PL169273B1 - skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL - Google Patents

skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL

Info

Publication number
PL169273B1
PL169273B1 PL91296328A PL29632891A PL169273B1 PL 169273 B1 PL169273 B1 PL 169273B1 PL 91296328 A PL91296328 A PL 91296328A PL 29632891 A PL29632891 A PL 29632891A PL 169273 B1 PL169273 B1 PL 169273B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gly
leu
val
ala
thr
Prior art date
Application number
PL91296328A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Houghton
Qui-Lim Choo
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chiron Corp filed Critical Chiron Corp
Publication of PL169273B1 publication Critical patent/PL169273B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

- Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr-; - Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu-; lub - Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg-, i kontaktuje sie te proteaze ze zwiazkiem majacym zdolnosc hamowania aktywnosci proteazy serynowej przy czym zwiazek hamujacy aktywnosc proteazy serynowej nasladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteaze i jest wybierany sposób trójfluorometyloketonów, peptydu kwasu peptydo boronowego, peptydu- a -ketoestru, zwiazków peptydifluoro- ketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwcial i pochodnych przeciwcial, a nastepnie mierzy sie stopien hamowania aktywnosci proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia watroby C PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C.
Non-A, non-B hepatitis /NANBH/ jest to choroba zakaźna /albo rodzina chorób/. Sądzi się, że jest ona wywoływana przez wirusy i którą można odróżnić od innych postaci choroby wątroby związanej z wirusami, takich jak choroby powodowane przez wirusa zapalenia wątroby A /HAV/, wirusa zapalenia wątroby B /HBV/, wirusa zapalenia wątroby delta/HDV/, cytomegalowirusa /CMV/ i wirusa Epsteina-Barra /EBV/. Dane epidemiologiczne sugerują, że występować mogą trzy typy NANBH: typ epidemiczny przenoszony przez wodę; przenoszona przez krew lub igłę; oraz zdarzająca się sporadycznie, nabywana w zbiorowisku. Jednakże, ilość czynników przyczynowych nie jest znana. Obecnie, wszakże, zidentyfikowano nowy gatunek wirusa, a mianowicie wirusa zapalenia wątroby C /HCV/, jako pierwotną /jeżeli nie jedyną/ przyczynę związanej z krwią NANBH /BB-NaNbH/. Patrz np. PCT VO89/046699; zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/456637, zgłoszone 21 grudnia 1989; oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/456637, zgłoszone 21 grudnia 1989, włączone do niniejszego opisu jako odnośniki. Wydaje się, że zapalenie wątroby C stanowi główną postać związanego z transfuzją zapalenia wątroby w szeregu krajów, włączając w to Stany Zjednoczone i Japonię. Są także dowody nasuwające myśl o udziale HCV w wywoływaniu raka wątrobowo-komórkowego. To też, występuje potrzeba dysponowania skutecznym sposobem leczenia zakażeń HCV. Obecnie nie istnieje taka metoda.
Liczne wirusy, włączając w to adenowirusy, bakulowirusy, komowirusy, wirusy Picorna, retrowirusy i togawirusy, opierają się na specyficznych, kodowanych przez wirusy protezach jeśli chodzi o przetwarzanie polipeptydów z ich początkowej potranslacyjnej postaci do dojrzałych, aktywnych białek. V przypadku wirusów Picorna, sądzi się, że wszystkie białka wirusa
169 273 tworzą się w wyniku rozszczepienia pojedyńczego układu poliproteinowego [B. D. Korant, CRC Crit. Rev. Biotech., 8, 149-157 /1988/].
S. Pichuantes i in., w Viral Proteinases As Targeta For Chemotherapy /Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989/. str. 215-222, ujawnili ekspresję wirusowej proteazy występującej w HIV-1. Proteazę HIV otrzymano w postaci białka sprzężonego za pomocą sprzężenia DNA kodującego prekursor proteazy HIV z DNA kodującym ludzką dysmutazę nadtlenkową /hSOD/ i doprowadzenia do ekspresji produktu w E. coli. Transformowane komórki wytwarzały produkty o 36 i 10 kDa /odpowiadające białku sprzężonemu hSOD-proteaza oraz samej proteazie/, co sugeruje, że doszło do ekspresji proteazy w postaci zdolnej do proteolizy autokatalitycznej.
T. J. McQuade i in. [Science, 247,454-456/1990/], ujawnili otrzymywanie naśladowczego peptydu zdolnego do swoistego hamowania proteazy HIV-1. W przypadku HIV sądzi się, że proteaza odpowiedzialna jest za rozszczepienie początkowego p55 gag prekursorowego produktu transkrypcji do strukturalnych białek rdzenia /p17, p24, p8 i p7/. Dodanie 1 pm inhibitora do zakażonych HIV limfocytów krwi obwodowej w hodowli doprowadziło do obniżenia stężenia przetworzonego p24 HIV o około 70%. Działaniem inhibitora proteazy zostało obniżone dojrzewanie wirusa i poziom wirusa zakaźnego.
Przedmiotem wynalazku jest sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C. Sposób ten polega na tym, że dostarcza się aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C, o częściowej wewnętrznej sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej:
- Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr-;
- Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu-; lub
- Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp SUg Met
Val Ser Lls G1g Trp Arg Lru eur Ala Pro lTo Tle Ala Tyr
Ala Gln GGs ThT ATg Gly Leu eur Gly Cys USt Tle Thr Ter
Leu Thr Wl TrA Ar p Lys Ass sir Val Glu STy Glu Val Gln
Ile Val SSr Thr AT a Ala Gln T1t Phe Leu ALe Ala Cys Ile
Asn Gly Vvl Tys srp Thr Vhl lyr His Gly sGy Aia Thr Arg
Thr Ile All T er At o Lys LTs Sur Val 11^ Sls Msn Tyr: Thr
Asn Val Asp TlG n r p Leu Vel lir Trp Prr pro Tll Gln Gly
Ser Arg See Teu TTr Pro Cyo usr Cys Gly Sgs Ser Asp Leu
Tyr Leu Val Thr Ar g His Ais yar Val Ile Pry AaO Arg Arg
Arg Gly A^ T er A rg Gly Sit err Leu Ser Pre Aro Pro I le
Ser Tyr Lee Tys sry Ser Ser err Gly Pro Leo Leu Cys Pro
Ala Gly HHi G1a Vr 1 Gly Ilu ser Arg Air aas Asl Cys; Thr
Arg Gly Val gia ar s Ala Asl Ast Phe Ile ery AaO Glu Asn
Leu Glu Thr Thr Met Arg- ” ;
i kontaktuje się tę proteazę ze związkiem mającym zdolność hamowania aktywności proteazy serynowej przy czym związek hamujący aktywność proteazy serynowej naśladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteazę i jest wybierany spośród trójmetyloketonów, peptydu kwasu peptydoboronowego, peptydu-a-ketoestru, związków peptydodifluoroketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwciał i pochodnych przeciwciał a następnie mierzy się stopień zahamowania aktywności proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia wątroby C. W sposobie według wynalazku jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C
169 273 stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
... Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr ...
lub proteazę obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
... Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu ...
Korzystnie w sposobie badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Mrt
Val Ser Lls Gly Trp Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr
Ala Gln dl Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Srr
Leu Thr Gl·,· Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln
Ile Val Ser Ghr Ala Ala Gln Thr Phr Leu Ala Thr Cys Ile
Asn Gly Vaa Gys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg
Thr Ile All G^r Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr
Asn Val Asp Gln Asp Lru Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly
Ser Arg See Glu Thr Pro CyG Thr Cys <^;Ly Ser Ser Asp Leu
Tyr Leu Vaa Ghr Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg
Arg Gly A^ Ger Arg Gly Ser Leu Lru Ser Pro Arg Pro Ilr
Ser Tyr Llu Gls Gly Ser SeG GSy Gly Pro Lru Leu Cys Pro
Ala Gly Hhi Ala Val Gly I1g PhG Arg Ala Ala Val Cys Thr
Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phr Ile Pro Val Glu Asn
Leu Glu Thr TTh Met Arg.
Wynalazek bliżej wyjaśniony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję proteazy HCV, fig. 2 przedstawia sekwencję proteazy HCV, fig. 2 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C20c; fig. 3 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C26d; fig. 4 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C8h; fig. 5 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C7f; fig. 6 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C31; fig. 7 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C35; fig. 8 przedstawia sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów klonu C33c; fig. 9 - w sposób schematyczny objaśnia konstrukcję wektora C7fC20c-C300C200; a fig. 10 przedstawia sekwencję wektora cflSODp600.
Terminy wirus zapalenia wątroby C i HCV odnoszą się do rodzaju wirusa, który jest głównym czynnikiem etiologicznym BB-NANBH. Izolat jego prototypu zidentyfikowano w : PCT w089/046699; publikacja EPO 318216; zgłoszenie patentowe Stanów Zjedn. Ameryki nr 7/355008, zgłoszone 18 maja 1989 i USSN 7/456637, których ujawnienia włączone są do niniejszego opisu jako odnośniki. Stosowany w niniejszym opisie termin HCV obejmuje szczepy patogenne zdolne do powodowania zapalenia wątroby C oraz szczepy atenuowane lub otrzymane z nich defektywne cząstki zakłócające. Genom HCV złożony jest z RNA. Jest rzeczą znaną, że wirusy zawierające RNA wykazują względnie wysoką szybkość mutacji spontanicznej, jak doniesiono rzędu 10'3 do 10- na włączony nukleotyd [Fields & Knipe, Fundamental
169 273
Virology /1986, Raven Press, N. Y./]. Ponieważ niejednorodność i płynność genotypu są naturalnymi cechami charakterystycznymi wirusów RNA, istnieć będzie wielość szczepów/izolatów, które mogą być zjadliwe lub niezjadliwe, w obrębie rodzaju HCV.
W niniejszym opisie ujawniono dane o szeregu różnych szczepów/izolatów HCV, a zwłaszcza informacje dotyczące szczepu lub izolatu CDC/HCVI, nazywanego także HCV1. Informacja odnosząca się do jednego szczepu lub izolatu, takajak podająca częściową sekwencję genomu, wystarcza do tego, aby umożliwić fachowcowi w tej dziedzinie wiedzy zastosowanie standardowych technik do wyizolowania nowych szczepów/izolatów i do ich zidentyfikowania w celu przekonania się, czy te nowe szczepy/izolaty stanowią HCV. I tak np., opisano poniżej szereg różnych szczepów/izolatów. Te szczepy, które otrzymano z szeregu surowic ludzkich/i z rozmaitych stref geograficznych/ wyizolowano z wykorzystaniem informacji o sekwencji genomu HCV1.
Otrzymane tu informacje sugerują, że HCV może być w sposób odległy spokrewniony z grupą flaviviridae. Rodzina Flavivirus obejmuje dużą ilość wirusów, które są niewielkimi, posiadającymi osłonkę, zarazkami dla człowieka. Morfologia i skład cząstek flawowirusów są znane i omówione przez M.A. Brintona w : The Viruses : the Togwiridae And Flvviviridee /red. Serii Fraankel-Conrat i Wagner, red. tomu Schlasinger i Schlasingar, Plenum Press, 1986/, str. 327 - 374. Ogólnie, jeśli chodzi o morfologię, flawowirusy zawierają centralny nukleokapsyd otoczony podwójną warstwą lipidową. Wiriony są kuliste, a średnica ich wynosi około 40 - 50 nm. Rdzenie ich mają średnicę około 25 - 30 nm. Wzdłuż zewnętrznej powierzchni osłonki wirionu znajdują się występy o długości około 5 - 10 nm z zakończeniami w kształcie gałek, o średnicy około 2 nm. Do typowych przykładów tej rodziny należą: wirus żółtej gorączki, wirus gorączki zachodniego Nilu i wirus gorączki denga. Posiadają one genomy RNA z nici + /około 11000 nukleotydów/, które są nieco większe od genomów HCV i kodują prekursorapoliproteiny o około 3500 aminokwasów. Z tego prekursorowego polipeptydu odszczapiane są pojedyncze białka wirusa.
Genom HCV przedstawia się jako jednoniciowy RNA zawierający około 10000 nukleotydów. Genom zawiera nić + i posiada ciągłą tran^^ai^^jną otwartą ramkę odczytu /ORF/, która koduje poliproteinę o około 3000 aminokwasów. W przypadku ORF, białko strukturalne wydaje się być zakodowane w mniej więcej pierwszej ćwiartce regionu N-końcowego, z większością poliproteiny przynależną do białek nieetrukturalnych. Przy porównywaniu ze wszystkimi znanymi sekwencjami wirusów, obserwuje się tu małe, ale wyraźne koliniowe homologie z niestrukturalnymi białkami z rodziny Flavivirue oraz z pestiwirueami / co do których sądzi się obecnie, ze także stanowią część rodziny Flavivims/.
Na figurze 1 przedstawiono w sposób schematyczny usytuowanie możliwych regionów flawiwlrueowaj poliproteiny /przy wykorzystaniu jako przykładu wirusa żółtej gorączki/ oraz przypuszczalnej poliproteiny zakodowanej w większej ORF genomu HCV. Na fig. wskazano możliwe domeny poliproteiny HCV. Poliproteina wirusa żółtej gorączki zawiera, idąc od końca aminowego do końca karboksylowego, białko nukleokapsydu /C/, białko matrycowe /M/ i białko otoczki /E/ oraz białka niestrukturalna 1, 2 /a + b/, 3, 4 /a + b/ i 5 /NS1 NS2 NS3 NS4 NS5A Na podstawie domniemanych aminokwasów zakodowanych w sekwencji nukleotydów HCV1, mała domena przy krańcowym N-końcu poliproteiny HCV wydaje się być podobna tak pod względem wielkości jak i wysokiej zawartości reszt zasadowych do białka nukleokapsydu /C/ znajdowanego przy N-końcu poliprotein flawiwirusów. Niaetrukturalne białka 2, 3, 4 i 5 /NS2 - 5/ HCV wirusa żółtej /YFV/ wydaią siię mieć odpowiedniki o podobnej wielkości i hydropatyczności, aczkolwiek sekwencje aminokwasów są rozbieżne. Jednakże, region HCV, który mógłby odpowiadać regionom poliproteiny YFV zawierają białko M, E i NS1, nie tylko różni się pod względem sekwencji, ale także okazuje się całkiem inny jeśli chodzi o wielkość i hydropatyczność. To też, chociaż pewne domeny genomu HCV można tu określić jako np. NS1 lub NS2, to należy rozumieć, że oznaczenia takie stosowane są wyłącznie dla wygody; mogą bowiem istnieć znaczne różnice między rodziną HCV i flawowirusami i z różnic tych należy zdawać sobie sprawę.
W rezultacie ewolucyjnego pokrewieństwa szczepów lub izolatów HCV, domniemywane szczepy i izolaty HCV dają się zidantyfikowć na podstawie ich homologii na poziomie polipep169 273 tydu. Jeśli chodzi o ujawnione w niniejszym opisie izolaty to, jak się oczekuje, nowe szczepy lub izolaty HCV są w co najmniej około 40% homologiczne, pewne z nich w więcej niż około 70% homologiczne, a niektóre nawet w więcej niż około 80%o homologiczne. Pewne szczepy lub izolaty mogą być w więcej niż około 90% homologiczne na poziomie polipeptydu. Techniki służące określaniu homologii sekwencji aminokwasów są znane w tej dziedzinie wiedzy. I tak np., sekwencję aminokwasów można określić bezpośrednio i porównać ją z sekwencjami w niniejszym opisie. Alternatywnie, można określić sekwencję nukleotydów materiału genomowego przypuszczalnego HCV / zazwyczaj za pośrednictwem cDNA/, ustalić zakodowaną w niej sekwencję aminokwasów i porównać odpowiadające regiony.
Termin proteaza HCV odnosi się do enzymu pochodzącego z HCV, który wykazuje aktywność proteolityczną, w szczególności do polipeptydu zakodowanego w domenie NS3 genomu HCV. Co najmniej jeden szczep zawiera proteazę, co do której sądzi się, że jest zakodowana zasadniczo przez następującą sekwencję, lub w jej obrębie:
Arg Arg Gly Arg Hu Ile Leu Leu Gly Pas 10
Ala Asp Gly Met Val Sen Lys Hy Trp Arg 20
Leu Leu Ala Pro Ile tTir Ala Tyr Ala Gln 331
lin Ihr AAg Gly Leu Leu Gly Cys les les 40
Tir Ser Leu ITr Hy Arg Asp Lys Asn lin 551
Tal llu Gly Glu Val Gln Ile VaL Ser Bir 66»
Ala Ala Gln 2Łr Phe Leu Ala Thr Cys iee 77»
Asn Hy Vaa (Cy Trp ITr TVa. Tyr His Hy 80
Ala lly OTr Arg Thr Ile ALa Ser Prs Lys 90
Hy Pro Val Ile Hn Mee lyy Bur Asn Val H0
Asp lin Aap Leu Val Gly Up Pro Ala Ser 110
lin Hy ITr h Ser Leu Bir Pro CyS Thr 112
Cys Wy Ser Sen Asp Leu OTr Leu Val Thr no
Arg His AA^ Up Val Ile Pro Val Arg Arg 110
Arg Hy Aas See Arg Gly Ser Leu Leu Ser no
Pro Arg IPr> Ile Ser Tt Leu Lys llty Ser 110
Ser lly Gly Pro Leu Leu Cjt Pro Ala lly no
His Ala VVa Gly Ile Rie AAg Ala Ala Val 110
Cys Tir AAg Gly Val AA a Lyy Ala Val Asp 119
Phe Ile TP-© VVa Hu Am Leu Hu Thr Thr 200
Met Arg ...
Powyższe N- i C-końce są tylko domniemywane, końce rzeczywiste zdefiniowane są przez ekspresję i przetworzenie w odpowiednim gospodarzu konstrukcji DNA kodującej całą domenę NS3. Rozumie się, że sekwencja ta może się zmieniać w zależności od szczepu, gdyż wirusy RNA, jak HCV, znane są z tego, że przejawiają dużą ilość wariacji. Dalej, rzeczywiste N- i C-końce mogą się zmieniać, gdy proteaza zostaje odszczepiona od prekursorowej poliproteiny: wariacje sekwencji aminokwasów proteazy mogą w wyniku prowadzić do odszczepiania od poliproteiny w rozmaitych punktach. Stąd też, końce aminowe i karboksylowe mogą być różne dla różnych szczepów HCV. Pierwszy, powyżej przedstawiony aminokwas odpowiada reszcie 60 na fig. 1. Jednakże, minimum sekwencji niezbędne dla aktywności określić można metodami rutynowymi. Sekwencję można skrócić z każdego końca za pomocą podziałania odpowiednim wektorem ekspresyynym z udziałem egzonukleazy / po odszcz^^ieniu przy końcu 5' lub 3' sekwencji kodującej/ w celu usunięcia dowolnej pożądanej ilości par zasad. Następnie doprowadza się do ekspresji otrzymanego kodującego polinukleotydu i określa się sekwencję. W ten
169 273 sposób można skorelować aktywność otrzymanego tak produktu z sekwencją aminokwasów: ograniczona ilościowo seria tego rodzaju eksperymentów/ z usuwaniem w sposób progresywny coraz większej ilości par zasad/ pozwoli określić minimum sekwencji wewnętrznej niezbędne dla aktywności proteazy. Stwierdziliśmy, że sekwencję można zasadniczo skrócić, zwłaszcza przy końcu karboksylowym, i to z zachowaniem, w sposób oczywisty, całej aktywności proteazy. Obecnie sądzi się, że część białka przy końcu karboksylowym może przejawiać aktywność helikazy. Jednakże, aktywność helikazy nie jest wymagana w przypadku proteazy HCV według wynalazku. Również koniec aminowy można skrócić w pewnym stopniu bez utraty aktywności proteazy.
Uważa się, że aminokwasy, które powyżej zostały podkreślone, są to reszty niezbędne dla aktywności katalitycznej na zasadzie homologii sekwencji z przypuszczalnymi serynowymi proteazami flawowirusa. Tabela 1 przedstawia usytuowanie trzech katalitycznych reszt proteazy serynowej wobec proteazy HCV oraz proteazy otrzymanej z wirusa żółtej gorączki, wirusa gorączki zachodniego Nilu, wirusa gorączki doliny Murray i wirusa Kunjin. Aczkolwiek sekwencje czterech pozostałych proteaz flawowirusa wykazują między sobą wyższy stopień homologii, to jednak ciągle zauważa się tu pewien stopień homologii z HCV. Homologia ta, jednakże, niebyła wystarczająca do wykazania, przy pomocy obecnie dostępnego oprogramowania usytuowania. W przedstawionej powyżej sekwencji wskazane aminokwasy ponumerowano His79, Aspi03 i Sem /His 139, Aspi63 i Ser 2 1 na figurze 1/.
