JPH05507612A - Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウィルスプロテアーゼ 関連出願に関する参照事項 本願は、１９９０年４月４日出願の米国特許出願第０７／５０５．４３３号の一 部継続出願である。

技術分野 本発明は分子生物学およびＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のウィルス学に関する。

より詳しくは、本発明は、ＨＣＶによって生成される新規のプロテアーゼ、発現 方法、組換えプロテアーゼ、プロテアーゼ変異体、およびＨＣＶプロテアーゼの インヒビターに関する。

１且血１見 非Ａ・非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウィルスにより誘発されると考えられてい る伝染性疾病（あるいは疾病ファミリー）であり、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＹ） 、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウィルス（ＨＤＶ）　、サイトメガ ロウィルス（ＣＭＶ）あるいはエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）などによ って引き起こされるようなその他の形態のウィルス関連肝臓疾患と区別される。

疫学的証拠によって、ＮＡＮＢＨには、飲料水媒介伝染型；血液または注射針関 連型；および単独発生（地域獲得）型の３種類があると考えられる。しかし、病 原因子の数は未知である。しかし、最近になって、新規のウィルス種であるＣ型 肝炎ウィルス（ＨＣｖ）が血液関連型ＮＡＮＢＨ（ＢＢ−ＮＡＮＢＨ）の（唯一 ではないにしろ）主要な要因であると見いだされている。例えば、ＰＣＴ出願第 ＷＯ３９１０４６６９９号、　１９８９年１２月２１日出願の米国特許出願第７ ７４５６．６３７号；および１９８９年１２月２１日出願の米国特許出願第７７ ４５６．６３７号を参照のこと。これらは参考のために本明細書に援用する。Ｃ 型肝炎は、合衆国および日本を含む多（の国において、輸血に伴う肝炎の主要形 態であると思われる。また、ＨＣｖが肝細胞癌の誘発に関係しているという証拠 もある。従って、）ＩｃＶ感染の効果的な治療方法が望まれて。

いるが、現在のところそれは存在しない。

アゾノウ゛イルス、バキユロウイルス、コモウィルス、ピコルナウィルス、レト ロウィルスおよびトガウィルスを含む多くのウィルスが、ポリペプチドをその当 初の翻訳された形態から成熟した活性タンパク質へとプロセシングするための、 特異的な、ウィルスにコードされたプロテアーゼに依存している。ピコルナウィ ルスの場合には、全てのウィルスタンパク質が単一のポリタンパク質の開裂から 生じると考えられている（Ｂ、Ｄ、　Ｋｏｒａｎｔ、　ＣＲＣＣｒ１ｔ　Ｒｅｖ 　Ｂｔｏｔｅｃｈ　（１９８８）ｉ：１４９−５７）Ｓ、Ｐｉｃｈｕａｎｔｅｓ らは、−Ｖｉｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　Ａｓ　Ｔａｒｇｅｔｓ　Ｆｏｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）ｐｐ、　２１５−２２において、Ｈ ＩＶ−１で見られるウィルスプロテアーゼの発現を開示している。この旧Ｖプロ テアーゼは、ＨＩＶプロテアーゼ前駆体をコードするＤＮＡを、ヒトスーパーオ キシドジスムターゼ（ｈｓＯＤ）をコードするＤＮＡに融合させ、その生成物を Ｅ、　ｃｏｌｔ、で発現させることによって、融合タンパク質の形態で得られた 。形質転換された細胞は、３６および１０　ｋＤａの生成物（ｈｓＯＤプロテア ーゼ融合タンパク質およびプロテアーゼのみに対応）を発現したが、これはこの プロテアーゼが自己触媒作用によるタンパク質分解が可能な形態で発現したこと を示している。

Ｔ、　Ｊ、ＭｃＱｕａｄｅらは、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４ユニ４５ ４−５６に、特異的に旧Ｖ−１プロテアーゼを阻害できる模擬ペプチドの調製を 開示した。ＨＩＶにおいては、プロテアーゼは当初のｐ５５　ｇａｇ前駆体転写 物の、コア構造タンパク質（ｐ１７、ｐ２４、ｐ８およびｐ７）への開裂に関与 していると考えられている。１μＭのインヒビターを培養中の■ＩＶ感染末梢血 リンパ球に加えると、プロセシングされた旧Ｙ　ｐ２４の濃度が約７０％減少し た。ウィルス成熟および感染ウィルスのレベルは、プロテアーゼインヒビターに よって減少した。

發朋ヱＪ」丞 我々は、組換えＨＣＶプロテアーゼ、■Ｃｖプロテアーゼ融合タンパク質、切り 形および改変されたＨＣＶプロテアーゼ、クローニングおよびそのための発現ベ クター、およびＨＣｖ治療に効果的な抗ウィルス剤を同定する方法を発明した。

殴ｉユ！！呈笠ユ 図１は、ＨＣＶプロテアーゼの配列を示す。

図２は、クローンＣ２０ｃのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示 す。

図３は、クローンＣ２６ｄのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示 す。

図４は、クローンＣ８ｈのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す 。

図５は、クローンＣ７ｆのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す 。

図６は、クローンＣ３１のポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す 。

図７は、クローンＣ３Ｓのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す 。

図８は、クローンＣ３３ｃのポリヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示 す。

図９は、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００の組立を略図的に説明してい る。

図１０は、ベクターｃｆｌｓＯＤｐ６００の配列を示す。

「Ｃ型肝炎ウィルス」およびｒ　ＨＣＶＪという用語は、ＢＢ−ＮＡＮＢＨの主 要な病原因子であるウィルス種のことであり、そのプロトタイプ単離物はＰＣＴ 第ＷＯ３９１０４６６９９号；　ＥＰＯ公開第３１８．２１６号；　１９８９年 ５月１８日出願のＵＳＳＮ第７／３５５．００８号；およびＵＳＳＮ第７／４５ ６．６３７号に同定されており、それらの開示を本明細書に参考のために援用す る。本明細書で用いられるｒ　ＨＣＶＪは、Ｃ型肝炎を引き起こし得る病原性菌 株、および弱毒菌株またはそれに由来する欠陥干渉性粒子をも包含する。ＨＣＶ ゲノムはＩＩＮＡから成る。ＲＮＡ含有ウィルスは、取り込まれたヌクレオチド あたり１０−３から１Ｏ−４のオーダーと報告されているように、自然突然変異 の速度が比較的速いということが知られている（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐｅ 、　−Ｆｕｎｄａ＋ａｅｎｔａｌ　Ｖｉｒｌｏｇｙ”　（１９８６，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、））。遺伝子型の不均一性および流動性は、ＲＮＡウィ ルスに固有の特性であるため、ＢＣＶ種には多数の菌株／単離物があり、これら は毒性でも非毒性でもあり得る。

様々す異ナルＨＣｖノ菌株／単離物、特ニＣＤＣ／ＨＣＶ　Ｉ　’（ＨＣＶＩと も呼ばれる＞ｍ株または単離物に関する情報を本明細書に開示する。部分ゲノム 配列などの、１つの菌株または単離物からの情報は、当業者が標準的な技術を用 いて、新たな菌株／単離物を単離し、このような新たな菌株／単離物がＨＣＶで あるか否かを同定するのに十分なものである。例えば、様々な菌株／単離物を以 下に説明する。これらの菌株は、多くのヒト血清から（そして様々な地理的領域 から）得られたものであり、ＨＣＶＩのゲノム配列から得た情報を用いて単離さ れた。

本明細書に提供される情報によって、ＨＣＶがワラビウイルスの遠縁にあたるこ とが示される。ワラビウイルスファミリーには、ヒトの病原体となる小さくてエ ンベロープを有する多くのウィルスが含まれる。ワラビウイルス粒子の形態学お よび構成は公知であり、Ｍ、Ａ、　Ｂｒ１ｎｔｏｎ著−Ｔｈｅ　Ｖｉｒｕｓｅｓ ：Ｔｈｅ　Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ　Ａｎｄ　Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ”（シ リーズ編集、Ｆｒａｅｎｋｅｌ−ＣｏｎｒａｔおよびＷａｇｎｅｒ、本巻編集、 ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒ ｅｓｓ、１９８６）、　ｐｐ、３２７−３７４で論じられている。

一般に、形態学に関しては、フラビウイルスは脂質二重層によって囲まれた中心 ヌクレオカプシドを含有している。ピリオンは球形であり、約４０〜５０ｒｖの 直径を有している。そのコアの直径は約２５〜３０ｎｍである。ピリオンのエン ベロープの外表面に沿って、長さ約５〜１０ｎ＋ｍで直径約２ｎｍの末端瘤を有 する突起物がある。このファミリーの典型的な例としては、黄熱病ウィルス、西 ナイルウイルス、およびデング熱ウィルスが挙げられる。これらは、ＨＣＶより わずかに大きく、約３５００のアミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする玉 鎖のＲＮＡゲノム（約１１．０００のヌクレオチド）を有している。個々のウィ ルスタンパク質はこの前駆体ポリペプチドから開裂する。

ＨＣＶのゲノムは、約ｔｏ、　ｏｏｏのヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡであ ると思われる。このゲノムは玉鎖であり、約３．０００個のアミノ酸のポリタン パク質をコードする連続的翻訳オーブンリーディングフレイム（ＯＲＦ）を有し ている。このＯＲＦにおいて、構造タンパク質は、Ｎ末端領域の最初の４分の１ にコードされており、主だるポリタンパク質は非構造タンパク質に当てられてい る。すべての既知のウィルス配列と比較すると、小さいが重要な共直線性の相同 性が、フラピウイルスファミリーの非構造タンパク質およびペスチウイルス（現 在ではフラビウイルスファミリーの一部であると考えられている）との間に見ら れる。

（例として黄熱病ウィルスを用いた）フラビウイルスポリタンパク質と、ＨＣＶ ゲノムの主要なＯＲＦにコードされた推定ポリタンパク質の、可能な領域の記号 化した配列を図１に示す。

ＨＣＶポＩＪ　９７パク質の可能なドメインを図に示す。黄熱病ウィルスポリタ ンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端に同けて、ヌクレオカプシドタンパ ク質（Ｃ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、 および非構造タンパク質１．２　（ａ＋ｂ）、　３．４　（ａ＋ｂ）および５　 （ＮＳ１．　ＮＳ２．　ＮＳ３．　ＮＳ４およびＮ５Ｓ）を含有している。ＨＣ Ｖ　１のヌクレオチド配列にコードされた推定アミノ酸に基づいて、ＨＣＶポリ タンノくり買のＮ末端の一番端の小さなドメインは、サイズにおいても塩基性残 基の含有率が高いことにおいても、フラピウイルスボリタンパク質のＮ末端に見 られるヌクレオカプシドタンパク質（Ｃ）に類似しているように思われる。アミ ノ酸配列は分岐するが、ＨＣＶおよび黄熱病ウィルス（ＹＦＶ）の非構造タンパ ク質２．３．４および５　（ＮＳ２−５）は、同様のサイズおよびハイドロパシ シティの等個物を有していると思われる。しかし、Ｍ、ＥおよびＮＳＩタンノく り質を含有するＹＦＶポリタンパク質の領域に対応するＢＣＶの領域は、配列が 異なるのみならず、サイズおよびハイドロア＜シシティにおいてもかなり興なっ ているように思われる。従って、ＦＩＣＶゲノムの或ドメインは、本明細書では 、例えばＮＳＩまたはＮＳ２として言及され得るが、これらの名称は参照の便を 図るためのものにすぎず、ＨＣＶファミリーとワラビウイルスとの間には：　は っきりと認識すべき、かなりの差があり得ることを理解されたい。゛ ＨＣＶの菌株ま元は単離物の進化的関係によって、推定ＨＣＶ菌株および単離物 はポリペプチドのレベルでその相同性によって同定され得る。本明細書に開示さ れる単離物に関しては、新たなＨＣｖ園株または単離物は、少なくとも約４０％ 、い（つかは約７０％以上、さらにいくつかは約８０％以上相同であることが予 測される。いくつかは、ポリペプチドのレベルで約９０％以上相同であり得る。

