SK14952002A3 - Makrocyklické zlúčeniny, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Description

Makrocyklické zlúčeniny, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nových inhibítorov proteázy hepatitídy vírusu C (HCV), farmaceutických prostriedkov obsahujúcich jeden alebo viacero takýchto inhibítorov, spôsobov prípravy takýchto inhibítorov a použitia takýchto inhibítorov na liečenie hepatitídy C a s ňou spojených porúch. Vynález osobitne poskytuje nové makrocyklické zlúčeniny ako inhibítory NS3/NS4 serínovej proteázy HCV. Opis v tomto vynáleze sa vzťahuje na opis v podanej patentovej prihláške, sériové číslo..., podanej 5. apríla 2000.

Doterajší stav techniky

Vírus hepatitídy C (HCV je vírus s jednovláknovou RNA, (+)-sense, ktorý je hlavným pôvodcom non-A, non-B hepatitídy (NANBH), osobitne NANBH asociovanej s krvou (BB-NANBH) (pozri medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 89/04669 a európsku patentovú prihlášku č. EP 381 216). NANBH je potrebné odlišovať od iných typov vírusových ochorení pečene, ako je napríklad vírus hepatitídy A (HAV), vírus hepatitídy B (HBV), vírus hepatitídy delta (HDV), cytomegalovírus (CMV) a Epstein-Barr vírus (EBV), ako aj od iných foriem ochorení pečene, ako je napríklad alkoholizmus a primárna biliárna cirhóza.

Nedávno bola nájdená, klonovaná a exprimovaná proteáza HCV potrebná na spracovanie polypeptidu a replikáciu vírusu (pozri napríklad US . patent č. 5,712,145). Tento polyproteín s približne 3000 aminokyselinami obsahuje od aminoterminálneho konca smerom ku karboxylovému koncu nukleokapsidový protein (C), obalové proteíny (E1 a E2) a niekoľko neštrukturálnych proteínov (NS1, 2, 3, 4a, 5a a 5b). NS3 je protein s molekulovou hmotnosťou približne 68 kda, ktorý je kódovaný približne 1893 nukleotidmi genómu HCV a má 2 samostatné domény: (a) doménu serínovej proteázy, ktorú tvorí približne 200 aminokyselín na N-terminálnom konci; a (b) doménu RNA-dependentnej ATPázy na C-terminálnom konci proteínu. NS3 proteáza sa považuje za člena chymotrypsínovej skupiny kvôli podobnosti

-2proteínovej sekvencie, celkovú trojrozmernú štruktúru a mechanizmus katalýzy. Iné enzýmy podobné chymotrypsínu sú elastáza, faktor Xa, trombín, trypsín, plazmín, urokináza, tPA a PSA. NS3 serínová proteáza HCV je zodpovedná za proteolýzu ’ polypeptidu (polyproteínu) v miestach spojenia medzi NS3/NS4a, NS4a/NS4b, NS4b/NS5a a NS5a/NS5b a je preto zodpovedná za generovanie štyroch vírusových proteínov počas replikácie vírusu. NS3 serínová proteáza HCV je preto atraktívnym cieľom antivírusovej chemoterapie.

Zistilo sa, že NS4a proteín, polypeptid s molekulovou hmotnosťou približne 6 kda, je kofaktorom serínovej proteázovej aktivity NS3. Autoštiepenie spojenia medzi NS3/NS4a serínovou proteázou NS3/NS4a sa vyskytuje intramolekulárne (t.j. cis), kým ostatné štiepne miesta sa spracúvajú intermolekulárne (t.j. trans).

Analýza prirodzených štiepnych miest proteázy HCV odhalila prítomnosť cysteínu v polohe P1 a serínu v polohe Pľ a že tieto zvyšky sú v miestach spojenia NS4a/NS4b, NS4b/NS5a a NS5a/NS5b prísne zakonzervované. Spojenie NS3/NS4a obsahuje treonín v polohe P1 a serín v polohe Pľ. Bolo postulované, že substitúcia Cys->Thr v mieste NS3/NS4a zodpovedá za požiadavku spracovávať cis namiesto trans v tomto mieste spojenia. Pozri napríklad Pizzi a spol. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91:888-892, Failla a spol. (1996) Folding & Design 1:35-42. Štiepne miesto NS3/NS4a je tiež tolerantnejšie voči mutagenéze ako ostatné miesta. Pozri napríklad Kollykhalov a spol. (1994) J. Virol. 68:7525-7533. Zistilo sa tiež, že na účinné štiepenie sú potrebné zvyšky kyselín v oblasti upstream od štiepneho miesta. Pozri napríklad Komoda a spol. (1994) J. Virol. 68:7351-7357.

Inhibítory HCV proteázy, ktoré boli publikované, zahŕňajú antioxidanty (pozri medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 98/14181), určité peptidy a peptidové analógy (pozri medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 98/17679, Landro a spol. (1997) Biochem. 36:9340-9348, Ingallinella a spol. (1998) Biochem. 37:8906-8914, Llinas-Brunet a spol. (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1713-1718), inhibítory založené na polypeptide eglin c so 70 aminokyselinami (Martin a spol. (1998) Biochem. 37:11459-11468, inhibítory afinitne volené z inhibítora ľudského pankreatického sekretorického trypsínu (hPSTI-C3) a z repertoárov miniteliesok (MBip) (Dimasi a spol. (1997) J. Virol. 71:7461-7469), cV_HE2 (kamelizovaný

-3fragment protilátky variabilnej domény) (Martin a spol. (1997) Protein Eng. 10:607614), a a1-antichymotrypsínu (ACT) (Elzouki a spol. (1997) J. Hepat. 27:42-28). Nedávno bol opísaný ribozým navrhnutý na selektívne ničenie RNA vírusu ! hepatitídy C (pozri BioWorld Today 9(217): 4 (10. november 1998)). ¹

Odkazuje sa aj na PCT publikáciu č. WO 98/17679 zverejnenú 30. apríla 1998 (Vertex Pharmaceutical Incorporated); WO 98/22496 zverejnenú 28. mája 1998 (F. Hoffmann-La Roche AG); a WO 99/07734 zverejnenú 18. februára 1999 (Boehringer Ingelheim Canada Ltd.).

HCV hrá úlohu v cirhóze pečene a v indukcii hepatocelulárneho karcinómu. V súčasnosti je prognóza pacientov trpiacich infekciou HCV zlá. Infekcia HCV sa dá liečiť ťažšie ako iné formy hepatitídy pre nedostatok imunity, alebo kvôli remisii spojenej s infekciou HCV. Najnovšie údaje ukazujú, že štvorročné prežívanie po diagnostikovaní cirhózy je nižšie ako 50 %. Pacienti s diagnostikovaným lokalizovaným operovateľným hepatocelulárnym karcinómom majú päťročné prežívanie 10 až 30 %, kým pacienti s lokalizovaným neoperovateľným hepatocelulárnym karcinómom majú päťročné prežívanie nižšie ako 1 %.

