
proteínas expresadas a las que se habían unido anticuerpos de los
sueros se marcaron mediante la incubación durante 2 horas con
anticuerpo antihumano de oveja marcado con ^{125}I. Tras el
lavado, los filtros se lavaron dos veces durante 30 minutos con
TBST, se secaron, y se sometieron a autorradiografía.
Se determinaron las secuencias de nucleótidos de
los cDNA del HCV utilizadas posteriormente esencialmente como se ha
descrito anteriormente, excepto porque se sustituyó el cDNA aislado
del clon 5-1-1 por el cDNA escindido
de estos fagos.
Se aisló el clon C33c utilizando una sonda de
hibridación que tenía la siguiente secuencia:
5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'
La secuencia del cDNA del HCV del clon C33c se
muestra en la Figura 8, que también muestra los aminoácidos
codificados en ella.
El clon 35 se aisló mediante el escrutinio con un
polinucleótido sintético que tenía la secuencia:
5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'
Aproximadamente un clon de 50.000 hibridó con la
sonda. Las secuencias de polinucleótidos y la de aminoácidos
deducida para el C35 se muestran en la Figura 7.
El clon C31 se muestra en la Figura 6, que
también muestra los aminoácidos codificados en ella. Se construyó un
casete C200 ligando un fragmento de 718 pb obtenido mediante la
digestión del DNA del clon C33c con EcoRI y HinfI, un fragmento de
179 pb obtenido mediante la digestión del DNA del clon C31 con
HinfI y BglI, y un fragmento de 377 pb obtenido digiriendo el DNA
del clon C35 con BglI y EcoRI. Se insertó la construcción con los
fragmentos ligados en el sitio EcoRI de pBR322, obteniéndose el
plásmido pBR322-C200.
El clon 7f se aisló utilizando una sonda que
tenía la secuencia:
5'-AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG
GGT GCA TAA T-3'
La secuencia del cDNA del HCV del clon 7f y los
aminoácidos codificados en ella se muestran en la Figura 5.
El clon C20c se aisló utilizando una sonda que
tenía la siguiente secuencia:
5'-TGC ATC AAT GGG GTG TGC
TGG-3'
La secuencia del cDNA del HCV del clon C20c, y
los aminoácidos codificados en ella se muestran en la Figura 2.
Los clones 7f y C20c se digirieron con EcoRI y
SfaNI para formar fragmentos de 400 pb y 260 pb, respectivamente.
Los fragmentos se clonaron entonces en el sitio EcoRI de pBR322
para formar el vector C7f-C20c, y se transformaron
con él células HB101.
Se aisló el clon 8h utilizando una sonda basada
en la secuencia de nucleótidos del clon 33c. La secuencia de
nucleótidos de la sonda era
5'-AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC
GGT GTT C-3'
La secuencia del cDNA del HCV del clon 8h, y los
aminoácidos codificados en ella, se muestran en la Figura 4.
El clon C26d se aísla utilizando una sonda que
tiene la siguiente secuencia:
5'-CTG TTG TGC CCC GCG GCA
GCC-3'
La secuencia y la traducción a aminoácidos del
clon C26d se muestran en la Figura 3.
Con los clones C26d y C33c (véase la parte A
anterior) se transformó la cepa de E. coli negativa respecto
a la metilación GM48. El clon C26d se digirió con EcoRII y DdeI
para proporcionar un fragmento de 100 pb. El clon C33c se digirió
con EcoRII y EcoRI para proporcionar un fragmento de 700 pb. El clon
C8h se digirió con EcoRI y DdeI para proporcionar un fragmento de
208 pb. Estos tres fragmentos se ligaron después al sitio EcoRI de
pBR322, y se transformó con ellos E. coli HB101, para
proporcionar el vector C300.
Se obtuvo de C7f+C20c un fragmento de 600 pb
mediante la digestión con EcoRI y NaeI, y se ligó a un fragmento de
945 pb NaeI/EcoRI de C300, y la construcción se insertó en el sitio
EcoRI de pGEM4Z (disponible comercialmente en Promega) para formar
el vector C7fC20cC300.
Se digirió C7fC20cC300 con NdeI y EcoRI para
proporcionar un fragmento de 892 pb, que se ligó a un fragmento de
1160 pb obtenido digiriendo C200 con NdeI y EcoRI. La construcción
resultante se insertó en el sitio EcoRI de pBR322 para proporcionar
el vector C7fC20cC300C200. La construcción de este vector se
ilustra esquemáticamente en la Figura 9.