アミノ酸配列の相同性を判断する技術は当該分野で公知である。例えば、アミノ 酸配列は直接決定され、本明細書に提供される配列と比較され得る。あるいは、 推定ＨＣｖのゲノム物質のヌクレオチド配列は、（通常はｃＤＮＡ中間体を介し て）決定され得、そこでコードされるアミノ酸配列を決定し、対応する領域を比 較することができる。

ｒＢｃＶプロテアーゼ」という用語は、タンパク質分解活性を示すＨＣＶ由来の 酵素、特にＨＣＶゲノムのＭＳ３ドメインにコードされているポリペプチドのこ とである。少なくとも１つのＨＣｖの菌株は、実質的に以下の配列によって、ま たは以下の配列内にコードされていると考えられるプロテアーゼを含有している ： （以下余白） 上記ＮおよびＣ末端は推定であり、実際の末端は、全ＮＳ３ドメインをフードす るＤＮＡ構築物の適切な宿主内での発現およびプロセシングにより明示される。

ＨＣＹのようなＲＮＡウィルスは広範囲の多様性を示すことが知られているため 、この配列は菌株によって改変すると考えられている。さらに、プロテアーゼは 前駆体ポリタンパク質から開裂するため、実際のＮおよびＣ末端は変動し得るニ ブロチアーゼアミノ酸配列が変動すると、様々な点でのポリタンパク質からの開 裂が起こる。従って、アミン末端およびカルボキシ末端は、ＨＣＶの菌株によっ て異なり得る。上記の最初のアミノ酸は、図１の残基６０に対応する。

しかし、活性に必要な最小配列は、通常の方法によって決定され得る。この配列 は、（コーディング配列の５゛または３′末端での開裂の後）あらゆる所望の数 の塩基対を除去するためにエキソヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクターを 処理することにより、その両端を切断し得る。その後、得られるコーディングポ リヌクレオチドが発現され、配列が決定される。このように、得られる生成物の 活性は、アミノ酸配列と相関し得る。（徐々により多くの数の塩基対を除去して い（〉そのような限定された一連の実験は、プロテアーゼ活性に必要な最低限の 内部配列を決定する。この配列は、特にカルボキシ末端で実質的に切断され、明 らかに十分にプロテアーゼ活性を保持し得ることを我々は見いだした。カルボキ シ末端におけるタンパク質の一部がヘリカーゼ活性を示し得ると現在考えられて いる。しかし、へりカーゼ活性は、本発明のＨＣＶプロテアーゼには必要ではな い。アミノ末端もまた、プロテアーゼ活性を失うことなくある程度切断され得る 。

上記で下線を施したアミノ酸は、推定ワラビウイルスのセリンプロテアーゼに対 する配列の相同性に基づいて、触媒活性に必要な残基であると考えられている。

表１は、■ＣｖブＣ１ｆアーゼおよび黄熱病ウィルス、西ナイル熱ウィルス、マ リーバレー熱ウィルスおよびクンジン（Ｋｕｎｊ　ｉｎ）ウィルスから得られる プロテアーゼの３つのセリンプロテアーゼ触媒作用残基の配列を示している。そ の他の４つのフラビウイルスプロテアーゼ配列は、ＨＣＶに対してより、互いに 対してより高い相同性を示すが、ＨＣＶともある程度の相同性が見られる。しか し、この相同性は、現在得られる配列ソフトウェアによって示すには十分ではな い。示されたアミノ酸には、上記の配列において、ＨｉＳｖｓ、Ａｓｐｌ　ｓｓ および５ｅｒ１６１　（図１における旧Ｓ、３８、Ａ３１）１６３および５ｅｒ ２２＋　）の番号が付されている。

表１：配列による活性残基の配列 あるいは、構造的相同性に基づいて触媒作用残基配列を作ることも可能である。

表２は、構造的研究に基づく、いくつかのよい特性を有するセリンプロテアーゼ ：　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓからのプロテアーゼＡ１α−位 分解プロチアーゼ、ウシトリプシン、キモトリプシン、およびエラスターゼの触 媒部位に対してのＨＣＶの配列を示す（Ｍ、　Ｊａｍｅｓら、Ｃａｎ　Ｊ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ　（１９７Ｂ）　５６＋３９６）。ここでも、ある程度の相同性が見 られる。同定されるＨＣＶ残基は、上記配列において旧Ｓ？９、ＡＳＩ’１２５ 、および５ｅｔｌａ＋の番号が付されている。

表２＝構造による活性残基の配列 活性部位に必須の残基を立証する最も直接的な方法は、各残基をそれぞれステア リンと同等のサイズの残基と置き替えることである。これは、部位特異的変異誘 発および当該分野で公知の同様の方法によって、容易に行われ得る。特定の残基 を等量寸法の残基と置き替えると活性が失われる場合は、置き替えられた残基の 本質的性質が確認される。

ｒＨｃＶプロテアーゼアナログ」とは、天然プロテアーゼのアミノ酸配列の欠失 、改変および／または付加によって全長プロテアーゼ配列から改変しているポリ ペプチドのことである。

ＨＣＶプロテアーゼアナログには、上記の切り形プロテアーゼ、およびＨＣＶプ ロテアーゼ変異タンパク質および■Ｃｖプロテアーゼ、切り形プロテアーゼまた はプロテアーゼ変異タンパク質を含有する融合タンパク質が含まれる。ＨＣｖプ ロテアーゼ変異タンパク質を形成するための改変は、同類アミノ酸置換であるこ とが好ましく、その際アミノ酸は同様の特性を有するその他の天然発生アミノ酸 と置換される。例えば、以下の置換が「同類」と考えられる： Ｇｌｙ　−Ａｈａ；　Ｌｙｓ　−Ａｒｇ；Ｖａｌ　−ｎｅ　−Ｌｅｕ；　Ａｓｎ 　−Ｇｉｎ；　唱４硅Ａｓｐ　−Ｇｌｕ；　Ｐｈｅ　−Ｔｒｐ　−Ｔｙｒ。

非同類的な改変は、一般に、上記のアミノ酸の１つを異なる群からのアミノ酸へ 置換することであり（例えば、ＡｓｎをＧｌｕに置換する）、あるいはＣｙｓ％ ＭｅＬ　ＨｉｓまたはＰｒｏを上記のアミノ酸のいずれかと置換することである 。天然のアミノ酸を含む置換は、所望のタンパク質をコードする発現ベクターの 部位特異的変異誘発によって好ましく行われ、改変された形態の発現が得られる 。また、合成または半合成方法によってアミノ酸を改変させることも可能である 。例えば、単離されたタンパク質を適切に化学的処理することによって、システ ィンまたはセリン残基をセレノシスティンに変換することができる。または、標 準的なインビトロのタンパク質合成方法によって５非天然のアミノ酸を組み込む こともできる。一般的Ｉこは、変異タンパク質の天然配列に対し行われる改変、 欠失あるいは付加される残基の合計数は、約２０を越えない、あるいは約１０を 越えないことが好ましく、約５を越えないことが最も好ましい。

一般に、融合タンパク質とは、２つ以上の個別のタンパク質から引き出されたア ミノ酸配列を含有するポリペプチドのことである。本発明では、「融合タンパク 質」とは、１（ＣＶプロテアーゼ、切り形、変異タンパク質またはそれらの機能 部分を含有し、非ＨＣＶタンパク質またはポリペプチド（「融合パートナ−」） に融合したポリペプチドの意味で用いられる。融合タンパク質は、融合遺伝子の 発現によって生成することが最も便利であり、この融合遺伝子は、１つのポリペ プチドの５′末端部分と、異なるポリペプチドの３°末端部分をコードし、その 異なる部分同志は結合されて適切な宿主において発現し得る１つのリーディング フレイムとなる。現在では、ＨＣＶプロテアーゼまたはアナログを融合タンパク 質のカルボキシ末端に位置させ、機能酵素の７ラグメントを７ミノ末端に用いる ことが（必要とされているわけではないが）好ましい。ＨＣＶプロテアーゼは通 常大きなポリタンパク質的に発現するため、細胞輸送シグナル（例えば輸出また は分泌シグナル）を含むことは期待できない。適切な機能酵素フラグメントは、 ＩＩＩＣＶプロテアーゼと融合して発現される時に定量可能な活性を示すポリペ プチドである。例としての酵素には、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）　、 β−ラクタマーゼ、ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　、グルコ ースオキシダーゼ（Ｇｏ）、ヒトスーパーオ牛シトジスムターゼ（ｈｓＯＤ）　 、ウレアーゼなどが制限なしに挙げられる。生成される融合タンパク質の童が簡 単な比色分析によって定量できるため、これらの酵素は便利である。または、融 合パートナ−に特異的な抗体を用いて、融合タンパク質を簡単に検出および定量 するために、抗原タンパク質またはフラグメントを用いることもできる。現在好 ましい融合パートナ−はｈｓｏｏである。

Ｂ、二股五呈立叛 本発明を実施するにあたっては、一般に、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ 、および免疫学の従来技術を用い、これらは当該分野の技術範囲内のものである 。このような技術は文献に詳細に説明されている。例えば、Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ　（１９８９）；　−ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−、Ｖｏｌ、Ｉ　 ａｎｄ　ＩＩ（Ｄ、Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）　；−０１ｉｇｏｎｕｅｌｅ ｏｔｉｄａＳｙｎｔｈｅｓｉｓ−（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ［１９８４）；　−Ｎｕｃ ｌｅｆｃ　Ａｃ１ｄ　ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉＯｎ”（Ｂ、Ｄ、　ＨａＩＩｌｅ ｓおよびＳ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓｍ　１９８４）；　”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ 。

ｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−（Ｂ、Ｄ、ＨａｍｅｓおよびＳ、　Ｊ、 　Ｈｉｇｇｉｎｓｍｉ　１９８４）；　”Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ−（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編１９８６）；−１ｍｍｏｂｉ１ｉｚｅｄ　 Ｃｅ１ｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙａ＋ｅｓ−（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８Ｂ） ：　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、”Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｆｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）：“Ｍｅｔｈａｄｓ　Ｉｎ　Ｅ ｎｚｙ＊ｏｌｏｇｙ＋のシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、） ；　−Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　Ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉ ａｎ　Ｃｅ１ｌｓ”（Ｊ、Ｈ，ＭｉｌｌｅｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａｌｏｓ編１９ ８？、’　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　 ；Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９８７）　１５４および出（それぞれＮｕお よびＧｒ。

ｓｓａ＋ａｎ！Ｉｇ、　Ｎｕ編）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１０７） 、　−１ｍｍａｎｏｃｈｅｍｔｅａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ａｎ ｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　 Ｌｏｎｄｏｎ）：　５ｃｏｐｅｓ、−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　Ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ−、２ｎｄ　Ｅｄ（Ｓ ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、、１９８７）：および−Ｈａｎｄｂ ｏｏｋ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ＋ａｅｎｔａｌ　［＋ｕ＋ｕｎｏｌｏｇｙ−，ｖｏ ｌｕ＋＊ｅｓ１−ＩＶ　（ＷｅｉｒおよびＢＩａｃｋｖｅｌ１４１１９８６）な どを参照のこと。

指定された宿主と適合する、適切な制御配列を用いる場合には、原核および真核 宿主細胞の両方が、所望のコーディング配列を発現するのに有用である。原核宿 主の中で、Ｅ、　ｃａｌｊが最もよく用いられる。原核細胞の制御配列には、任 意にオペレータ一部分を含有するプロモーター、およびリポソーム結合部位が含 まれる。原核細胞宿主に適合する転移ベクターは、一般に、例えば、アンピシリ ンおよびテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含有するプラスミドである ｐＢ２３２２、およびやはり抗生物賀耐性マーカーを付与する配列を含有してい る種々のｐＵＣベクターから由来する。これらのプラスミドは、商業的に入手可 能である。これらのマーカーは、選択によって、優れた形質転換体を得るのに用 い得る。一般に用いられる原核制御配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナー ゼ）およびラクトースプロモーターシステムＣＣｈａｎｇう、Ｍａｔ口１（１９ ７７）月咀：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇ ｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８０）ｉ：４０５７）およ びラムダ誘導ｐｔプロモーターおよびＮ遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｍａ ｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）および口上および１ａ ｃＵＶ５プロモーターの配列に由来するハイブリッド幻にプロモーター（Ｄａ　 Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｅａｄ　Ｓｃｆ　ＵＳＡ（１９８３）２９２ ：１２８）が含まれる。上述のシステムは、特にＥ、ｃｏｌｉに適合する：所望 の場合には、バシラスまたはシェードモナスの菌株のようなその他の原核宿主を 、対応する制御配列と共に用いることもできる。