Odkazuje sa na prácu A. Marchettiho a spol., Synlett, S1, 1000-1002 (1999), ktorá opisuje syntézu bicyklických analógov inhibítora NS3 proteázy HCV. Zlúčenina opisovaná v tej štúdii je vzorca

AcHN'

ΌΗ

COOH

Odkazuje sa aj na WO 00/09558 (zástupca: Boehringer Ingelheim Limited; zverejnený 24. februára 2000), ktorý opisuje deriváty peptidu vzorca

v ktorom sú rôzne substituenty určené tam. Príkladom zlúčeniny tej série je

Odkazuje sa aj na WO 00/09543 (zástupca: Boehringer Ingelheim Limited; zverejnený 24. februára 2000), ktorý opisuje deriváty peptidu vzorca

-5Α¹ \

Ό

R⁶

v ktorom sú rôzne substituenty určené tam. Príkladom zlúčeniny tej série je h₃c,

CH,

H,C

H,c

N

H

A

CH,

Súčasné terapie hepatitídy C zahŕňajú interferón-α (INFa) a kombinovanú terapiu s ribavirínom a interferónom. Pozri napríklad Beremguer a spol. (1998) Proc. Assoc. Am. Physicians 110(2):98-112. Nedostatkom týchto terapií je nízka frekvencia udržateľnej reakcie na terapiu a časté vedľajšie účinky. Pozri napríklad Hoofnagle aspol. (1997) N. Engl. J. Med. 336:347. V súčasnej dobe na HCV infekciu neexistuje nijaká vakcína.

-6Patentová prihláška sériového čísla ... podaná 5. apríla 2000 opisuje určité makrocyklické zlúčeniny ako inhibítory HCV proteázy, ako aj farmaceutické prostriedky obsahujúce uvedené zlúčeniny.

Pre HCV infekciu sú potrebné nové liečebné postupy a terapie. Cieľom tohto vynálezu je preto poskytnúť zlúčeniny užitočné na liečenie alebo prevenciu alebo zmiernenie jedného alebo viacerých symptómov hepatitídy C.

Ďalším cieľom tohto vynálezu je poskytnúť spôsoby liečenia alebo prevencie alebo zmiernenia jedného alebo viacerých symptómov hepatitídy C.

Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť spôsob modulácie aktivity serínových proteáz, najmä NS3/NS4a serínovej proteázy HCV, s použitím zlúčenín podľa vynálezu.

Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť spôsoby modulácie spracovania polypeptidu HCV s použitím zlúčenín podľa vynálezu.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje novú triedu makrocyklických inhibítorov proteázy HCV, farmaceutické prostriedky obsahujúce jednu alebo viac zlúčenín, spôsoby prípravy farmaceutických prostriedkov zahŕňajúce jednu alebo viac takýchto zlúčenín a použitie týchto zlúčenín na liečenie, prevenciu alebo zmiernenie jedného alebo viacerých symptómov hepatitídy C. Poskytujú sa aj spôsoby modulácie interakcie polypeptidu HCV s proteázou HCV. Medzi zlúčeninami podľa vynálezu sú výhodné tie, ktoré inhibujú proteázovú aktivitu NS3/NS4a serínovej proteázy HCV. Zlúčeniny podľa vynálezu obsahujú približne štyri alebo viac aminokyselinových zvyškov a menej ako približne dvanásť aminokyselinových zvyškov.

Podstatou vynálezu sú makrocyklické zlúčeniny všeobecného vzorca I

(O

-7kde

E, X a Y môžu byť nezávisle od seba prítomné alebo neprítomné, a ak sú prítomné, nezávisle od seba sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej: alkyl, aryl, alkylaryl, heteroalkyl, heteroaryl, arylheteroaryl, alkylheteroaryl, cykloalkyl, alkyléter, alkylaryléter, aryléter, alkylamino, arylamino, alkylarylamino, alkylsulfid, alkylarylsulfid, arylsulfid, alkylsulfón, alkylarylsulfón, arylsulfón, alkylalkylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylamid, alkylarylamid, arylamid, alkylsulfónamid, alkylarylsulfónamid, arylsulfónamid, alkylmočovina, alkylarylmočovina, arylmočovina, alkylkarbamát, alkylarylkarbamát, arylkarbamát, alkylhydrazid, alkylarylhydrazid, alkylhydroxamid, alkylarylhydroxamid, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, alkoxykarbonyl, aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl, heteroarylaminokarbonyl alebo ich kombinácie, za predpokladu, že E, X a Y môžu byť dodatočne substituované substituentami vybranými zo skupiny, ktorú tvorí aromatická časť, alkyl, alkylaryl, heteroalkyl, arylheteroaryl, alkylheteroaryl, cykloalkyl, alkyléter, alkylaryléter, alkylsulfid, alkylarylsulfid, alkylsulfón, alkylarylsulfón, alkylamid, alkylarylamid, alkylsulfónamid, alkylamíny, alkylarylamíny, alkylarylsulfónamid, alkylmočovina, alkylarylmočovina, alkylkarbamát, alkylarylkarbamát, halogén, hydroxylamino, alkylkarbazát, arylkarbazát;

R¹ znamená COR⁵ alebo B(OR)2, kde R⁵ znamená H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF3, C₂F₅, C₃F₇, CF₂R⁶, R⁶, COR⁷, kde R⁷znamená H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰ alebo NR⁹R¹⁰, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ sa nezávisle od seba vyberú zo skupiny, ktorú tvorí H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, CH(R^1,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONHCH(R²')CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)R',

CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)COOR¹¹,

CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONR¹²R¹³,

CH(R^1,)CONHCH(R²’)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)COOR¹¹,

CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONR¹²R¹³,

CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONHCH(R^5,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONHCH(R^5,)CONR¹²R¹³, kde R¹', R²', R³', R⁴', R⁵', R¹¹, R¹², R¹³, a R' sú nezávisle od seba volené zo skupiny,

-8ktorú tvorí H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl a heteroaralkyl;

Z sa volí z O, N alebo CH;

W môže byť prítomné alebo neprítomné, a ak W je prítomné, W sa volí z C=O, C=S> SO₂ alebo C=NR;

Q je (NR)_P, O, S, CH₂, CHR, CRR' alebo dvojitá väzba na V;

A je O, CH₂, (CHR)p, (CHR-CHR')_P, (CRR')_P, NR, S, SO₂, C=O alebo väzba;

G je (CH₂)_P, (CHR)p, (CRR')_P, NR, O, S, SO₂, S(O)₂NH, C=O, alebo dvojitá väzba na E alebo V;

V je CH, CR alebo N;

p je číslo medzi 0 až 6; a

R, R', R², R³, a R⁴ sa nezávisle od seba vyberú zo skupiny, ktorú tvorí H; CrC₁₀ alkyl; C₂-Ci₀ alkenyl; C₃-C₈ cykloalkyl; C₃-C₈ heterocykloalkyl, aryl, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, ketón, aldehyd, kyano, nitro; heteroaryl; alkylaryl; alkylheteroaryl; (cykloalkyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, kde uvedený cykloalkyl tvorí tri až osem atómov uhlíka, a nula až šesť atómov kyslíka, dusíka, síry alebo fosforu, a uvedený alkyl pozostáva z jedného až šiestich atómov uhlíka;

pričom uvedený alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl môže byť voliteľne substituovaný, pričom uvedený výraz substituovaný sa týka voliteľnej a vhodnej substitúcie s jedným alebo viacerými substituentami, ktoré sa vyberú zo skupiny, ktorú tvorí alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocyklus, halogén, hydroxy, tio, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, ketón, aldehýd, kyano, nitro, sulfónamid, sulfoxid, sulfón, sulfonylmočovina, hydrazid a hydroxamát a tiomočovina.