Este vector contiene una secuencia que codifica
la proteasa del HCV de longitud completa fusionada con una secuencia
líder funcional de la hSOD. El vector C7fC20cC300C200 se escindió
con EcoRI para proporcionar un fragmento de 2000 pb, que se ligó
entonces al sitio EcoRI del plásmido cf1CD (Ejemplo 2A). El vector
resultante codifica los aminoácidos 1-151 de la
hSOD, y los aminoácidos 946-1630 del HCV (numerados
desde el principio de la poliproteína, que corresponden a los
aminoácidos 1-686 de la Figura 1). El vector se
etiquetó como cf1SODp600 (al que algunas veces se hace referencia
como P600), y se transformó con él células D1210 de E. coli.
Estas células, con número de acceso en la ATCC 68275, se
depositaron en ella como se expone más adelante.
Se preparó un polinucleótido truncado con la
fusión SOD-proteasa escindiendo un fragmento de 600
pb EcoRI/NaeI de C7f+C20c, convirtiendo el fragmento en romo con el
fragmento Klenow, ligando el fragmento romo al sitio EcoRI de cf1EF
convertido en romo mediante el fragmento Klenow (Ejemplo 2A). Este
polinucleótido codifica una proteína de fusión que tiene los
aminoácidos 1-151 de la hSOD, y los aminoácidos
1-199 de la proteasa del HCV.
Se preparó un polinucleótido truncado más largo
con la fusión SOD-proteasa escindiendo un fragmento
EcoRI/NdeI de 892 pb de C7fC20cC300, convirtiendo el fragmento en
romo con el fragmento Klenow, ligando el fragmento romo al sitio
EcoRI de cf1EF convertido en romo mediante el fragmento Klenow. Este
polinucleótido codifica una proteína de fusión que tiene los
aminoácidos 1-151 de la hSOD, y los aminoácidos
1-299 de la proteasa del HCV.
Se preparó un polinucleótido truncado más largo
con la fusión SOD-proteasa escindiendo un fragmento
EcoRI/EcoRI de 1550 pb de C7fC20cC300, y ligando el fragmento al
sitio EcoRI de cf1CD para formar P500. Este polinucleótido codifica
una proteína de fusión que tiene los aminoácidos
1-151 de la hSOD, y los aminoácidos
946-1457 de la proteasa del HCV (aminoácidos
1-513 de la Figura 1).
Este vector contiene una secuencia que codifica
la proteasa del HCV de longitud completa fusionada con la secuencia
FLAG, Hopp et al. (1988) Biotechnology
6:1204-1210. Se utilizó PCR para producir un
gen de la proteasa del HCV con extremos especiales de restricción
para facilitar el clonaje. Se digirió el plásmido p500 con EcoRI y
NdeI para proporcionar un fragmento de 900 pb. Se utilizaron este
fragmento y dos iniciadores en una reacción en cadena de la
polimerasa para introducir un sitio único BglII junto al aminoácido
1009 y un codon de parada con un sitio SalI junto al aminoácido
1262 del HCV-1, como se muestra en la Figura 17 del
documento WO 90/11089, publicado el 4 de octubre de 1990. La
secuencia de los iniciadores es como sigue:
5' CCC GAG CAA GAT CTC CCG GCC C 3'
y
5' CCC GGC TGC ATA AGC AGT CGA CTT GGA 3'
Tras 30 ciclos de PCR, se digirió la mezcla de
reacción con BglII y SalI, y se aisló el fragmento de 710 pb. Este
fragmento se apareó y se ligó al siguiente dúplex:
El dúplex codifica la secuencia FLAG, y la
metionina de inicio, y un sitio NcoI en 5'. El fragmento NcoI/SalI
resultante se ligó con un derivado de pCF1.
Con esta construcción se transforman luego
células de E. coli D1210 y se induce la expresión de la
proteasa mediante la adición de IPTG.
La secuencia FLAG se fusionó con la proteasa del
HCV para facilitar la purificación. Para purificar la proteína de
fusión sin condiciones de elución drásticas se utiliza un
anticuerpo monoclonal dependiente de calcio, que se une al péptido
codificado por la FLAG.