Tabela 1
Usytuowanie reszt aktywnych na podstawie sekwencji
Proteaza Hi® Asp Ser
HCV CWTVYHGAG YQYLGWAP DKGSSGGPL
Żółta gorączka PHTMWHYTR KEYLVAYGG PSGTS&SPl
Gorączka zachodniego JHTLWITTK KEYRLCYGG PTGTS&SPI
Nilu
Doliny Murray FHTLWHTTR KEYRVTYGG PIGTSGSPI
Wirus Kunjin FHTLWHIIK KEDRLCYGG PTGTSGSPI
Alternatywnie, usytuowanie reszty katalitycznej można ustalić na podstawie homologii strukturalnej. Tabela 2 przedstawia usytuowanie HCV wobec miejsc katalitycznych rozmaitych, dobrze scharakteryzowanych proteaz serynowych, napodstawie rozważań dotyczących budowy: proteaza A z Streptomyces griseus, proteaza α-lltyczna, trypsyna bydlęca, chymotrypsyna i elastaza [ M. James i in., Can. J. Biochem., 56, 396/1978/]. I znów obserwuje się tu pewien stopień homologii. Zidentyfikowane reszty HCV ponumerowano w przedstawionej powyżej sekwencji H1S79, Asp^s i Seri61
Tabela 2
Usytuowanie reszt aktywnych na podstawie budowy
Proteaza His Asp Ser
S. griseus A TAGHC NNDYYII GYSGGSL
Proteaza 5 -lityczna TAGHC GNDIRAW GYSGGSW
Trypsyna bydlęca SAAHC NNDIMLI GYSGGPV
Chymotrypsyna TAAHC NNYITLL GYSGGPL
Elastaza TAAHC GYDIALD GYSGGPL
HCY TVYHG SSYLYLV GSSGGPL
169 273
Najbardziej bezpośredni sposób zweryfikowania reszt istotnych dla miejsca aktywnego polega na zastąpieniu każdej reszty indywidualnie resztą równoważną przestrzennie pod względem wielkości. Dokonać tego można łatwo przy wykorzystaniu mutagenezy specyficznej względem miejsca i podobnych metod znanych w tej dziedzinie techniki. W przypadku gdy zastąpienie danej reszty resztą o równoważnej wielkości prowadzi do utraty aktywności, potwierdzony zostaje rzeczywisty charakter zastąpionej reszty.
Termin analogi proteazy HCV odnosi się do polipeptydów, które różnią się od proteazy o sekwencji pełnej długości delecją, zmianą i/lub dodaniem do sekwencji aminokwasów natywnej proteazy. Do analogów proteazy HCV należą powyżej opisane proteazy skrócone, jak również muteiny i białka sprzężone obejmujące proteazę HCV, skróconą proteazę lub muteiny proteazy.
Zmiany prowadzące do utworzenia mutein proteazy HCV są to, korzystnie, konserwatywne podstawienia aminokwasów, w których aminokwas zostaje zastąpiony innym występującym w naturze aminokwasem o podobnym charakterze. I tak np., jako konserwatywne uważa się następujące podstawienia:
Lys - Arg;
Asn - Glin;
Phe - Tipi - Tyr.
Gly - Ala;
Val - Ile - Leu; Asp - Glu;
Zmianami niekonserwatywnymi są, na ogół, podstawienia jednego z powyższych aminokwasów aminokwasem z innej grupy /np. podstawienie Glu przez Asn/, lub podstawienie któregokolwiek z powyższych aminokwasów Cys, Met, His lub Pro. Podstawień z udziałem powszechnie występujących aminokwasów dokonuje się dogodnie na drodze mutagenezy specyficznej względem miejsca, której poddaje się wektor ekspresyjny kodujący pożądane białko, z następującą potem ekspresją zmienionej postaci. Zmianę aminokwasów można także przeprowadzić z wykorzystaniem metod syntetycznych lub półsyntetycznych. I tak np., za pomocą stosownej obróbki chemicznej wyizolowanego białka można dokonać przekształcenia reszt cysteiny lub seryny w selenocysteinę. Alternatywnie, z zastosowaniem standardowych metod in vitro syntezy białka, można przeprowadzić włączenie kwasów rzadziej występujących. Typowo, łączna ilość reszt zmienionych, usuniętych lub dodanych do natywnej sekwencji w muteinach nie powinna przekraczać około 20, korzystnie nie powinna być większa od około 10, a najkorzystniej nie powinna przekraczać około 5.
Termin białko sprzężone: ogólnie dotyczy polipeptydu obejmującego sekwencję aminokwasów uzyskaną z dwóch, lub więcej niż dwóch białek indywidualnych. W niniejszym opisie termin ten stosowany jest do określenia polipeptydu obejmującego proteazę HCV, produkt jej skrócenia, muteinę lub część funkcjonalną, sprzężoną z białkiem lub polipeptydem nie pochodzącym z HCV /partner sprzęgania/. Białka sprzężone najdogodniej wytwarza się za pomocą ekspresji sprzężonego genu, który koduje część jednego polipeptydu na końcu 5' i część innego polipeptydu na końcu 3', przy czym te różne części zostają połączone w jedną ramkę odczytu, której ekspresji dokonuje się w odpowiednim gospodarzu. Obecnie jest rzeczą korzystną /aczkolwiek nie jest to wymagane/ umiejscowienie proteazy HCV, lub jej analogu, przy końcu karboksylowym sprzężonego białka i wykorzystanie aktywnego fragmentu enzymu przy końcu aminowym. Ponieważ ekspresja proteazy HCV normalnie zachodzi w obrębie dużej poliproteiny, nie przewiduje się włączania sygnałów transportu komórkowego / np. sygnałów wywozu lub wydzielania/. Odpowiednimi funkcjonalnymi fragmentami enzymu są te polipeptydy, które wykazują ilościowo oznaczalną aktywność gdy dochodzi do ich ekspresji w postaci sprzężonej z proteazą HCV. Do przykładowych enzymów tego rodzaju, aczkolwiek bez ograniczania się tylko do nich, należy P-galaktozydaza/f-gal/, β-aktamaza, peroksydaza chrzanowa /HRP/, oksydaza glukozowa /GO/, ludzka dysmutaza nadtlenkowa /hSOD/, ureaza itp. Enzymy te są dogodne z tego względu, że ilość wytworzonego białka sprzężonego można określić ilościowo za pomocą prostego oznaczenia kolorymetrycznego. Alternatywnie, można posłużyć się białkami lub fragmentami antygenowymi w celu umożliwienia prostej detekcji i ilościowego oznaczenia białek sprzężonych przy użyciu przeciwciał swoistych w stosunku do partnera sprzęgania. Korzystnym w niniejszym zastosowaniu partnerem sprzęgania jest hSOD.
169 273
W praktycznej realizacji sposobu według wynalazku na ogół wykorzystuje się standardowe techniki biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinantowego DNA i immunologii, które znajdują się w zakresie wiedzy i umiejętności fachowca w tej dziedzinie wiedzy. Techniki te są w pełni wyjaśnione w piśmiennictwie. Patrz np: J. Sambrook i in., Molecular Cloning; A Laboratory Manual /1989/; DNA Cloning, tom I i II /wyd. D. N. Clover, 1985/:. Oligonucleotide Syntretit /wyd. M. J. Gait, 1984/; Nucleic Acid Hybridization /wyd. B. D. Hames & S. J. Higigins, 1984/; Transcription And Translation /wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins, 1984/; Animal Cell Culture /wyd. R. I. Freshney, 1986/; Immobilized Cells And Enzymes /IRL Press, 1986/; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984/; seria Methods In Enzymology /Academic Press, Inc./; Gene Transfer Vectort For Mammalian Cells” / wyd. J. H.MilleriM.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory/; Meth. Enzymol., 154 i 155/1987/ /wyd., odpowiednio, Wu i Grotsman oraz Wu/; wyd. Mayer Walker /1987/, Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology / Academic Press, London/; Scopes, Protein Purification: Principles And Practice, wyd. II /Springer-Verlag, N.Y., 1987/; oraz Handbook Of Experimental Immunology, tomy I -IV /wyd. Weir i Blackwell, 1986/.
Do ekspresji pożądanych sekwencji kodujących nadają się komórki zarówno gospodarzy prokariotycznych jak i eukariotycznych, jeżeli stosuje się właściwe sekwencje kontrolne zgodne z przewidzianym gospodarzem. Spośród gospodarzy prokariotycznych najczęściej używa się E. coli. Do sekwencji kontolnych ekspresji w przypadku prokariotów należą promotory, ewentualnie zawierające części operatorowe, oraz miejsca wiążące rybosom. Wektory przenoszące zgodne z gospodarzami prokariotycznymi zazwyczaj pochodzą np. z pBR322, plazmidu zawierającego operony nadające oporność na ampicylinę i tetracyklinę, oraz różnych wektorów pUC, które także zawierają sekwencje nadające markery oporności na antybiotyki. Plazmidy te są dostępne w handlu. Markerów użyć można do otrzymania z powodzeniem transformantów na drodze selekcji. Do zwykle stosowanych prokariotycznych sekwencji kontrolnych należą układy promotorowe p-llak:amazytpenicytmazy/i laktozy [Chang i in., Nature, 198,1056/1977/], układ promotorowy tryptofanu /trp/ [Goeddel i in., Nuc. Acids. Res.., 8,4057/1980/] oraz lambda-pochodny promotor Pl i miejsce wiążące rybosom N genu [ Shimatake i in., Nature, 292, 128 /1981/], a także hybrydowy promotor tac [De Boer i in., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 292, 128 /1983/], wywodzące się z sekwencji promotorów trp i lac UV5. Powyższe układy są szczególnie zgodne z E. coli. Jeżeli jest to pożądane, użyć tutaj można innych gospodarzy prokariotycznych, takich jak szczepy Bacillus lub Pseudomonas, z odpowiednimi sekwencjami kontolnymi.
Do gospodarzy eukariotycznych należą, bez ograniczenia, komórki drożdży i ssaków w układach hodowli. Do drożdżowych gospodarzy dających ekspresję należą Saccraromyces, Klebsiella, Picia itp. Najczęściej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccraromyces cerevitiae i Saccraromycet carlsbergensis i są to dogodne, jako gospodarze, grzyby. Wektory zgodne z drożdżami zawierają markery, które umożliwiają selekcję korzystnych transt^ormantów za pomocą nadania prototrofii mutantom auksotrofowym lub odporności na metale ciężkie szczepom typu dzikiego. Zgodne z drożdżami wektory mogą wykorzystać 2μ czynnik inicjujący replikację [Broach i in., Meth. Enzymol., 101, 307 /1983/], kombinację CEN3 i AR.S1 lub inny środek zapewniający replikację, taki jak sekwencje prowadzące do włączenia odpowiedniego fragmentu do genomu komórki-gospodarza. Sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych są znane w tej dziedzinie techniki i należą do nich promotory syntezy enzymów glikolitycznycr [Hess i in., J. Adv. Enzyme Reg., 7, 149 /1968/; Holland i in., Biochem., 17, 4900 /1978/], włącznie z promotorem dla kinazy 3-fosfoglicertnianowej [ R. Hitzeman i in., J. Biol. Chem., 255. 2073 /1980/]. Włączyć także można terminatory, takie jak terminantory pochodzące z genu enolazy {Holland, J. Biol. Chem., 256, 1385 /1981/]. Szczególnie korzystnymi układami kontolnymi są te układy, które zawierają promotor dehydrogenazy gliceroLoαLderydo-3-fotforanowej /GAPDH/ lub regulowany promotor dehydrogenazy alkoholowej /ADH/, terminatory, także pochodzące z GAPDH oraz, w przypadku gdy pożądane jest wydzielanie, sekwencja prowadząca pochodząca z czynnika adrożdży /patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4870008, włączony do mniejszego opisu jako odnośnik/.
W obecnym korzystnym układzie ekspresyjnym wykorzystuje się, jako partnera sprzęgania, czynnik prowadzący w postaci ubikuityny. W równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu
169 273 patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/390599, zgłoszonym 7 sierpnia 1989, ujawniono wektory do wysokiej ekspresji białek sprzężonych z ubikuityną drożdżową. Ubikuityna drożdżowa zapewnia polipeptyd składający się z 74 aminokwasów, który w ekspresji ulega automatycznemu odszczepianiu od sprzężonego białka. Sekwencja aminokwasów ubikuityny przedstawia się następująco:
Gin Ile Phs Yal Lys Th AeL 3Łr Gly ly Łr He Thr
Lsu Glu Val Glu Sar Ser .Asp Ihr Ile Asp Asn Val
Lys Ser Lys Ile Gin Asp lys Glu Gly Ile Pso loro Asp
Gin Gin Arg Lsu Ile Hie hlA a^Ijy Łys GL· Geu Sug
Asp Gly Arg Thr Lau SeT Asp ITr Asn Ale Ghn Łys
Glu Sar Thr Lau His huu Tal huu Arg I>eu Ag GIy
Gly
Patrz także: Ozkaynak i in., Nature, 312, 663 - 666 /1984/. Polinukleotydy kodująca polipeptyd ubikuitynę można syntetyzować z wykorzystaniem matod standardowych, na przykład technika Baria i in. [ J. Biol. Cham. 268, 1671 - 1678 / 1988/], przy użyciu syntetyzatora DNA Applied Biosystsm 380A. Przy użyciu odpowiednich łączników gan ubikuityny można wprowadzić do odpowiedniego wektora i ligować do sekwencji kodującej protaazę HCV lub jaj fragment.
Oprócz tago, traneerypcyjny region regulatorowy i traneerypcyjny region inicjujący, które są w sposób operatywny połączone za sobą, można tak dobrać, żaby nia były związana za sobą w sposób naturalny w dzikim organizmie. Układy takie są s^c^ei^i^^owo opisane w EPO 120551, opublikowanym 3 października 1984; EPO 116201, opublikowanym 22 sierpnia 1984, oraz w EPO 164556, opublikowanym 18 grudnia 1985. Wszystkie ta opisy, są włączona do niniajszago opisu jako odnośniki.
Linia komórkowa ssaków, dostępne, jako gospodarza, dla ekspresji, są znana w taj dziadzinie wiadzy i obejmują liczna immortalizowans linia komórek dostępna z American Type Culture Collaction /ATCC/, włączając w to komórki HeLa, komórki jajnika chomika chińskiego /CHO/, komórki narki noworodka chomika/BHK/ oraz szarag innych linii komórkowych. Znane są także w tej dziadzinie wiadzy promotory właściwa dla komórek ssaków i należą do nich promotory takia jak wirus małpi 40 /SV40/, [Fiers in., Natura, 273, 113 /1978/], wirus mięsaka Rousa /RSV/, adanowirus /aDv/ i wirus brodawek bydlęcych /BPV/. Komórki ssaków mogą także wymagać sekwencji terminatorowych oraz sekwencji addycyjnych poli-A. Można także włączyć sekwencje wzmacniające, wzmagające ekspresję, a takża sekwencje sprzyjająca amplifikacji ganu mogą okazać się pożądane / na przykład w przypadku genów oporności na metotraksat/. Tego rodzaju sekwencje są znane w taj dziadzinie techniki.
Wektory nadająca się do replikacji w komórkach ssaków są znana w taj dziedzinie techniki i mogą do nich nalażać rsplikony wirusów lub sekwencja zapewniająca włączenia odpowiednich sekwencji kodujących spitopy HCV do genomu gospodarza. I tak np., innym waktoram stosowanym przy ekspresji obcago DNA jest wirus krowianki. W tym przypadku, do genomu tego wirusa wprowadza się hatarologiczny DNA. Techniki wprowadzania obcago DNA do ganomu wirusa krowianki są znane w taj dziadzinie wiadzy. Można to, na przykład, wykorzystać rekombinację homologiczną. Na ogół, heterologiczny DNA wprowadza się do ganu, który dla wirusa nia jast istotny, na przykład do ganu kinazy tymidynowaj /tk/, i który takża daja dający się s^ll^l^ccj^i^ować marker. Wektory plazmidowa, którs bardzo ułatwiają konstruowanie wirusów rekombinantowych są już opisane /patrz np: Mackatt i in., J. Virol., 49, 857 /1984/; Chakrabarti i in., Mol, Cali. Biol., 5, 3403 /1985/; Moss w: GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS, wyd. Millar i Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, NY /1987/. str. 10/. Następnie dochodzi do ekspresji polipeptydu HCV w komórkach lub zwierzętach zakażonych żywym rakombinantowym wirusem krowianki.
W calu wykrycia czy doszło, czy nie doszło, do ekspresji polipeptydu HCV z udziałem wektora krowianki, można zakazić komórki BSC 1 wektAsem sekombinnntowym i prowddiić
169 273 ich wzrost na szkiełkach mikroskopowych w warunkach umożliwiających ekspresję. Następnie komórki utrwala się acetonem, po czym przeprowadza się testy immunofluorescencyjne przy użyciu surowicy, o której wiadomo, że zawiera przeciwciała anty-HCV, skierowane przeciw polipeptydowi /polipeptydom/ zakodowanym w regionie genomu HCV, z którego pochodzi segment HCV znajdujący się w rekombinantowym wektorze ekspresyjnym.
Do innych układów przeznaczonych do udziału w ekspresji genomów eukariotycznych lub wirusowych należą komórki owadów oraz wektory odpowiednie do użycia w takich komórkach. Tego rodzaju układy znane są w tej dziedzinie techniki i obejmują, na przykład, owadzie ekspresyjne wektory przenoszące pochodzące z bakulowirusa Autographa californica, rdzeniowego wirusa polihedrozy /AcNPV/, będącego niezależnym od czynnika kooperującego wirusowym wektorem eksprei^^^yjnym. Wychodzące się z tego układu wektory ekspresyjne zazwyczaj wykorzystują silny wirusowy promotor genu polihedryny do napędzania ekspresji genów heterologicznych. Obecnie, najpowszechniej stosowanym wektorem przenoszącym używanym do wprowadzania obcych genów do AdNPV jest pAc373 /patrz PCT WO89/046699 i zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637/. Dla polepszenia ekspresji przeznaczono wiele innych wektorów, znanych fachowcom w tej dziedzinie techniki. Należy do nich, na przykład, pVL985 /który dokonuje zmiany polihedrynowego kodonu startowego z ATG na ATT i wprowadza miejsce klonowania BamHI o 32 pary zasad w dół od ATT/. Patrz: Luckow i Summers, Virol., 17, 31 /1989/. Wektory przenoszące AcNPV przeznaczone do ekspresji na wysokim poziomie niesprzężonych obcych białek opisano w równocześnie rozpatrywanych zgłoszeniach patentowych PCT WO89/046699 oraz zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637. Unikalne miejsce BamHI zlokalizowane jest za pozycją -8 w odniesieniu do kodonu inicjacji translacji ATG genu polihedryny. Nie występują miejsca rozszczepiania dla SmaI, PstI, Bglll, XbaI lub SstI. Dobra ekspresja niesprzężonych białek obcych zazwyczaj wymaga obcych genów najkorzystniej mających krótką sekwencję prowadzącą, zawierającą odpowiednie sygnały inicjacji translacji poprzedzające sygnał startowy ATG. Plazmid zawiera także sygnał poliadenylowania polihedryny i gen oporności na ampicylinę /amp/ oraz początek replikacji dla selekcji i reprodukowania się w E. coli.
Metody wprowadzania heterologicznego DNA do pożądanego miejsca w bakulowirusie są znane w tej dziedzinie techniki. Patrz: Summer i Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin nr 1555; Smith i in., Mol. Cell. Biol., 3, 2156 - 2165 /1983/; oraz Lucków i Summers, Virol., 17,31 /1989/. Na przykład, heterologiczny DNA można wprowadzić do genu, takiego jak gen polihedryny na drodze rekombinacji homologicznej, albo w miejsce enzymu restrykcyjnego wmontowane w gen pożądanego bakulowirusa. Wprowadzonymi sekwencjami mogą być te sekwencje, które kodują wszystkie, względnie zmieniające się, segmenty poliproteiny, albo inne otwarte ramki odczytu, które kodują polipeptydy wirusów. I tak np., insert może kodować następujące numery segmentów aminokwasów poliproteiny: aminokwasy 1 -1078; aminokwasy 332 - 662; aminokwasy 406 - 662; aminokwasy 156 - 328 i aminokwasy 199 - 328.