Pokiaľ nie je určené inak, všetky technické a vedecké výrazy použité vo vynáleze majú rovnaký význam ako sa všeobecne chápe odborníkmi v danej oblasti techniky, ku ktorej tento vynález patrí. Tak napríklad výraz alkyl (včítane alkylovej časti v alkoxy) sa týka monovalentnej skupiny odvodenej z nasýteného uhľovodíka s priamym alebo rozvetveným reťazcom odstránením jediného atómu, pričom bude mať 1 až 8, výhodne 1 až 6 atómov uhlíka;

-9aryl znamená karbocyklickú skupinu so 6 až 14 atómami uhlíka a aspoň jedno benzénové jadro, pričom sa predpokladá, že všetky dostupné substituovateľné aromatické atómy uhlíka karbocyklickej skupiny sú možné miesta pripojenia. Výhodné arylové skupiny zahŕňajú fenyl, 1-naftyl, 2-naftyl a indanyl, a osobitne fenyl a substituovaný fenyl;

aralkyl znamená skupinu obsahujúcu arylovú skupinu pripojenú prostredníctvom nižšieho alkylu;

alkylaryl znamená skupinu obsahujúcu nižší alkyl pripojený prostredníctvom arylovej skupiny;

cykloalkyl znamená nasýtený karbocyklický kruh obsahujúci 3 až 8 atómov uhlíka, výhodne 5 alebo 6, ktoré sú voliteľne substituované;

heterocyklus znamená, okrem heteroarylových skupín určených nižšie, nasýtené a nenasýtené cyklické organické skupiny, ktoré majú aspoň jeden atóm O, S, a/alebo N prerušujúci štruktúru karbocyklického kruhu, ktorý pozostáva z jedného alebo viacerých kruhov, pričom každý kruh má 5, 6 alebo 7 členov a môže alebo nemusí mať dvojité väzby, ktoré postrádajú delokalizované pi elektróny, a pričom kruhová štruktúra má 2 až 8, výhodne 3 až 6 atómov uhlíka, napríklad 2- alebo 3-piperidinyl, 2- alebo 3-piperazinyl, 2- alebo 3-morfolinyl, alebo 2- alebo 3-tiomorfolinyl; halogén znamená fluór, chlór, bróm a jód;

heteroaryl znamená cyklickú organickú skupinu, ktorá má aspoň jeden atóm O, S a/alebo N prerušujúci štruktúru karbocyklického jadra a ktorá má dostatočný počet delokalizovaných pí elektrónov na vytvorenie aromatickej povahy, pričom aromatická heterocyklická skupina má 2 až 14, výhodne 4 alebo 5 atómov uhlíka, napríklad 2-, 3- alebo 4-pyridyl, 2- alebo 3-furyl, 2- alebo 3-tienyl, 2-, 4- alebo 5tiazolyl, 2- alebo 4-imidazolyl, 2-, 4- alebo 5-pyrimidinyl, 2-pyrazinyl, alebo 3- alebo 4-pyridazinyl, atd. Výhodné heteroarylové skupiny sú 2-, 3- a 4-pyridyl. Také heteroarylové skupiny môžu byť tiež voliteľne substituované.

Do vynálezu sú zahrnuté aj tautoméry, rotaméry, enantiomé'ry a iné optické izoméry zlúčenín všeobecného vzorca I, ako aj ich farmaceutický prijateľné soli a solváty.

Ďalej vynález poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce zlúčeninu všeobecného vzorca I (alebo jej soľ, solvát alebo izoméry) ako účinnú látku spolu

- 10s farmaceutický prijateľným nosičom alebo excipientom.

Vynález tiež poskytuje spôsoby prípravy zlúčenín všeobecného vzorca I, ako aj tieto zlúčeniny na použitie na liečenie ochorení, ako sú napríklad HCV a príbuzné poruchy. Liečenie zahŕňa podávanie terapeuticky účinného množstva zlúčeniny všeobecného vzorca I alebo farmaceutických prostriedkov zahŕňajúcich zlúčeninu všeobecného vzorca I pacientovi s uvedeným ochorením alebo ochoreniami.

Vynález ďalej poskytuje aj použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I na výrobu lieku na liečenie HCV a príbuzných porúch.

Podľa jedného uskutočnenia predkladaný vynález poskytuje zlúčeniny všeobecného vzorca I ako inhibítory proteázy HCV, osobitne NS3/NS4 serínovej proteázy HCV:

kde rôzne substituenty boli určené vyššie. Niektoré z výhodných uskutočnení zahŕňajú, avšak sa neobmedzujú iba na nasledujúce definície rôznych funkcií vo vyššie uvedenom všeobecnom vzorci I; iné požadované definície tých istých a ďalších funkčných skupín sa nachádzajú v štruktúrach a nárokoch tejto prihlášky, ktoré sú takisto v rámci rozsahu predkladaného vynálezu. Vo výhodných uskutočneniach sa R² vo všeobecnom vzorci I môže zvoliť z nasledujúcich skupín:

E môže byť substituovaný alebo nesubstituovaný alkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný aryl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroalkyl, substituovaný alebo nesubstituovaný heteroaryl alebo substituovaný alebo nesubstituovaný cykloalkyl, pričom E znamená výhodne:

Výhodné uskutočnenia R³ zahŕňajú nasledujúce skupiny:

n = 0-4

Ν

COCH₃

'(j)n = 0-2 COR³¹

COR

COR'

R³² R³³ kde

R³⁰ znamená H, CH₃ alebo iné alkylové skupiny;

R³¹ znamená OH, O-alkyl, NH₂, N-alkyl; a

R³² a R³³ môžu byť rovnaké alebo rôzne a volia sa nezávisle od seba z H, F, Cl, Br a CH₃.

Výhodnými uskutočneniami skupiny X-Y sú nasledujúce štruktúry:

Niekoľko dodatočných a ďalších doplnkov k vyššie uvedeným rôznym definíciám zlúčenín všeobecného vzorca I sa uvádza v časti Patentové nároky tejto prihlášky. Sú uvádzané aj ako rôzne zlúčeniny vymenované v špecifikácii a v nárokoch. Takéto doplnky, definície a limitácie je potrebné považovať za súčasť celého vynálezu tejto prihlášky.

Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré majú výbornú inhibičnú aktivitu voči proteáze HCV, sú uvedené v zozname nižšie:

(δ)

(20)

(24)

(32)

(36)

(43)

(⁴⁸)

νπ₃ (52)

Aktivita niektorých zlúčenín je uvedená v Tabuľke 1 ako rozpätie hodnôt K, vnanomóloch (nM). Čísla príkladov v Tabuľke 1 sa vzťahujú na čísla rôznych štruktúr uvedené v časti Príklady na konci tejto prihlášky.

Tabuľka 1

Výsledky priebežného testu proteázy HCV

Číslo príkladu	K* n M
1	B
2	A
3	B
4	B
5	B
6	A
.7	B
8	A
9	B

10	B
11	B
12	A
13	B
14	B
15	B
16	A
17	B
18	A
19	B
20	A
21	B
22	A
23	B
24	B
25	B
26	B
27	B
28	B
29	B
30	A
31	B
32	B
33	B
34	B
35	B
36	B
37	B
38	B
39	A

40	B
41	A
42	B
43	A
44	A
45	B
46	B
47	B
48	B
49	B
50	B
51	B
52	A
53	A
54	B

Rozpätie K* priebežného testu HCV:

Kategória A = 0,001 až 1,0 μΜ

Kategória B = 1,1 až 100 μΜ

Niektoré spôsoby syntézy rôznych typov zlúčenín podľa vynálezu sú opísané nižšie v tejto kapitole, a sú tiež schematicky opísané spolu s príkladmi uvádzanými na ilustrovanie vynálezu.

Zlúčeniny podľa vynálezu v závislosti od štruktúry môžu vytvárať farmaceutický prijateľné soli s organickými alebo anorganickými kyselinami alebo s organickými alebo anorganickými zásadami. Vhodnou kyselinou na tvorbu takých solí je napríklad kyselina chlorovodíková, sírová, fosforečná, octová, citrónová, šťaveľová, malónová, salicylová, jablčná, fumárová, jantárová, askorbová, maleínová, metánsulfónová a iné anorganické a karboxylové kyseliny známe odborníkom v danej oblasti techniky. Vhodnou zásadou na tvorbu solí je napríklad NaOH, KOH, NH₄OH, tetraalkylamóniumhydroxid, a podobne.

-29V ďalšom uskutočnení tento vynález poskytuje farmaceutické prostriedky zahŕňajúce vyššie uvedené makrocyklické zlúčeniny podľa vynálezu ako účinné látky. Farmaceutické prostriedky všeobecne dodatočne zahŕňajú farmaceutický prijateľné riedidlo, excipient alebo nosič (úhrnné tu nazývané ako nosičové materiály). Pre ich inhibičnú aktivitu HCV takéto farmaceutické prostriedky sú užitočné na liečenie hepatitídy C a príbuzných porúch.

V ďalšom uskutočnení súčasný vynález opisuje spôsoby prípravy farmaceutických prostriedkov zahŕňajúcich makrocyklické zlúčeniny podľa vynálezu ako účinné látky. Vo farmaceutických prostriedkoch a spôsoboch podľa vynálezu účinné látky sa budú v typickom prípade podávať s prímesou vhodných nosičových materiálov, ktoré sa vhodne zvolia s ohľadom na predpokladanú formu podávania, napríklad vo forme ústnych tabliet, kapsúl (plnených buď tuhou látkou, polotuhou látkou alebo kvapalinou), práškov na rekonštituovanie, ústnych gélov, elixírov, dispergovateľných granúl, sirupov, suspenzií, a podobne, a v súlade s konvenčnou farmaceutickou praxou. Napríklad na ústne podávanie vo forme tabliet alebo kapsúl sa účinná látka môže skombinovať s akýmkoľvek ústnym netoxickým farmaceutický prijateľným inertným nosičom, ako je napríklad laktóza, škrob, sacharóza, celulóza, stearan horečnatý, fosforečnan vápenatý, síran vápenatý, mastenec, manitol, etylalkohol (kvapalné formy) a podobne. Okrem toho v prípade potreby možno do prostriedku pridať aj vhodné spojivá, mazadlá, dezintegračné prostriedky a farbivá. Prášky a tablety môžu pozostávať z približne 5 až približne 95 % zlúčeniny podľa vynálezu. Vhodné spojivá zahŕňajú škrob, želatínu, prírodné cukry, kukuričné sladidlá, prírodné a syntetické gumy ako je napríklad arabská guma, alginan sodný, karboxymetylcelulózu, polyetylénglykol a vosky. Medzi mazadlami možno uviesť v súvislosti s týmito dávkovými formami kyselinu boritú, benzoan sodný, octan sodný, chlorid sodný, a podobne. Dezintegrátory zahŕňajú škrob, metylcelulózu, guarovú gumu, a podobne.

V prípade potreby možno zahrnúť aj sladidlá a dochucovadlá a ochranné prostriedky. Niektoré z výrazov uvedených vyššie, napríklad dezintegrátory, riedidlá, mazadlá, spojivá, a podobne, sa podrobnejšie diskutujú nižšie.

Okrem toho prostriedky podľa vynálezu možno formulovať vo forme s oneskoreným uvoľňovaním, aby sa poskytlo kontrolované uvoľňovanie

-30ktoréhokoľvek alebo ktorýchkoľvek zložiek alebo účinných látok na optimalizáciu terapeutických účinkov, napríklad inhibičnej aktivity HCV a podobne. Vhodné dávkové formy na oneskorené uvoľňovanie zahŕňajú vrstvené tablety obsahujúce vrstvy s rôznymi rýchlosťami dezintegrácie alebo s kontrolovaným uvoľňovaním polymérnych matríc impregnovaných s účinnými látkami a tvarovanými do tvaru tabliet alebo kapsúl obsahujúcich také impregnované alebo obalené pórovité polymérne matrice.

Prípravky v kvapalnej forme zahŕňajú roztoky, suspenzie a emulzie. Ako príklad možno uviesť vodu alebo roztok vody a propylénglykolu na parenterálne injekcie alebo pridanie sladidiel a utišujúcich prostriedkov pre ústne roztoky, suspenzie a emulzie. Prípravky v kvapalnej forme môžu tiež zahŕňať roztoky na vnútronosové podávanie.

Aerosólové prípravky vhodné na inhaláciu môžu zahŕňať roztoky a tuhé látky vo forme prášku, ktoré môžu byť v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom, ako je napríklad inertný stlačený plyn, napríklad dusík.

Na prípravu čapíkov sa najprv roztopí vosk s nízkou teplotou topenia, ako je napríklad zmes glyceridov mastných kyselín, ako je napríklad kakaové maslo, a účinná látka sa v ňom rovnomerne rozptýli premiešaním alebo podobným miešaním. Roztopená homogénna zmes sa potom vyleje do foriem vhodnej veľkosti, nechá sa vychladnúť a tým stuhnúť.

Zahrnuté sú aj tuhé formy prípravkov, ktoré sa majú krátko pred použitím prekonvertovať na prípravky v kvapalnej forme buď na ústne alebo parenterálne podávanie. Také kvapalné formy zahŕňajú roztoky, suspenzie a emulzie.

Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať aj cez kožu. Transdermálne prostriedky môžu byť vo forme krémov, vodičiek, aerosólov a/alebo emulzií a môžu byť zahrnuté do transdermálnej náplasti matricového alebo rezervoárového typu, ako to je konvenčné v problematike pre tento účel.

Zlúčenina sa výhodne podáva ústne.

Farmaceutický prostriedok je výhodne vo forme jednotkovej dávky. V takej forme je prostriedok ďalej delený do jednotkových dávok vhodnej veľkosti obsahujúcich vhodné kvantity účinných zložiek, napríklad účinné množstvo na dosiahnutie požadovaného cieľa.

-31 Množstvo účinnej látky podľa vynálezu v jednotkovej dávke prípravku môže byť všeobecne rôzne alebo nastavené v rozpätí približne medzi 1,0 mg a približne 1000 mg, výhodne približne medzi 1,0 a približne 950 mg, výhodnejšie približne medzi 1,0 a približne 500 mg, a typicky približne medzi 1 a približne 250 mg, podľa osobitnej aplikácie. Skutočná použitá dávka môže byť rôzna v závislosti od veku, pohlavia, a hmotnosti pacienta a od závažnosti liečeného stavu. Také postupy sú odborníkom v danej oblasti techniky dobre známe.

Všeobecne, ústnu dávkovú formu pre ľudí obsahujúcu účinné látky možno podávať 1- alebo 2-krát denne. Množstvo a frekvencia podávania sa upravuje podľa úsudku ošetrujúceho lekára. Všeobecne odporúčaný denný dávkový režim na ústne podávanie je približne medzi 1,0 mg a približne 1000 mg denne, v jedinej alebo v rozdelených dávkach.

Niektoré užitočné výrazy sú opísané nižšie:

Kapsula sa vzťahuje na špeciálnu nádobu alebo puzdro vyrobenú z metylcelulózy, polyvinylalkoholov alebo z denaturovaných želatín alebo škrobu na držanie alebo na obalenie zmesí obsahujúcich účinné látky. Tvrdé kapsuly sú typicky vyrobené zo zmesi kostí s pomerne vysokou gélovou silou a želatíny z bravčovej kože. Samotná kapsula môže obsahovať malé množstvá farbív, prostriedkov na odstránenie priesvitnosti obalu, prostriedkov na zvýšenie tvárnosti, a ochranných prostriedkov.

Tableta sa vzťahuje na vylisovanú alebo tvarovanú tuhú dávkovú formu obsahujúcu účinné látky s vhodnými riedidlami. Tabletu možno pripraviť vylisovaním zmesí alebo granúl získaných mokrou granuláciou, suchou granuláciou alebo kompaktovaním.

Ústny gél sa vzťahuje na účinné látky dispergované alebo solubilizované v hydrofilnej polotuhej matrici.

Prášok na rekonštituovanie sa vzťahuje na práškové zmesi obsahujúce účinné látky a vhodné riedidlá, ktoré možno suspendovať vo vode alebo v šťavách.

Riedidlo sa vzťahuje na látky, ktoré obyčajne tvoria väčší diel zmesi alebo dávkovej formy. Vhodné riedidlá zahŕňajú cukry, ako je napríklad laktóza, sacharóza, manitol a sorbitol; škroby odvodené z pšenice, kukurice, ryže a zemiakov; a celulózy, ako je napríklad mikrokryštalická celulóza. Množstvo

-32riedidla v prostriedku sa môže pohybovať približne medzi 10 a približne 90 % hmotnostnými v celkovom prostriedku, výhodne medzi približne 25 a približne 75 %, ešte výhodnejšie približne medzi 30 a približne 60 % hmotnostnými, a najvýhodnejšie približne medzi 12 a približne 60 % hmotnostnými.

Dezintegrátor sa vzťahuje na materiály, ktoré sa pridávajú k zmesi na podporu rozdrobenia (dezintegrácie) a uvoľnenia liečiv. Vhodné dezintegrátory zahŕňajú škroby; modifikované škroby rozpustné v studenej vode, ako je napríklad sodná soľ karboxymetylškrobu; prírodné a syntetické gumy, ako je napríklad karobová guma, karaya, guar, tragant a agar; deriváty celulózy ako je napríklad metylcelulóza a sodná soľ karboxymetylcelulózy; mikrokryštalické celulózy a zosieťované mikrokryštalické celulózy, ako je napríklad sodná soľ kroskarmelózy; algináty, ako je napríklad kyselina algínová a alginan sodný; hliny, ako sú napríklad bentonity; a šumivé zmesi. Množstvo dezintegrátora v prostriedku sa môže pohybovať približne medzi 2 a 15 % hmotnostnými prostriedku, výhodnejšie približne medzi 4 a približne 10 % hmotnostnými.

Spojivo sa vzťahuje na látky, ktoré viažu alebo zlepujú prášky dohromady a robia ich kohezívnymi tým, že vytvárajú granuly, a tak slúžia vo formulácii ako adhezívum. Spojivá pridávajú kohezívnu silu prítomnú už v riedidle alebo v sypkom prostriedku. Vhodné spojivá zahŕňajú cukry, ako je napríklad sacharóza; škroby odvodené z pšenice, kukurice, ryže a zemiakov; prírodné gumy ako je napríklad arabská guma, želatína a tragant; deriváty morských rias ako je napríklad kyselina algínová, alginát sodný a alginan amónno-vápenatý; celulózové materiály, ako je napríklad metylcelulóza a sodná soľ karboxymetylcelulózy a hydroxypropylmetylcelulóza; polyvinylpyrolidón; a anorganické látky ako je napríklad kremičitan horečnato-hlinitý. Množstvo spojiva v zmesi sa môže pohybovať medzi približne 2 a približne 20 % hmotnostnými prostriedku, výhodnejšie medzi približne 3 a približne 10 % hmotnostnými, ešte výhodnejšie medzi približne 3 a približne 6 % hmotnostnými.

Mazadlo sa vzťahuje na látku, ktorá sa pridáva k dávkovej forme, aby sa tableta, granuly, atcf., po vylisovaní uvoľnili z formy alebo matrice redukčným trením alebo oderom. Vhodné mazadlá zahŕňajú stearany kovov, ako je napríklad stearan horečnatý, stearan vápenatý alebo stearan draselný; kyselina steárová; vosky

-33s vysokou teplotou topenia; a mazadlá rozpustné vo vode, ako je napríklad chlorid sodný, benzoan sodný, octan sodný, olean sodný, polyetylénglykoly a dj-leucín. Mazadlá sa obyčajne pridávajú v poslednom kroku pred vylisovaním, pretože musia byť prítomné na povrchu granúl a medzi nimi, a medzi čiastočkami lisu na tablety. Množstvo mazadla v zmesi sa môže pohybovať približne medzi 0,2 a približne 5 % hmotnostnými prostriedku, výhodne približne medzi 0,5 a približne 2 %, výhodnejšie približne medzi 0,3 a približne 1,5 % hmotnostnými.