真核宿主には制限なしに、゛培養システム中の酵母および哺乳動物細胞を含む。

酵母発現宿主には、５ａｃｃｈａｒｏ＋ｍｙｃｅｓｘ　Ｋｌｅｂｓｆｅｌｌａ、 　Ｐｆｃｆａなどが含まれるａ　５ａｃｃｈａｒｏｔｔｒｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ ｆｓｉａｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ およびに、１ａｃｔｉｓが最もよく用いられる酵母宿主であり、便利な菌類宿主 である。酵母適合ベクターは、原栄養性を栄養要求性突然変異体にまたは野生型 菌株に重金属耐性に付与することによって、優れた形質転換体を選択することの できるマーカーを有する。酵母適合ベクターは、２μの複製起点を用い（Ｂｒｏ ａｃｈら、Ｍｅｔｈ　Ｅｒ＋ｚＢｇｑ　（１９８３＞１０１：３０７）　、複製 を確実にするためにＣ２Ｈ４およびＡＲＳＩの組み合せ、または宿主細胞ゲノム に適切なフラグメントを組み込む配列のような他の手段を活用し得る。酵母ベク ターの制御配列は、当該分野では公知であり、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ のプロモーター（Ｒ，Ｈｉ　ｔｚｅａ＋ａｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１ ９１１０）２５５：２０７Ｋ）を含む、解糖酵素の合成のためのプロモーターが 含まれる（Ｈｅｓｓら、Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚ　ａｒｅ　Ｒｅ　（１９６８）７： １４９；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ（１９７８）、　Ｌ７：４９０ ０）　。エノラーゼ遺伝子に由来するもののようなターミネータ−も含まれる（ Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ（１９８１）２５６：１３８５）　 ａ特に宵月な制御システムは、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ （ＧＡＰＤＨ）プロモーター、またはアルコールデヒドロゲナーゼＣＡＤＨ）調 節可能プロモーター、ＧＡＰＤＨにも由来するターミネータ−１および分泌が必 要な場合には酵母α−因子に由来するリーダー配列を含有するものである（参考 までに本明細書に援用する、米国特許第４．８７０．００８号参照）。

現在のところ、好ましい発現システムは、融合パートナ−としてユビ牛チン（ｕ ｂｆｑｕｊｔｆｎ）リーダーを用いている。１９８９年８月７日に出願された同 時係属中の第ＵＳＳＮ　７／３９０，５９９号は、酵母ユビキチン融合タンパク 質を高率に発現するためのベクターを開示している。酵母ユビキチンは、発現に よって自動的に融合タンパク質から開裂する、７６アミノ酸ポリペプチドを提供 する。ユビキチンのアミノ酸配列は以下のものであるまた、０ｚｋａｙｎａｋら 、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）　３１２：　６６３−６６も参照のこと。

ユビキチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、Ｂａｒｒら 、１Ｊｌｑ上Ｃｈｅｗ（１９８１１＞２６８：１６７１−７８の技術に従いＡｐ ｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　３８ＯＡ　ＤＮＡ合成器を用いるなど、標準 的な方法で合成し得る。適切なリンカ−を用いると、ユビキチン遺伝子を適当な ベクターに挿入し、ＨＣＶプロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする配 列に結合することができる。

さらに、作動可能なように連結された転写調節領域および転写開始領域は、野生 型有機体には自然には関連しないものにし得える。これらのシステムは、　１９ ８４年１０月３日公開のＥＰＯ第１２０．５５１号；　１９１１４年８月２２日 公開のＥＰＯ策１１６．２０１号；　１９１１ｓ年１２月１８日公開のＥＰＯ第 １６４．５５６号に詳細に説明されており、これらはすべて本発明と同一出願人 によるものであるため、参考までに本明細書に詳しく援用される。

発現の宿主として入手可能な哺乳動物細胞系は、当該分野では公知であり、Ａ！ １ｌｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣ Ｃ）から入手可能な、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞および多くのその他の細胞株を含む、多く の不滅細胞系が含まれる。哺乳動物細胞に適当なプロモーターもまた当該分野で 公知であり、シミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）　（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕ ｒｅ　（１９７８）２７３：１１３）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）　、アデ ノウィルス（ＡＤＶ）おヨヒウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）などからのウィルス プロモーターが含まれる。哺乳動物細胞は、また、ターミネータ−配列およびポ リーＡ付加配列を必要とすることがある。発現を増大させるエンハンサ−配列を 含むことも可能であり、遺伝子を増幅する配列もまた望ましい（例えば、メトト レキセート耐性遺伝子）。これらの配列は当該分野では公知である。

哺乳動物細胞における複製に適切なベクターは、当該分野で公知であり、これに は、ウィルスレプリコン、＊　ｔ：　ｉｔ　ＨＣＶ　ｘビトープを宿主ゲノムに コードするのに適切な配列の宿主ゲノムへの組み込みを確実にする配列を含み得 る。例えば、外来ＤＮＡを発現するのに用いられるその他のベクターは、ワクシ ニアウィルスである。この場合、異種ＤＮＡはワクシニアゲノムに挿入される。

外来ＤＮＡをワクシニアウィルスゲノムに挿入スる技術は当該分野では公知であ り、例えば、相同組換えを用いることができる。異種ＤＮＡは、一般に、ウィル スに必須ではない遺伝子、例えばチミジンキナーゼ遺伝子０」）に挿入され、こ れによって選択可能なマーカーがまた提供される。組換えウィルスの構築を太き （促進するプラスミドベクターは、すでに記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅ ｔ　ｔら、ＬＬ工は（１９ｇ４）ｌ：８５７；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、恥土 」ｊ土ＪＬＬＱＩ　（１９８５）ｉ：３４０３；　Ｍｏ５ｓ、　ｉｎ　ＧＥＮＥ 　ＴＲＡＮＳＰＥＲＶＥＣＴＯＲＳ　ＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮ　ＣＥＬＬＳ　 （ＭｉｌｌｓｒおよびＣａｌｏｓ編Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮＹ、　１９８７）、９．１０を参照のこと）。その後 、活動組換えワクシニアウィルスに感染した細胞または動物中で、ＨＣＶポリペ プチドが発現する。

ＨＣＶポリペプチドがワクシニアベクターから発現する飢否かを判断するために 、Ｂ５Ｃｌ細胞を組換えベクターで感染させ、発現可能な条件の乍で顕微鏡スラ イド上に増殖させることもできる。次に細胞をアセトン固定し、組換え発現ベク ターのＨＣＶセグメントが由来している、ＨＣＶゲノムの領域にコードされたポ リペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含有するとわかっている血清を用いて、免疫 蛍光アッセイが行われる。

真核またはウィルスゲノムの発現のためのその他のシステムには、昆虫細胞およ びこれらの細胞で用いるのに適切なベクターが含まれる。これらのシステムは当 該分野で公知であリ、例えば、バキュロウィルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌ ｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する昆虫発現転移ベ クターが含まれ、これはヘルパー独立のウィルス発現ベクターである。

このシステムに由来する発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するた めの、強いウィルス性のポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子プロモー ターを用いる。現在、ＡｃＮＰＶに外来遺伝子を導入するために最も一般的に用 いられる転移ベクターは、ｐＡｃ３７３である（　ＰＣＴ第１ｆ０８９１０４６ ６９９号およびＵＳＳＮ第７／４５６、６３７号参照）。当業者に公知のその他 の多（のベクターも発現を向上させるよう設計されてきた。この中には、例えば 、ｐＶＬ９８５　（これは、ポリヘトリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに改変 させ、そのＡＴＴから３２ｂｐ下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する； 　ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕ冨ｍｅｒｓ、　■Ｌ壮（１９８９）［：３１参照）が 含まれる。非融合外来タンパク質を高度に発現するためのＡｃＮＰＶ転移ベクタ ーは、同時係属中のＰＣＴ出願番号第ＷＯ３９１０４６６９９号およびＵＳＳＮ 第７／４５６，６３７号に記載されている。唯一のＢａｍ旧部位は、ポリ未ドリ ン遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに関して、８位後ろにある。Ｓ＋＊ａｌ、Ｐｓ ｔ［、Ｂｇｌｌｌ、ＸｂａｌまたはＳｓｔ　＋についての開裂部位はない。非融 合外来タンパク質を良好に発現するためには、通常、理想的には、ＡＴＧ開始シ グナルに先行する、適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を持つ 外来遺伝子が必要である。このプラスミドもポリへドリンポリアデニル化シグナ ルおよびアンピシリン耐性（ＬＪ）遺伝子およびＥ、ｃｏｌｉにおける選択およ び増殖のための複製起点を含有している。

異種ＤＮＡをバキュロウィルスの所望の部位に導入する方法は当該分野で公知で ある。　（ＳｕｍｍａｒおよびＳ＋＊ｉｔｈ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔ ｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｆｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、 １５５５；　Ｓｍ１ｔｈ、ら、ＬＬ全山Ｉ　Ｂｉｏ＋　（１９８３）ｉ：２１５ ６−２１６５；およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕ＋ａ＋１ｅｒｓ、　■Ｌｕ（１９ ８９）１７＋３１参照のこと）。例えば、異種ＤＮＡを、相同組換えによってポ リヘトリン遺伝子のような遺伝子に、または所望のバキュロウィルス遺伝子内に 構築された制限酵素部位に挿入することができる。挿入される配列は、全てのま たは様々なポリタンパク質のセグメントをコードするもの、もしくはウィルスポ リペプチドをコードするその他のｏｒｆであり得る。例えば、この挿入物は、ポ リタンパク質から以下の番号のアミノ酸セグメントをコードすることができた二 アミノ酸１−１０７８　、アミノ酸３３２−６６２；アミノ酸４０６−６６２二 アミノ酸１５６−３２８およびアミノ酸１９９−３２８゜シグナルペプチド開裂 、タンパク質分解開裂およびリン酸化などの、翻訳後改変のためのシグナルは、 昆虫細胞によって認識される。分泌および核内蓄積に要求されるシグナルも、無 を椎動物細胞とを椎動物細胞との間に保存されている。無を椎動物細胞において 効果的なを椎動物細胞からのシグナル配列の実例は、当該分野では公知であり、 例えば、細胞からの分泌をシグナルとして送るヒトインターロイキン−２シグナ ル（ＩＬＬ、）が認識され、昆虫細胞内で適切に除去される。

形質転換は、例えば、ウィルス内のポリヌクレオチドをパッケージングして、宿 主細胞をそのウィルスで形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞 に導入する公知の方法のいずれによっても、および直接ポリヌクレオチドを取り 込むことによっても行われ得る。用いられる形質転換方法は、形質転換される宿 主によって異なる。直接取り込みによるバクテリアの形質転換では、一般に、カ ルシウムまたは塩化ルヒジウムニよる処理を用いる（Ｃｏｈｅｎ、　Ｐｒｏｃ　 Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７２）　６９：２１１０：　Ｔ、Ｍ ａｎｉａｔｉｓら、−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｃ。

ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９８２）　ｏ直接取り込みに よる酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ 　ＵＳＡ　（１９７８）７５：１９２９の方法を用いて行われ得る。直接取り込 みによる哺乳動物細胞の形質転換は、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ 、　Ｖｉｒｏｌ　（１９７８）５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱方法を用い て、または公知の様々なこの方法の改変を用いて行われ得る。組換えポリヌクレ オチドを細胞に、特に哺乳動物細胞に導入するその他の方法としては、デキスト ラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、 ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラストフニージコン、１１＆気 穿孔法、リポソーム内へのポリヌクレオチドの包み込み、および核へのポリヌク レオチドの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。