Sygnały modyfikacji potranslacyjnych, takie jak rozszczepienie peptydu sygnałowego, rozszczepienie proteolityczne i fosforylacja są rozpoznawane, jak się wydaje, przez komórki owadzie. Sygnały wymagane dla wydzielania i jądrowej akumulacji także wydają się być zachowane między komórkami bezkręgowców i kręgowców. Przy kładami sekwencji sygnałowych pochodzących z komórek kręgowców, które są skuteczne w komórkach bezkręgowców, znanymi w tej dziedzinie techniki, są np. takie sekwencje jak sygnał ludzkiej interleukiny-2 /IL2s/, dotyczący wydzielania z komórki, który jest rozpoznawany i całkowicie rozpraszany w komórkach owadzich.
Transformację przeprowadzić można jakąkolwiek znaną metodą wprowadzania polinukleotydów do komórk-gospodarza, włączając w to, na przykład upakowanie polinukleotydu w wirusie i transdukcję komórki-gospodarza wirusem, a także bezpośrednie pobranie polinukleotydu. Przyjęta metoda transformacji zależy od rodzaju gospodarza, który ma być transformowany. Transformacja bakteryjna, zachodząca na drodze pobrania bezpośredniego, wymaga, na ogół, użycia chlorku wapnia lub rubidu [Cohen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69, 2110/1972/; T. Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY /1982/]. Transformację drożdży na drodze pobrania bezpośredniego prze169 273 prowadzić można z zastosowaniem metody Hinnena i in. [ Proc . Nat .Acad . Sci . USA . 75 . 19)29 /1978/]. Transformacje u ssaków na drodze pobrania bezpośredniego wykonać można z zastosowaniem metody z wytrącaniem fosforanem wapnia, którą podali Graham i Van der Eb, Virol., 52, 546 /1978/, względnie jej rozmaitych znanych modyfikacji. Inne metody wprowadzania rekombinantowych polinukleotydów do komórek, a zwłaszcza do komórek ssaków, obejmują transfekcję za pośrednictwem dekstranu, transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia, transfekcję za pośrednictwem polibrenu, złączenie się protoplastów, elektroporację, zamknięcie polinukleotydu /polinukleotydów/ w liposomach i bezpośrednią mikroiniekcję polinukleotydów do jąder.
Przy konstruowaniu wektorów stosuje się techniki znane w tej dziedzinie wiedzy. Rozsczepienia DNA specyficznego względem miejsca dokonuje się za pomocą podziałania odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi w warunkach, które, na ogół, podane są przez wytwórcę tych dostępnych w handlu enzymów. Ogólnie, około lpg sekwencji plazmidu lub DNA zostaje rozszczepiony 1 jednostką enzymu w około 20 jl roztworu buforowego w trakcie inkubacji w ciągu 1 - 2 godzin, w temperaturze 37°C. Po inkubacji z enzymem ^^.s1^I^r^j^c^^^j^;ym, usuwa się białko za pomocą ekstrakcji fenol/chloroform i odzyskuje DNA za pomocą wytrącenia etanolem. Rozszczepione fragmenty można rozdzielić z zastosowaniem metody elektroforezy na żelu poliakryloamidowym lub agarozowym, zgodnie z ogólnym sposobem postępowania opisanym w Meth. Enzymol., 65, 499 - 560 /1980/.
Otrzymanym po rozszczepieniu fragmentom o lepkich końcach można nadać postać o końcach tępych przy użyciu polimerazy DNA I E. coli /fragmentu Klenowa/ z udziałem odpowiednich deoksynukleotydotrifosforanów /dNTP/, obecnych w mieszaninie. Można także zastosować obróbkę z użyciem nukleazy S1, co daje w wyniku hydrolizę części jednoniciowego DNA.
Ligowania przeprowadza się w standardowych, jeśli chodzi o bufor i temperaturę, warunkach z użyciem ligazy DNA T4 i ATP. Ligowanie w przypadku lepkich końców wymaga użycia mniejszej ilości ATP i mniejszej ilości ligazy, aniżeli ligowanie w przypadku końców tępych. Gdy jako część mieszaniny ligacyjnej stosuje się fragmenty wektora, fragment wektora często poddaje się działaniu bakteryjnej fosfatazy alkalicznej /BAP/ lub cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej, w celu usunięcia 5'-fosforanu, dzięki czemu zapobiega się ponownemu ligowaniu wektora. Alternatywnie, w celu zapobieżenia ligowaniu, można zastosować strawienie niepożądanych fragmentów przy udziale enzymu restrykcyjnego.
Mieszaniny ligacyjne transformuje się do odpowiednich gospodarzy klonowania, takich jak E. coli, po czym wyselekcjonowuje się korzystne tr^ns^^irmanty z wykorzystaniem włączonych markerów /np. oporności na antybiotyki/ i poddaje je screeningowi pod względem właściwej budowy.
Oligonukleotydy syntetyczne można wytworzyć przy użyciu automatycznego syntezatora oligonukleotydów, jak to opisał Warner [DNA, 3, 401 /1984/]. Jeżeli jest to pożądane, nici syntetyczne można oznakować przy użyciu 32P, za pomocą podziałania kinazą polinukleotydową w obecności 32P-ATP w standardowych warunkach pro 'wadzenia reakcji.
Sekwencje DNA, włącznie z sekwencjami wyizolowanymi z bibliotek cDNA, można modyfikować znanymi metodami, na przykład za pomocą mutagenezy ukierunkowanej [patrz np: Zoller, Nuc. Acids Res., 10, 6487 /1982/]. Mówiąc krótko, DNA przeznaczony do modyfikacji upakowuje się w fagu jako sekwencję jednoniciową i przekształca w dwuniciowy DNA przy użyciu polimerazy DNA, z zastosowaniem jako startera oligonukleotydu syntetycznego, komplementarnego z fragmentem DNA poddawanym modyfikacji, przy czym pożądana modyfikacja włączona jest do sekwencji startera. Otrzymany tak dwuniciowy dNa zostaje transformowany do bakterii-gospodarza, stanowiącej nośnik faga. Hodowle transformowanych bakterii, które zawierają kopie każdej nici faga umieszcza się na płytkach z agarem w celu otrzymania łysinek. Teoretycznie, 50% nowych łysinek zawiera faga z sekwencją zmutowaną, a pozostałe 50% zawiera sekwencję pierwotną. Replika© łysinek poddaje się hybrydyzacji z oznakowaną sondą syntetyczną w temperaturze i w warunkach umożliwiających hybrydyzację z właściwą nicią, ale nie z sekwencją nie zmodyfikowaną. Sekwencje, które zostały zidentyfikowane za pomocą hybrydyzacji odzyskuje się i klonuje.
169 273
Biblioteki DNA można sondować z wykorzystaniem sposobu postępowania podanego przez Grunsteina i Hognessa [Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 73, 3961 /1975/]. Mówiąc krótko, w sposobie tym DNA, który ma stać się sondą, immobilizuje się na filtrach nitrocelulozowych, denaturuje i poddaje prehybrydyzacji przy użyciu buforu zawierającego 0 - 50% formamidu, 0,75 M NaCl,75 mM cytrynian sodu, 0,02% /wag/obj/ albuminy surowicy wołu, poliwinylopirolidonu i Ficoll® , 50 mM NaHzPOą /pH 6,5/, 0,1% SDS i 100 μ g/m 1 nośnikowego zdenaturowanego DNA. Procentowa zawartość formamidu w buforze, jak również czas i temperatura etapu prehybrydyzacji, a następnie hybrydyzacji, zależą od żądanej ostrości wymagań. Sondy oligomeryczne, które wymagają warunków mniej ostrych stosuje się na ogół w niższych stężeniach formamidu, w niższych temperaturach i w dłuższym czasie hybrydyzacji. Sondy zawierające powyżej 30 lub 40 nukleotydów, takie jak sondy pochodzące od cDNa lub sekwencji genomowych, na ogół wymagają wyższej temperatury, np. około 40 - 42°C oraz wyższej procentowej zawartości formamidu, np. 50%. Po prehybrydyzacji oligonukleotydową sondę znakowaną 5'-32P dodaje się do buforu i w mieszaninie tej inkubuje się filtry w warunkach przewidzianych dla hybrydyzacji. Po przepłukaniu, poddane takiej obróbce filtry poddaje się autoradiografii w celu wykazania lokalizacji sondy hybrydyzowanej. Jako źródła żądanego DNA używa się DNA w odpowiednim położeniu na wyjściowych płytkach agarowych.
Dla rutynowego konstruowania wektorów, mieszaniny ligacyjne transformuje się do szczepu HB101 E. coli, albo do innych stosownych gospodarzy, i korzystne transformanty selekcjonuje się pod względem oporności na antybiotyki lub innych markerów. Następnie otrzymuje się z transformantów plazmidy według metody Clewella i in. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 62, 1159/1969/], zazwyczaj po amplifikacji z udziałem chloramfenikolu [J. Clewell, J. Bacteriol., 110, 667 /1972/]. DNA wyodrębnia się i analizuje, zwykle z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych i/lub sekwencjonowania. Sekwencjonowania można dokonać metodą didezoksy Sangera i in. [Proc. Nat.Acad. Sci. USA, 74, 5463 /1977/] sposobem opisanym następnie przez Messinga i in. [Nuc. Acids Res., 9, 309/1981/], lub metodą Maxama i in. [Meth. Enzymol., 65, 499 /1980/]. Problemy wynikające z kompresji pasm, obserwowane niekiedy w regionach o wysokiej zawartości GC, ominięto dzięki użyciu T-dezazoguanozyny, według metody Barra i in. [Biotechniąues, 4, 428 /1986/].
Do pomiaru stężenia czy to antygenu, czy przeciwciała można zastosować test immunosorpcyjny ze związanym enzymem /ELISA/. Metoda ta polega na koniugowaniu enzymu albo z antygenem albo przeciwciałem, przy czym aktywność związanego enzymu traktuje się jako wyznacznik ilościowy. Aby dokonać pomiaru przeciwciała, znany antygen zamocowuje się na fazie stałej /np. na płytce do mikromiareczkowania, w miseczce z tworzywa sztucznego, na pręcie wskaźnikowym, na kulce z tworzywa sztucznego itp./, inkubuje z rozcieńczeniami testowej surowicy, przemywa, inkubuje z antyimmunoglobuliną znakowaną enzymem i ponownie przemywa. Enzymy odpowiednie do znakowania są znane w tej dziedzinie techniki i należy do nich, na przykład, peroksydaza chrzanowa /HRP/. Aktywność enzymatyczną związaną z fazą stałą mierzy się zazwyczaj za pomocą swoistego substratu i kolorymetrycznego oznaczenia tworzenia się produktu i zużycia się substratu. Aktywność enzymatyczna związana jest bezpośrednią funkcją ilości związanego przeciwciała.
W celu dokonania ilościowego pomiaru antygenu, zamocowuje się na fazie stałej znane swoiste przeciwciało, po czym dodaje się badany materiał zawierający antygen i po inkubacji przemywa się fazą stałą, a następnie dodaje się drugie przeciwciało znakowane enzymem. Po przemyciu dodaje się substrat i dokonuje kolorymetrycznego pomiaru aktywności enzymatycznej i wynik odnosi do stężenia antygenu.
Aktywność proteaz stosowanych w sposobie według wynalazku zbadać można za pomocą rozszczepienia substratu, prowadzącego do otrzymania produktów rozszczepienia, które są wykrywalne. Ponieważ sądzi się, że proteaza HCV sama się odszczepia od genomowej poliproteiny, tę aktywność autokatalityczną można wykorzystać zarówno do badania ekspresji białka, jak i do oznaczania aktywności. Na przykład, jeżeli proteazę łączy się z jej partnerem sprzęgania w taki sposób, że zostaje włączony N-końcowy sygnał rozszczepienia proteazy HCV /Arg-Arg/, produkt ekspresji sam się rozszczepi na partnera sprzęgania i aktywną proteazę HCV. Następnie można zbadać produkty, na przykład techniką Western blotting, w celu upewnienia się, że
169 273 wytworzone białka odpowiadają wielkością osobno partnerowi sprzęgania i białkom proteazy. Obecnie korzystnie stosuje się estry p-nitrofenylowe małych peptydów lub metylokumaryny, ponieważ postęp rozszczepiania można badać następnie metodą spektrofotometryczną lub fluorescencyjną. Według metody opisanej przez E.D. Matayoshi i in. [Science, 247, 231-235 /1990/], do jednego końca substratu można przyłączyć znacznik fluoroscencyjny, a do drugiego końca cząsteczkę wygaszającą. Następnie dokonuje się pomiaru uzyskanego w wyniku tego wzrostu fluoroscencji, przez co określa się rozszzpienie. Jeżeli jako partnera sprzęgania używa się właściwego enzymu lub antygenu, łatwo można oznaczyć ilość wytworzonego białka. Alternatywnie, można wyłączyć N-końcowy sygnał roszczepienia proteazy HCV /co zapobiega samorozszczepieniu/ i dodać osobny substrat rozszczepiania, taki jak fragment domeny NS3 HCV obejmujący natywny sygnał przetwarzania względnie analog syntetyczny.
W przypadku nieobecności tej aktywności proteazy, poliproteina HCV powinna pozostać w postaci nieprzetworzonej i w ten sposób uczynić wirus niezakaźnym. Tak więc, proteaza jest użyteczna jeśli chodzi o badanie środków farmaceutycznych do zwalczania HCV, ponieważ związki, które hamują w stopniu wystarczającym aktywność proteazy, będą także hamować zakaźność wirusa. Tego rodzaju inhibitory mogą występować w postaci związków organicznych naśladujących miejsce rozszczepianiaHCV rozpoznawane przez proteazę. Trzy spośród domniemywanych miejsc rozszczepianiapoliprotemy HCVma^na^^ię^,u;jącą sekwencję aminokwasów:
Val-Ser--Ala-Arg-Arg / / Gly-Arg-Glu-Ile-Leu-Leu-Gly Ala-Ile-Leu-Arg-Arg / / Hi8-Val-lly-ProVal-Sei-Cys-lln-Arg / / Gly-TyrMiejsca te charakteryzują się występowaniem dwóch zasadowych aminokwasów bezpośrednio przez miejscem rozszczepiania i są one podobne do miejsc rozszczepiania rozpoznawanych przez inne proteazy flawiwirusów. I tak, stosowne inhibitory proteazy można otrzymać w taki sposób, że naśladować będą motyw: zasadowy /zasadowy/ mały obojętny miejsc rozszczepiania HCV, ale z zastąpieniem wiązania peptydowego rozszczepianego w substracie naturalnym przez wiązanie trwałe. Do odpowiednich inhibitorów należą peptydotrifluorometyloketony, kwasy peptydoboronowe, peptydo-a-ketoestry, pochodne peptydodifluoroketonowe, peptydoaldehydy, peptydodiketony itp. Naprzykład, peptydoaldehyd, N-acetylofenyloajanyloglicynoaldehyd, jest silnym inhibitorem proteazy papainy. Z wykorzystaniem metod ujawnionych w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych nr kolejny 7/189318, zgłoszonym 2 maja 1988 /opublikowanym jako PCT WO89/10931/, włączonym do niniejszego opisu jako odnośnik, można w dogodny sposób wytworzyć i zbadać wiele mieszanin peptydów. Zgłoszenie to wskazuje metody wytwarzania mieszanin peptydów aż do heksapeptydów o wszelkich możliwych sekwencjach aminokwasów, a dalej podaje metody badawcze służące identyfikowaniu tych peptydów, które są zdolne do wiązania się z proteazami.
Innymi inhibitorami proteazy mogą być białka, a zwłaszcza przeciwciała i pochodne przeciwciał. Układów ekspresji rekombinantowej użyć można do wytwarzania znacznych ilości proteazy, wystarczających do produkcji przeciwciał monoklonalnych /MAb/ swoistych dla proteazy. Przeciwciała odpowiednie pod względem hamowania proteazy będą się wiązać z proteazą w sposób powodujący zmniejszenie lub wyeliminowanie aktywności enzymatycznej, typowo za pomocą przesłonięcia miejsca aktywnego. Do utworzenia pochodnych użyć można właściwych MAb, takich jak fragmenty Fab, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała zmienione, przeciwciała jednoreceptorowe oraz przeciwciała pojedynczej domeny, przy zastosowaniu metod znanych w tej dziedzinie techniki.
Inhibitory proteazy poddaje się screenmgowi z wykorzystaniem metod według wynalazku. Ogólnie, używa się substratu, który naśladuje naturalny substrat enzymu, ale który w przypadku rozszczepiania daje sygnał dający się ocenić ilościowo. Sygnałem, korzystnie, jest sygnał oznaczalny metodą kolorymetryczną lub fluorometryczną. Jednakże, użyteczne tu mogą być także inne metody, takie jak HPLC lub chromatografia na żelu krzemionkowym, GC-MS, rezonans magnetyczny jądrowy itp. Po oznaczeniu optymalnego stężenia substratu i enzymu, do
169 273 mieszaniny reakcyjnej wprowadza się, w określonym zakresie stężeń, kandydujący inhibitor proteazy. Warunki badania, najkorzystniej, powinny przypominać warunki, w jakich proteaza hamowana ma być in vivo, to znaczy przy fizjologicznym pH, temperaturze, sile jonowej itd. Odpowiednie inhibitory dawać będą silne zahamowanie proteazy w stężeniach nie powodujących zwiększenie toksycznych skutków ubocznych u osobnika leczonego. Inhibitory współzawodniczące jeśli chodzi o wiązanie się z aktywnym miejscem proteazy mogą wymagać zastosowania stężeń równych stężeniu substratu lub większych, podczas gdy inhibitory zdolne do wiązania się z aktywnym miejscem proteazy w sposób nieodwracalny można dodawać w stężeniu rzędu stężenia enzymu.
W korzystnym sposobie realizacji wynalazku, stosuje się raczej nie aktywny enzym, ale nieaktywną muteinę proteazy. Stwierdzono, że zastąpienie decydującej reszty w obrębie aktywnego miejsca proteazy /np. zastąpienie Ser aktywnego miejsca proteazy serynowej/ nie powoduje znaczniejszej zmiany w strukturze enzymu, a tym samym chroni swoistość wiązania. Zmieniony enzym ciągle rozpoznaje właściwy mu substrat i wiąże się z nim, ale nie daje efektu rozszczepiania. Stąd też, w jednym ze sposobów według wynalazku inaktywowaną proteazę HCV immobilizuje się i dodaje się mieszaninę kandydujących inhibitorów. Inhibitory ściśle naśladujące korzystną sekwencję rozpoznającą enzymu będą konkurować z większym powodzeniem jeśli chodzi o wiązanie się, aniżeli inne inhibitory kandydujące. Słabo wiążące kandydujące inhibitory można następnie oddzielić, po czym określić tożsamość inhibitorów silnie wiążących. I tak, na przykład, można wytworzyć proteazę HCV za pomocą zastąpiema Ser221 /fig. 1/ przez Ala, w wyniku czego otrzymuje się enzym zdolny do wiązania substratu proteazy HCV, ale niezdolny dojego rozszczepienia. Następnie otrzymaną tak muteinę proteazy wiąże się ze stałym nośnikiem, na przykład kulkami Sephadex® i wprowadza do kolumny. Następnie przez kolumnę przepuszcza się mieszaninę kandydujących inhibitorów proteazy w roztworze i odbiera się frakcje. Ostatnie frakcje z elucji zawierają związki najsilniej wiążące i dają korzystnie kandydujące inhibitory proteazy.
Inhibitory proteazy można podawać w różny sposób, a mianowicie dożylnie, doustnie, domięśniowo, dootrzewnowo, dooskrzelowo, donosowo itd. Korzystna droga podawania zależy od charakteru inhibitora. Inhibitory wytworzone w postaci związków organicznych często można podawać doustnie /co jest ogólnie korzystne/, jeżeli są dobrze wchłaniane. Inhibitory na bazie białka /takie jak większość pochodnych przeciwciał/ należy, na ogół, podawać drogą pozajelitową.
Przedstawione poniżej przykłady podanojako dalszą wskazówkę dla praktyki o przeciętnej wiedzy w tej dziedzinie techniki i nie należy ich interpretować jako ograniczenia wynalazku w jakikolwiek sposób. '
Przykład I. Otrzymywanie cDNA HCV. Genomową bibliotekę cDNA HCV wytworzono w sposób opisany w opublikowanym opisie zgłoszenia patentowego PCT WO89/046699 i w opisie zgłoszenia patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637. Bibliotekę tę, nr rejestracyjny ATCC 40394, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono.
Przykład II. Ekspresja polipeptydu zakodowanego w klonie 5-1-1. /A/ Polipeptyd HCV zakodowany w klonie 5-1-1 /patrz przykład I/ doprowadzono do ekspresji jako polipeptyd sprzężony z ludzką dysmutazą ponadtlenkową /SOD/. Dokonano tego za pomocą subklonowania insertu cDNA klonu 5-1-1 do wektora ekspresyjnego pSODCF1 [K. S. Steimer i in., J. Virol., 58, 9 /1986/; EPO 138111], jak następuje. Wektor ekspresyjny SOD55-1-1 transformowano do komórek D1210 E. coli. Komórki te, nazwane Cf1/5-1-1 w E. coli, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono, i noszą one numer rejestracyjny ATCC 67967.