Glident je materiál, ktorý zabraňuje zlepeniu a zlepšuje prietokové vlastnosti granulácií tak, aby prietok bol hladký a uniformný. Vhodné glidenty zahŕňajú oxid kremičitý a mastenec. Množstvo glidentu v zmesi sa môže pohybovať približne medzí 0,1 % a približne 5 % hmotnostnými celkového prostriedku, výhodne približne medzi 0,5 a približne 2 % hmotnostnými.

Farbiace prostriedky sú excipienty, ktoré zmesi alebo dávkovej forme poskytujú zafarbenie. Také excipienty môžu zahŕňať potravinové farbivá a potravinové farbivá adsorbované na vhodný adsorbent, ako je napríklad hlina alebo oxid hlinitý. Množstvo farbiaceho prostriedku sa môže pohybovať približne medzi 0,1 a približne 5 % hmotnostnými farmaceutického prostriedku, výhodne približne medzi 0,1 a približne 1 % hmotnostným.

Biologická dostupnosť sa vzťahuje na rýchlosť a rozsah, v akom sa účinná zložka alebo terapeutická časť absorbuje do systémového obehu z podanej dávkovej formy v porovnaní so štandardom alebo kontrolou.

Konvenčné spôsoby na prípravu tabliet sú známe. Také spôsoby zahŕňajú suché spôsoby, ako je napríklad priame lisovanie a lisovanie granulácie pripravenej kompaktovaním, alebo mokré spôsoby alebo iné osobitné spôsoby. Konvenčné spôsoby na prípravu iných foriem podávania, ako sú napríklad kapsuly, čapíky, a podobne, sú tiež dobre známe.

Ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje použitie farmaceutických prostriedkov opísaných vyššie na liečenie ochorení, ako je napríklad hepatitída C a podobne. Spôsob zahŕňa podanie terapeuticky účinného množstva farmaceutického prostriedku podľa vynálezu pacientovi s takým ochorením alebo ochoreniami a ktorý potrebuje takú liečbu.

Ako sa uvádza vyššie, vynález zahŕňa aj tautoméry, enantioméry a iné

-34stereoizoméry týchto zlúčenín. To znamená, ako odborníci v danej oblasti techniky vedia, niektoré zlúčeniny podľa vynálezu môžu existovať v izomérnych formách. Také variácie sa považujú za súčasť rozsahu predkladaného vynálezu.

Ďalšie uskutočnenie vynálezu poskytuje spôsob prípravy makrocyklických zlúčenín opísaných v tomto vynáleze. Zlúčeniny možno pripraviť pomocou niekoľkých spôsobov známych v problematike. Reprezentatívne spôsoby na ilustráciu vynálezu sú uvedené v nasledujúcich reakčných schémach. Je potrebné vychádzať z toho, že nasledujúce schémy na ilustrovanie vynálezu opisujú prípravu makrocyklov odvodených predovšetkým z meŕa-tyrozínu alebo lyzínu v polohe P2. Vhodná substitúcia ktorejkoľvek z prírodných aj neprírodných aminokyselín vedie k tvorbe požadovaných makrocyklov založených na takej substitúcii.

Skratky, ktoré sa používajú v opisoch schém, prípravkov a nasledujúcich príkladov, sú nasledovné:

THF: tetrahydrofurán DMF: /V,A/-dimetylformamid EtOAc: etylacetát AcOH: kyselina octová

HOOBt: 3-hydroxy-1,2,3-benzotriazín-4(3/7)-ón

EDCI: 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydrochlorid

NMM: /V-metylmorfolín

ADDP: 1,ľ-(azodikarbonyl)dipiperidín

DEAD: dietylazodikarboxylát

MeOH: metanol

EtOH: etanol

Et₂O: dietyléter

Bn: benzyl

Boe: terc-butyloxykarbonyl

Cbz: benzyloxykarbonyl

Cp: cyklopentyldienyl

Ts: p-toluénsulfonyl

Me: metyl

HATU: O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-A/,A/,A/',A/'-tetrametylurónium hexafluórfosfát

-35Chg: cyklohexylglycín

Tyr: tyrozín

G: glycerol

TG: tioglycerol alloc: alyloxykarbonyl

FMOC: 9-fluórenylmetyloxykarbonyl

Dde: N-l-(4,4-dimetyl-2,6-dioxocyklohex-1 -ylidén)etyl tBu: ferc-butyl equiv: ekvivalent rel. int.: relatívna intenzita aq: vodný

RT: izbová teplota satd: nasýtený

Hex: hexán(y)

NBA: kyselina nitrobenzoová

PyBrOP: tris(pyrolidino)brómfosfónium hexafluórfosfát

DMSO: dimetylsulfoxid

TFA: kyselina trifluóroctová

HOBt: hydroxybenzotriazol

Hiinigova zásada: diizopropyletylamín

BOP: benzotriazol-1 -yloxytris(dimetylamino)fosfóniunn hexafluórfosfát

LDA: lítiumdiizopropylamid

Ph₃P: trifenylfosfín

LAH: hydrid hlinito-lítny

DMAP: 4-dimetylaminopyridín

DCC: dicyklohexylkarbodiimid

MCPBA: kyselina mefa-chlórperbenzoová

BINAP: 2,2'-bis(difenylfosfino)-1,1'binaftol

MeCN: acetonitril

Pr: propyl

Ac: acetyl

Ph: fenyl

-36Všeobecné schémy syntézy zlúčenín podľa vynálezu

V nasledujúcich schémach n znamená číslo 1 až 6.

1e

Syntéza zlúčenín typu 1e, kde R¹, R², R³, R' boli určené vyššie, R⁴ je amid, karbamát alebo vodík, pričom R je alkyl, aryl alebo arylalkyl, sa začala reakciou 1a s dipeptidom 1b s použitím NMM, HOBt, a EDCI, čím sa získal medziprodukt 1c. Medziprodukt 1c reagoval s CS2CO3 v DMF, po ktorom nasledovala fotolýza, čím sa získala zlúčenina 1d. Makrocyklický ester 1d sa hydrólyzoval a reagoval s vhodným amínovým medziproduktom, čím vznikli zlúčeniny typu 1e.

Schéma 2

2a

OR

O R^{3 H} O Ŕ²

2e

Príprava zlúčeniny vzorca 2e, kde R¹, R², R³, a n boli určené vyššie, R' je alkyl, heteroalkyl (O, SR', NRR', kde R a R' sú alkylové skupiny), halogénový substituent v polohe orto, metá alebo para voči atómu kyslíka, R je alkyl, aryl alebo alkylarylová skupina, a n znamená 0 až 5, je uvedená v schéme 2. Meta-tyrozínový dipeptid 2a reaguje s alkenylkarboxylovou kyselinou v prítomnosti HOOBt, EDCIHCI a NMM. Hydroboráciou výsledného produktu sa získa zlúčenina 2c. Makrocyklizácia sa dosiahne v Mitsunobuových podmienkach s použitím trifenylfosfínu a ADDP. (Mitsunobuovu reakciu uvádza D. L. Hughes, Org. Reactions, 42 (1992) 335, John Wiley & Sons, New York, vydavateľ L. Paquette). Po hydrolýze esteru hydroxidom lítnym na kyselinu táto kyselina reaguje s amínovým medziproduktom, čím sa získa 2e.