(A) Se transformaron células de E. coli
D1210 con cf1SODp600 y se hicieron crecer en medio de cultivo de
Luria que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta una DO de
0,3-0,5. Se añadió entonces IPTG a una concentración
de 2 mM, y se cultivaron las células hasta una DO final de 0,9 a
1,3. Se lisaron entonces las células, y se analizó el lisado
mediante transferencia tipo Western utilizando sueros
anti-HCV, como se describe en el documento USSN
7/456.637.
Los resultados indicaron la existencia de
escisión, pues no era evidente en el gel ningún producto de
longitud completa (teóricamente 93 kDa de Mr). Las bandas
correspondientes al compañero en la fusión hSOD y la proteasa del
HCV por separado aparecían en zonas correspondientes a pesos
moleculares relativos de alrededor de 34, 53, y 66 kDa. La banda de
34 kDa corresponde al compañero hSOD (20 kDa aproximadamente) con
una porción del dominio NS3, mientras que las bandas de 53 y 66 kDa
corresponden a la proteasa del HCV con diversos grados de
procesamiento (posiblemente bacteriano).
(B) Se transformaron células de E. coli
D1210 con P500 y se hicieron crecer en medio de cultivo de Luria
que contenía 100 \mug/ml de ampicilina hasta una DO de
0,3-0,5. Se añadió entonces IPTG a una concentración
de 2 mM, y se cultivaron las células hasta una DO final de 0,8 a
1,0. Se lisaron entonces las células, y se analizó el lisado como
se describió anteriormente.
Los resultados indican de nuevo la existencia de
escisión, pues no era evidente en el gel ningún producto de longitud
completa (teóricamente 73 kDa de Mr). Las bandas correspondientes al
compañero en la fusión hSOD y la proteasa del HCV truncada aparecían
en zonas correspondientes a pesos moleculares de alrededor de 34 y
45 kDa, respectivamente.
(C) Se transformaron células de E. coli
D1210 con los vectores P300 y P190 y se hicieron crecer como se
describió anteriormente.
Los resultados de la expresión de P300 indicaron
la existencia de escisión, pues no era evidente en el gel ningún
producto de longitud completa (teóricamente 51 kDa de Mr). Una
banda correspondiente al compañero en la fusión hSOD apareció en
una zona correspondiente a un peso molecular relativo de alrededor
de 34. La banda correspondiente a la proteasa del HCV no era
visible, pues esta región del dominio NS3 no es reconocida por los
sueros empleados para detectar los productos. Sin embargo, la
aparición de la banda de la hSOD a 34 kDa en lugar de a 51 kDa
indica que ocurrió la escisión.
El producto de expresión del P190 apareció sólo
como el producto de longitud completa (codificada) sin escisión,
formando una banda a alrededor de 40 kDa, lo que corresponde al
peso molecular teórico del producto sin escindir. Esto puede
indicar que la secuencia mínima esencial para la proteasa del HCV se
extiende hasta la región situada entre los aminoácidos 199 y
299.
La proteasa del HCV y los fragmentos expresados
en el Ejemplo 5 se pueden purificar como sigue:
Se someten las células bacterianas en las que se
expresó el polipéptido a un choque osmótico y a ruptura mecánica, se
aísla la fracción insoluble que contiene la proteasa y se somete a
extracción diferencial con una solución
alcalina-NaCl, y se purifica el polipéptido del
extracto mediante cromatografía en columnas de
S-Sefarosa® y Q-Sefarosa®.
Se prepara el extracto en bruto resultante del
choque osmótico y la ruptura mecánica suspendiendo 1 g de las
células empaquetadas en 10 ml de una solución que contiene Tris HCl
0,02 M, pH 7,5, EDTA 10 mM, sacarosa al 20%, e incubándolas durante
10 minutos en hielo. Se hace entonces sedimentar las células
mediante centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4ºC. Después de
separar el sobrenadante, se resuspenden los sedimentos de células
en 10 ml de Tampón A1 (Tris HCl 0,01 M, pH 7,5, EDTA 1 mM,
\beta-mercaptoetanol -"\betaME"- 14 mM), y
se incuban en hielo durante 10 minutos. Se hace sedimentar de nuevo
las células a 4.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Tras la
separación del sobrenadante claro (fracción periplásmica I), se
resuspenden los sedimentos de células en Tampón A1, se incuban en
hielo durante 10 minutos, y se centrifugan de nuevo a 4.000 x g
durante 15 minutos a 4ºC. Se separa el sobrenadante claro (fracción
periplásmica II), y se resuspende el sedimento de células en 5 ml
de Tampón T2 (Tris HCl 0,02 M, pH 7,5, \betaME 14 mM, EDTA 1 mM,
PMSF 1 mM). Para romper las células, se colocan en un tubo Falcon la
suspensión (5 ml) y 7,5 ml de perlas de vidrio lavadas con ácido
libre de plomo Dyno-mill (0,10-0,15
mm de diámetro) (disponibles en Glen-Mills, Inc.) y
se agitan en el vórtex a la velocidad más alta durante dos minutos,
seguidos por el enfriamiento durante al menso 2 minutos en hielo.