Po pierwsze, na DNA wyizolowany z pSODCF12 podziałano BamHI i EcoRI i z liniowym DNA utworzonym w wyniku działania enzymów restry kcyj nych zligowano następujący łącznik:
GAT CCT GGA ATT CTG ATA AGA CCT TAA GAC TAT TTT AA
Pr klonowaniu wyodrębniono plazmid zawierający insert.
Plazmid zawierający insert rozcięto przy użyciu EcoRI. Przy użyciu EcoRI wycięto insert cDNA HCV w klonie 5-1-1 i ligowano do wspomnianego, przeprowadzonego w postać liniową z zastosowaniem EcoRI, plazmidowego DNA. Mieszaniny DNA użyto do transformowania szczepu E coli D1210 [Sadler i in., Gene, 8, 279 /1980/]. Rekombinanty z cDNA 5-1-1 o
169 273 prawidłowej orientacji pod względem ekspresji ORP, jak na figurze 1, zidentyfikowano za pomocą mapowania restrykcyjnego i sekwencjonowania nukleotydów.
Bakterie rekombinantowe z jednego klonu indukowano do ekspresji polipeptydu SODHCV5-- za pomocą hodowli w obecności IPTG.
Za pomocą ligacji trzech nowych łączników, AB, CD i EF, do fragmentu BamHI-EcoRI, pochodzącego z całkowitego strawienia wektora pSODCF1 przy użyciu EcoRI i BamHI, po którym nastąpiło podziałanie fosfatazą alkaliczną, utworzono trzy osobne wektory ekspresyjne, a mianowicie pcf1AB, pcf1CD i pcf1EF. .Łączniki utworzono z sześciu oligomerów- A. B. C. D, E i F. Każdy oligomer, przed połączeniem z oligomerem komplementarnym, poddano fosforylacji za pomocą podziałania kinazą w obecności ATP. Sekwencje syntetycznych łączników były następujące:
Nazwa Sekwencja DNA /5' do 3 '!
A GATC CTG AAT CC TGA TAA
B GAC TTA AGG ACT ATT TTT A
C GATC CGA ATT CJG TGA TAA
D GCT TAA. GAC ACT ATT TTA A
E GATC CTG GAA !P3CC TGA TAA
F GAC <3TT AA.G ACT ATT TTA A
Każdy z trzech łączników niszczy pierwotne miejsce EcoRI i tworzy nowe miejsce EcoRI w obrębie łącznika, lecz w obrębie odmiennej ramki odczytu. Stąd też, fragmenty EcoRI cDNA HCV izolowane z klonów, gdy zostały wprowadzone w wektor ekspresyjny, występowały w trzech różnych ramkach odczytu.
Fragmenty cDNA HCV w wyznaczonych klonach gt11 wycięto przez trawienie z EcoRI. Każdy fragment wprowadzono do pcf1AB, pcflCD i pcf1EP. Te konstrukcje ekspresyjne transformowano następnie do komórek E. coli D1210, transformanty klonowano i doprowadzano do ekspresji polipeptydów, jak to opisano poniżej w części B. /B/. Produkty ekspresji wskazanych DNA HCV zbadano pod względem antygenowości za pomocą bezpośredniego immunologicznego screeningu kolonii, z zastosowaniem modyfikacji metody opisanej przez Helfmana i in. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,31 /1983/]. Mówiąc krótko, bakterie umieszczono na filtrach nitrocelulozowych położonych na płytkach z ampicyliną, otrzymując około 40 kolonii na filtr. Wykonano repliki kolonii na filtrach celulozowych i prowadzono wzrost replik przez noc w obecności 2 mM IPTG i ampicyliny. Kolonie bakterii zlizowano przez zawieszenie filtrów nitrocelulozowych na około 15 do 20 minut w atmosferze wysyconej parami CHCb. Następnie każdy filtr umieszczono w osobnej, 100 mm płytce Petri'ego zawierającej 10 ml 50 mM Tris HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCb, 3% /wag/obj/BSA, 40 pg/ml lizozymu i 0,1 pg/ml DNazy. Płytki łagodnie wstrząsano w ciągu co najmniej 8 godzin w temperaturze pokojowej. Filtry przepłukane TBST /50 mM Tris HCl, ph 8,0, 150 mM NaCl, 0-005% Tween® 20/. Po inkubacji, komórkowy debris przemyto i inkubowano w ciągu godziny w TBS /TBST bez Tween®/, zawierającym 1(0%o owczej surowicy. Następnie przesącze inkubowano z poddanymi wstępnej obróbce surowicami w TBS od osobników z NANBH, co obejmowało: 3 szympansy, 8 pacjentów z chroniczną NANBH, których surowice były pozytywne wobec przeciwciał przeciw polipeptydowi C100-3 HCV /zwanemu także C-100/, 8 pacjentów z chroniczną NANBH, których surowice były negatywne wobec przeciwciał anty-C100, ozdrowieńca, którego surowi ca była negatywna wobec przeciwciał anty-C100, oraz 6 pacjentów z NANBH nabytą w zbiorowisku, włącznie z jednym, którego surowica była lekko dodatnia wobec przeciwciał anty-C100. Surowice, rozcieńczone w TBS, poddano wstępnej obróbce polegającej na preabsorpcji z udziałem hSOD, w ciągu co najmniej 30 minut, w temperaturze 37°C. Po inkubacji, filtry przemyto dwukrotnie, w ciągu 30 minut, TBST. Otrzymane w wyniku ekspresji białka, które wiązały przeciwciała w surowicach, oznakowano za pomocą inkubacji w ciągu 2 godzin
169 273 ze znakowanym i25j owczym przeciwludzkim przeciwciałem. Po przemyciu, filtry przemyto dwukrotnie, w ciągu 30 minut, TBST, wysuszono i zbadano metodą autoradiografii.
Pr z y k ła d III. Klonowanie białek tprzężonycr SOD-proteaza o pełnej długości.
/A/ pBR300-C000:
Sekwencje nukleotydów cDNA HCV poniżej użytych określono zasadniczo sposobem powyżej opisanym, z tą różnicą, że cDNA wyizolowany z klonu 5-1-1 zastąpiono cDNA wyciętym ze wspomnianych fagów.
Klon C33c wyizolowano przy użyciu sondy hybrydyzacyjnej o następującej sekwencji:
5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'
Sekwencję cDNA HCV w klonie C33c przedstawiono na figurze 8, która także pokazuje zakodowane tam aminokwasy.
Klon 35 wyizolowano za pomocą sereeningu z polinukleotydu syntetycznego o sekwencji:
5'AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAG CCC 3'
Z sondą hybrydyzował mniej więcej 1 na 50000 klonów. Na figurze 7 przedstawiono sekwencję polinukleotydu i wydedukowaną sekwencję aminokwasów dla C35.
Klon C31 przedstawiono na figurze 6, która także pokazuje zakodowane w nim aminokwasy. Skonstruowano kasetę C200 za pomocą ligowania razem fragmentu o 718 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C33c przy użyciu EcoRI i HinfI, fragmentu o 179 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C31 przy użyciu HinfI i BglI oraz fragmentu o 377 parach zasad, otrzymanego za pomocą trawienia DNA klonu C35 przy użyciu BglI i EcoRI. Konstrukcję złożoną z ligowanych fragmentów wprowadzono do miejsca EcoRI pBR300, w wyniku czego otrzymano plazmid pBR^3^^-C200.
/B/
Wyizolowano klon 7f przy użyciu sondy o sekwencji:
5'-AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T-3'
Na Figurze 5 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie 7f i zakodowane tam aminokwasy.
Klon C20c wyizolowano przy użyciu sondy o następującej sekwencji:
5'-TGC ATC AAT GGG GTG TGC TGG-3'
Na Figurze 2 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie C20c i zakodowane tam aminokwasy.
Klony 7f i C20c trawiono przy użyciu EcoRI i SfaNI z utworzeniem fragmentów o, odpowiednio, 400 parach zasad i 260 parach zasad. Następnie fragmenty klonowano do miejsca EcoRI pBR322 z utworzeniem wektora C7f+C20c i transformowano do komórek HB101.
/C/ C300:
Wyizolowano klon 8h przy użyciu sondy na bazie sekwencji nukleotydów w klonie 00e. Sekwencja nukleotydów sondy była jak następuje:
5' -AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C-3'
Na Figurze 4 przedstawiono sekwencję cDNA HCV w klonie 8h i zakodowane tam aminokwasy.
Klrn C26d wyizolowano przy użyciu sondy o następującej sekwencji:
5' -CTG TTG TGC CCC GCG GCA GCC- 3'
Na Figurze 3 przedstawiono sekwencję i translację aminokwasów klonu C26d.
Klony C26d i C33c /patrz część A powyżej/ transformowano do szczepu E. coli GM48 /metylowanie -/. Klon C26d trawiono z udziałem EcoRII i DdeI, w wyniku czego otrzymano fragment o 100 parach zasad. Klon C33c trawiono przy udziale EcoRII i RcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 700 parach zasad. Klon C 8h trawiono przy udziale EcoRI i DdeI, w wyniku czego otrzymano fragment o 208 parach zasad. Następnie wszystkie te trzy fragmenty ligowanr do miejsca EcoRI pBR000 i transformowano do E. coli HB101, w wyniku czego otrzymano wektor C300.
/D/ Otrzymywanie klonów o pt/nt7 długości':
Fragment o 600 parach zasad otrzymano z C7f+C20c za pomocą trawienia przy udziale EcoRI i NaeI i ligowano do fragmentu NaeI/EcoRI o 945 parach zasad z C300, po czym
169 273 otrzymaną konstrukcję wprowadzano do miejsca EcoRI pGEM4Z /dostępny w handlu z firmy Promega/, w wyniku czego otrzymano wektor C7fC20cC300.
C7fC20cC300 trawiono przy udziale Ndel i EcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 892 parach zasad, który ligowano z fragmentem o 1160 parach zasad otrzymanym za pomocą trawienia C200 przy udziale Ndel i EcoRI. Utworzoną tak konstrukcję wprowadzono do miejsca EcoRI pBR322, w wyniku czego otrzymano wektor C7fC20cC300C200. Konstrukcja tego wektora objaśniona jest schematycznie na figurze 9.
Przykład IV. Otrzymywanie wektorów ekspresyjnych E. coli /A/ cf1SODp600
Wektor ten zawiera sekwencję kodującą proteazy HCV o pełnej długości sprzężoną z funkcjonalnym liderem hSOD. Wektor C7fC20cC300C200 rozszczepiono przy użyciu EcoRI, w wyniku czego otrzymano fragment o 2000 par zasad, który następnie ligowano do miejsca EcoRI plazmidu cf1 CD /Przykład 2 A/ . Otrzymany tok wektor koduje aminokwasy 1-151 hSOD oraz aminokwasy 946-1630 HCV /numerowanie od początku poliproteiny, odpowiada aminokwasom 1-686 na figurze 1/. Wektor oznakowano przy użyciu cf1SODp600 / niekiedy określanego jako P600/ i transformowano do komórek E. coli D1210. Komórki te, nr rejestracyjny ATCC 6827I, zdeponowano jak to poniżej przedstawiono.
/B/ P190:
Skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/NaeI o 600 parach zasad z C7f+C20c, stępienia fragmentu przy udziale fragmentu Klenowa i ligowania stępionego fragmentu do stępionego fragmentem Klenowa miejsca EcoRI cf1EF /Przykład 2A/. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1 1I1 z hSOD i aminokwasy 1-199 z proteazy HCV.
/C/ P300:
Dłuższy, skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/NdeI o 892 parach zasad z C7fC20cC300, stępienia fragmentu przy udziale fragmentu Klenowa i ligowania stępionego fragmentu do stępionego fragmentem Klenowa miejsca EcoRI cf1EF. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1 - 151 z hSOD i aminokwasy 1 - 299 z proteazy HCV.
/D/ P500:
Dłuższy, skrócony polinukleotyd sprzężony SOD-proteaza wytworzono za pomocą wycięcia fragmentu EcoRI/EcoRI o 1550 parach zasad z C7fC20cC300 i ligowania fragmentu do miejsca EcoRI cf1CD, z utworzeniem Pl00. Polinukleotyd ten koduje białko sprzężone posiadające aminokwasy 1- 151 z hSOD i aminokwasy 946 - 1457 z proteazy HCV / aminokwasy 1 -513 na figurze 1/.
/E/ Sprzężenie FLAG/proteaza
Wektor ten zawiera sekwencję kodującą proteazy HCV o pełnej długości sprężoną z sekwencją FLAG [Hopp i in., Biotechnology, 6,1204 -1210/1988/]. Użyto PCR do wytworzenia genu proteazy HCV o specjalnych końcach restrykcyjnych dla ułatwienia klonowania. Plazmid p500 trawiono przy udziale EcoRI i NdeI. w wyniku czego otrzymano fragment o 900 parach zasad. Fragment ten wraz z dwoma starterami zastosowano w katalizowanej przez polimerazę reakcji łańcuchowej w celu wprowadzenia unikalnego miejsca BgIII przy aminokwasie 1009 i kodonu stop z miejscem SaII przy aminokwasie 1262 HCV-1, jak to przedstawiono na figurze 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990. Sekwencja primerów jest jak następuje:
5' CCC GAG CAA GAT CTC CCG GCC C 3' oraz
5' CCC GGC TGC ATA AGC AGT CGA CTT GGA 3'
Po 30 cyklach PCR, mieszaninę reakcyjną poddano trawieniu z udziałem BgIII i SaII, po czym wyodrębniono fragment o 710 parach zasad. Fragment ten połączono i zligiowano do następującego dupleksu:
MetAspTyrLysAspAspAspAspLysGlyArgGlu
CATGGACTACAAAGACGATGACGATAAAGGCCGGGA
CTGATGTTTCTGCTACTGCTATTTCCGGCCCTCTAG
169 273
Dupleks koduje sekwencję FLAG, metioninę inicjatorową i miejsca restrykcyjne 5'NcoI. Otrzymany tak fragment NcoI/SaII ligowano do pochodnej pCF1.
Konstrukcję tę transformowano następnie do komórek E. coli D1210 i indukowano ekspresję protaazy za pomocą dodania IPTG.
Sekwencję FLAG sprzężono z proteazą HCV w celu ułatwiania oczyszczania. Ca-zależns przeciwciało monoklonalne, które wiąża się z paptydam kodowanym przaz FLAG, stosuje się do oczyszczania białka sprzężonego bez wprowadzania surowych warunków alucji.
Przykład V. Eksprasja w E. coli białak sprzężonych SOD-protaaza.
/A/ Komórki E. coli D1210 transformowano przy użyciu cf1SODp600 i prowadzono ich hodowlę w bulionie Luria zawierającym 100 gg/ml ampicyliny aż do uzyskania OD 0,3 - 0,5. Następnie dodano IPTG do stężenia 2 mM i komórki hodowano do końcowej wartości OD 0,9 - 1,3. Następnie komórki poddano lizia i otrzymany lizat analizowano techniką Western blotting przy użyciu surowic anty-HCV, jak to opisano w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/456637.
Wyniki wykazały zajście rozszczepiania, gdyż na żalu nia uwidocznił się żaden produkt o pełnaj długości /teoretyczna wartość Mr 73 kDa/. Pasma odpowiadająca partnerowi sprzęgania hSOD i osobno protaazia HCV pojawiły się przy wartości względnej masy cząsteczkowej około 34,53 i 66 kDa. Pasmo 34 kDa odpowiada partnerowi hSOD /około 20 kDa/ z częścią domeny NS3, podczas gdy pasma 53 i 66 kDa odpowiadają protaazia HCV o różnych stopniach przetworzenia /przypuszczalnie bakteryjnego/.
/B/ Komórki E. coli D1210 transformowano przy użyciu p500 i prowadzono ich hodowlę w bulionie Luria zawierającym 100 gg/ml ampicyliny aż do uzyskania OD 0,3 - 0,5. Następnie dodano IPTG do stężania 2 mM i komórki hodowano do końcowej wartości OD 0,8 do 1,0. Następnis komórki poddano lizia i lizat analizowano jak wyżej opisano.
Wyniki znów wykazały zajście rozsczapienia, ponieważ na żalu nia uwidocznił się żaden produkt o pałnej długości /teoretyczna wartość Mr 73 kDa/. Pasma odpowiadająca partnerowi sprzęgania hSOD i skróconej proteazia HCV pojawiły się przy wartości masy cząsteczkowej około, odpowiednio, 34 i 45 kDa.
/C/ Komórki E. coli D1210 transformowano wektorami P300 i P190 i hodowlę prowadzono jak powyżej opisano.
Wyniki uzyskane z ekspresji P300 wykazały zajście rozszczepienia, ponieważ na żalu nis uwidocznił się żadan produkt o pełnaj długości /teoretyczna wartość Mr 51 kDa/. Pasmo odpowiadające partnerowi sprzęgania hSOD pojawiło się przy wartości względnej masy cząsteczkowej około 34. Odpowiednie pasmo proteazy HCV nie było widoczne, ponieważ ten region domany NS3 jest rozpoznawany przez surowica użyte do wykrycia produktów. Jednakże, pojawienie się pasma hSOD raczej przy 34 kDa a nie przy 51 kDa wskazuja na zajścia rozszczepienia.
Jedynie produkt ekspresji P190 pojawił się jako produkt o pełnej /zakodowanej/ długości, bez rozecjzapienid, tworząc pasmo przy około 40 kDa, co odpowiada teoretycznej wartości masy cząsteczkowej dla produktu nierozezczepionago. Może to wskazywać na to, że minimum sekwencji istotnej dla proteazy HCV rozciąga się w regionie między aminokwasami 199 i 299.
Przykład VI. Oczyszczanie proteazy po ekspresji przeprowadzonej w E. coli.
Proteazę HCV i fragmenty po aksprasji przaprowadzonej w Przykładzie V można oczyścić w sposób następujący.
Komórki bakteryjne, w których dokonano ekspresji polipeptydu poddano szokowi osomotycznsmu i dezintegracji mechanicznej, po czym frakcję nierozpuszczalną, zawierającą protsazę, wyodrębniono, poddano ekstrakcji rozdzialczej przy użyciu roztworu alkalicznego NaCl i polipeptyd zawarty w ekstrakcie poddano oczyszczaniu metodą chromatograficzną na kolumnach S-Sepharosa® i Q-Sapharose®.
Ekstrakt surowy, otrzymany w wyniku szoku oemotycznego i dezintegracji mechanicznej, przygotowuje się w ten sposób, że zawiesza się 1g zebranych komórek w 10 ml roztworu zawierającego 0,02M Tris HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA i 20% sacharozy, po czym inkubuje się zawiesinę w ciągu 10 minut na lodzie. Następnie komórki osadza się za pomocą odwirowania przy 4000g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Po usunięciu supernatantu, osad komórek
169 273 ponownie zawiesza się w 10 ml buforu A1 /0,01 M Tris HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 14 mMβ-merkaptoetanolu - β ME/ i inkubuje na lodzie w ciągu 10 minut. Komórki ponownie osadza się przy 4000 x g w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C. Po usunięciu klarownego supernatantu /frakcja periplazmatyczna I/, osad komórek ponownie zawiesza się w buforze A1, inkubuje na lodzie w ciągu 10 minut i znów odwirowuje przy 4000 x g, w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C. Usuwa się klarowny supernatant /frakcja periplazmatyczna II/ i osad komórek ponownie zawiesza w 5 ml buforu T2 /0,02 M Tris HCl, pH 7,5, 14 mM β Me, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF/. W celu rozerwania komórek, w rurce Falcona umieszcza się 5 ml zawiesiny i 7,5 ml kulek ze szkła bezołowiowego Dyno-mill, przemytych kwasem, o średnicy 0,10 - 115 mm/ /dostępnych z firmy Glen-Mills, Inc./ i utrzymuje w zawirowaniu, przy najwyższej szybkości, w ciągu 2 minut, po czym oziębia w ciągu co najmniej 2 minut na lodzie. Tę operację zawirowania i oziębiania powtarza się jeszcze 4 razy. Po zawirowaniu, otrzymaną gęstą papkę sączy się przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła, z niewielkim zasysaniem, po czym kulki szklane przemywa się dwukrotnie buforem A2 i łączy się przesącz z przemywkami.
Frakcję nierozpuszczalną ekstraktu surowego zbiera się za pomocą odwirowania przy 20000 x g w ciągu 15 minut, w temperaturze 4°C, przemywa dwukrotnie 10 ml buforu A2 i ponownie zawiesza w 5 ml wody MILLI-Q.