Schéma 3

3a

3b

Príprava zlúčenín vzorca 3e, kde R', R¹, R², R³, R a n boli určené v schéme 1 a PG je Cbz, Boe, alebo alloc, je uvedená v schéme 3. Zlúčenina 3a reagovala so substituovaným derivátom histidínu s použitím DCC. Z tejto zlúčeniny 3b sa odstránila ochrana a ďalej reagovala s ω-brómovými kyselinami, čím sa získala zlúčenina typu 3c. Cykiizácia zlúčeniny 3c sa uskutočnila s Nal a Na2CO₃ vo vriacom metylvinylketóne, čím sa získala zlúčenina 3d. Zlúčenina 3d sa prekonvertovala na zlúčeniny typu 3e hydrolýzou esteru, po ktorej nasledovala reakcia s vhodným amínovým medziproduktom.

Schéma 4

Príprava zlúčenín typu 4f, kde R', R¹, R², R³, R, n a PG boli určené v schéme 1, sa začala zo zlúčeniny typu 4a. Alkohol 4a sa prekonvertoval na 4b pôsobením fosgénu. 4b sa prekonvertovala na 4c reakciou s 1b chráneným pomocou alloc, a sTe₃N. Zo skupiny alloc zlúčeniny 4c sa odstránila ochrana s použitím Pd(PPh₃)₄, čím sa získala zlúčenina 4d, ktorá bola cyklizovaná v Mitsunobuových podmienkach, čím sa získala zlúčenina 4e. Ester 4e sa hydrolyzoval a ďalej reagoval s amínom s použitím EDCI, HOOBt, čím sa získali zlúčeniny typu 4f.

Schéma 5

Príprava zlúčenín typu 5h, kde R¹, R², R³, R', PG a n boli určené v schémach 1 až 3 a PG¹ je Cbz alebo Boe a PG² je alloc, vychádzala zo známej zlúčeniny 5a. Kyselina 5a sa prekonvertovala na ester refluxovaním s ROH a TsOH. Kyslík z fenolu 5b sa prekonvertoval na skupinu alloc pôsobením s alloc-chloridom a trietylamínom, čím sa získala zlúčenina 5c. Sekundárny alkohol 5c sa prekonvertoval na zlúčeniny typu 5d reakciou s chráneným cyklohexylglycínom s použitím DCC a HOBt. Zo skupiny alloc zlúčeniny 5d sa odstránila ochrana s použitím Pd(Ph₃P)₄ a dimedónu. Zo zlúčeniny 5e sa odstránila ochrana a reagovala s EDCI, HOOBt s primerane aktivovaným ruténiovým komplexom, čím sa získali zlúčeniny vzorca 5f. Zlúčeniny typu 5f sa prekonvertovali na cyklické zlúčeniny vzorca 5g s použitím Cs₂CO₃ a s následným fotolytickým odstránením ruténia. Esterická skupina zlúčeniny 5g sa hydrolyzovala a spojila s amínovým medziproduktom, čím sa získali zlúčeniny typu 5h.

Schéma 6

6a

Príprava zlúčeniny vzorca 6f, kde R¹, R², R³ boli určené vyššie, R' je alkyl, heteroalkyl (OR, SR', ΝΡ'Ή', kde R a R' sú alkylové skupiny), halogénový substituent v polohe orto, metá alebo para, R je alkyl, aryl alebo alkylarylová skupina, PG je Cbz alebo Boe, a n je 0 až 5, je znázornená v schéme 6. Metajódfenylglycín 6a sa prekonvertuje na svoj ester za obvyklých esterifikačných podmienok (ROH, HCI). Produkt sa potom spojí s N-chránenou aminokyselinou v prítomnosti HOOBt, EDCI-HCI a NMM. Po odstránení ochrany sa výsledný amín opäť spojí s terminálnou alkenylkarboxylovou skupinou, čím sa získa produkt 6d. Intramolekulová Hečkova reakcia s paládiovým katalyzátorom poskytuje požadovanú makrocyklickú zlúčeninu 6e. (Hečkova reakcia bola podrobne opísaná v štúdiu R. F. Heck, Org. React. 27 (1989) 345-390). Po hyd rolýze esteru na kyselinu s použitím hydroxidu lítneho sa spojí s amínovým medziproduktom, čím sa získa 6f.

Schéma 7

7a

Príprava zlúčeniny vzorca 7b, kde R¹, R², R³ boli určené vyššie, R' je alkyl, heteroalkyl (OR, SR', NRR', kde R a R' sú alkylové skupiny), halogénový substituent v polohe orto, metá alebo para, R je alkyl, aryl alebo alkylarylová skupina a n je 0 až 5, je uvedená v schéme 7. Hydrogenáciou dvojitej väzby zlúčeniny 6e sa získal makrocyklus 7a. Hydrolýzou esteru na kyselinu a následným spojením s amínovým medziproduktom sa získala zlúčenina 7b.

Schéma 8

-43Príprava zlúčeniny vzorca 8f, kde R¹, R², R³ boli určené vyššie, R' je alkyl, heteroalkyl (OR, SR', NRR', kde R a R' sú alkylové skupiny), halogénový substituent v polohe orto, metá alebo para voči atómu kyslíka, R je alkyl, aryl alebo alkyarylová skupina, PG je Boe, a n je 0 až 5, je uvedená v schéme 8. Metatyrozíndipeptid 8a sa spojí s terminálnym /V-chráneným aminoalkoholom 8b za Mitsunobuových podmienok (trifenylfosfín a ADDP). Ochranné skupiny sa odstránia a získa sa diamín hydrochlorid 8d. Makrocyklizácia sa dosiahne vytvorením väzby s močovinou s použitím fosgénu alebo karbonyl diimidazolu. Výsledný ester sa potom hydroxidom lítnym hydrolyzuje na kyselinu a následne sa spojí s amínovým medziproduktom, čím sa získa požadovaný produkt 8f.

Schéma 9

PG'^- V v COOR R³ o,

Syntéza zlúčenín typu 9d, kde substituenty R¹, R², R³, R', R a PG boli určené v schéme 1, sa začala odstránením ochrany zlúčeniny 9a s použitím HCI vdioxáne a spojením s ω-hydroxykyselinou s použitím EDCI, HOOBt, čím sa získali zlúčeniny typu 9b. Zlúčeniny typu 9b sa ďalej cyklizovali s použitím Ph₃P, ADDP, aby sa generovali zlúčeniny typu 9c. V cyklickej zlúčenine 9c sa odstránila ochrana a spojila sa s primeraným amínovým medziproduktom, čím sa generovala zlúčenina typu 9d.