El procedimiento de agitación en el
vórtex-enfriamiento se repite otras cuatro veces.
Tras agitar en el vórtex, se filtra la suspensión a través de un
embudo de vidrio sinterizado utilizando baja succión, se lavan dos
veces las perlas de vidrio con Tampón A2, y se combinan el filtrado
y los lavados.
La fracción insoluble del extracto en bruto se
recoge mediante centrifugación a 20.000 x g durante 15 minutos a
4ºC, se lava dos veces con 10 ml de Tampón A2, y se resuspende en 5
ml de agua MILLI-Q.
Una fracción que contiene la proteasa del HCV se
aísla del material insoluble añadiendo a la suspensión NaOH (2 M) y
NaCl (2 M) para obtener una concentración final de 20 mM para cada
compuesto, agitando la mezcla en el vórtex durante 1 minuto,
centrifugando a 20.000 x g durante 20 minutos a 4ºC, y conservando
el sobrenadante.
La proteasa parcialmente purificada se purifica
entonces mediante SDS-PAGE. La proteasa se puede
identificar mediante transferencia tipo Western, y escindir la
banda del gel. La proteasa se eluye entonces de la banda, y se
analiza para confirmar su secuencia de aminoácidos. Las secuencias
N-terminales se pueden analizar utilizando un
secuenciador automático de aminoácidos, mientras que las secuencias
C-terminales se pueden analizar mediante la
secuenciación automatizada de los aminoácidos de una serie de
fragmentos generados por digestión con
tripsina.
tripsina.
Este vector contiene una secuencia del HCV, que
incluye la secuencia que codifica la proteasa de longitud completa
del HCV de tipo silvestre, fusionada en el extremo 5' con la
secuencia que codifica la SOD. Se utilizaron dos fragmentos, un
fragmento EcoRI/BglII de 441 pb del clon 11b y un fragmento
BglII/EcoRI de 1471 pb del vector de expresión P500, para
reconstruir una secuencia que codifica la proteasa de longitud
completa del HCV de tipo silvestre. Estos dos fragmentos se ligaron
de forma conjunta con un vector pS356 digerido con EcoRI para
producir un casete de expresión. El casete de expresión codifica el
promotor híbrido de levaduras ADH2/GAPDH, la SOD humana, la proteasa
del HCV, y una secuencia de terminación de la transcripción de la
GAPDH. El vector resultante se digirió con BamHI y se aisló un
fragmento de 4052 pb. Este fragmento se ligó al vector pAB24
digerido con BamHI para producir p650. p650 expresa una
poliproteína que contiene, desde su extremo amino, los aminoácidos
1-154 de la hSOD, un oligopéptido
-Asn-Leu-Gly-Ile-Arg-,
y los aminoácidos 819 a 1458 del HCV-1, como se
muestra en la Figura 17 del documento WO 90/11089, publicado el 4 de
octubre de 1990.
El clon 11b se aisló a partir de la genoteca de
cDNA del HCV, con el número de acceso en la ATCC 40394, como se
describió anteriormente en el Ejemplo 3A, utilizando una sonda de
hibridación que tiene la siguiente secuencia:
5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT
3'.
Este procedimiento está descrito también en la
publicación de la EPO Nº 318.216, Ejemplo IV.A.17.