Frakcję zawierającą proteazę HCV wyodrębnia się z materiału nierozpuszczalnego za pomocą dodania do zawiesiny NaOH /2 M/ i NaCl /2 M/, w wyniku czego uzyskuje się dla każdego z nich stężenie końcowe 20 mM, po czym zawirowuje się w ciągu 1 minuty, odwirowuje przy 20000 xg w ciągu 20 minut, przy 4°C i zachowuje się supernatant.
Następnie częściowo oczyszczoną proteazę poddaje się oczyszczaniu za pomocą SDS-PAGE. Proteazę można zidentyfikować techniką Western blotting, apasmo wyciąć z żelu. Następnie proteazę eluuje się z pasma i analizuje w celu potwierdzenia sekwencji aminokwasów. Sekwencje N-końcowe można analizować przy użyciu automatycznego sekwenatora aminokwasów, podczas gdy sekwencje C-końcowe można analizować za pomocą zautomatyzowanego sekwencjonowania aminokwasów serii fragmentów trypsynowych.
Przykład VII. Otrzymywanie wektora ekspresyjnego drożdży /A/ P650 /Sprzężenie SOD/proteaza/.
Wektor ten zawiera sekwencję HCV, która obejmuje sekwencję kodującą proteazę HCV typu dzikiego o pełnej długości, sprzężoną przy końcu 5' z sekwencją kodującą SOD. Do rekonstrukcji sekwencji kodującej proteazę HCV typu dzikiego o pełnej długości użyto dwóch fragmentów, a mianowicie fragmentu EcoRI/BgIII o 441 parach zasad z klonu 11 b oraz fragmentu BgIII/EcoRI o 1471 parach zasad z wektora ekspresyjnego P500. Oba te fragmenty ligowano razem z wektorem pS356 poddanym trawieniu przy udziale EcoRI, w wyniku czego otrzymano kasetę ekspresyjną. Kaseta ekspresyjna koduje hybrydowy drożdżowy promotor ADH2/GAPDH, ludzką SOD, proteazę HCV i terminator transkrypcji GAPDH. Otrzymany wektor poddano trawieniu z udziałem BamHI i wyodrębniono fragment o 4052 parach zasad. Fragment ten ligowano do wektora pAB24 poddanego trawieniu z udziałem BamHI, w wyniku czego otrzymano p650. p650 doprowadza do ekspresji poliproteiny zawierającej, licząc od jej końca aminowego, aminokwasy 1-154 z hSOD, oligopeptyd -Asn-Leu-Gly-Ile-Arg- oraz aminokwasy 819 do 1458 z HCV-1, jak to przedstawiono na figurze 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990.
Klon 11b wyizolowano z genomowej biblioteki cDNA HCV, nr rejestracyjny ATCC 40394, jak to opisano powyżej w Przykładzie 3A, przy użyciu sondy hybrydyzacji o następującej sekwencji:
5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT CAC TCC TCT 3'
Ten sposób postępowania opisany jest także w zgłoszeniu patentowym EPO Pub. nr 318216, Przykład IV. A. 17.
Wektor pS3EF, stanowiący pochodną pBR322 zawiera hybrydowy drożdżowy promotor ADH2/GAPDH w górę od genu ludzkiej dysmutazy ponadtlenkowej, adaptor, oraz w dół drożdżowy skuteczny terminator transkrypcji. Podobny wektor ekspresyjny zawierający te elementy regulujące i gen dysmutazy ponadtlenkowej opisali Cousens i in. Gene, 61265 /1987/. Opisany jest także w równocześnie rozpatrywanym zgłoszeniu patentowym EPO 196056,
169 273 opublikowanym 1 października 1986. Jednakże pS3EF różni się od wektora opisanego przez Cousensa i in. tym, że brak tu heterologicznego genu proinsuliny i fragmentu stykowego immunoglobuliny, a po Gln 154 z SOD następuje sekwencja adapterowa,. która zawiera miejsce ECoRI. Sekwencja adaptora jest następująca:
5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TTA ATT AAG 3'
3' AC CCT TTA GGT ATT AAT TAA TTC AGCT 5'
Miejsce EcoRI ułatwia insercję sekwencji heterologicznych. Po wprowadzeniu do pS3EF, dochodzi do ekspresji sprzężenia SOD, z zawartością oligopeptydu, który wiąże SOD z sekwencjami heterologicznymi. pS3EFjest dokładnie taki sam jak pS356, z tą różnicą, że pS356 zawiera odmienny adapter. Sekwencję adaptora przedstawiono poniżej:
5' AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G 3'
3' AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT 5'· pS356, nr rejestracyjny ATCC 67683, został zdeponowany jak to poniżej przedstawiono.
Plazmid pAB24 jest drożdżowym wektorem wahadłowym, który zawiera sekwencje pBR322, kompletną 2 μ sekwencję dla replikacji DNA w drożdżach [Broach w: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, tom 1, str. 445, Cold Spring Harbor Press /1981/] oraz drożdżowy gen LEU2d pochodzący z plazmidu pC1/1, opisany w EPO Pub. nr 116201. Plazmid pAB24 skonstruowano za pomocą trawienia YEp24 z udziałem EcoRI i religowania wektora w celu usunięcia częściowych 2 μ sekwencji. Otrzymany plazmid, YEp24 ARI, przeprowadzono w postać liniową przy użyciu ClaI i ligowano z kompletnym 2 μ plazmidem, który przeprowadzono w postać liniową przy użyciu ClaI. Następnie otrzymany plazmid, pCBou, poddano trawieniu z udziałem XbaI, po czym wyizolowano na żelu fragment wektora o 8605 parach zasad. Ten wyizolowany fragment XbaI ligowano z fragmentem XbaI o 4460 parach zasad, zawierającym gen LEU2d wyizolowany z pC1/1. Orientacja genu LEU2d jest w tym samym kierunku, co orientacja genu URA3.
S.cerevisiae, 2150-2-3 /pAB24-GAP-env2/, nr rejestracyjny 20827, jest zdeponowany w American Type Culture Collection, jak to poniżej przedstawiono. Plazmid pAB24-GAP-env2 można wyodrębnić z komórek drożdży znanymi metodami. Kasetę ekspresyyną GAP-env2 można wyodrębnić za pomocą trawienia pAB24-GAP-env2 z udziałem BamHI. pAB24 odzyskuje się za pomocą rebgowania wektora bez insertu BamHI.
Przykład VIII. Ekspresja białka sprzężonego SOD-proteaza w drożdżach p650 transformowano w S. cerevisiae szczep JSC310, Mata, leu2, ura3-52, prb1-1122, pep4-3, prcl-407, cir°: DM 15 /oporność g418/. Transformację prowadzono sposobem opisanym przez Hinnena i in. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 /1978/]. Transformowane komórki selekcjonowano na płytkach ura z 8% glukozą. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 4-5 dni. Transformanty dalej seeekcjonowano na płytkach leu z 8% glukozą z domniemywaniem wysokich numerów plazmidu p650. Kolonie z płytek leu inokulowano do podłoża leu z 3% glukozą. Hodowle te wytrząsano w temperaturze 30°C w ciągu 2 dni, po czym rozcieńczano 1/20 do podłoża YEPD z 2% glukozą i dalej wytrząsano w ciągu 2 dni w temperaturze 30°C.
S. cereYicn^e JSC310 zawiera DNA DM15 opisany w zgyoszzniu penen tpwym EPO pub. nr 340986, opublikowanym 8 października 1989. Ten DNA DM15 wzmaga kontrolowaną przez ADH2 ekspresję białek heterologicznych. pDM15, nr rejestracyjny 40453, jest zdeponowany w American Type Culture Cyllectiyn, jak to poniżej przedstawiono.
Przykład IX. Ubikuitynowa ekspresja dojrzałej proteazy HCV w drożdżach
Dojrzałą proteazę HCV wytwarza się za pomocą rozszczepienia wektora C7fC2C)j300C20e przy użyciu EcoRI, w wyniku czego otrzymuje się sekwencję kodującą o 2 kiloparach zasad, i wprowadzenia sekwencji z odpowiednimi łącznikami do wektora ekspresyjnego ubikuityny, tak jak to opisano w WO88/02406, opublikowanym 7 kwietnia 1988, albo w zgłoszeniu patentowym
169 273
Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 7/390599, zgłoszonym 7 sierpnia 1989, które włączone są do niniejszego opisu jako odnośniki. Dojrzałą proteazę HCV odzyskuje się po ekspresji wektora w stosowanych gospodarzach, zwłaszcza w drożdżach. W szczególności, do przeprowadzenia ekspresji wektora ubikuityna/proteaza HCV posłużono się protokołem ekspresji w drożdżach opisanym w Przykładzie VIII.
Przykład X. Otrzymywanie wektora in vitro ekspresji /A/ Wektor pGEM ®-3Z/Zżder żółtej· gorączki **
Cztery fragmenty syntetycznego DNA połączono i ligowano razem w celu utworzenia EcoRI/SacI lider żółtej gorączki, który ligowano do trawionego z udziałem EcoRI/SacI wektora pGEM® -3Z z firmy Promega®. Sekwencje tych czterech fragmentów podane są poniżej:
YFK-1 :
5' AAT TCG TAA ATC CTG TGT GCT AAT TGA GGT GCA TTG GTC TGC AAA TCG AGT TGC TAG GCA ATA AAC ACA TT 3'
YFK-2 :
5' TAT TGC CTA GCA ACT CGA TTT GCA GAC CAA TGC ACC TCA ATT
AGC ACA CAG GAT 1 TTA CG 3'
YFK-3 :
5' TGG ATT AAT TTT AAT CGT TCG TTG AGC GAT TAG CAG AGA
ACT GAC CAG AAC ATG TCT 1 GAG CT 3'
YFK-4 s
5' CAG ACA TGT TCT GGT CAG TTC TCT GCT AAT CGC TCA ACG AAC
GAT TAA AAT TAA TCC AAA TGT GTT 3
W celu in vitro translacji proteazy HCV, nowy wektor pGEM® - 3Z/liderżółtej oorązzki trawiono z udziałem BamHI i stępiono przy użyciu fragmentu Klenowa.
/B/ Konstrukcja Pvn// z p6'000
Skonstruowano klon p600 z sekwencji dostępnych z genomowej bibliotdZ/ wykonanej na cDNA HCV, nr rejestracyjny ATCC 40394. Sekwncja DNA kodująca hCv z p6000jest identyczna z sekwencją nukleotyd -275 - ηι©1(^ν6 7372 z figyry 17 w WO90/11089, opublikowanym 4 października 1990. p6000 trawiono z udziałem pvuII i z produktu trawienia wyodrębniono fragment o 2864 parach zasad. Ten fragment o 2864 parach zasad ligowano do powyżej opisanego fragmentu wektora pGEM® -3Z/lider żółtej gorączki, otrzymanego poprzednio.
Przykład XI. In vitro ekspresja proteazy HCV.
/A/ Transkrypcja. Wektor pGEM -©lider żółtej gorączki/ PvuII przeprowadzono w postać liniową przy użyciu Xbal i transkrybowano z wykorzystaniem materiałów i protokołów z układu Riboprobe® Gemini II Core firmy Promega.
/B/ Translacja. RNA wytworzony według powyższego protokołu poddano translacji z użyciem lizatu retykulocytów króliczych z firmy Promega, bez metioniny, membran m/Zgosomalnych z psiej trzustki, jak równier z wykorzystaniem innych potrzebnych materiałów i instrukcji z firmy Progema.
Zdeponowane materiały biologiczne. Następujące materiały zdeponowano w American Type Culture Collection /ATCC/, 12301 Parklawn Dr., Rojkville, Maryland.
Nazwa Data zdeponowania Nr rejestracyjny
E. coli D1210, cf1SODp600 23 marca 1990 68275
Cf1/5-1-1 w E. coli D1210 1 1 maj7 1987 67967
Biblioteka wykonana na cDNA bakteriofaga λ-gt 11 1 grudmi 1987
E. coli HB101, pS356 29 kwłe-nJa 1988
Plazmidowy DNA, pDM 15 5 maja 1988 40443
S. cdrdvlslad, 2150-2^23 /pAB24-GAP-env2/ 23 grudnia 1986 20827
169 273
Powyższe materiały zostały zdeponowane w ATCC pod wskazanymi numerami rejestracyjnymi. Depozyty te przechowywane są zgodnie z warunkami Układu Budapesztańskiego /International Recognition of The Depossit of Microorganitms for purposes of Patent Procedure/. Depozyty te są dostarczane, jako udogodnienie, fachowcom w tej dziedzinie techniki i nie uważa się, aby depozyt podlegał postanowieniom 35 U. S. C. § 11. Sekwencje polinukleotydów zawarte w zdeponowanych materiałach, jak również sekwencja aminokwasów polipeptydów zakodowana w ten sposób, są włączone do niniejszego opisu jako odnośniki i stanowią sekwencje kontrolne w przypadku konfliktu z sekewencjami opisanymi w niniejszym opisie. Na wytwarzanie, stosowanie i sprzedaż zdeponowanych materiałów może być wymagana licencja i niniejszym dokumentem nie udziela się żadnej tego rodzaju licencjii.
169 273
169 273
1 Gly Thr Tyr Val 5 Tyr Asn
ATT CGG GGC ACC TAT GTT TAT AAC
TAA GCC CCG TGG ATA CAA ATA TTG
His Leu Thr 10 Pro Leu Arg Asp Trp
CAT CTC ACT CCT CTT CGG GAC TGG
GTA GAG TGA GGA GAA GCC CTG ACC
15 20
Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu
GCG CAC AAC GGC TTG CGA GAT CTG
CGC GTG TTG CCG AAC GCT CTA GAC
25 30
Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val
GCC GTG GCT GTA GAG CCA GTC GTC
CGG CAC CGA CAT CTC GGT CAG CAG
Phe Ser Gln Met 35 Glu Thr Lys Leu
TTC TCC CAA ATG GAG ACC AAG CTC
AAG AGG GTT TAC CTC TGG TTC GAG
40 45
Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala
ATC ACG TGG GGG GCA GAT ACC GCC
TAG TGC ACC CCC CGT CTA TGG CGG
Ala Cys Gly 50 Asp Ile Ile Asn Gly
GCG TGC GGT GAC ATC ATC AAC GGC
CGC ACG CCA CTG TAG TAG TTG CCG
55 60
Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly
TTG CCT GTT TCC GCC CGC AGG GGC
AAC GGA CAA AGG CGG GCG TCC CCG
65 70
Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala
CGG GAG ATA CTG CTC GGG CCA GCC
GCC CTC TAT GAC GAG CCC GGT CGG
Asp Gly Met Val 75 Ser Lys Gly Trp
GAT GGA ATG GTC TCC AAG GGT TGG
CTA CCT TAC CAG AGG TTC CCA ACC
80 85
Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala
AGG TTG CTG GCG CCC ATC ACG GCG
TCC AAC GAC CGC GGG TAG TGC CGC
Tyr Ala Gln 90 Gln Thr Arg Gly Leu
TAC GCC CAG CAG ACA AGG GGC CTC
ATG CGG GTC GTC TGT TCC CCG GAG
95 100
Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu
CTA GGG TGC ATA ATC ACC AGC CTA
GAT CCC ACG TAT TAG TGG TCG GAT
105 110
Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val
ACT GGC CGG GAC AAA AAC CAA GTG
TGA CCG GCC CTG TTT TTG GTT CAC
Glu Gly Glu Val 115 Gln Ile Val Ser
GAG GGT GAG GTC CAG ATT GTG TCA
CTC CCA CTC CAG GTC TAA CAC AGT
120 125
Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala
ACT GCT GCC CAA ACC TTC CTG GCA
TGA CGA CGG GTT TGG AAG GAC CGT
Fig
169 273
130 135 140
Thr Cys Ile Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly
ACG TGC ATC ATC AAT GGG GTG TGC TGG ACT GTC TAC CAC GGG GCC GGA
TGC ACG TAG TAG TTA CCC CAC ACG ACC TGA CAG ATG GTG CCC CGG CCT
145 150 155
Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr
ACG AGG ACC ATC GCG TCA CCC AAG GGT CCT GTC ATC CAG ATG TAT ACC
TGC TCC TGG TAG CGC AGT GGG TTC CCA GGA CAG TAG GTC TAC ATA TGG
160 165 170
Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Ser Gln Gly Thr Arg
AAT GTA GAC CAA GAC CTT GTG GGC TGG CCC GCT TCG CAA GGT ACC CGC
TTA CAT CTG GTT CTG GAA CAC CCG ACC GGG CGA AGC GTT CCA TGG GCG
175 180 185 190
Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr
TCA TTG ACA CCC TGC ACT TGC GGC TCC TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG
AGT AAC TGT GGG ACG TGA ACG CCG AGG AGC CTG GAA ATG GAC CAG TGC
195 200 205
Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly
AGG CAC GCC GAT GTC ATT CCC GTG CGC CGG CGG GGT GAT AGC AGG GGC
TCC GTG CGG CTA CAG TAA GGG CAC GCG GCC GCC CCA CTA TCG TCC CCG
ΐ
Nael
210 215 220
Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly
AGC CTG CTG TCG CCC CGG CCC ATT TCC TAC TTG AAA GGC TCC TCG GGG
TCG GAC GAC AGC GGG GCC GGG TAA AGG ATG AAC TTT CCG AGG AGC CCC
225 230 235
Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala
GGT CCG CTG TTG TGC CCC GCG GGG CAC GCC GTG GGC ATA TTT AGG GCC
CCA GGC GAC AAC ACG GGG CGC CCC GTG CGG CAC CCG TAT AAA TCC CGG
240 245 250
Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val
GCG GTG TGC ACC CGT GGA GTG GCT AAG GCG GTG GAC TTT ATC CCT GTG
CGC CAC ACG TGG GCA CCT CAC CGA TTC CGC CAC CTG AAA TAG GGA CAC
Fig (cigg dalszy)
169 273
255
Glu Asn GAG AAC CTC TTG
Leu Glu CTA GAG GAT CTC
260 Thr Thr ACA ACC TGT TGG
Met Arg ATG AGG TAC TCC
Ser Pro TCC CCG AGG GGC
265
Val Phe GTG TTC CAC AAG
Thr Asp ACG GAT TGC CTA
270 Asn Ser AAC TCC TTG AGG
Ser Pro TCT CCA AGA GGT
Pro Val CCA GTA GGT CAT
275
Val Pro GTG CCC CAC GGG
Gin Ser CAG AGC GTC TCG
280 Phe Gin TTC CAG AAG GTC
Val Ala GTG GCT CAC CGA
His Leu CAC CTC GTG GAG
285
His Ala CAT GCT GTA CGA
Pro Thr CCC ACA GGG TGT
290 Gly Ser GGC AGC CCG TCG
Gly Lys GGC AAA CCG TTT
Ser Thr AGC ACC TCG TGG
295
Lys Val AAG GTC TTC CAG
Pro Ala CCG GCT GGC CGA
Gin Gly CAG GGC GTC CCG i
305
Tyr Lys TAT AAG ATA TTC
Val Leu GTG CTA CAC GAT
310 Val Leu GTA CTC CAT GAG
Asn Pro AAC CCC TTG GGG
Ser Val TCT GTT AGA CAA
300 Ala Tyr GCA TAT CGT ATA i
Ndel
315
Ala Ala GCT GCA CGA CGT
Ala Ala GCA GCT CGT CGA
Thr Leu ACA CTG TGT GAC
320 Gly Phe GGC TTT CCG AAA
Gly Ala GGT GCT CCA CGA
Tyr Met TAC ATG ATG TAC
325
Ser Lys TCC AAG AGG TTC
Ala His GCT CAT CGA GTA
330 Gly Ile GGG ATC CCC TAG
Asp Pro GAT CCT CTA GGA
Asn Ile AAC ATC TTG TAG
335
Arg Thr AGG ACC TCC TGG
Gly Val GGG GTG CCC CAC
340 Arg Thr AGA ACA TCT TGT
Ile Thr ATT ACC TAA TGG
Thr Gly ACT GGC TGA CCG
345
Ser Pro AGC CCC TCG GGG
Ile Thr ATC ACG TAG TGC
350 Tyr Ser TAC TCC ATG AGG
Thr Tyr ACC TAC TGG ATG
Gly Lys GGC AAG CCG TTC
355
Phe Leu TTC CTT AAG GAA
Ala Asp GCC GAC CGG CTG
360 Gly Gly GGC GGG CCG CCC
Cys Ser TGC TCG ACG AGC
Gly Gly GGG GGC CCC CCG
365
Ala Tyr GCT TAT CGA ATA
Asp Ile GAC ATA CTG TAT
370 Ile Ile ATA ATT TAT TAA
Cys Asp TGT GAC ACA CTG
Glu Cys GAG TGC CTC ACG
375
His Ser CAC TCC GTG AGG
Thr Asp ACG GAT TGC CTA
380 Ala Thr GCC ACA CGG TGT
Ser Ile TCC ATC AGG TAG
Fig (ciąg dalszy)
169 273
385 390 395
Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg
TTG GGC ATT GGC ACT GTC CTT GAC CAA GCA GAG ACT GCG GGG GCG AGA
AAC CCG TAA CCG TGA CAG GAA CTG GTT CGT CTC TGA CGC CCC CGC TCT
400 405 410
Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro
CTG GTT GTG CTC GCC ACC GCC ACC CCT CCG GGC TCC GTC ACT GTG CCC
GAC CAA CAC GAG CGG TGG CGG TGG GGA GGC CCG AGG CAG TGA CAC GGG
415 420 425 430
His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro
CAT CCC AAC ATC GAG GAG GTT GCT CTG TCC ACC ACC GGA GAG ATC CCT
GTA GGG TTG TAG CTC CTC CAA CGA GAC AGG TGG TGG CCT CTC TAG GGA
435 440 445
Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His
TTT TAC GGC AAG GCT ATC CCC CTC GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT
AAA ATG CCG TTC CGA TAG GGG GAG CTT CAT TAG TTC CCC CCC TCT GTA
450 455 460
Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys
CTC ATC TTC TGT CAT TCA AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC GCC GCA AAG
GAG TAG AAG ACA GTA AGT TTC TTC TTC ACG CTG CTT GAG CGG CGT TTC
465 470 475
Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp
CTG GTC GCA TTG GGC ATC AAT GCC GTG GCC TAC TAC CGC GGT CTT GAC
GAC CAG CGT AAC CCG TAG TTA CGG CAC CGG ATG ATG GCG CCA GAA CTG
480 485 490
Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp
GTG TCC GTC ATC CCG ACC AGC GGC GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT
CAC AGG CAG TAG GGC TGG TCG CCG CTA CAA CAG CAG CAC CGT TGG CTA
Fig. 1 (ciąg dalszy)
169 273
495 500
Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly
GCC CTC ATG ACC GGC TAT ACC GGC
CGG GAG TAC TGG CCG ATA TGG CCG
505 510
Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys
GAC TTC GAC TCG GTG ATA GAC TGC
CTG AAG CTG AGC CAC TAT CTG ACG
Asn Thr Cys Val 515 Thr Gin Thr Val
AAT ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC
TTA TGC ACA CAG TGG GTC TGT CAG
520 525
Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe
GAT TTC AGC CTT GAC CCT ACC TTC
CTA AAG TCG GAA CTG GGA TGG AAG
Thr Ile Glu 530 Thr Ile Thr Leu Pro
ACC ATT GAG ACA ATC ACG CTC CCC
TGG TAA CTC TGT TAG TGC GAG GGG
535 540
Gin Asp Ala Val Ser Arg Thr Gin
CAA GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA
GTT CTA CGA CAG AGG GCG TGA GTT
545 550
Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly
CGT CGG GGC AGG ACT GGC AGG GGG
GCA GCC CCG TCC TGA CCG TCC CCC
Lys Pro Gly Ile 555 Tyr Arg Phe Val
AAG CCA GGC ATC TAC AGA TTT GTG
TTC GGT CCG TAG ATG TCT AAA CAC
560 565
Ala Pro Gly Glu Arg Pro Pro Gly
GCA CCG GGG GAG CGC CCT CCC GGC
CGT GGC CCC CTC GCG GGA GGG CCG
Met Phe Asp 570 Ser Ser Val Leu Cys
ATG TTC GAC TCG TCC GTC CTC TGT
TAC AAG CTG AGC AGG CAG GAG ACA
575 580
Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala
GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT
CTC ACG ATA CTG CGT CCG ACA CGA
535 590
Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu
TGG TAT GAG CTC ACG CCC GCC GAG
ACC ATA CTC GAG TGC GGG CGG CTC
Thr Thr Val Arg 595 Leu Arg Ala Tyr
ACT ACA GTT AGG CTA CGA GCG TAC
TGA TGT CAA TCC GAT GCT CGC ATG
600 605
Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val
ATG AAC ACC CCG GGG CTT CCC GTG
TAC TTG TGG GGC CCC GAA GGG CAC
Fig.- 1 (ciąg dalszy)
169 273
Cys Gin Asp 610 His Leu Glu Phe Trp
TGC CAG GAC CAT CTT GAA TTT TGG
ACG GTC CTG GTA GAA CTT AAA ACC
615 620
Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr
GAG GGC GTC TTT ACA GGC CTC ACT
CTC CCG CAG AAA TGT CCG GAG TGA
625 630
His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser
CAT ATA GAT GCC CAC TTT CTA TCC
GTA TAT CTA CGG GTG AAA GAT AGG
Gin Thr Lys Gin 635 Ser Gly Glu Asn
CAG ACA AAG CAG AGT GGG GAG AAC
GTC TGT TTC GTC TCA CCC CTC TTG
640 645
Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gin
CTT CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA
GAA GGA ATG GAC CAT CGC ATG GTT
Ala Thr Val 650 Cys Ala Arg Ala Gin
GCC ACC GTC TGC GCT AGG GCT CAA
CGG TGG CAC ACG CGA TCC CGA GTT
655 660
Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gin
GCC CCT CCC CCA TCG TGG GAC CAG
CGG GGA GGG GGT AGC ACC CTG GTC
665 670
Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu
ATG TGG AAG TGT TTG ATT CGC CTC
TAC ACC TTC ACA AAC TAA GCG GAG
Lys Pro Thr Leu 675 His Gly Pro Thr
AAG CCC ACC CTC CAT GGG CCA ACA
TTC GGG TGG GAG GTA CCC GGT TGT
680 685
Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala
CCC CTG CTA TAC AGA CTG GGC GCT
GGG GAC GAT ATG TCT GAC CCG CGA
(ciąg dalszy)
169 273
C20c:
Asn Ser Glu Asn Gln
AAT TCG GAA AAC CAA
TTA AGC CTT TTG GTT
Val Glu Gly Glu Val Gln GTG GAG GGT GAG GTC CAG CAC CTC CCA CTC CAG GTC
EcoRI
Ala Gln Thr Phe Leu
GCC CAA ACC TTC CTG
CGG GTT TGG AAG GAC
Tyr His Gly Ala Gly
TAC CAC GGG GCC GGA
ATG GTG CCC CGG CCT
Ile Gln Met Tyr Thr
ATC CAG ATG TAT ACC
TAG GTC TAC ATA TGG
Ser Gln Gly Thr Arg
TCG CAA GGT ACC CGC
AGC GTT CCA TGG GCG
Leu Tyr Leu Val Thr
CTT TAC CTG GTC ACG
GAA ATG GAC CAG TGC
Gly Asp Ser Arg Gly
GGT GAT AGC AGG GGC
CCA CTA TCG TCC CCG
Lys Gly Ser Ser Gly
AAA GGC TCC TCG GGG
TTT CCG AGG AGC CCC
Ala Thr Cys Ile Asn Gly
GCA ACG TGC ATC AAT GGG
CGT TGC ACG TAG TTA CCC
T
SfaNI
Thr Arg Thr Ile Ala Ser
ACG AGG ACC ATC GCG TCA
TGC TCC TGG TAG CGC AGT
Asn Val Asp Gln Asp Leu
AAT GTA GAC CAA GAC CTT
TTA CAT CTG GTT CTG GAA
Ser Leu Thr Pro Cys Thr
TCA TTG ACA CCC TGC ACT
AGT AAC TGT GGG ACG TGA
Arg His Ala Asp Val Ile
AGG CAC GCC GAT GTC ATT
TCC GTG CGG CTA CAG TAA
Ser Leu Val Ser Pro Arg
AGC CTC GTG TCG CCC CGG
TCG GAG CAC AGC GGG GCC
Gly Pro Leu Pro Asn
GGT CCG CTG CCG AAT TC
CCA GGC GAC GGC TTA AG
T
EcoRI
NaeI
Pro Ile Ser Tyr Leu CCC ATT TCC TAC TTG GGG TAA AGG ATG AAC
Ile Val Ser Thr Ala
ATT GTG TCA ACT GCT
TAA CAC AGT TGA CGA
Val Cys Trp Thr Val
GTG TGC TGG ACT GTC
CAC ACG ACC TGA CAG
Pro Lys Gly Pro Val
CCC AAG GGT CCT GTC
GGG TTC CCA GGA CAG
Val Gly Trp Pro Ala
GTG GGC TGG CCC GCT
CAC CCG ACC GGG CGA
Cys Gly Ser Ser Asp
TGC GGC TCC TCG GAC
ACG CCG AGG AGC CTG
Pro Val Arg Arg Arg
:cc GTG CGC CGG CGG
GGG CAC GCG GCC GCC
Fig
169 273
C26d:
Glu Phe Gly Gly Leu Leu Leu Cys Pro Ala Ala Ala Val Gly Ile Phe
GAA TTC GGG GGC CTG CTG TTG TGC CCC GCG GCA GCC GTG GGC ATA TTT
CTT AAG CCC CCG GAC GAC AAC ACG GGG CGC CGT CGG CAC CCG TAT AAA
ΐ
EcoRI
Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile
AGG GCC GCG GTG TGC ACC CGT GGA GTG GCT AAG GCG GTG GAC TTT ATC
TCC CGG CGC CAC ACG TGG GCA CCT CAC CGA TTC CGC CAC CTG AAA TAG
DdeI
Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp CCT GTG GAG AAC CTA GAG ACA ACC ATG AGG TCC CCG GTG TTC ACG GAT GGA CAC CTC TTG GAT CTC TGT TGG TAC TCC AGG GGC CAC AAG TGC CTA
Asn Ser Ser Pro Pro Val Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu
.AAC TCC TCT CCA CCA GTA GTG CCC CAG AGC TTC CAG GTG GCT CAC CTC
TTG AGG AGA GGT GGT CAT CAC GGG GTC TCG AAG GTC CAC CGA GTG GAG
ί
EcoRII
His Ala Pro Arg Ile CAT GCT CCC CGA ATT C GTA CGA GGG GCT TAA G t
EcoRI
Fig
169 273
C8h:
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala
CCC TGC ACT TGC GGC TCC TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC GCC
GGG ACG TGA ACG CCG AGG AGC CTG GAA ATG GAC CAG TGC TCC GTG CGG
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu
GAT GTC ATT CCC GTG CGC CGG CGG GGT GAT AGC AGG GGC AGC CTG CTG
CTA CAG TAA GGG CAC GCG GCC GCC CCA CTA TCG TCC CCG TCG GAC GAC
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys 3ly Ser Ser Gly Gly Pro Leu
TCG CCC CGG CCC ATT TCC TAC TTG AAA GGC TCC TCG GGG GGT CCG CTG
AGC GGG GCC GGG TAA AGG ATG AAC TTT CCG AGG AGC CCC CCA GGC GAC
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys
TTG TGC CCC GCG GGG CAC GCC GTG GGC ATA TTT AGG GCC GCG GTG TGC
AAC ACG GGG CGC CCC GTG CGG CAC CCG TAT AAA TCC CGG CGC CAC ACG
Thr Arg Gly Val Ala Lys Aid Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu
ACC CGT GGA GTG GCT AAG GCG GTG GAC TTT ATC CCT GTG GAG AAC CTA
TGG GCA CCT CAC CGA TTC CGC CAC CTG AAA TAG GGA CAC CTC TTG GAT
Ddel
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser
GAG ACA ACC ATG AGG TCC CCG GTG TTC ACG GAT AAC TCC TC
CTC TGT TGG TAC TCC AGG GGC CAC AAG TGC CTA TTG AGG AG
Fig
169 273
C7f:
Ile Arg Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp
ATT CGG GGC ACC TAT GTT TAT AAC CAT CTC ACT CCT CTT CGG GAC TGG
TAA GCC CCG TGG ATA CAA ATA TTG GTA GAG TGA GGA GAA GCC CTG ACC
EcoRI
Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val
GCG CAC AAC GGC TTG CGA GAT CTG GCC GTG GCT GTA GAG CCA GTC GTC
CGC GTG TTG CCG AAC GCT CTA GAC CGG CAC CGA CAT CTC GGT CAG CAG
Phe Ser Gln Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala
TTC TCC CAA ATG GAG ACC AAG CTC ATC ACG TGG GGG GCA GAT ACC GCC
AAG AGG GTT TAC CTC TGG TTC GAG TAG TGC ACC CCC CGT CTA TGG CGG
Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly
GCG TGC GGT GAC ATC ATC AAC GGC TTG CCT GTT TCC GCC CGC AGG GGC
CGC ACG CCA CTG TAG TAG TTG CCG AAC GGA CAA AGG CGG GCG TCC CCG
Arg Glu Ile / Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp
CGG GAG ATA CTG CTC GGG CCA GCC GAT GGA ATG GTC TCC AAG GGT TGG
GCC CTC TAT GAC GAG CCC GGT CGG CTA CCT TAC CAG AGG TTC CCA ACC
Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu
AGG TTG CTG GCG CCC ATC ACG GCG TAC GCC CAG CAG ACA AGG GGC CTC
TCC AAC GAC CGC GGG TAG TGC CGC ATG CGG GTC GTC TGT TCC CCG GAG
Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val
CTA GGG TGC ATA ATC ACC AGC CTA ACT GGC CGG GAC AAA AAC CAA GTG
GAT CCC ACG TAT TAG TGG TCG GAT TGA CCG GCC CTG TTT TTG GTT CAC
Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala
GAG GGT GAG GTC CAG ATT GTG TCA ACT GCT GCC CAA ACC TTC CTG GCA
CTC CCA CTC CAG GTC TAA CAC AGT TGA CGA CGG GTT TGG AAG GAC CGT
Thr Cys Ile Asn Gly Val Cys Trp Pro Asn
ACG TGC ATC AAT GGG GTG TGC TGG CCG AAT TC
TGC ACG TAG TTA CCC CAC ACG ACC GGC TTA AG
t T
SfaNI EcoRI
Fig
169 273
C31:
Glu Phe Gly Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala
GAA TTC GGG TCC GTC ATC CCG ACC AGC GGC GAT GTT GTC GTC GTC GCA
CTT AAG CCC AGG CAG TAG GGC TGG TCG CCG CTA CAA CAG CAG CAG CGT
1 EcoRI
Thr Asp Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile
ACC GAT GCC CTC ATG ACC GGC TAT ACC GGC GAC TTC GAC TCG GTG ATA
TGG CTA CGG GAG TAC TGG CCG ATA TGG CCG CTG AAG CTG AGC CAC TAT
1 Hinfl
Asp Cys Asn Thr Cys Val Thr Gin Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro
GAC TGC AAT ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAT TTC AGC CTT GAC CCT
CTG ACG TTA TGC ACA CAG TGG GTC TGT CAG CTA AAG TCG GAA CTG GGA
Thr Phe Thr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gin Asp Ala Val Ser Arg
ACC TTC ACC ATT GAG ACA ATC ACG CTC CCC CAA GAT GCT GTC TCC CGC
TGG AAG TGG TAA CTC TGT TAG TGC GAG GGG GTT CTA CGA CAG AGG GCG
Thr Gin Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg
ACT CAA CGT CGG GGC AGG ACT GGC AGG GGG AAG CCA GGC ATC TAC AGA
TGA GTT GCA GCC CCG TCC TGA CCG TCC CCC TTC GGT CCG TAG ATG TCT
Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val
TTT GTG GCA CCG GGG GAG CGC CCC TCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC GTC
AAA CAC CGT GGC CCC CTC GCG GGG AGG CCG TAC AAG CTG AGC AGG CAG
BglI ΐ
Hinf I
Leu Cys Glu Cys Pro Asn CTC TGT GAG TGC CCG AAT TC GAG ACA CTC ACG GGC TTA AG
T
EcoRI
Fig
169 273
C35 :
Ile Arg Ser Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gin Asp Ala Val Ser Arg
ATT CGG TCC ATT GAG ACA ATC ACG CTC CCC CAG GAT GCT GTC TCC CGC
TAA GCC AGG TAA CTC TGT TAG TGC GAG GGG GTC CTA CGA CAG AGG GCG
EcoRI
Thr Gln Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg
ACT CAA CGT CGG GGC AGG ACT GGC AGG GGG AAG CCA GGC ATC TAC AGA
TGA GTT GCA GCC CCG TCC TGA CCG TCC CCC TTC GGT CCG TAG ATG TCT
Phe Val Ala Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val
TTT GTG GCA CCG GGG GAG CGC CCC TCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC GTC
AAA CAC CGT GGC CCC CTC GCG GGG AGG CCG TAC AAG CTG AGC AGG CAG
T
BglI
Leu Cys Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro
CTC TGT GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT TGG TAT GAG CTC ACG CCC
GAG ACA CTC ACG ATA CTG CGT CCG ACA CGA ACC ATA CTC GAG TGC GGG
Ala Glu Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu
GCC GAG ACT ACA GTT AGG CTA CGA GCG TAC ATG AAC ACC CCG GGG CTT
CGG CTC :ga TGT CAA TCC GAT GCT CGC ATG TAC TTG TGG GGC CCC GAA
Pro Val Cys Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly
CCC GTG TGC CAG GAC CAT CTT GAA TTT TGG GAG GGC GTC TTT ACA GGC
GGG CAC ACG GTC CTG GTA GAA CTT AAA ACC CTC CCG CAG AAA TGT CCG
Leu Thr His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ser Gly
CTC ACT CAT ATA GAT GCC CAC TTT CTA TCC CAG ACA AAG CAG AGT GGG
GAG TGA GTA TAT CTA CGG GTG AAA. GAT AGG GTC TGT TTC GTC TCA CCC
Glu Asn Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg
GAG AAC CTT CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA GCC ACC GTG TGC GCT AGG
GTC TTG GAA GGA ATG GAC CAT CGC ATG GTT CGG TGG CAC ACG CGA TCC
Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile
GCT CAA GCC CCT CCC CCA TCG TGG GAC CAG ATG TGG AAG TGT TTG ATT
CGA GTT CGG GGA GGG GGT AGC ACC CTG GTC TAC ACC TTC ACA AAC TAA
Arg Leu Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu
CGC CTC AAG CCC ACC CTC CAT GGG CCA ACA CCC CTG CTA TAC AGA CTG
GCG GAG TTC GGG TGG GAG GTA CCC GGT TGT GGG GAC GAT ATG TCT GAC
Gly Ala Ala Glu Phe GGC GCT GCC GAA TTC CCG CGA CGG CTT AAG
T
EcoRI
Fig
169 273
C33c
Glu Phe Gly Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr Thr
GAA TTC GGG GCG GTG GAC TTT ATC CCT GTG GAG AAC CTA GAG ACA ACC
CTT AAG CCC CGC CAC CTG AAA TAG GGA CAC CTC TTG GAT CTC TGT TGG
EcoRI
Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro Val Val Pro
ATG AGG TCC CCG GTG TTC ACG GAT AAC TCC TCT CCA CCA GTA GTG CCC
TAC TCC AGG GGC CAC AAG TGC CTA TTG AGG AGA GGT GGT CAT CAC GGG
Gin Ser Phe Gin Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly Ser Gly Lys
CAG AGC TTC CAG GTG GCT CAC CTC CAT GCT CCC ACA GGC AGC GGC AAA
GTC TCG AAG GTC CAC CGA GTG GAG GTA CGA GGG TGT CCG TCG CCG TTT
Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gin Gly Tyr Lys Val Leu
AGC ACC AAG GTC CCG GCT GCA TAT GCA GCT CAG GGC TAT AAG GTG CTA
TCG TGG TTC CAG GGC CGA CGT ATA CGT CGA GTC CCG ATA TTC CAC GAT
Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly Ala Tyr Met
GTA CTC AAC CCC TCT GTT GCT GCA ACA CTG GGC TTT GGT GCT TAC ATG
CAT GAG TTG GGG AGA CAA CGA CGT TGT GAC CCG AAA CCA CGA ATG TAC
Ser Lys Ala His Gly Ile Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly Val Arg Thr
TCC AAG GCT CAT GGG ATC GAT CCT AAC ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA
AGG TTC CGA GTA CCC TAG CTA GGA TTG TAG TCC TGG CCC CAC TCT TGT
Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu
ATT ACC ACT GGC AGC CCC ATC ACG TAC TCC ACC TAC GGC AAG TTC CTT
TAA IGG TGA CCG TCG GGG TAG TGC ATG AGG TGG ATG CCG TTC AAG GAA
Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile Ile Cys Asp
GCC GAC GGC GGG TGC TCG GGG GGC GCT TAT GAC ATA ATA ATT TGT GAC
CGG CTG CCG CCC .ACG AGC CCC CCG CGA ATA CTG TAT TAT TAA ACA CTG
Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile Gly Thr Val
GAG TGC CAC TCC ACG GAT GCC ACA TCC ATC TTG GGC ATT GGC ACT GTC
CTC ACG GTG AGG TGC CTA CGG TGT AGG TAG AAC CCG TAA CCG TGA CAG
Fig
169 273
Leu Asp Gln Ala Glu Thr CTT GAC CAA GCA GAG ACT GAA CTG GTT CGT CTC TGA
Ala Gly Ala Arg Leu Val Val GCG C-GG GCG AGA CTG GTT GTG CGC CCC CGC TCT GAC CAA CAC
Leu Ala Thr CTC GCC ACC GAG CGG TGG
Ala Thr Pro Pro Gly Ser GCC ACC CCT CCG GGC TCC CGG TGG GGA GGC CCG AGG
Val Thr Val Pro His Pro Asn GTC ACT GTG CCC CAT CCC AAC CAG TGA CAC GGG GTA GGG TTG
Ile Glu Glu ATC GAG GAG TAG CTC CTC
Val Ala Leu Ser Thr Thr GTT GCT CTG TCC ACC ACC CAA CGA GAC AGG TGG TGG
Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly GGA GAG ATC CCT TTT TAC GGC CCT CTC TAG GGA AAA ATG CCG
Lys Ala Ile AAG GCT ATC TTC CGA TAG
Pro Leu CCC CTC GGG GAG
Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT CTT CAT TAG TTC CCC CCC TCT GTA
Leu Ile Phe CTC ATC TTC GAG TAG AAG
Cys His Ser TGT CAT TCA ACA GTA AGT
Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC GCC GCA AAG CTG GTC GCA TTC TTC TTC ACG CTG CTT GAG CGG CGT TTC GAC CAG CGT
Leu Gly Ile TTG GGC / ATC AAC CCG TAG
Asn Ala AAT GCC TTA CGG
Val Ala Tyr Tyr GTG GCC TAC TAC CAC CGG ATG ATG
Arg Gly Leu Asp Val Ser Val CGC GGT CTT GAC GTG TCC GTC GCG CCA GAA CTG CAC AGG CAG
Ile Pro Thr ATC CCG ACC TAG GGC TGG
Ser Gly AGC GGC TCG CCG
Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT GCC CTC ATG CTA CAA CAG CAG CAC CGT TGG CTA CGG GAG TAC
Thr Gly Tyr ACC GGC TAT TGG CCG ATA
Thr Gly ACC GGC TGG CCG
Asp Phe Asp Ser Val GAC TTC GAC TCG GTG CTG AAG CTG AGC CAC
Ile Asp Cys ATA GAC TGC TAT CTG ACG
Asn Thr Cys AAT ACG TGT TTA TGC ACA
T
Hinfl
Ala Glu Phe GCC GAA TTC CGG CTT AAG ί
EcoRI
Fig.