ベクター構築には当該分野で公知の技術を用いる。部位特異的ＤＮＡ開裂は、一 般にこれらの市販の酵素の製造によって特定される条件の下で、適切な制限酵素 で処理することによって行われる。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ 配列が、約２０μＬの緩衝溶液中で１単位の酵素によって、３７℃で１〜２時間 のインキュベージコンを行うことによって、開裂される。

制限酵素によるインキュベージコンの後、タンノ（り質をフェノール／クロロホ ルム抽出によって除去し、ＤＮＡをエタノールによる沈澱によって回収する。開 裂したフラグメントは、■止」■■虹（１９８０）６５：４９９−５６０に記載 されている一般的処理に従って、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気 泳動法を用いて分離され得る。

付着末端の開裂フラグメントは、この混合物中に存在する適切なデオキシヌクレ オチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を用いてＥ、ｅｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（ フレノウフラグメント）により平滑末端にされ得る。Ｓ１ヌクレアーゼによる処 理も用い得、これは、あらゆる−零値ＤＮＡ部分を加水分解することになる。

標準の緩衝液および温度条件の下で、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼおよびＡＴＰを用い て、連結反応を行う：付着末端連結反応で必要なＡＴＰおよびリガーゼは、平滑 末端連結反応より少ない。ベクターフラグメントを連結混合物の一部に用いる場 合には、そのベクターフラグメントは細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）ま たは仔牛腸由来のアルカリホスファターゼによって処理され、５゛−リン酸基を 除去してベクターの再連結を防ぐことが多い。あるいは、不要のフラグメントの 制限酵素分解はまた、連結を防ぐのに用いることもできる。

連結混合物を、Ｅ、　ｃｏｌｔなどの適切なりローニング用宿主に形質転換し、 組み込まれたマーカー（例えば抗生物質耐性）を用いて優れた形質転換体を選択 し、正しい構築物をスクリーニングする。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ、　ＤＮＡ（１９８４）ｉ：４０１に 記載されている自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製することができる。

必要に応じて、標準的な反応条件の下で、３２Ｐ−ＡＴＰの存在下、ポリヌクレ オチドキナーゼで処理することによりて、合成鎖を３２ｐで標識することができ る。

ｃＤＮＡライブラリーから単離されたものも含めて、ＤＮＡ配列は、公知の技術 、例えば、部位指定変異誘発によって、改変することができる（例えば、Ｚｏｌ ｌｅｒ、　Ｈｕｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８２）１０：６４８７）。簡単に 言うと、改変すべきＤＮＡを一本鎖配列としてファージ内にパフケージングし、 改変すべきＤＮＡの一部に相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして 用い、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡに変換し、この時所望の改変は プライマー配列に含まれる。得られる二本鎖ＤＮＡで、ファージを保持する宿主 バクテリアを形質転換する。このファージの各鎖のコピーを含む形質転換された バクテリアの培養は、寒天培地にプレートし、プラークが得られる。理論的には 、新しいプラークの５０％は、変異した配列を有するファージを含有し、そして 残りの５０％は元々の配列を有する。プラークの複製物は非改変配列をもたない 正しい鎖との／％イブリダイゼーションを可能にする温度と条件下で標識した合 成プローブと！−イブリダイズされる。ハイブリダイゼーションによって同定さ れた配列が回収され、クローニングされる。

ＤＮＡライブラリーは、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの乙！Ｌ１躬 −に■Ｓｅｔ　ＵＳＡ（１９７５）　７３：３９６１の方法を用いて調べること ができる。簡単に言えば、この方法では、調べるべきＤＮＡをニトロセルロース フィルターに固定化し、変性させ、０〜５０％ホルムアミド、０．７５ＭのＮａ Ｃ１，７５＋ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０２％（ｖｔ／ｖ）の各ウシ血清 アルブミン、ポリビニルピロリドンおよびＦｉｃｏｌｌ　＠、５０ｍＭのＮａｔ １２ＰＯａ　（ｐＨ６，５）　、０．１％のＳＤＳ、および１００μｇ／ｍＬの キャリア変性ＤＮＡを含有する緩衝液で、ブレハイプリダイズする。緩衝液内で のホルムアミドのパーセンテージ、およびプレハイブリダイゼーシ藁ンとそれに 続くハイブリダイゼーション工程との時間および温度条件は、必要とされるスト リンジエンシーによって改変する。一般に、低いストリンジエンシーを必要とす るオリゴマープローブは、低いパーセントのホルムアミド、より低い温度、およ びより長いハイブリダイイー２１２時間で用いられる。ｃＤＮＡまたはゲノム配 列に由来するものなど、３０または４０より多いヌクレオチドを含有するプロー ブは、一般に、例えば約４０〜４２℃の高い温度、および例えば５０％という高 いホルムアミドのパーセンテージで用いる。プレハイブリダイゼーシゴンの後、 ５°−３２Ｐ標識されたオリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に加え、ハイブリ ダイゼーション条件の下で、この混合物内でフィルターをインキュベートする。

洗浄した後、処理されたフィルターをオートラジオグラフィーにかけ、ハイブリ ダイズしたプローブの位置を示す；当初のアガー培養上の対応する位置にあるＤ ＮＡを、所望のＤＮＡ源として用いる。

通常のベクター構築のために、結合反応混合物をＥ、ｃｏｌｉのＨ８１０１株ま たはその他の適切な宿主に形質転換し、優れた形質転換体が抗生物質耐性または その他のマーカーによって選択される。そして、形質転換体からのプラスミドを 、Ｃ１ｅｖｅｌｌら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ（１９６９ ）６２：１１５９の方法に従って、通常、クロラムフェニコール増幅（Ｃ１ｅｖ ｅｌｌ、　ＪＢａＣｔｅｉＯｌ（１９７２）１１０：６６７）に引き続いて調製 する。ＤＮＡは、通常制限酵素分析および／または配列決定法によって、単離さ れ、分析される。

配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　 （１９７７）７４：５４６３の方法で、さらにＭｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃ　Ａｃ ’ｄｓ　Ｒｅ５（１９８１）ｉ：３０９によって説明されているジデオキシ法に よって、あるいはＭａＸａｌｌら、　ｅｔｈ　ｎｚ　ｍｏｌ（１９８０）６５： ４９９の方法によって行うことができる。バンド圧縮の問題は、ＧＣ豊富領域で 見られることがあるが、Ｂａｒｒ９Ｌ　１ｏｔｅｃｈ　’　ｕｅｓ（１９８６） ４：４２８に従ってＴ−デアジグアノシン（ｄｅａｚｏｇｕａｎｏｓ　１ｎｅ） を用いることによって克服された。

酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）を、抗原または抗体濃度のいず れかを測定するのに用いることができる。この方法は、酵素の、抗原または抗体 いずれかへの連結に依存し、定量可能標識として結合酵素活性を用いる。抗体を 測定するためには、既知の抗原を固相（例えば、マイクロタイターディツシュ、 プラスチックカップ、ディツプスティ、２り、プラスチックビーズなど）に固定 し、テスト血清希釈物とインキュベートし、洗浄し、酵素で標識された抗イムノ グロブリンでインキュベートし、再び洗浄する。標識に適切な酵素は、当該分野 では公知であり、例えばホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が含ま れる。固相に結合した酵素活性は、通常、特定の基質を添加し、物質の生成また は比色分析により基質の使用を判断することによって測定される。結合酵素活性 は、結合抗体量の直接的関数である。

抗原を測定するためには、既知の特定の抗体を固相に固定し、抗原を含有するテ スト物質を添加し、インキュベーションの後、固相を洗浄し、第二の酵素標識抗 体を添加する。洗浄した後、基質を添加し、酵素活性を比色的に測定し、抗原濃 度と関連づけられる。

本発明のプロテアーゼの活性は、検出可能な開裂生成物を提供する基質を開裂す ることによってアッセイすることもできる。１Ｃｖプロテアーゼは、ゲノムポリ タンパク質から開裂すると考えられるため、タンパク質の発現をアッセイし、活 性を測定するために、この自己触媒活性を用いることもできる。

例えば、ＨＣＶプロテアーゼＮ−末端開裂シグナル（Ａｒｇ−Ａｒｇ）が含まれ るようにプロテアーゼが融合パートナ−と結合されると、発現生成物は、融合パ ートナ−および活性ＨＣＶプロテアーゼに開裂する。生成されたタンパク質がサ イズにおいて、融合パートナ−およびプロテアーゼタンパク質に対応することを 立証するために、例えばウェスタンプロットによってこの生成物をアッセイする こともできる。現在では、小さなペプチドｐ−ニトロフェニルエステルまたはメ チルクマリンヲ用いることが好ましい。そうすると、開裂の後、分光光度計測定 または蛍光アッセイを行い得るためである。Ｅ、　Ｄ、　１１１１ｔａｙｏｓｈ ｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）２４ユニ２３１−３５に記載された方法に 従って、蛍光標識を基質の一端に、クエンチング分子を他端に添加することもで きる：そして得られる蛍光の増加を測定することによって開裂が判断される。適 切な酵素または抗原を融合パートナ−として用いると、生成されるタンパク質の 量は簡単に測定できる。あるいは、ＨＣＶプロテアーゼＮ−末端開裂シグナル（ 自己開裂を抑制する）を排除し、天然のプロセシングシグナルまたは合成アナロ グを含有するＨＣＶ　ＮＳ３ドメインのフラグメントなどの、別の開裂基質を添 加することもできる。

このプロテアーゼ活性がなければ、ＨＣＶポリタンパク質はプロセシングされな い形態のままであり、そのためウィルスを非感染性にする。従って、プロテアー ゼ活性を十分に抑制子る成分がウィルス感染性も阻害するため、このプロテアー ゼは、ＨＣＶの制御のための薬剤アッセイに有用である。このようなインヒビタ ーは有機成分、特にプロテアーゼによって認識されるＨＣＶの開裂部位を模倣す る成分の形態をとり得る。ＨＣＶポリタンパク質の３つの推定開裂部位は、以下 のアミノ酸配列を有する： Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　／／　Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−１ １ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙこれらの部位は、開裂部位の直前に２つの塩基性 アミノ酸が存在することによって特徴づけられ、その他のフラビウイルスプロテ アーゼによって認識される開裂部位に類似している。従って、ＨＣＶ開裂部位の 塩基性／塩基性／小中性モチーフを模倣し、不安定結合を天然基質において開裂 したペプチド結合と置換する、適切なプロテアーゼインヒビターが調製し得る。

適切なインヒビターとしては、ペプチドトリフルオロメチルケトン、ペプチドボ ロン酸、ペプチドα−ケトエステル、ペプチドジフルオロケト化合物、ペプチド アルデヒド、ペプチドジケトンなどが挙げられる。例えば、ペプチドアルデヒド Ｎ−アセチル−フェニルアラニル−グリシンアルデヒドは、プロテアーゼパパイ ンの有力なインヒビターである。参考までに本明細書に援用する、１９８８年５ 月２日出願の米国特許出願−策７７１８９．３１８号（ＰＣＴ第１０８９／１０ ９３１号として公開）に開示された方法を用いて、ペプチドの大量の混合物を調 製し、アツセイすると便利である。この出願は、ペプチドの混合物を、全ての可 能なアミノ酸配列を有するヘキサペプチドまで生成する方法を教示しており、さ らに、プロテアーゼと結合可能なこれらのペプチドを同定する方法を教示してい る。

その他のプロテアーゼインヒビターは、タンパク質、特に抗体および抗体誘導体 であり得る。組換え発現システムを用いて、このプロテアーゼに特異的なモノク ローナル抗体（ＭＡｂｓ）を生成するのに十分な量のプロテアーゼを生成するこ ともできる。プロテアーゼを阻害するための適切な抗体は、酵素活性を減少また は排除するような様式で、典型的には活性部位をおおい隠すように、このプロテ アーゼに結合する。適切なＭＡｂｓを、当該分野で公知の方法を用いて、Ｆａｂ フラグメント、キメラ抗体、改変された抗体、−価の抗体およびシングルドメイ ン抗体などの誘導体を生成するのに用いることもできる。

プロテアーゼインヒビターは、本発明の方法を用いてスクリーニングされる。一 般には、酵素の天然基質を模倣し、開裂した時には定量可能なシグナルを提供す る基質を用いる。