El vector pS3EF, que es un derivado de pBR322,
contiene el promotor híbrido de levaduras de ADH2/GAPDH aguas arriba
con respecto al gen de la superóxido- dismutasa humana, un
adaptador, y una secuencia efectiva de terminación de la
transcripción en levaduras aguas abajo. Un vector de expresión
similar que contiene estos elementos de control y el gen de la
superóxido-dismutasa está descrito en Cousens et
al. (1987) Gene 61:265, y en la solicitud en tramitación
con la presente EPO 196.056, publicada el 1 de octubre de 1986.
pS3EF, sin embargo, difiere del de Cousens et al. en que hay
una deleción del gen heterólogo de la proinsulina y la región
bisagra de la inmunoglobulina, y la Gln_{154} de la SOD va
seguida de una secuencia adaptadora que contiene un sitio EcoRI. La
secuencia del adaptador es:
5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TTA ATT AAG 3'
3' AC CCT TAA GGT ATT AAT TAA TTC AGCT 5'
El sitio EcoRI facilita la inserción de
secuencias heterólogas. Una vez insertada en pS3EF, se expresa una
proteína de fusión con SOD que contiene un oligopéptido que une la
SOD a las secuencias heterólogas. pS3EF es exactamente igual a
pS356 excepto en que pS356 contiene un adaptador diferente. La
secuencia del adaptador se muestra a continuación:
5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G 3'
3' AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT 5'
pS356, con nº de acceso en la ATCC 67683, está
depositado en ella como se expone más adelante.
El plásmido pAB24 es un vector lanzadera de
levaduras, que contiene secuencias de pBR322, la secuencia completa
del plásmido de 2 \mu para la replicación del DNA en una levadura
(Broach (1981) en: Molecular Biology of the Yeast
Saccharomyces, Vol. 1, pag. 445, Cold Spring Harbor Press) y
el gen LEU^{2d} de levaduras derivado del plásmido pC1/1,
descrito en la publicación de la EPO con Nº 116.201. El plásmido
pAB24 se construyó digiriendo YEp24 con EcoRI y religando el vector
para separar las secuencias parciales del plásmido de 2 micras. El
plásmido resultante, YEp24deltaRI, se linearizó con ClaI y se ligó
con el plásmido de 2 micras completo que se había linearizado con
ClaI. El plásmido resultante, pCBou, se digirió entonces con XbaI,
y se aisló de un gel el fragmento del vector de 8605 pb. El
fragmento XbaI aislado se ligó con un fragmento XbaI de 4460 pb que
contenía el gen LEU^{2d} aislado a partir de pC1/1; la
orientación del gen LEU^{2d} está en la misma dirección que el gen
URA3.
S. cerevisiae,
2150-2-3
(pAB24-GAP-env2), con nº de acceso
20827, está depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo
como se expone más adelante. El plásmido
pAB24-GAP-env2 se puede recuperar a
partir de células de levadura mediante técnicas conocidas. El
casete de expresión GAP-env2 se puede separar
digiriendo pAB24-GAP-env2 con BamHI.
pAB24 se recupera religando el vector sin el inserto BamHI.
Se transformó la cepa de S. cerevisiae
JSC310, Mata, leu2, ura3-52, prb1- 1122,
pep4-3, prc1-407, cirº: DM15
(resistencia a g418) con p650. La transformación es como la
descrita por Hinnen et al. (1978) Proc. Natl Acad. Sci
USA 75: 1929. Las células transformadas se seleccionaron en
placas ura^{-} con glucosa al 8%. Las placas se incubaron a 30ºC
durante 4-5 días. Los transformantes se
seleccionaron adicionalmente en placas leu^{-} con glucosa al 8%
basándose hipotéticamente en la presencia de un alto número de
copias del plásmido p650. Se inocularon colonias de las placas
leu^{-} en medio leu^{-} con glucosa al 3%. Estos cultivos se
agitaron a 30ºC durante 2 días y luego se diluyeron 1/20 en medio
YEPD con glucosa al 2% y se agitaron durante 2 días más a 30ºC.
S. cerevisiae JSC310 contiene DNA de DM15,
descrito en la publicación de la EPO Nº 340.986, publicada el 8 de
noviembre de 1989. Este DNA de DM15 potencia la expresión regulada
por ADH2 de proteínas heterólogas. pDM15, con número de
acceso 40453, está depositado en la Colección Americana de Cultivos
Tipo como se expone más adelante.
Se prepara proteasa madura del HCV escindiendo el
vector C7fC20cC300C200 con EcoRI para obtener una secuencia
codificante de 2 kb, e insertando la secuencia con los fragmentos
enlazadores apropiados en un vector de expresión de la ubiquitina,
tal como el descrito en los documentos WO 88/02406, publicado el 7
de abril de 1988, o USSN 7/390.599, presentado el 7 de agosto de
1989, que se incorporan en la presente memoria como referencia. La
proteasa madura del HCV se recupera tras la expresión del vector en
huéspedes apropiados, particularmente levaduras. Específicamente,
se utiliza el protocolo de expresión en levaduras descrito en el
Ejemplo 8 para expresar un vector de ubiquitina/proteasa del
HCV.