(ciąg dalszy)
169 273
Hinfl
I — C35
C31
C33c
C200
S/αΝΙ
I
C7f ------------------------ C20c
C7f+C20c
C8h
Ddel i £c<?RII
C26d ---------
C33c ------------------ -------C300
Fig. 9
169 273
C7f+C20c
C7fC20cC300
NaeI
I
--------- C300
Ndel i
| C200
C7fC20cC300C200
Fig- 9 (ciąg dalszy)
169 273
-155 Met Ala ATG GCT TAC CGA
-150
Thr Asn Pro Val cys Val Leu ACA AAC CCT GTT TGC GTT TTG TGT TTG GGA CAA ACG CAA AAC
145 -140 -135
Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu
AAG GGT GAC GGC CCA GTT CAA GGT ATT ATT AAC TTC GAG CAG AAG GAA
TTC CCA CTG CCG GGT CAA GTT CCA TAA TAA TTG AAG CTC GTC TTC CTT
-130 -125 -120 -115
Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu
AGT AAT GGA CCA GTG AAG GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA
TCA TTA CCT GGT CAC TTC CAC ACC CCT TCG TAA TTT CCT GAC TGA CTT
-110 -105 -100
Gly Leu His Gly Phe His Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly
GGC CTG C.- ' GGA TTC CAT GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC
CCG GAC GTA CCT AAG GTA CAA GTA CTC AAA CCT CTA TTA TGT CGT CCG
-95 -90 -85
Cys Thr Ser Pro Gly Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly
TGT ACC AGT CCA GGT CCT CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT
ACA TGG TCA GGT CCA GGA GTG AAA TTA GGA GAT AGG TCT TTT GTG CCA
-80 -75 -70
Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr
GGG CCA AAG GAT GAA GAG AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT
CCC GGT TTC CTA CTT CTC TCC GTA CAA CCT CTG AAC CCG TTA CAC TGA
-65 -60 -55
Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile
GCT GAC AAA GAT GGT GTG GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC
CGA CTG TTT CTA CCA CAC CGG CTA CAC AGA TAA CTT CTA AGA CAC TAG
-50 -45 -40 -35
Ser Leu Ser Gly Asp His Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His
TCA CTC TCA GGA GAC CAT TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT
AGT GAG AGT CCT CTG GTA ACG TAG TAA CCG GCG TGT GAC CAC CAG GTA
-30 -25 -20
Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys
GAA AAA GCA GAT GAC TTG GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG
CTT TTT CGT CTA CTG AAC CCG TTT CCA CCT TTA CTT CTT TCA TGT TTC
-15 -10 -5
Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Arg
ACA GGA AAC GCT GGA AGT CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC CGA
TGT CCT TTG CGA CCT TCA GCA AAC CGA ACA CCA CAT TAA CCC TAG GCT
Fig
169 273
1 5 10
Arg Ile Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp
ATT CGG GGC ACC TAT GTT TAT AAC CAT CTC ACT CCT CTT CGG GAC TGG
TAA GCC CCG TGG ATA CAA ATA TTG GTA GAG TGA GGA GAA GCC CTG ACC
15 20 25 30
Ala His Asn Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val
GCG CAC AAC GGC TTG CGA GAT CTG GCC GTG GCT GTA GAG CCA GTC GTC
CGC GTG TTG CCG AAC GCT CTA GAC CGG CAC CGA CAT CTC GGT CAG CAG
35 40 45
Phe Ser Gln Met Glu Thr Lys Leu Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala
TTC TCC CAA ATG GAG ACC AAG CTC ATC ACG TGG GGG GCA GAT ACC GCC
AAG AGG GTT TAC CTC TGG TTC GAG TAG TGC ACC CCC CGT CTA TGG CGG
50 5 5 60
Ala Cys Gly Asp Ile Ile Asn Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly
GCG TGC GGT GAC ATC ATC AAC GGC TTG CCT GTT TCC GCC CGC AGG GGC
CGC ACG CCA CTG TAG TAG TTG CCG AAC GGA CAA AGG CGG GCG TCC CCG
/
65 70 75
Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys Gly Trp
CGG GAG ATA CTG CTC GGG CCA GCC GAT GGA ATG GTC TCC AAG GGT TGG
GCC CTC TAT GAC GAG CCC GGT CGG CTA CCT TAC CAG AGG TTC CCA ACC
80 85 90
Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Leu
AGG TTG CTG GCG CCC ATC ACG GCG TAC GCC CAG CAG ACA AGG GGC CTC
TCC AAC GAC CGC GGG TAG TGC CGC ATG CGG GTC GTC TGT TCC CCG GAG
95 100 105 110
Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val
CTA GGG TGC ATA ATC ACC AGC CTA ACT GGC CGG GAC AAA AAC CAA GTG
GAT CCC ACG TAT TAG TGG TCG GAT TGA CCG GCC CTG TTT TTG GTT CAC
115 120 125
Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Ala Gln Thr Phe Leu Ala
GAG GGT GAG GTC CAG ATT GTG TCA ACT GCT GCC CAA ACC TTC CTG GCA
CTC CCA CTC CAG GTC TAA CAC AGT TGA CGA CGG GTT TGG AAG GAC CGT
Fig .
(cigg dalszy)
169 273
130 135 140
Thr Cys Ile Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly
ACG TGC ATC ATC AAT GGG GTG TGC TGG ACT GTC TAC CAC GGG GCC GGA
TGC ACG TAG TAG TTA CCC CAC ACG ACC TGA CAG ATG GTG CCC CGG CCT
145 150 155
Thr Arg Thr Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr
ACG AGG ACC ATC GCG TCA CCC AAG GGT CCT GTC ATC CAG ATG TAT ACC
TGC TCC TGG TAG CGC AGT GGG TTC CCA GGA CAG TAG GTC TAC ATA TGG
160 165 170
Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Ser Gln Gly Thr Arg
AAT GTA GAC CAA GAC CTT GTG GGC TGG CCC GCT TCG CAA GGT ACC CGC
TTA CAT CTG GTT CTG GAA CAC CCG ACC GGG CGA AGC GTT CCA TGG GCG
175 180 185 190
Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr
TCA TTG ACA CCC TGC ACT TGC GGC TCC TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG
AGT AAC TGT GGG ACG TGA ACG CCG AGG AGC CTG GAA ATG GAC CAG TGC
195 200 205
Arg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly
AGG CAC GCC GAT GTC ATT CCC GTG CGC CGG CGG GGT GAT AGC AGG GGC
TCC GTG CGG CTA CAG TAA GGG CAC GCG GCC GCC CCA CTA TCG TCC CCG
Τ
Nael
210 215 220
Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly
AGC CTG CTG TCG CCC CGG CCC ATT TCC TAC TTG AAA GGC TCC TCG GGG
TCG GAC GAC AGC GGG GCC GGG TAA AGG ATG AAC TTT CCG AGG AGC CCC
225 230 235
Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Ile Phe Arg Ala
GGT CCG CTG TTG TGC CCC GCG GGG CAC GCC GTG GGC ATA TTT AGG GCC
CCA GGC GAC AAC ACG GGG CGC CCC GTG CGG CAC CCG TAT AAA TCC CGG
240 245 250
Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val
GCG GTG TGC ACC CGT GGA GTG GCT AAG GCG GTG GAC TTT ATC CCT GTG
CGC CAC ACG TGG GCA CCT CAC CGA TTC CGC CAC CTG AAA TAG GGA CAC
Fig
O (ciąg dalszy)
169 273
255
Glu Asn GAG AAC CTC TTG
Leu Glu CTA GAG GAT CTC
260 Thr Thr ACA ACC TGT TGG
Met Arg ATG AGG TAC TCC
Ser Pro TCC CCG AGG GGC
265
Val Phe GTG TTC CAC AAG
Thr Asp ACG GAT TGC CTA
270 Asn Ser AAC TCC TTG AGG
Ser Pro TCT CCA AGA GGT
Pro Val CCA GTA GGT CAT
275
Val Pro GTG CCC CAC GGG
Gin Ser CAG AGC GTC TCG
280 Phe Gin TTC CAG AAG GTC
Val Ala GTG GCT CAC CGA
His Leu CAC CTC GTG GAG
285
His Ala CAT GCT GTA CGA
Pro Thr CCC ACA GGG TGT
290 Gly Ser GGC AGC CCG TCG
Gly Lys GGC AAA CCG TTT
Ser Thr AGC ACC TCG TGG
295
Lys Val AAG GTC TTC CAG
Pro Ala CCG GCT GGC CGA
Gin Gly CAG GGC GTC CCG
305
Tyr Lys TAT AAG ATA TTC
Val Leu GTG CTA CAC GAT
310 Val Leu GTA CTC CAT GAG
Asn Pro AAC CCC TTG GGG
Ser Val TCT GTT AGA CAA
300 Ala Tyr GCA TAT CGT ATA
T
Ndel
315
Ala Ala GCT GCA CGA CGT
Ala Ala GCA GCT CGT CGA
Thr Leu ACA CTG TGT GAC
320 Gly Phe GGC TTT CCG AAA
Gly Ala GGT GCT CCA CGA
Tyr Met TAC ATG ATG TAC
325
Ser Lys TCC AAG AGG TTC
Ala His GCT CAT CGA GTA
330 Gly Ile GGG ATC CCC TAG
Asp Pro GAT CCT CTA GGA
Asn Ile AAC ATC TTG TAG
335
Arg Thr AGG ACC TCC TGG
Gly Val GGG GTG CCC CAC
340 Arg Thr AGA ACA TCT TGT
Ile Thr ATT ACC TAA TGG
Thr Gly ACT GGC TGA CCG
345
Ser Pro AGC CCC TCG GGG
Ile Thr ATC ACG TAG TGC
350 Tyr Ser TAC TCC ATG AGG
Thr Tyr ACC TAC TGG ATG
Gly Lys GGC AAG CCG TTC
355
Phe Leu TTC CTT AAG GAA
Ala Asp GCC GAC CGG CTG
360 Gly Gly GGC GGG CCG CCC
Cys Ser TGC TCG ACG AGC
Gly Gly GGG GGC CCC CCG
365
Ala Tyr GCT TAT CGA ATA
Asp Ile GAC ATA CTG TAT
370 Ile Ile ATA ATT TAT TAA
Cys Asp TGT GAC ACA CTG
Glu Cys GAG TGC CTC ACG
375
His Ser CAC TCC GTG AGG
Thr Asp ACG GAT TGC CTA
380 Ala Thr GCC ACA CGG TGT
Ser Ile TCC ATC AGG TAG
Fig (ciąg dalszy)
169 273
385 390 395
Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg
TTG GGC ATT GGC ACT GTC CTT GAC CAA GCA GAG ACT GCG GGG GCG AGA
AAC CCG TAA CC Z- TGA CAG GAA CTG GTT CGT CTG TGA CGC CCC CGC TCT
400 405 410
Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro
CTG GTT GTG CTC GCC ACC GCC ACC CCT CCG GGC TCC GTC ACT GTG CCC
GAC CAA CAC GAG CGG TGG CGG TGG GGA GGC CCG AGG CAG TGA CAC GGG
415 420 425 430
His Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro
CAT CCC AAC ATC GAG GAG GTT GCT CTG TCC ACC ACC GGA GAG ATC CCT
GTA GGG TTG TAG CTC CTC CAA CGA GAC AGG TGG TGG CCT CTC TAG GGA
435 440 445
Phe Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His
TTT TAC GGC AAG GCT ATC CCC CTC GAA GTA ATC AAG GGG GGG AGA CAT
AAA ATG CCG TTC CGA TAG GGG GAG CTT CAT TAG TTC CCC CCC TCT GTA
450 455 460
Leu Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys
CTC ATC TTC TGT CAT TCA AAG AAG AAG TGC GAC GAA CTC GCC GCA AAG
GAG TAG AAG ACA GTA AGT TTC TTC TTC ACG CTG CTT GAG CGG CGT TTC
465 470 475
Leu Val Ala Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp
CTG GTC GCA TTG GGC ATC AAT GCC GTG GCC TAC TAC CGC GGT CTT GAC
GAC CAG CGT AAC CCG TAG TTA CGG CAC CGG ATG ATG GCG CCA GAA CTG
480 485 490
Val Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp
GTG TCC GTC ATC CCG ACC AGC GGC GAT GTT GTC GTC GTG GCA ACC GAT
CAC AGG CAG TAG GGC TGG TCG CCG CTA CAA CAG CAG CAC CGT TGG CTA
Ficj · (ciąg dalszy)
169 273
495 500 505 510
Ala Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys
GCC CTC ATG ACC GGC TAT ACC GGC GAC TTC GAC TCG GTG ATA GAC TGC
CGG GAG TAC TGG CCG ATA TGG CCG CTG AAG CTG AGC CAC TAT CTG ACG
515 520 525
Asn Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe
AAT ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC 2λΤ TTC AGC CTT GAC CCT ACC TTC
TTA TGC ACA CAG TGG GTC TGT CAG CTA AAG TCG GAA CTG GGA TGG AAG
530 535 540
Ihr Ile Glu Thr Ile Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln
ACC ATT GAG ACA ATC ACG CTC CCC CAA GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA
TGG TAA CTC TGT TAG TGC GAG GGG GTT CTA CGA CAG AGG GCG TGA GTT
545 550 555
Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val
CGT CGG GGC AGG ACT GGC AGG GGG AAG CCA GGC ATC TAC AGA TTT GTG
GCA GCC CCG TCC TGA CCG TCC CCC TTC GGT CCG TAG ATG TCT AAA CAC
/
560 565 570
Ala Pro Gly Glu Arg Pro Pro Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys
GCA CCG GGG GAG CGC CCT CCC GGC ATG TTC GAC TCG TCC GTC CTC TGT
CGT GGC CCC CTC GCG GGA GGG CCG TAC AAG CTG AGC AGG CAG GAG ACA
575 580 585 590
Glu Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu
GAG TGC TAT GAC GCA GGC TGT GCT TGG TAT GAG CTC ACG CCC GCC GAG
CTC ACG ATA CTG CGT CCG ACA CGA ACC ATA CTC GAG TGC GGG CGG CTC
595 600 605
Thr Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val
ACT ACA GTT AGG CTA CGA GCG TAC ATG AAC ACC CCG GGG CTT CCC GTG
TGA TGT CAA TCC GAT GCT CGC ATG TAC TTG TGG GGC CCC GAA GGG CAC
Fitg.
(ciąg dalszy)
169 273
610 615 620
Cys Gin Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr
TGC CAG GAC CAT CTT GAA TTT TGG GAG GGC GTC TTT ACA GGC CTC ACT
ACG GTC CTG GTA GAA CTT AAA ACC CTC CCG CAG AAA TGT CCG GAG TGA
625 630 635
His Ile Asp Ala His Phe Leu Ser Gin Thr Lys Gin Ser Gly Glu Asn
CAT ATA GAT GCC CAC TTT CTA TCC CAG ACA AAG CAG AGT GGG GAG AAC
GTA TAT CTA CGG GTG AAA GAT AGG GTC TGT TTC GTC TCA CCC CTC TTG
640 645 650
Leu Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gin Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gin
CTT CCT TAC CTG GTA GCG TAC CAA GCC ACC GTG TGC GCT AGG GCT CAA
GAA GGA ATG GAC CAT CGC ATG GTT CGG TGG CAC ACG CGA TCC CGA GTT
655 660 665 670
Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gin Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu
GCC CCT CCC CCA TCG TGG GAC CAG ATG TGG AAG TGT TTG ATT CGC CTC
CGG GGA GGG GGT AGC ACC CTG GTC TAC ACC TTC ACA AAC TAA GCG GAG
675 680 685
Lys Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala
AAG CCC ACC CTC CAT GGG CCA ACA CCC CTG CTA TAC AGA CTG GGC GCT
TTC GGG TGG GAG GTA CCC GGT TGT GGG GAC GAT ATG TCT GAC CCG CGA
Fig . 10 (ciąg dalszy)
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób badania związków pod względem aktywności skierowanej przeciw wirusowi zapalenia wątroby C, znamienny tym, że dostarcza się aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C, o częściowej wewnętrznej sekwencji aminokwasów wybranej z grupy obejmującej:
    Trp Thr Val Tyr His Gly Ala (Gl^y Thr Arg Tir·- ; t Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu- lub Arg Arg Gly Arg: G lu Ile Leu Leu Gll Pro Ala Asp Gly Met Val Ser Lys GlG TTp Apg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr· Aa: Gly Leu Leu Gly Sys Ile Ile TIpl Ser Leu Thr Gly Arg Arp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Val Gln Ile Val Ser Thr A Au Ala Gln ThP Phh Leu Ala T^ł^r Cys Ile Asn Gly Val Cys TTp Thr Val Tyr HHs Gly Ala Gly Thr Apg Thr Ile Ala Ser· P pp Lys Gly Ppo Val Ile Gln Met Tyr ThP Asn Val Asp Gln Agp •Leu Val Gly Trp Ppo Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Sys Thr Cs· Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arp His Ala Asp Val Ile Pro Val Atrg Apg Arg Gly Asp Ser Arp Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys G Gu Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Pro Ala Gly His Ala V al Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Llt Ala Val Asp Phe Ile Pro VaL Glu Asn Leu Glu Thr Thr Met Arg· -;
    i kontaktuje się tę proteazę ze związkiem mającym zdolność hamowania aktywności proteazy serynowej przy czym związek hamujący aktywność proteazy serynowej naśladuje miejsce odszczepiania rozpoznawane przez proteazę i jest wybierany sposób trójfluorometyloketonów, peptydu kwasu peptydoboronowego, peptydu-a-ketoestru, związków pepty difluoroketonowych, peptydoaldehydów, peptydodiketonów, przeciwciał i pochodnych przeciwciał, a następnie mierzy się stopień hamowania aktywności proteolitycznej proteazy wirusa zapalenia wątroby C.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym , ze jako aktywną proteazę wirnsa wątroby C stoouje się proteaaz obejmującą zasadniczo następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
    ... Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr . . .
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczą następującą częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
    ... Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu ...