シグナルは比色法または蛍光法によって検出することが好ましい：しかし、ＨＰ ＬＣまたはシリカゲルクロマトグラフィ、ＧＣ−ＭＳ、核磁気共鳴等のその他の 方法も有効である。最適な基質および酵素の濃度を決定した後、候補となるプロ テアーゼインヒビターを濃度の範囲で反応混合物に添加する。アツセイ条件は、 インビボで、プロテアーゼが阻害される条件、つまり生理学的ｐＨ１温度、イオ ン強度等に類似のものであることが理想である。適切なインヒビターは、被験体 に毒性副作用を起こさせない濃度で、強いプロテアーゼ阻害を示す。プロテアー ゼ活性部位への結合について競合するインヒビターは、基質濃度と同等あるいは それ以上の濃度を必要とし、他方、プロテアーゼ活性部位に不可逆的に結合する ことのできるインヒビターは、酵素濃度のオーダーの濃度で添加し得る。

本願の好ましい実施態様においては、活性酵素ではなく、不活性のプロテアーゼ 変異タンｔ４り質を用いる。プロテアーゼの活性部位内の重要残基を置き替え（ 例えば、セリンプロテアーゼの活性部位Ｓｅｔを置き替え）でも、酵素の構造を 有意には改変させず、結合特異性が保たれる。改変させられた酵素は、それでも 適切な基質を認識し、それに結合するが、開裂を起こさせることはできない。従 って、本発明の方法の１つによると、不活性化されたＨＣＶプロテアーゼは固定 化され、候補となるインヒビターの混合物が添加される。酵素の好ましい認識配 列を詳細に模倣するインヒビターは、その他の候補のインヒビターよりうまく結 合のために競合する。うまく結合できない候補は、そこで分けられ、結合の強い インヒビターが決定される。例えば、ＨＣＶプロテアーゼは、Ａｌａを一３ｅｔ ２２＋（図１の）に置き換えて調製され、ＨＣＹプロテアーゼ基質に結合は可能 であるが、それを開裂させることはできない酵素を提供する。そして、得られた プロテアーゼ変異タン／ｆり質は、例えば５ｅｐｈａｄｅｘ■ビーズなどの固体 支持物に結合され、カラムに詰められる。そして、候補のプロテアーゼインヒビ ターの混合液をカラムに通し、画分を集める。溶出する最後の画分は、最も結合 の強い化合物を含有し、好ましいプロテアーゼインヒビター候補を提供する。

プロテアーゼインヒビターは、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内、鼻腔内など、様 々な方法で投与し得る。好ましい投与経路は、インヒビターの性質による。有機 化合物として調製されたインヒビターは、吸収性がよい場合には、経口で投与さ れる（一般にこれが好ましい）。（はとんどの抗体誘導体などの）タンパク質を 基礎とするインヒビターは、一般に、非経口的経路による投与を行わねばならな い。

（以下余白） Ｃ１Ｌ立五 下記に示す実施例は当該分野の通常の技術を有する実験者にさらなるガイドとし て提供されるものであって、本発明をいかなる点においても限定することを意図 するものではない。

爽思」Ｌ （ＨＣＶ　ｃＤＮＡの調製） ＨＣＶ　ｃＤＮＡのゲノムライブラリーを、ＰＣＴ　ＷＯ３９１０４６６９９お よびＵＳＳＮ　７／４５６，６３７に記載のように調製した。このライブラリー 、ＡＴＣＣ受託番号第４０３９４号は、以下に説明するように寄託されている。

爽思」組 （クローン５−１−１にコードされたポリペプチドの発現）（Ａ）りｏ　−７５ −１−１（実施例１参照）内にコードされたＨＣＩ／ポリペプチドは、ヒトスー パーオキシドジスムターゼ（５ＯＤ）との融合ポリペプチドとして発現した。こ れは、下記のように発現ベクターｐｓＯＤｃＦ１　（Ｌ　Ｓ、　Ｓｔｅｉｍｅｒ ら、　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　（１９８６）　５炙：９；　ＥＰｏ　１３８．１１１） 内にクローンＳ−１−１ｃＤＮＡ挿入物をサブクローニングすることによって達 成した。この５ＯＤ１５−１−１発現ベクターを、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細 胞に形質変換した。Ｅ、ｃｏｌｉ内のＣｆ１／Ｓ−１−１と命名されたこれらの 細胞は、以下に説明するように寄託され、ＡＴＣＣ受託番号第６７９６７号を有 している。

まず始めに、ｐｓＯＤｃＦｌから単離されたＤＮＡを、　Ｂａｉ＋旧およびＥｃ ｏＲＩで処理し、下記のリンカ−を、制限酵素によって生じた直鎖状ＤＮＡに連 結した： ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＣＣＴ　ＴＡＡ　 ＧＡＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＡクローニングした後、この挿入物を有するプラスミ ドを単離した。

この挿入物を有するプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した。クローン５−１−１内 のＨＩＭ　ｃＤＮＡ挿入物を、ＥｃｏＲＩで切り出し、このＥｃｏＲ■直鎖化し たプラスミドＤＮＡに連結した。このＤＮＡ混合物を、Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｄ１２１ ０　（Ｓａｄｌｅｒら、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　８：２７９）を形質転換す るために使用した。図１に示したＯＲＦを発現するための適切な配向にある５− １−１ｃＤＮＡの組み換え体を、制限地図の作成およびヌクレオチド配列決定に よって同定した。

１つのクローン由来の組み換え体バクテリアを、ＩＰＴＧの存在下でバクテリア を増殖させて、５ＯＤ−ＨＣＶｓ−１−＋ポリペプチドを発現するよう誘導した 。

３つの新たなリンカ−（ＡＢ、　ＣＤ、およびＥＦ）を、ベクターｐｓＯＤｃＦ １をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨで完全に消化し、その後アルカリホスファターゼ で処理して得られたＢａｍＨ［−ＥｃｏＲ［フラグメントに連結して、３つの異 なる発現ベクター（＋）ｃｆｌＡＢ、　ｐｃｆｌｃＤ。

およびｐｃｆｌＥＦ）を作成した。これらのリンカ−は、６つのオリゴマー、Ａ ＳＢ、　Ｃ，Ｄ、　Ｅ、およびＦから作成した。その相補的オリゴマーにアニー リングする前に、各オリゴマーを、ＡＴＰ存在下でキナーゼ処理し、リン酸化し た。合成リンカ−の配列は、下記の通りであった： Ｌ　ＤＮＡ　ｙｌ　５’　から３′ Ａ　ＧＡＴＣＣｒＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＴＧＡ　ＴＡＡＢ　ＧＡＣＴｒＡ　ＡＧＧ 　ＡＣｒ　ＡＴｒＴＴＡＡＣＧＡＴＣＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴ”Ｇ　ＴＧＡ　ＴＡ ＡＤ　ＧＣＴ　ＴＡＡ　ＧＡＣＡＣｒ　ＡＴＴＴＴＡＡ３つのリンカ−の各々は 、本来のＥｃｏＲ１部位を破壊し、リンカ−内（但し別のリーディングフレーム 内）に、新しいＥｃｏＲ■部位を形成する。従って、クローンから単離されたＨ ＣＶ　ｃＤＮＡ　ＥｃｏＲＩフラグメントは、発現ベクターに挿入された際、３ つの異なるリーディングフレーム内に存在していた。

指定のｇｔｌｌクローン内のＨＣＶ　ｅＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩで消 化して切り出した；各フラグメントを、ｐｃｆｌＡＢ、　ｐｃｆｌｃＤ、および ｐｃｆｌＥＦ内に挿入した。その後、これらの発現構築物をＤＩ２１０　Ｅ、ｃ ｏｌｉ細胞に形質転換し、この形質転換体をクローニングし、ポリペプチドを以 下のＢ項に記載するように発現させた。

（Ｂ）指定されたＨＣＶ　ｃＤＮＡの発現生成物の抗原性を、Ｈｅｌｆｍａｎら 、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８３）、　８０：３ １に記載の方法の改変を用い、コロニーの直接的免疫学的スクリーニングによっ て、試験した。簡潔に述べると、アンピシリンプレートを覆ったニトロセルロー スフィルター上にバクテリアをプレートシ、フィルター当り約４０コロニーを得 た。コロニーヲ、二トロセルロースフィルター上にレプリカプレートし、このレ プリカを一晩２■Ｍ　ＩＰＴＧおよびアンピシリンの共存下で再増殖させた。Ｃ ＨＣｌ３蒸気の飽和雰囲気中で約１５から２０分間ニトロセルロースフィルター を懸濁し、バクテリアのコロニーを溶解した。その後、各フィルターを、１０　 ｍＬの５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＬ、　ｐＨ７，５、１５０ｍＭ　ＮａＣ１， ５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．　３％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ、４０ｕ　ｇ／ｌｎＬリゾチー ム、およびＱ、　１μｇ／ｗＬ　ＤＮａｓｅを含む別々の１００■ペトリ皿に入 れた。このプレートを、室温で少なくとも８時間穏やカニ攪拌した。コノフィル ターをＴＢＳＴ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、　ｐＨ８，０，１５０ｍＭ　 ＮａＣ１，０，００５％Ｔｗｅｅｎ■２０）で洗浄した。インキュベートの後、 細胞残渣を洗浄し、１０％ヒツジ血清を含むＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ■を除いたＴＢ ＳＴ）中で１時間インキュベートした。その後、フィルターをＮＡＮＢ■を有す る個体からのＴＢＳ中の前処理された血清でインキュベートした。これらの個体 は、チンパンジー３匹；■Ｃ’／　Ｃ１００−３ポリペプチド（Ｃ１００とも呼 ばれる）に対する抗体に陽性を示す血清を持つ、慢性ＮＡＮＢＨを有する患者８ 人；抗Ｃ１００抗体に対して陰性を示す血清を持つ、慢性ＮＡＮＢＨを有する患 者８人；抗Ｃ１００抗体に対して陰性を示す血清を持つ、回復期患者１人；およ び抗Ｃ１００抗体に対して強い陽性を示す血清を有する１人、抗Ｃ１００抗体に 対してぎりぎりの陽性を示す血清を有する１人を含む、地域獲得性ＮＡＮＢＨを 有する患者６人を含む。ＴＢＳで希釈された血清を、３７°Ｃで少なくとも３０ 分間ｈｓＯＤで前吸収することにより、前処理した。インキユベーションの後、 フィルターをＴＢＳＴで３０分間ずつ２回洗浄した。血清中で抗体と結合した発 現タンパク質を、１２５１−標識されたヒツジ抗ヒト抗体で２時間にわたってイ ンキュベートして、標識した。洗浄の後、フィルターをＴＢＳＴで３０分間ずつ ２回洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行った〇 亙１１は （５ＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質全長のクローニング）（Ａ）日別２２− Ｃ２岨： 以下で使用したＨＣＶ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、これらのファージから 切り出されたｃＤＮＡをクローン５−１−１から単離したｃＤＮＡで置換したこ と以外は、実質的に上記で記載したようにして決定した。

クローンＣ３３ｃを、下記の配列： ５°ＡＴＣＡＧＧ　ＡＣＣＧＧＧ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＣＣＡ ＣＴ　３゜を有スるハイブリダイゼーションプローブを用いて、単離した。クロ ーンＣ３３ｃ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列を、図８に示す。図８は、その中にコ ードされているアミノ酸も示す。

クローン３Ｓを、配列： ５°ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＴＧＴ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＣＴＣＡＡＧ 　ＣＣＣ３゜を有する合成ポリヌクレオチドでスクリーニングして、単離した。

５０．０００個のクローン中約工個が、プローブとハイブリダイズした。Ｃ３５ のポリヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を、図７に示す。

クローンＣ３１を、図６に示す。図６は、その中にコードされてＥｃｏＲＩおよ び旧ｎｆ＋で消化して得られた７１８　ｂｐフラグメント、クローンＣ３１ＤＮ ＡをＨｉｎｆｌおよびＢｇｌ　Ｉで消化して得られた１７９ｂｐフラグメント、 およびクローンＣ３５ＤＮＡをＢｇｌｌおよびＥｃｏＲＩで消化して得られた３ ７７　ｂｐフラグメントを連結することにより、構築した。フラグメントを連結 して得たこの構築物を、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に挿入し、プラスミドｐ ＢＲ３２２−Ｃ２００を生成した。