Se asociaron y ligaron** conjuntamente cuatro
fragmentos sintéticos de DNA para crear una secuencia líder del
virus de la fiebre amarilla EcoRI/SacI, que se ligó a un vector
pGEM®-3Z de Promega® digerido con EcoRI/SacI. La secuencia de los
cuatro fragmentos se muestra a continuación:
YFK-1:
5' AAT TCG TAA ATC CTG TGT GCT AAT TGA GGT GCA
TTG GTC
TGC AAA TCG AGT TGC TAG GCA ATA AAC ACA TT 3'
YFK-2:
5' TAT TGC CTA GCA ACT CGA TTT GCA GAC CAA TGC
ACC TCA ATT
AGC ACA CAG GAT TTA CG 3'
YFK-3':
5' TGG ATT AAT TTT AAT CGT TCG TTG AGC GAT TAG
CAG AGA
ACT GAC CAG AAC ATG TCT GAG CT 3'
YFK-4:
5' CAG ACA TGT TCT GGT CAG TTC TCT GCT AAT CGC
TCA ACG AAC
GAT TAA AAT TAA TCC AAA TGT GTT 3'
Para la traducción in vitro de la proteasa
del HCV, el nuevo vector pGEM®-3Z/secuencia líder del Virus de la
Fiebre Amarilla se digirió con BamHI y se convirtió en romo con
Klenow.
Se construyó el clon p6000 a partir de secuencias
disponibles de la genoteca de cDNA del HCV, con número de acceso en
la ATCC 40394. La secuencia de DNA codificante del HCV de p6000 es
idéntica a los nucleótidos -275 a 6372 de la Figura 17 del
documento WO 90/11089, publicado el 4 de octubre de 1990. p6000 se
digirió con PvuII, y a partir del resultado de la digestión, se
aisló un fragmento de 2864 pb. Este fragmento de 2.864 pb se ligó
al fragmento preparado del vector pGEM®-3Z/secuencia líder del
Virus de la Fiebre Amarilla, como se describió anteriormente.
Se linearizó con XbaI el vector
pGEM®-3Z/secuencia líder del Virus de la Fiebre Amarilla/PvuII y se
transcribió utilizando los materiales y protocolos del sistema
Riboprobe® Gemini II Core de Promega.
El RNA producido mediante el protocolo anterior
se tradujo utilizando un lisado de reticulocitos de conejo de
Promega, metionina negativo, membranas de microsomas de páncreas
canino, así como otros materiales e instrucciones necesarios de
Promega.
Se depositaron los siguientes materiales en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC: American Type Culture
Collection), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland:
| Nombre | Fecha de Depósito | Nº de acceso |
| E. coli D1210, cf1SODp600 | 23 de marzo de 1990 | 68275 |
| Cf1/5-1-1 en E coli D1210 | 11 de mayo de 1989 | 67967 |
| Genoteca de cDNA del bacteriófago \lambda-gt11 | 01 de diciembre de 1987 | 40394 |
| E. coli HB101, pS356 | 29 de abril de 1988 | 67683 |
| DNA de plásmido, pDM15 | 05 de mayo de 1988 | 40453 |
| S. cerivisiae, 2150-2-3 (pAB24-GAP-env2) | 23 de diciembre de 1986 | 20827 |
Los materiales anteriores han sido depositados en
la ATCC con los números de acceso indicados. Estos depósitos se
mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre del
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con
propósitos de llevar a cabo Procedimientos de Patentes. Estos
depósitos se crean por ser convenientes para los expertos en la
técnica, y no son una admisión sino que se requiere un depósito
según 35 U.S.C. \NAK112. Las secuencias de polinucléotidos
contenidas en los materiales depositados, así como la secuencia de
aminoácidos de los polipéptidos codificados en ellas, se incorporan
en la presente memoria como referencia y sirven de control ante la
posibilidad de cualquier conflicto con las secuencias descritas en
la presente memoria. Se requiere una licencia para construir,
utilizar o vender los materiales depositados, y mediante la
presente memoria no se otorga tal licencia.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Chiron Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4560 Horton Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Emeryville
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 94608-2916
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteasa del virus de la hepatitis C
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 86
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 91908105.9
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 202 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Gln Asp Leu Gly Trp Pro Ala Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Glu Asp Leu Val Ala Tyr Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ser Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe His Thr Leu Trp His Thr Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Glu Asp Arg Leu Cys Tyr Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Thr Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe His Thr Leui Trp His Thr Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Glu Asp Arg Val Thr Tyr Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ile Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe His Thr Leu Trp His Thr Thr Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Glu Asp Arg Leu Cys Tyr Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Thr Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Gly His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Asp Tyr Gly Ile Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Ser Gly Gly Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Gly His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Asp Arg Ala Trp Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ala Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Asn Asp Ile Thr Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ala Ala His Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Tyr Asp Ile Ala Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Tyr His Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu
Gly Ala Ile Leu Arg}
\sac{Arg His Val Gly Pro Val Ser Cys Gln Arg Gly
Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTGAA TTCTGATAAG ACCTTAAGAC TAATTTTAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTGAAT TCCTGATAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTTAAGGA CTATTTTAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCGAATT CTGTGATAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTAAGACA CTATTTTAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTGGAA TTCTGATAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACCTTAAGA CTATTTTAA