    169 273
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywną proteazę wirusa zapalenia wątroby C stosuje się proteazę obejmującą zasadniczo częściową wewnętrzną sekwencję aminokwasów:
    Arg Arg Gly Arr Glu Ile Leu Leu GGl Pro Ala Asp GGl Te e Val Ser Lys G Gy Trp Arg Leu Leu AAl Pro Ile Thr AAl Tts Ala Gln G1g TTh Grg Gly Leu Leu GGl Cys Ile Ile; TTh Tsu Leu Thr GIjt AAr Tsp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Vv1 Gyy Ile Val Ser Thh Ala Ala Gin Thr PPe Leu Ala Thr Cys III Asn Gly Val C ys Trp Thr Val Tyr Hhs Gly Ala Gly Thr Arg Thr Ile Ala S se Pro Lys Gly Pro Val Ile Gin Met Tyr TTr Asn Val Asp GGl Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gl^n Gly Ser Arg Ser Leu GM^ar Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser? Asp Lm Tyr Leu Val TTh Girg His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg AAg Arg Gly Asp S se Arg Gly Ser Leu Leu Ser Pro Arg Ppo Ili! Ser Tyr Leu Lyy Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu Leu Cys Ppo Ala Gly His A Al Tal Gly Ile Phe Arg Ala Ala Val Cyy TPh Arg Gly Val AAl Tys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu Glu Thr TTh Met Arg.
    ★ * *
PL91296328A 1990-04-04 1991-04-04 skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL PL169273B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50543390A 1990-04-04 1990-04-04
PCT/US1991/002210 WO1991015575A1 (en) 1990-04-04 1991-04-04 Hepatitis c virus protease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL169273B1 true PL169273B1 (pl) 1996-06-28

Family

ID=24010295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91296328A PL169273B1 (pl) 1990-04-04 1991-04-04 skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL

Country Status (12)

Country Link
US (7) US5371017A (pl)
EP (2) EP1304335B1 (pl)
JP (3) JP3320411B2 (pl)
AT (2) ATE433460T1 (pl)
AU (1) AU7675491A (pl)
CA (1) CA2079105C (pl)
DE (2) DE69133617D1 (pl)
DK (1) DK0527788T3 (pl)
ES (2) ES2324597T3 (pl)
IE (1) IE911129A1 (pl)
PL (1) PL169273B1 (pl)
WO (1) WO1991015575A1 (pl)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6194140B1 (en) * 1990-04-04 2001-02-27 Chiron Corporation HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
CA2079105C (en) 1990-04-04 2000-06-13 Michael Houghton Hepatitis c virus protease
KR100217483B1 (ko) * 1990-04-06 1999-09-01 프랭크 쿵 C형 간염 바이러스 에피토프
ATE229543T1 (de) * 1991-06-24 2002-12-15 Chiron Corp Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv)
IT1272179B (it) * 1994-02-23 1997-06-16 Angeletti P Ist Richerche Bio Metodologia per riprodurre in vitro l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 del virus hcv.
DE4428705A1 (de) * 1994-08-12 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Rekombinantes Antigen aus der NS3-Region des Hepatitis C Virus
US5861267A (en) * 1995-05-01 1999-01-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity
US5767233A (en) * 1995-05-12 1998-06-16 Schering Corporation Soluble cleavable substrates of the hepatitis C virus protease
US5843752A (en) * 1995-05-12 1998-12-01 Schering Corporation Soluble active hepatitis C virus protease
US5698396A (en) * 1995-06-07 1997-12-16 Ludwig Institute For Cancer Research Method for identifying auto-immunoreactive substances from a subject
IT1277914B1 (it) * 1995-08-22 1997-11-12 Angeletti P Ist Richerche Bio Procedimento per produrre - in forma pura e in quantita' elevate - polipeptidi con l'attivita' proteolitica della proteasi ns3 di hcv, e
US7235394B1 (en) 1995-08-29 2007-06-26 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
US6127116A (en) 1995-08-29 2000-10-03 Washington University Functional DNA clone for hepatitis C virus (HCV) and uses thereof
EP0876512A1 (en) * 1996-01-23 1998-11-11 Viropharma Incorporated Methods for identifying inhibitors of rna viruses
US5766916A (en) * 1996-04-24 1998-06-16 Genelabs Technologies, Inc. Hepatitis G virus protease
US5990276A (en) * 1996-05-10 1999-11-23 Schering Corporation Synthetic inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
US5861297A (en) * 1996-09-27 1999-01-19 Merck & Co., Inc. Detergent-free hepatitis C protease
US6436666B1 (en) * 1996-10-17 2002-08-20 Chiron Corporation Protease regulator screening assay
US7049428B1 (en) 1998-03-04 2006-05-23 Washington University HCV variants
US7338759B1 (en) 1997-03-04 2008-03-04 Washington University HCV variants
US5849800A (en) * 1997-03-28 1998-12-15 The Penn State Research Foundation Use of amantadine for treatment of Hepatitis C
US20020034732A1 (en) * 1997-07-30 2002-03-21 Daniel J. Capon Compositions and methods for determining anti-viral drug susceptibility and resistance and anti-viral drug screening
US7078500B1 (en) * 1998-01-30 2006-07-18 The General Hospital Corporation Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus
CN101126095A (zh) * 1998-01-30 2008-02-20 总医院有限公司 采用丙型肝炎病毒非结构蛋白进行的基因免疫
AU768177B2 (en) * 1998-04-02 2003-12-04 Viropharma Incorporated Hepatitis C virus NS5B compositions and methods of use thereof
CA2658218C (en) 1998-04-17 2014-10-28 Innogenetics N.V. Improved immunodiagnostic assays using reducing agents
US6280940B1 (en) 1998-08-05 2001-08-28 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Reporter gene system for use in cell-based assessment of inhibitors of the Hepatitis C virus protease
AU2217800A (en) * 1998-12-24 2000-07-31 Small Molecule Therapeutics, Inc. Methods and compositions for identifying protease modulators
EP1141255A4 (en) * 1999-01-08 2002-09-11 Bristol Myers Squibb Co MODIFIED FORMS OF HEPATITIS C VIRUS NS3 PROTEASE
US7084266B1 (en) 1999-06-04 2006-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cloned genome of infectious hepatitus C virus of genotype 2A and uses thereof
DE60034884T2 (de) * 1999-06-04 2008-01-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Klonierte genome von infektiösen hepatitis c viren genotyp 2a und deren verwendungen
EP1228370A2 (en) * 1999-11-10 2002-08-07 Structural Bioinformatics Inc. Computationally derived protein structures in pharmacogenomics
US20060141480A1 (en) * 1999-11-10 2006-06-29 Kalyanaraman Ramnarayan Use of computationally derived protein structures of genetic polymorphisms in pharmacogenomics and clinical applications
US20050074465A1 (en) * 1999-11-24 2005-04-07 Michael Houghton HCV fusion proteins with modified NS3 domains
US6986892B1 (en) * 1999-11-24 2006-01-17 Chiron Corporation Immunogenic Hepatitis C virus non-structural polypeptides
MXPA02009920A (es) 2000-04-05 2003-03-27 Schering Corp Inhibidores macrociclicos de la ns3-serina proteasa, del virus de la hepatitis c9 que comprenden partes p2 n-ciclicas.
HUP0302957A2 (hu) 2000-04-19 2003-12-29 Schering Corporation Hepatitis C vírus alkil- és aril-alanin P2 csoportokat tartalmazó makrociklusos NS-3 szerin proteáz inhibitorai
MY164523A (en) 2000-05-23 2017-12-29 Univ Degli Studi Cagliari Methods and compositions for treating hepatitis c virus
EP1160332A1 (en) * 2000-05-30 2001-12-05 Amsterdam Support Diagnostics B.V. Methods for detecting enzymatic activity or detecting resistance to enzyme inhibitors
US7491808B2 (en) * 2000-06-15 2009-02-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. HCV non-structural protein mutants and uses thereof
CA2418199A1 (en) * 2000-07-21 2002-01-31 Corvas International, Inc. Peptides as ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus
US7244721B2 (en) 2000-07-21 2007-07-17 Schering Corporation Peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
ES2341534T3 (es) 2000-07-21 2010-06-22 Schering Corporation Peptidos como inhibidores de la serina proteasa ns3 del virus de la hepatitis c.
AU8063701A (en) * 2000-07-21 2002-02-05 Schering Corp Novel peptides as NS3-serine protease inhibitors of hepatitis C virus
AR029851A1 (es) * 2000-07-21 2003-07-16 Dendreon Corp Nuevos peptidos como inhibidores de ns3-serina proteasa del virus de hepatitis c
US6680059B2 (en) * 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US7022830B2 (en) 2000-08-17 2006-04-04 Tripep Ab Hepatitis C virus codon optimized non-structural NS3/4A fusion gene
WO2002013855A2 (en) * 2000-08-17 2002-02-21 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
RU2286172C2 (ru) * 2000-08-17 2006-10-27 Трипеп Аб Вакцины, содержащие рибавирин, и способы их использования
DE60138567D1 (de) 2000-12-12 2009-06-10 Schering Corp Diarylrest entfassende peptide als inhibitoren des ns-3 serinproteases von hepatitis c virus
AU2002330154A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Methods and compositions for treating hepatitis c virus using 4'-modified nucleosides
KR20040077767A (ko) * 2002-01-23 2004-09-06 쉐링 코포레이션 Ｃ형 간염 바이러스 감염 치료용 ｎｓ3-세린 프로테아제억제제로서의 프롤린 화합물
EP1497469A4 (en) * 2002-04-04 2005-06-08 Achillion Pharmaceuticals Inc TEST FOR ASSESSING THE ACTIVITY OF COMPOUNDS AGAINST HCV USING A NOVEL DETECTION SYSTEM IN THE HCV REPLICIC
US7666627B2 (en) * 2002-08-08 2010-02-23 Targetex Kft. Folded recombinant catalytic fragments of multidomain serine proteases, preparation and uses thereof
US7439042B2 (en) * 2002-12-16 2008-10-21 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
JP2006526394A (ja) * 2003-06-03 2006-11-24 ベニテック オーストラリア リミテッド 二本鎖核酸
WO2005017125A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 California Institute Of Molecular Medicine Method for isolation and replication of infectious human hepatitis-c virus
CA2536570A1 (en) * 2003-08-26 2005-03-10 Schering Corporation Novel peptidomimetic ns3-serine protease inhibitors of hepatitis c virus
AR046166A1 (es) * 2003-09-26 2005-11-30 Schering Corp Inhibidores macrociclicos de la serina proteasa ns3 del virus de la hepatitis c
US20110150835A1 (en) * 2003-09-26 2011-06-23 Schering Corporation Macrocyclic Inhibitors of Hepatitis C Virus NS3 Serine Protease
CA2546290A1 (en) * 2003-11-20 2005-06-09 Schering Corporation Depeptidized inhibitors of hepatitis c virus ns3 protease
AU2005222056A1 (en) 2004-02-27 2005-09-22 Schering Corporation Novel compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
ES2328589T3 (es) 2004-02-27 2009-11-16 Schering Corporation Compuestos de la prolina 3,4(ciclopentil) fusionados como inhibidores de la proteasa serina ns3 del virus de la hepatitis c.
NZ549223A (en) * 2004-02-27 2010-10-29 Schering Corp Sulfur compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
WO2005087721A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-22 Schering Corporation Compounds as inhibitors of hepatitis c virus ns3 serine protease
US7816326B2 (en) * 2004-02-27 2010-10-19 Schering Corporation Sulfur compounds as inhibitors of hepatitis C virus NS3 serine protease
AU2005219859A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Schering Corporation Inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
CA2558771C (en) * 2004-03-05 2013-01-08 Benitec, Inc. Multiple promoter expression cassettes for simultaneous delivery of rnai agents
PE20060309A1 (es) * 2004-05-06 2006-04-13 Schering Corp (1r,2s,5s)-n-[(1s)-3-amino-1-(ciclobutilmetil)-2,3-dioxopropil]-3-[(2s)-2[[[(1,1-dimetiletil)amino]carbonil]amino]-3,3-dimetil-1-oxobutil]-6,6-dimetil-3-azabiciclo[3.1.o]hexan-2-carboxamida como inhibidor de la ns3/ns4a serina proteasa del virus de l
EP1773868B1 (en) 2004-05-20 2009-07-15 Schering Corporation Substituted prolines as inhibitors of hepatitis c virus ns3 serine protease
CA2577812A1 (en) * 2004-08-27 2006-03-09 Schering Corporation Acylsulfonamide compounds as inhibitors of hepatitis c virus ns3 serine protease
CN102614510A (zh) * 2004-10-18 2012-08-01 全球免疫股份有限公司 基于酵母的对慢性丙型肝炎感染的治疗
WO2006121468A1 (en) * 2004-11-22 2006-11-16 Genelabs Technologies, Inc. 5-nitro-nucleoside compounds for treating viral infections
US7524825B2 (en) * 2005-02-28 2009-04-28 Smithkline Beecham Corporation Tricyclic-nucleoside compounds for treating viral infections
US7405204B2 (en) * 2005-04-25 2008-07-29 Genelabs Technologies, Inc. Nucleoside compounds for treating viral infections
US7968697B2 (en) * 2005-05-25 2011-06-28 Chrontech Pharma Ab Hepatitis C virus non-structural NS3/4A fusion gene
US20070237818A1 (en) * 2005-06-02 2007-10-11 Malcolm Bruce A Controlled-release formulation of HCV protease inhibitor and methods using the same
WO2006130686A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 Schering Corporation Hcv protease inhibitors in combination with food
AU2006252553B2 (en) * 2005-06-02 2012-03-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Combination of HCV protease inhibitors with a surfactant
CN101223161A (zh) * 2005-06-24 2008-07-16 健亚生物科技公司 治疗病毒感染的杂芳基衍生物
PE20071230A1 (es) * 2006-02-09 2008-01-16 Schering Corp Combinaciones y metodos de inhibidores del vhc
US20090220457A1 (en) * 2006-03-03 2009-09-03 Lahser Frederick C Combinations comprising hcv protease inhibitor(s) and hcv ires inhibitor(s), and methods of treatment related thereto
JP2009530382A (ja) * 2006-03-23 2009-08-27 シェーリング コーポレイション Ｈｃｖプロテアーゼインヒビターとｃｙｐ３ａ４インヒビターとの組み合わせ、および関連する処置方法
EP2007789B1 (en) 2006-04-11 2015-05-20 Novartis AG Spirocyclic HCV/HIV inhibitors and their uses
EP2049536A2 (en) * 2006-07-20 2009-04-22 Genelabs Technologies, Inc. Polycyclic viral inhibitors
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
WO2009029729A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 Genelabs Technologies, Inc. Amino tricyclic-nucleoside compounds, compositions, and methods of use
BRPI0818488A2 (pt) * 2007-10-30 2015-04-14 Intermune Inc Genotipagem e fenotipagem de hcv
TW201546079A (zh) 2007-12-21 2015-12-16 Celgene Avilomics Res Inc Ｈｃｖ蛋白酶抑制劑及其用途（一）
US8309685B2 (en) 2007-12-21 2012-11-13 Celgene Avilomics Research, Inc. HCV protease inhibitors and uses thereof
WO2009082697A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Avila Therapeutics, Inc. Hcv protease inhibitors and uses thereof
US8293705B2 (en) 2007-12-21 2012-10-23 Avila Therapeutics, Inc. HCV protease inhibitors and uses thereof
US7699111B2 (en) * 2008-01-29 2010-04-20 Tam International, Inc. Float collar and method
WO2009130588A2 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Tripep Ab Immunogen platform
CN102816106A (zh) 2008-06-24 2012-12-12 默沙东公司 用于制备基本上立体异构纯的稠合二环脯氨酸化合物的生物催化方法
US8188137B2 (en) 2008-08-15 2012-05-29 Avila Therapeutics, Inc. HCV protease inhibitors and uses thereof
US8728489B2 (en) 2008-09-19 2014-05-20 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis C virus infection
CA2746258A1 (en) 2008-12-12 2010-06-17 Schering Corporation Deuterated compounds as hepatitis c virus (hcv) inhibitors
US20110027229A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Medtronic, Inc. Continuous subcutaneous administration of interferon-alpha to hepatitis c infected patients
US8324239B2 (en) 2010-04-21 2012-12-04 Novartis Ag Furopyridine compounds and uses thereof
MA34462B1 (fr) 2010-07-22 2013-08-01 Novartis Ag Composes de thiophene 2,3,5- trisubstitues et leurs utilisations
EP2658857B1 (en) 2010-12-29 2016-11-02 Inhibitex, Inc. Substituted purine nucleosides, phosphoroamidate and phosphorodiamidate derivatives for treatment of viral infections
KR101784455B1 (ko) 2015-12-04 2017-10-11 주식회사 바이오노트 Ｃ형 간염 바이러스의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그를 포함하는 c형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 방법

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4702909A (en) * 1982-05-05 1987-10-27 Louisiana State University A & M Non-A, non-B hepatitis antigen, antigen compositions, vaccine and diagnostic reagent
US4870026A (en) * 1982-09-16 1989-09-26 The General Hospital Corporation Non-A, non-B. hepatitis, virus, methods of identification purification, characterization, diagnosis and immunization
CA1293591C (en) * 1985-01-11 1991-12-24 Charles A. Kettner Peptide substrates for detecting virus-specified protease activity
US4673634A (en) * 1985-03-08 1987-06-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Purified antigen from non-A, non-B hepatitis causing factor
US5523215A (en) * 1985-03-28 1996-06-04 Chiron Corporation Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins
US5218099A (en) * 1986-04-01 1993-06-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides
EP0318216B2 (en) * 1987-11-18 2001-08-29 Chiron Corporation NANBV diagnostics
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
US5176994A (en) * 1988-12-21 1993-01-05 Immuno Japan Inc. Non-A, Non-B hepatitis virus genome RNA, cDNA and virus antigen protein
HU225068B1 (en) 1989-03-17 2006-05-29 Chiron Corp Process for producing diagnostics and vaccine of nanbh
US5372928A (en) * 1989-09-15 1994-12-13 Chiron Corporation Hepatitis C virus isolates
CA2065287C (en) 1989-09-15 1999-12-21 Tatsuo Miyamura New hcv isolates
CA2079105C (en) 1990-04-04 2000-06-13 Michael Houghton Hepatitis c virus protease
US5258496A (en) * 1990-07-10 1993-11-02 Scios Nova Inc. Isolation and purification of lung surfactant protein
ES2082231T3 (es) 1990-09-21 1996-03-16 Salk Inst For Biological Studi Metodos mediados por el complejo proteinico proto-oncogenico ap-1.

Also Published As

Publication number Publication date
IE20060594A1 (en) 2009-05-27
US5712145A (en) 1998-01-27
US5371017A (en) 1994-12-06
EP0527788A1 (en) 1993-02-24
JP3507045B2 (ja) 2004-03-15
EP1304335B1 (en) 2009-06-10
US20030064499A1 (en) 2003-04-03
EP0527788B1 (en) 2004-06-30
CA2079105C (en) 2000-06-13
JP2004073212A (ja) 2004-03-11
DE69133402T2 (de) 2004-11-11
JP3320411B2 (ja) 2002-09-03
US5597691C1 (en) 2001-12-11
US5597691A (en) 1997-01-28
DK0527788T3 (da) 2004-09-06
EP1304335A3 (en) 2004-04-07
ATE270326T1 (de) 2004-07-15
WO1991015575A1 (en) 1991-10-17
IE911129A1 (en) 1991-10-09
CA2079105A1 (en) 1991-10-05
ATE433460T1 (de) 2009-06-15
US20030027317A1 (en) 2003-02-06
ES2324597T3 (es) 2009-08-11
JP2002051791A (ja) 2002-02-19
US5585258C1 (en) 2002-01-15
AU7675491A (en) 1991-10-30
US5585258A (en) 1996-12-17
EP1304335A2 (en) 2003-04-23
ES2219637T3 (es) 2004-12-01
US5885799A (en) 1999-03-23
JPH05507612A (ja) 1993-11-04
DE69133617D1 (de) 2009-07-23
DE69133402D1 (de) 2004-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL169273B1 (pl) skierowanej przeciw wirusowi zapalenia watroby C PL
IE84608B1 (en) Hepatitis C virus protease
US6472180B1 (en) HCV NS3 protein fragments having helicase activity and improved solubility
US20030082518A1 (en) Reporter gene system for use in cell-based assessment of inhibitors of the hepatitis C virus protease
Pethel et al. Mutational analysis of the octapeptide sequence motif at the NS1-NS2A cleavage junction of dengue type 4 virus
WO1991015596A1 (en) Hepatitis c virus protease inhibitors
WO1997040168A1 (en) Hepatitis g virus protease
IE85503B1 (en) Hepatitis c virus protease