（Ｂ）　Ｃ７ｆ＋Ｃ２０ｃ： クローン７ｆを、配列： ５°−ＡＧＣＡＧＡ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　ＧＣＣＴＣＣＴＡＧ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　 ＴＡＡ　Ｔ−３゜を有するプローブを用いて、単離した。クローン７ｆ内のＨＣ ＶｃＤＮＡの配列、およびその中にフードされたアミノ酸を、図５に示す。

クローンＣ２０ｃを、下記の配列： ５°−ＴＧＣＡＴＣＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＴＧＣＴＧＧ−３゜を用いて単離 する。

クローンＣ２Ｏｃ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびその中にコードされたア ミノ酸を、図２に示す。

クローン７ｆおよびＣ２０ｃをＥｃｏＲＩおよび５ｆａＮ＋で消化し、４００ｂ ｐおよび２６０　ｂｐフラグメントをそれぞれ形成した。その後、これらの７ラ グメントをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位にクローニングし、ベクターＣ７ｆ＋ Ｃ２０ｃを形成し、ＨＢＩＯＩ細胞に形質変換した。

（ｃ）姐並： クローン８ｈを、クローン３３ｃ中のヌクレオチド配列に基づいたプローブを用 いて単離した。このプローブのヌクレオチド配列は、 ５−ＡＧＡ　ＧＡＣＡＡＣＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＣＣＣＣＧＧＴ　ＧＴＴ　Ｃ− ３゜であった。クローン８ｈ内のＨＣＶ　ｃＤＮＡの配列、およびその中にコー ドされたアミノ酸を、図４に示す。

クローンＣ２６ｄを、下記の配列： ５−ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＴＧＣＣＣＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣ−３゜を有するプロ ーブを用いて単離する。

クローンＣ２６ｄの配列およびアミノ酸翻訳を、図３に示す。

クローンＣ２６ｄおよびＣ３３ｃ　（上記Ａ項を参照）を、メチル化マイナスＥ 、ｃｏｌｉ株ＧＭ４８に形質変換した。クローンＣ２６ｄをＥｃｏＲＩＩおよび Ｄｄｅｌで消化し、ｉｏｏ　ｂｐフラグメントを得た。クローンＣ３３ｃをＥｃ ｏＲＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｔｏｏ　ｂｐ７ラグメントを得た。クロー ンＣ８ｈをＥｃｏＲＩおよびＤｄｅｌで消化し、２０８　ｂｐフラグメントを得 た。その後、これらの３つのフラグメントを、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に 連結し、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩに形質変換し、ベクターＣ３０Ｇを得た。

（Ｄ）クローン　の ＥｃｏＲＩおよびＮａ１ｌで消化してＣ７ｆ＋Ｃ２０ｃから６００　ｂｐフラグ メントを得、Ｃ３００からの９４５　ｂｐ　Ｎａｅ［／ＥｃｏＲ［７ラグメント に連結して、この構築物をｐＧＥＭ４ＺのＥｃｏＲ１部位（Ｐｒｏｍｅｇａから 市販で入手可能）に挿入して、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００を形成した。

Ｃ７ｆＣ２０ｃＣ３００を、ＮｄｅｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、８９２　ｂｐ フラグメントを得た。これは、Ｃ２００をＮｄｅｌおよびＥｃｏＲＩで消化して 得られた１１６０　ｂｐフラグメントに連結した。得られた構築物を、ｐＢＲ３ ２２のＥｃｏＲ１部位に挿入し、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００を得 た。このベクターの構造を、図９に図式的に示す。

爽１」■ （Ｅ、ｃｏｌｉ発現ベクターの調製） （Ａ）■■川用並 このベクターは、機能性ｈｓＯＤリーダーに融合した、全長のＨＣＶプロテアー ゼコーディング配列を含んでいる。ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２０Ｇを 、ＥｃｏＲＩで開裂して２０００　ｂｐフラグメントを得た。これを、その後プ ラスミドｃｆｌｃＤのＥｃｏＲ１部位に連結した（実施例２Ａ）。得られたベク ターは、ｈｓＯＤのアミノ酸１−１５１およびＨＣｖのアミノ酸９４６−１６３ ０　（、図１のアミノ酸１−６８６に対応して、ポリプロティンの始めから番号 付けされている）をコードする。このベクターは、ｃｆｌｓＯＤｐ６００と明示 され（しばしばＰ２Ｏ３と呼ばれる）、Ｅ、ｃｏｌｉ　０１２１０細胞に形質転 換された。

これらの細胞（ＡＴＣＣ受託番号第６８２７５号）を以下で説明するように寄託 した。

（Ｂ）肛封： 切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆ＋Ｃ２０ｃから６ ００　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｎａｅｌフラグメントを切り出し、このフラグメント をフレノウフラグメントで平滑にし、ｃｆＬＥＦのフレノウで平滑にされたＥｃ ｏＲ１部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した（実施例２Ａ）。この ポリヌクレオチドは、ｈｓＯＤのアミノ酸１−ｔｓｔおよびＨＣ’／プロテアー ゼのアミノ酸１−１９９を有する融合タンパク質をコードする。

ＣＧ）Ｐ３姐： さらに長い切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆＣ２０ ｅＣ３００から８９２　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｎａｅｌフラグメントを切り出し、 このフラグメントをフレノウフラグメントで平滑にし、ｃｆｌＥＦのフレノウで 平滑にされたＥｃｏＲ１部位にこの平滑フラグメントを連結して、調製した。こ のポリヌクレオチドは、ｈＳＯＤのアミノ酸１−１５１およびＢＣＶプロテアー ゼのアミノ酸１−２９９を有する融合タンパク質をコードする。

（Ｄ）■岨： さらに長い切り形のＳＯＤプロテアーゼ融合ポリヌクレオチドを、Ｃ７ｆＣ２０ ｃＣ３００から１５５０１）ｐ　ＥｃｏＲ１／ＥｃｏＲＩフラグメントを切り出 し、このフラグメントをｃｆｌｃＤのＥｃｏＲ１部位に連結して調製し、　ｐｓ ｏｏを形成した。このポリヌクレオチドは、ｈｓＯＤのアミノ酸ｌ−１５１およ びＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸９４６−１４５７を有する融合タンパク質をフ ードする（図１のアミノ酸１−５１３）。

（Ｅ）　ＦＬＡＧプロテアーゼ　ム このベクターは、Ｈｏｐｐら　（１９８８）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　６：　 １２０４−１２１０のＦＬＡＧ配列に融合した全長のＨＣＶプロテアーゼコーデ ィング配列を含んでいる。ＰＣＲを用いて、クローニングを容易にするための特 定の制限末端を有する、ＨＣＶプロテアーゼ遺伝子を生成した。プラスミドｐ５ ００を、ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅｌで消化し、９ｏｏ　ｂｐフラグメンントを生 成した。このフラグメントおよび２つのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応に使 用し、１９９０年１０月４日公開ノＷ０９０／１１０８９の図１７に示されるよ うに、ＨＣｖ−１１１７）　アミノ酸１００９位で固有のＢｇｌ１１部位を有し 、アミノ酸１２６２位でＳａｌ１部位を有する停止コドンを有するものを導入し た。このプライマーの配列は下記のとおりである：５°ＣＣＣＧＡＧ　ＣＡＡ　 ＧＡＴ　ＣＴＣＣＣＧ　ＧＣＣＣ３゜および ５°ＣＣＣＧＧＣＴＧＣＡＴＡ　ＡＧＣＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　−ＧＧＡ　３ °。

ＰＣＨの３０サイクルの後、反応物をＢｇｌｌ＋およびＳａｌ　Ｉで消化し、７ １０　ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントをアニールし、下記の二 本鎖に連結した。

この二本鎖は、ＦＬＡＧ配列、イニシエーターであるメチオニン、および５°Ｎ ｅａｔ制限部位をコードする。得られたＮｃｏｌ／Ｓａｉ＋フラグメントをｐｃ Ｆｌの誘導体に連結した。

その後、この構築物をＥ、Ｃｏ１１　Ｄ１２１０細胞に形質転換し、ＩＰＴＧを 加えてプロテアーゼの発現を誘発した。。

ＦＬＡＧ配列をＨＣＶプロテアーゼに融合し、精製を促した。ＦＬＡＧでフード されたペプチドに結合するカルシウム依存性モノクローナル抗体を、厳しい溶離 条件を用いずに融合タン／ｆり質を精製するために使用する。

支」■ ’　（ＳＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質のＥ、　ｃｏｌ　ｉ発現）（Ａ）　 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞を、ｃｆ　ｌ５ＯＤｐ６００で形質転換し、１０ ０μｇ／■Ｌアンピシリンを含むルリア液（Ｌｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）中で、Ｏ Ｄを０．３−０．５まで増殖させた。その後、ＩＰＴＧを２ｍＭの濃度まで加え 、細胞を培養して、０．９から１．３の最終ＯＤにした。その後、この細胞を溶 解し、ＵＳＳＮ　７／４５６，６３７に記載のように抗ＨＣＶ血清を用いてウェ スタンプロット法により、溶解物を分析した。

全長（理論的にはＭｒ　９３　ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、 その結果、開裂の発生が示された。ｈｓＯＤ融合パートナ−および分離したＦｉ ＣＶプロテアーゼに対応するバンドは、約３４．５３．６６　ｋＤａの相対分子 量で現れたｏ　３４　ｋＤａバンドは、ＮＳ３ドメインの一部分のｈｓＯＤパー トナ−（約２０　ｋＤａ）に対応し、５３および６６　ｋＤνインドは、（恐ら くバクテリアによる）プロセシングの種々の程度のＨＣＶプロテアーゼに対応す る。

（Ｂ）　Ｅ、Ｃｏ１１　Ｄ１２１０細胞を、ｐｓｏｏで形質転換し、１００μｇ ／ｍＬアンピシリンを含むルリア液中で０．３−０．５のＯＤまで増殖させた。

その後、ＩＰＴＧを２＋ｅＭの濃度まで加え、細胞を培養して、０．８から１． ０の最終ＯＤにした。その後、この細胞を溶解し、溶解物を上記のように分析し た。

全長（理論的にはＭｒ　７３　ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、 その結果、ここでも開裂の発生が示された。ｈｓＯＤ融合パートナ−および切り 形のＨＣＶプロテアーゼに対応するバンドは、約３４および４５　ｋＤａの分子 量でそれぞれ現れた。

（Ｃ）　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０細胞を、ベクターＰ３００およびＰ２Ｓ５で 形質転換し、上記のように増殖させた。

全長（理論的にはＭｒ　５１　ｋＤａ）の生成物はゲル上に現れなかったので、 Ｐ３００発現の結果は開裂の発生を示した。ｈｓＯＤ融合パートナ−に対応する バンドは、約３４の相対分子量で現れた。

ＮＳ３ドメインのこの部分は生成物を検出するために使用される血清によって認 識されないので、対応するＨＣＶプロテアーゼバンドは目視により確認されなか った。しかし、ｈｓＯＤバンドが５１　ｋＤａではなく、３４　ｋＤａで現れて いるので、開裂が生じていることがわかる。

Ｐ１９０発現生成物は、開裂のない全長の（フードされた）生成物としてのみ現 れ、約４０　ｋＤａのバンドを形成した。これは、開裂していない生成物の理論 的分子量に対応する。これは、ＨＣＶプロテアーゼの最小必須配列が、アミノ酸 の１９９位と２９９位との間の領域にわたることを示している。

尖１」組 （Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ発現プロテアーゼの精製）実施例５で発現したＨＣＶプロテ アーゼおよびフラグメントは、下記のように精製され得る。

ポリペプチドが発現したバクテリア細胞を、浸透圧シー１２りおよび機械分断に かけ、プロテアーゼを含む不溶性画分を単離し、アルカリ性−ＮａＣＩ溶液によ り分離抽出し、この抽出物中のポリペプチドを、Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｏお よびＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ■のカラム上でクロマトグラフィーにかけて精製し た。