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCAGGACCG GGGTGAGAAC AATTACCACT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGCCACCGT GTGCGCTAGG GCTCAAGCCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCAGACAAG GGGCCTCCTA GGGTGCATAA T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCATCAATG GGGTGTGCTG G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAGCAACC ATGAGGTCCC CGGTGTTC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTTGTGCCC CCGCGGCAGC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGAGCAAG ATCTCCCGGC CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGCTGCA TAAGCAGTCG ACTTGGA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..37
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipC ATG GAC TAC AAA GAC GAT GAC GAT GAC GAT AAA GGC CGG GAG
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Arg
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCTATGTT TATAACCATC TCACTCCTCT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTGGGAA TTCCATAATT AATTAAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACTTAAT TAATTATGGA ATTCCCA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTGGGAA TTCCATAATG AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGACTCATT ATGGAATTCC CA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCGTAAA TCCTGTGTGC TAATTGAGGT GCATTGGTCT GCAAATCGAG TTGCTAGGCA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAAACACAT T
\hfill71
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATTGCCTAG CAACTCGATT TGCACCTCAA TTAGCACACA GGATTTACG
\hfill59
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGATTAATT TTAATCGTTC GTTGAGCGAT TAGCAGAGAA CTGACCAGAA CATGTCTGAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCT
\hfill62
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGACATGTT CTGGTCAGTT CTCTGCTAAT CGCTCAACGA ACGATTAAAA TTAATCCAAA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTGTT
\hfill66
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 202 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 299 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 199 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 299 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2064 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 7..2064
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 686 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 368 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..366
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 122 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 208 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..207
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 69 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 281 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..279
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 93 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 416 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..414
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 138 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 308 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..306
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 495 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..495
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 165 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 816 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..816
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 84:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 272 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 85:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2523 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..2523
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA CON Nº DE
IDENTIFICACIÓN: 86:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 841 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (8)
1. Un método para ensayar en compuestos su
actividad frente al virus de la hepatitis C (HCV), método que
comprende:
- (a)
- proporcionar una composición que contiene una proteasa purificada del dominio NS3 del HCV codificada en el dominio NS3 del genoma del HCV, o sus formas truncadas que tienen actividad como proteasas;
- (b)
- poner en contacto dicha proteasa con un compuesto capaz de inhibir la actividad como proteasa; y
- (c)
- medir la inhibición de la actividad proteolítica de dicha proteasa.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha proteasa contiene una secuencia interna parcial de
aminoácidos como la mostrada en la Seq ID Nº 63.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que dicha proteasa contiene una secuencia interna parcial
de aminoácidos como la mostrada en la Seq ID Nº 64.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteasa contiene la
secuencia de aminoácidos como la mostrada en la Seq ID Nº 69.
5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha proteasa contiene una
secuencia interna parcial de aminoácidos como la mostrada en la Seq
ID Nº 65.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicha proteasa contiene un
residuo de histidina, aspartato y serina en las posiciones
correspondientes al aminoácido 139, 163 y 221 respectivamente de la
secuencia de aminoácidos de la Seq ID Nº 69, o en posiciones
equivalentes.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha proteasa tiene una secuencia de aminoácidos como la
mostrada en la Seq ID Nº 67.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha proteasa tiene una secuencia de aminoácidos como la
mostrada en la Seq ID Nº 66.
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