浸透圧ショックおよび機械分断によって得られた粗製の抽出物を、０．０２　Ｍ 　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１０ｒｎＭ　ＥＤＴＡ、　２０％スクロー スを含む１０　ｍＬの溶液中でＩｇの充填細胞を懸濁し、氷上で１０分、間イン キュベートして調製する。その後、この細胞を４°Ｇで４，０００　ｘ　ｇで１ ５分間遠心し、ベレット化する。上溝を除去した後、１０　ｍＬの緩衝液Ａｌ　 （０，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、　ｐＨ７，５、Ｌ　ｄ　ＥＤＴＡ、　１４　 ｍＭβ−メルカプトエタノール−「βＭＥＪ　）中に、この細胞ベレットを再懸 濁し、１０分間氷上でインキュベートする。

この細胞を、４°Ｇで４，０００　ｘ　ｇで１５分間再びベレット化する。

透明な上清（ペリプラズム画分Ｉ）を除去した後、この細胞ベレットを緩衝液Ａ ｌ中で再懸濁し、１０分間水上でインキュベートシ、再び４°Ｇで４．０００　 ｘ　ｇで１５分間遠心する。透明な上清（ペリプラズム画分■）を除去し、この 細胞ベレットを５゜Ｌの緩衝液Ｔ２　Ｃ０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ ７，５，１４１ＭβＭＢ、　１　ｍＭＥＤＴＡ、　１■Ｍ　ＰＭＳＦ）中に再懸 濁する。細胞を破壊するために、懸濁液（５■Ｌ）および７，５■Ｌの鉛を含有 しない酸性洗浄されたＤｙｎｏ−ｍｉ　１１ガラズビーズ（直径０．ＬＯ−０， １５ｍｍ）　（Ｇｌｅｎ−Ｍｉｌｌｓ−ドで２分間回転させた後、氷上で少な（ とも２分間冷却する。

この回転冷却工程を、さらに４回繰り返す。回転の後、スラリーを、弱い吸引を 用いて、焼結したガラス漏斗を介して濾過し、このガラスピーズを緩衝液＾２で ２回洗浄し、濾液と洗浄液とを合わせた。

粗製の抽出物の不溶性画分を、４℃で２０，０００　ｘ　ｇで１５分間遠心して 集め、緩衝液Ａ２１０　ｔａＬで２回洗浄し、５鱈のＭ　ＩＬＬ　Ｉ−Ｑ水中に 再懸濁する。

この懸濁液にＮａＯＨ（２Ｍ）およびＮａＣ１（２Ｍ）を加えてそれぞれが２０ 　ｓ＋Ｍとなる最終濃度物を生成し、この混合物を１分間回転し、これを４℃で ２０．Ｇｏｏ　Ｘ　ｇで２０分間遠心し、上清を維持することにより、ＨＣＶプ ロテアーゼを含む画分を不溶性物質から単離する。

その後、この部分的に精製されたプロテアーゼを、　５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけて 精製する。このプロテアーゼは、ウェスタンプロット法によす同定され得、この バンドはゲルから切り出される。その後、プロテアーゼをこのバンドから溶出し 、アミノ酸配列を確認するために分析する。Ｎ末端配列は自動アミノ酸シークエ ンサーを使用して分析され得、Ｃ末端配列は一連のトリプシン消化フラグメント の自動アミノ酸シークエンシングにより分析され得る。

（以下余白） 爽Ｗ （酵母発現ベクターの調製） （Ａ）　Ｐ６５０ＳＯＤプロテアーゼ　４このベクターは、５°末端でＳＯＤコ ーディング配列と融合した野生型全長ＨＣＩ／プロテアーゼのコーディング配列 を含んでいるＨＣＶ配列を有する。２つのフラグメント（クローン１１ｂ由来の ４４１　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌｌＩフラグメントおよび発現ベクターｐｓｏ ｏ由来の１４７ｆ　ｂｐ　ＢｇｌｌＶＥｃｏＦ１１フラグメント）を、野生型全 長ＨＣＶプロテアーゼコーディング配列を再構築するために使用する。

これらの２つのフラグメントは、ｐｓ３５６ベクターをＥｃｏＲＩで消化したベ クターに連結して、発現カセットを生成した。この発現カセットは、ＡＤＨ２／ ＧＡＰＤＨハイブリッド酵母プロモーター、ヒトＳＯＤ、　ＨＣＶプロテアーゼ 、およびＧＡＰＤＨ転写ターミネータ−をコードする。得られたベクターを、Ｂ ａｌ■！で消化し、４０５２ｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントを ｐＡＢ２４をＢａ寵Ｈ１で消化したベクターに連結して、ｐａｓｏを生成した。

ｐａｓｏは、１９９０年１０月４日公開の１０９０／１１０８９の図１７に示さ れるように、アミン末端から、ｈｓＯＤのアミノ酸１−１５４、オリゴペプチド −Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−１１ｅ−Ａｒｇ−１および■ＣＶ−１のアミノ酸 ８１９から１４５８までを含む、ポリプロティンを発現する。

りａ−ンｌｌｂを、上記実施例３ＡＪこ記載のように下記の配列：Ｓ″ＣＡＣＣ ＴＡ　ＴＧＴ　ＴＴＡ　ＴＡＡ　ＣＣ＾、ＴＣＴ　ＣＡＣＴＣＣＴＣＴ　３゜を 有するへイプリダイゼーン璽ンプロープを用いて、ＨＣＶ　ｃＤＩＩＩ（ムＴＣ Ｃ受託番号東４０３９４号）のゲノムライブラリーから単離した。

この工程もまた、ＥＰＯ公報第３１１１２１６号、実施例ＩＶ、Ａ、１７ニ記載 されている。

ｐＢＲ３２２からの誘導体であるベクターｐＳ３ＥＦは、ヒトスーパーオキシド ジスムターゼ（ＳＯＤ）の遺伝子の上流にＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨハイブリッド酵 母プロモーター、アダプター、および下流に酵母機能性転写ターミネータ−を含 む。これらのコントロールエレメントおよびスーパーオキシドジスムターゼ遺伝 子を含む同様の発現ベクターは、Ｃｏｕｓｅｎｓら（１９８７）　江■６１：２ ６５、および１９８６年１０月１日に公開された同時係属中の出願ＥＰＯ１９６ ，０５６に記載されている。しかし、ｐＳ３ＥＦは、異種プロインシュリン遺伝 子およびイムノグロブリンヒンジを欠失してており、ＳＯＤのＧｌｎ＋ｓ４がＥ ｅｏＲ１部位を有するアダプター配列に続いている点で、Ｃｏｕｓｅｎｓらのも のとは異なっている。このアダプターの配列は： ５’　ＭＴ　’ｒ’ｒＧ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＡ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　 ｋＡＧ　３’３’　ＡＣＣＣＴ　ＴＡＡ　にＧＴ　ＡＴＴ　ＡＡＴ　ＴＡＡ　Ｔ ＴＣＡＧＣＴ　５’である。このＥｃｏＲ１部位は異種配列の挿入を促進し、一 度ｐＳ３ＥＦに挿入されると、ＳＯＤが異種配列に結合しているオリゴペプチド を含むＳＯＤ融合物が発現する。ｐＳ３ＥＦは、ｐＳ３５６が異なるアダプター を有する点を除いてｐｓ３５６と全く同じである。このアダプターの配列を以下 に示す： ５’　ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＡ　ＴＧＡ　Ｇ　３’３ ’　ＡＣＣＣＴ　ＴＭ　ＧにＴ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＴ　５’ｐＳ３５ ６　（ＡＴＣＣ受託番号第６７６８３号）は、下記に説明される゛ように寄託さ れる。

プラスミドｐＡＢ２４は酵母用シャトルベクターであり、ｐＢＲ３２２配列、酵 母のＤＮＡ複製のための完全な２μ配列（Ｂｒｏａｃｈ　（１９８１）：　ｏｌ ｅｃｕ　ａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ａ ｓｓ、　Ｖｏｌ。

１、　ｐ、４４５．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓに記 載）、およびＥＰＯ公報第１１６２０１に記載のプラスミドｐｃ１／１に由来す る酵母ＬＥＤ”遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＡＢ２４を、部分的な２ミク ロン配列を除去するようＹＥｐ２４をＥｃｏＲＩで消化し、このベクターに再連 結して、構築した。得られたプラスミドであるＹＥｐ２４デルタＲ１を、Ｃ１ａ ｌで直鎖化し、Ｃ１ａｌで直鎖化された完全な２ミクロンプラスミドに連結した 。その後、得られたプラスミドであるｐＣＢｏｕをＸｂａｌで消化し、ａｓｏｓ 　ｂｐベクターフラグメントをゲル上で単離した。この単離されたＸｂａｌフラ グメントを、ｐｃ１／１から単離されたＬＥＵ”遺伝子を含む４４６０　ｂｐ　 Ｘｂａｌフラグメントと連結したｉ　ＬＥＤ”遺伝子の配向は、ＵＩＩＡ３遺伝 子と同じである。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、　２１５０−２−３　（ｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ ２）　（受託番号第２０８２７号）は、下記に説明するようにＡｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されてる。このプラス ミドｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２は、酵母細胞から周知の技術で回収され得る 。ＧＡＰ−ｅｎｖ２発現カセットは、ｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２をＢａ１１ 旧で消化して除去され得る。

ｐＡＢ２４を、このＢａｍＨＩ挿入物を持たないベクターに再連結して回収する 。

実１」」 （ＳＯＤ−プロテアーゼ融合タンパク質の酵母発現）ｐａｓｏをＳ、　Ｃｅｒｅ ｖｉｓａｅ株ＪＳＣ３１０，Ｍａｔａ、　Ｌｅｕ２．　ｕｒａ３−５２．　ｐｒ ｂ！−１１２２，ｐｅｐ４−３．　ｐｒｃｌ−４０？、　ｃｉｒ’　＋　ＤＭ１ ５　（ｇ４１８耐性）中に、形質転換した。この形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら（ １９７ｇ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌｃａｄ　Ｓｃ’　ＵＳＡ　７５：１９２９によ って記載されているように行なった。形質転換された細胞を、８％グルコースの ｕｒａ−プレート上で選択した。このプレートを３０℃で４−５日間インキュベ ートした。この形質転換体を、多数のｐ６５０プラスミドを推定して、さらに８ 駕グルコースの１ｅｕ−プレート上で選択した。１ｅｕ−プレートからのコロニ ーを、３％グルコースの１ｅｕ−培地に接種した。

この培養物を３０℃で２日間振とうし、その後、２％グルコースのＹＥＰＤ溶媒 中に１７２０に希釈し、３０℃でさらに２日間振とうした。

Ｓ、ｃｅｒａｖｔｓａｅ　ＪＳＣ３１０は、１９８９年１１月８日公開のＥＰＯ 公報第３４０９８６号に記載のＤＭ１５　ＤＮＡを含む。このＤＭ１５　ＤＮＡ は、異種タンパク質の弘統制発現を強化する。ｐＤＭ１５　（受託番号第４０４ ５３号）は、下記に説明されるようにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されてる。

実１」」 （成熟１１ＣＶプロテアーゼの酵母ユビキチン発現）成熟ＨＣＶプロテアーゼを 、ベクターＣ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００をＥｃｏＲＩで゛開裂して２Ｋｂコ ーディング配列を得、°ここに参考として援用されている１９８８年４月７日公 開のＷＯ３８１０２４０６または１９８９年８月７日出願のＵＳＳＮ７／３９０ ．５９９に記載のように、適切なリンカ−を用いて、この配列をユビキチン発現 ベクターに挿入することにより、調製する。成熟ＨＣＶプロテアーゼを、適切な 宿主、特に酵母中のベクターでの発現により回収する。特に、実施例８に記載の 酵母発現プロトコールを、ユピキチン／ＨＣＶプロテアーゼベクターを発現する ために使用する。

支度大川 （インビトロ発現ベクターの調製） （Ａ）ＧＥＭ■−３Ｚ　ｌ−−ヘク　−４つの合成りＮＡフラグメントをアニー ルし、連結して°。

ＥｃｏＲＩ／Ｓａｃ＋黄熱病リーダーをつくり、Ｐｒｏｍａｇａ■からのＥｃｏ Ｒ１／Ｓａｃ　Ｉ消化したｐＧＥＭ■−３２ベクターに連結した。この４つのフ ラグメントの配列を以下に挙げる： ＹＦＫ−１： ５’ＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＣＴＡＡ丁ＴＧＡＧＧＴＧＣＡＴ ｒＧＧＴＣＴＧＣＡＡＡ　ＴＣＧ　ＡＧＴＴＧＣＴ、ＡＧ　ＧＣＡ　ＡＴＡ　Ａ ＡＣＡＣＡ　Ｔｒ３゜ＹＦＫ−２： ５’　ＴＡＴ　ＴＧＣＣｒＡ　ＧＣＡ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＴｒＴ　ＧＣＡ　ＧＡ ＣＣＡＡ　ＴＧＣＡＣＣＴＣＡ　ＡＴｒＡＧＣＡＣＡ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＴｒＡ 　ＣＧ　３゜ＹＦＫ−３： ５’　ＴＧＧ　ＡＴｒ　ＡＡＴ　ｍ　ＡＡＴ　ＣＧＴ　ＴＣＧ　ＴｒＧ　ＡＧＣ ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡＡＣＴ　ＧＡＣＣＡＧ　ＡＡＣＡＴＧ　ＴＣＴ ’　ＧＡＧ　ＣＴ　３゜ＹＦＫ−４： ５’　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＴｒＣＴＣＴ　ＧＣ Ｔ″ＡＡＴ　ＣＧＣＴＣＡＡＣＧ　ＡＡＣＧＡＴ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　Ｔ、す、　 ＴＣＣＡ／誠Ｔω゛Ｇπ３゛。

ＨＣＶプロテアーゼのインビトロ翻訳のために、新しいｐＧＥＭ＠−３２／黄熱 病リーダーベクターを、Ｂａ間［１で消化し、フレノウで平滑にした。

（Ｂ）６０００か゛のＰｖｕＩ クロー　７ｐ６０００を、ＡＴＣＣ受託番号第４０３９４号であるＨＣＶ　ｃＤ ＮＡのゲノムライブラリーから入手可能な配列から構築した。ｐ６０００ノＤＮ Ａ配列をコートするＩＩＣＶは、１９９０年１０月４日公開１７）ＷＯ９Ｇ／１ １０８９の図１７のヌクレオチド−２７５からヌクレオチド６３７２と同一であ る。ｐ６０００をＰｖｕｌｌで消化して、この消化物から２，８６４ｂｐフラグ メントを単離した。この２，８６４　ｂｐフラグメントを、上記のように、調製 されたＰＧＥＭ■−３２７黄熱病リーダーベクターフラグメントに連結した。

Ｌ敷匠■ （ＨＣＶプロテアーゼのインビトロ発現）（Ａ）　Ｋ互 ｐＧＥＭ＠−３Ｚ／黄熱病リーダー／Ｐｖｕｌｌベクターを、Ｘｂａｌで直鎖化 し、ＰｒｏｍｅｇａのＲｌｂｏｐｒｏｂｅＯＧａｍｉｎｉ　ＩＩ　Ｃｏｒｅシス テムからの材料およびプロトコールを用いて転写した。

（Ｂ）肚 上記のプロトコールにより生成されたＲＮＡを、Ｐｒｏｒａｅｇａのウサギ網状 赤血球溶解産物、マイナスメチオニン、イヌ膵臓ミクロンーム膜、および他の必 要な材料およびＰｒｏ＋＊ｅｇａからの指示に基づいて翻訳した。

寄ｌジＬ技ム１１体： 下記の物質ヲ、メリーランド州、ロックビル、パークローン　ドライブ１２３０ １のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ ＡＴＣＣ）に寄託した： 五旌　ＩＬ旦　１ＥｌＩ Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｄ１２１０．　ｃｆｌｓＯＤｐ６００　１９９０年３月２３日 　６８２７５Ｃｆ１１５−１−１（Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｄ１２１０中＞　１９８９年 ５月１１日　６７９６７バタテリオフアージλ−ｇｔｌｌ　１９８７年１２月１ 日　４０３９４ｃＤＮＡライブラリー Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ、　ｐｓ３５６　１９８８年４月２９日　６７６８ ３プラスミドＤＮＡ、　ｐＤＭ１５　１９８８年５月５日　４０４５３Ｓ、　ｃ ｅｒｅｖｉｓａｅ、　２１５Ｇ−２−３１９８６年１２月２３日　２０８２７（ ｐＡＢ２４−ＧＡＰ−ｅｎｖ２） 上記の生物体は、示された受託番号でＡＴＣＣに寄託されている。

これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト 条約の下で維持される。これらの寄託物は、当業者の利泪のために提供され、米 国特許法第１１２条で要求されているものではない。寄託された生物体内に維持 されるポリヌクレオチド配列、およびこれによりコードされたポリペプチドのア ミノ酸配列は、ここに参考のために援用されており、ここに記載されている配列 に関するいかなる争議の事態も規制する。この寄託された生物体の製造、使用、 または販売には、ライセンスが必要であり、いかなるそのようなライセンスもこ こでは与えられない。

ＧＣＣＣＴＣＴＡＴ　ＧＡＣＧＡＧ　ＣＣＣにＧＴ　ＣＧＧ　Ｃ’Ｌ’Ａ　ＣＣ Ｔ　ＴＡＣＣＡＧ　ＡＧＧ　？ｒＣＣＣＡ　ＡＣＣＦｉｇ　ｕｘｍ　工 Ｎａ＠工 Ｆ岬ｕｒｅユ（紐２） Ｎｄａ工 Ｆｉｇｕｒｅ　ｌ　（％υ Ｆｉｇｕｒｅ　ｌ　（捧ｒ　） Ｆｉｇｕｒ＠ｌ　（様り Ｆｉｇｕｒｅ　ｌ　（ａｔ） 二肛慮： ＥｃｏＲ工 ５ｆａＮ工 ａｅＸ ＥｃｏＲ工 Ｆ’ｉｇｕ：ｅ−ｓ＋　２ 仁μ−二 ＥｃｏＲよ りｄａ工 ＥｃｏＲ工工 ？ｉｃｌｕｘｍ　３ 一二 Ｄｄａ工 Ｆｉｇｕｚ−ｍ　４ α： ＥｃｏＲＸ Ｆｉｇｕｙｓ＝　５ ζ１よ： ＥｃｏＲＸ １ｎｆＸ ＥｃｏＲＸ Ｆｉｇｔｘｚ−ｓ＊　６ ｃＬＬ： ！：ｃｏＲよ りｑ１！ ＥｃｏＲＸ Ｆｉｇｗｒｅ　７ 一−−： ２ｃｏＲＸ Ｆｉｇｕｒｍ　８ Ｆｉｇｕｒ＠８　（季１）Ｆ） Ｂｇよ工 Ｆｉｇｕｘｅ　９ Ｎａｅ■ Ｃ７ｆＣ２０ｃＣ３００Ｃ２００ Ｆｉｇｕｒｅ　９０Ｌ　Ｆ　） Ｆｉｇｗｚ−ｍ　１０ Ｆｉｇｕｒａ　１０　（ｊｔＪ） Ｈａ＠Ｘ Ｆｉｇｕｒｅ　！Ｏ（績ｊ） Ｎｄ＠Ｘ Ｆｉｇｕｒｅ　１０　（ｉｆ） Ｆｉ−ｐｒｅ　”　（ｊｔＪ） Ｆｉｇｕｒｅ　Ｌり　（季ｉｆ） Ｆｉｇｕｒ＠１０　（ｌｌｌｆ） 要Ｊ【直 Ｃ型肝炎ウィルスにおいてポリタンパク質をプロセシングするのに必要なプロテ アーゼを、同定し、クローニングし、発現させる。特定のポリペプチドの開裂、 およびＨＣＶに特異的な抗ウィルス剤のアツセイおよび設計に有用な、プロテア ーゼ、切り形プロテアーゼおよび改変プロテアーゼを開示する。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃ型肝炎ウイルスに由来する、精製されたタンパク質分解ポリペプチドを含 有する組成物。
2. ２．前記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列を有する、請求 項１に記載の組成物：【配列があります】
3. ３．前記ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列を有する、請求 項１に記載の組成物：【配列があります】
4. ４．前記ポリペプチドが、実質的に以下の部分的内部配列を有する、請求項２に 記載の組成物： 【配列があります】
5. ５．前記ポリペプチドが、実質的に図１に示すナノ酸配列を有する、請求項１に 記載の組成物。
6. ６．Ｃ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質分解ポリペプチドと融合された、適 切な融合パートナーを含有する、融合タンパク質。
7. ７．前記融合パートナーがヒトスーバーオキシドジスムターゼを含有する、請求 項６に記載の融合タンパク質。
8. ８．前記タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列 を有する、請求項６に記載の融合タンパク質： 【配列があります】
9. ９．前紀タンパク質分解ポリペプチドが、実質的に下記のような部分的内部配列 を有する、請求項６に記載の融合タンパク質： 【配列があります】
10. １０．前記タンパク質分解ポリペプチドが、以下の配列を部分的内部配列として 有する、請求項６記載の融合タンパク質： 【配列があります】
11. １１．前記融合パートナーがユピキチンである、請求項６に記載の融合タンパク 質。
12. １２．ＨＣＶプロテアーゼまたは活性ＨＣＶプロテアーゼアナログのみをコード するポリヌクレオチドを含有する、組成物。
13. １３．前記ポリヌクレオチドが図１のＨＣＶプロテアーゼをコードする、請求項 １２に記載の組成物。
14. １４．ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログ、および融合パー トナーを含有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する、組 成物。
15. １５．前記融合パートナーが、ｈＳＯＤ、酵母α−因子、ＩＬ−２Ｓ、ユピキチ ン、β−ガラクルダーゼ、β−ラクタマ−ゼ、ホースラデイッシュペルオキシダ ーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群から選択される、 請求項１４に記載の組成物。
16. １６．前記ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログが、実質的に 以下の配列を有するポリペプチドを含有する、請求項１４に記載の組成物： 【配列があります】
17. １７．前記ＨＣＶプロテアーゼまたはアナログが、実質的に以下の配列を有する ポリペプチドを含有する、請求項１４に記載の組成物： 【配列があります】
18. １８．前紀ポリペプチドが実質的に以下の配列を有する、請求項１４に記載の組 成物： 【配列があります】
19. １９．Ｃ型肝炎ウイルスに対する化合物の活性をアツセイする方法であって、 活性なＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼを提供する工程；該プロテアーゼを、セリ ンプロテアーゼ活性を阻害することができる化合物と接触させる工程；および該 Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼの、タンパク質分解活性阻害を測定する工程、を 包含する方法。
20. ２０．ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶプロテアーゼアナログを宿主細胞内で産 生するための発現ベクターであって、ＨＣＶプロテアーゼまたはＨＣＶアナログ をコードするポリヌクレオチド； 該ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能なように連結さ れた、該宿主細胞内で機能する転写および翻訳制御配列；および 選択可能なマーカー、を含有するベクター。
21. ２１．発現の際に融合タンパク質を形成するために、前記ＨＣＶプロテアーゼを コードするポリヌクレオチドに連結される、融合パートナーをコードする配列を さらに含有する、請求項２０に記載のベクター。
22. ２２．前記融合パートナーが、ｈＳＯＤ、酵母α−因子、ＩＬ−２Ｓ、ユピキチ ン、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマ−ゼ、ホースラディッシュペルオキシ ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、およびウレアーゼからなる群から選択される 、請求項２１に記載のベクター。
23. ２３．前記融合パートナーが、ユピキチン、ｈＳＯＤおよび酵母α−因子からな る群から選択される、請求項２２に記載のベクター。
24. ２４．前記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下 の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２０に記載のベクター： 【配列があります】
25. ２５．前記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下 の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２０に記載のベクター： 【配列があります】
26. ２６．前記ＨＣＶプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが、実質的に以下 の配列を有するポリペプチドをコードする、請求項２０に記載のベクター：【配 列があります】発明の詳細な説明