-44Schéma 10

10i

-45Syntéza zlúčenín typu 10i, kde R²', R¹', R¹, R³ boli určené v schéme 1, PG¹ a PG² boli určené ako ochranné skupiny, menovite Fmoc a Dde. P sa definuje ako polymérová podpora, kde zlúčenina je imobilizovaná a n je číslo 1 až 6. Spôsob použitý na syntézu molekúl typu 10i je štandardná syntéza peptidu so solídnou fázou s použitím Fmoc ako ochrannou skupinou. Zo Sasarinovej živice 10a chránenej skupinou Fmoc sa najprv odstráni ochranná skupina pôsobením piperidínu, po ktorom nasleduje spojenie s aminokyselinou chránenou s Fmoc s použitím HATU, čím sa získala zlúčenina typu 10b. Ochranná skupina 10b sa odstránila a spojila sa s aminokyselinou s použitím HATU, čím sa získala zlúčenina 10c. Z polymérom podporovanej zlúčeniny 10c sa odstránila ochrana pôsobením piperidínu a spojila sa s hydroxykyselinou, čím sa získal hydroxyamid typu 10d. Ochranná skupina 10d sa rozštiepila a spojila sa s chráneným lyzínovým derivátom s použitím HATU, čím sa získali zlúčeniny typu 10e. Ochrannej skupine 10e sa ešte raz odstránila ochrana a spojila sa s aminokyselinou chránenou s Fmoc, čím sa získala zlúčenina typu Wf. Ochranné skupiny PG¹ a PG²sa odstránili a cyklizovali sa s použitím diacidu a HATU, čím sa získal makrocyklus 10g. Zlúčenina 10g sa oxidoval s použitím Dess-Martinovho činidla a nakoniec a vyštiepila zo živice s použitím TFA, čím sa získala zlúčenina 10j.

Schéma 11

Syntéza zlúčenín typu 11e, kde R¹, R², R³, R⁴ a n boli určené v schéme 1 a PG² je Cbz, PG¹ je Bn a PG je Boe, vychádza z chránenej kyseliny 11a. 11a sa prekonvertovala na zlúčeniny typu 11b spojením s derivátom lyzínu s použitím EDCI, HOOBt. Esterická skupina 11b sa hydrolyzovaia s použitím LiOH.H₂O a potom sa spojila s primeraným amínovým medziproduktom, čím sa získala zlúčenina 11c. Táto ďalej reagovala s HCI v dioxáne a spojila sa s lyzínovým medziproduktom s použitím EDCI, HOOBt, čím sa získali zlúčeniny typu 11 d. Zo zlúčenín 11 d sa odstránila ochrana a cyklizovali sa s použitím EDCI, HOOBt, čím sa získali zlúčeniny typu 11 e.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príprava medziproduktov

Medziprodukt A

Krok 1

Do miešaného roztoku 1-nitrobutánu (16,5 g, 0,16 mol) a kyseliny glyoxylovej v H₂O (28,1 g, 0,305 mol) a MeOH (122 ml) sa pri teplote 0 až 5 °C počas 2 hodín pridával po kvapkách trietylamín (93 ml, 0,667 mol). Roztok sa ohrial na izbovú teplotu, miešal sa cez noc a skoncentroval sa dosucha, čím sa získal olej. Olej sa potom rozpustil v H₂O a okyslil sa na pH 1 s 10%-nou HCI, potom sa vyextrahoval

-47s EtOAc. Zlúčený organický roztok sa premyl roztokom soli, vysušil sa nad Na₂SO₄, prefiltroval a skoncentroval sa dosucha, čím sa získal produkt ii (28,1 g, výťažok 99 %).

Krok 2

Do miešaného roztoku počiatočného materiálu ii (240 g, 1,35 mol) v kyseline octovej (1,25 I) sa pridalo 10% Pd/C (37 g). Výsledný roztok sa hydrogenoval pri tlaku 407 kPa (407 kPa (59 psí)) 3 hodiny a potom pri 414 kPa (60 psí) cez noc. Kyselina octová sa potom odparila a azeotropovala 3-krát s toluénom, potom sa triturovala s MeOH a s éterom. Roztok sa potom prefiltroval a azeotropoval dvakrát s toluénom, čím sa získala zlúčenina iii ako špinavobiela tuhá látka (131 g, 0,891 mol, 66 %).

Krok 3

Do miešaného roztoku aminokyseliny iii (2,0 g, 013,6 mmol) vdioxáne (10 ml) a H₂O (5 ml) sa pri 0 °C pridal 1N roztok NaOH (4,3 ml, 14,0 mmol). Výsledný roztok sa miešal 10 minút, potom sa pridal di-ŕerc-butyldikarbonát (0,110 g, 14,0 mmol) a miešal sa 15 minút pri 0 °C. Roztok sa potom ohrial na izbovú teplotu, miešal sa 45 minút a držal sa v chladničke cez noc a skoncentroval sa dosucha, čím sa získal surový materiál. Do roztoku tohto surového materiálu v EtOAc (100 ml) a ľade sa pridal KHSO₄ (3,36 g) a H₂O (32 ml) a miešal sa 4 až 6 minút. Organická

-48vrstva sa potom odseparovala a vodná vrstva sa dvakrát vyextrahovala s EtOAc a zlúčená organická vrstva sa premyla s vodou, vysušila sa cez Na₂SO₄, prefiltrovala a skoncentrovala sa dosucha, čím sa získal produkt iv ako číra guma (3,0 g, výťažok 89 %).

Krok 4

Do miešaného roztoku iv (3,00 g, 12,0 mmol) v DMF (15 ml) a CH₂CI₂ (15 ml) pri -20 °C sa pridal HOOBt (1,97 g, 12,0 mmol), /V-metylmorfolín (4,0 ml, 36,0 mmol) a EDCI (2,79 g, 14,5 mmol) a miešal sa 10 minút, potom sa pridal HCIH₂N-Giy-OBn (2,56 g, 13,0 mmol). Výsledný roztok sa miešal pri -20 °C 2 hodiny, potom sa držal cez noc v chladničke a skoncentroval sa dosucha, potom sa zriedil s EtOAc (150 ml). Roztok EtOAc sa potom dvakrát premyl s nasýteným NaHCO₃, H₂O, 5%-nou H₃PO₄, roztokom soli, vysušil sa nad Na₂SO₄, prefiltroval a skoncentroval sa dosucha, čím sa získal produkt v (4,5 g, 94 %). LRMS m/z MH⁺ = 395,1.

Krok 5

BocHN

(v)

Roztok počiatočného materiálu v (7,00 g, 17,8 mmol) v absolútnom etanole (300 mi) sa miešal pri izbovej teplote vo vodíkovej atmosfére v prítomnosti Pd-C (300 mg, 10 %). Postup reakcie sa sledoval pomocou TLC. Po 2 hodinách sa zmes

-49prefiltrovala cez vrstvu celitu a výsledný roztok sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získal produkt vi (5,40 g, kvantitatívne). LRMS m/z MH⁺ = 305,1.

Krok 6

Do roztoku dimetylamín hydrochloridu (1,61 g, 19,7 mmol), A/-Boc-fenylglycínu (4,50 g, 17,9 mmol), HOOBt (3,07 g, 18,8 mmol) a EDCI (4,12 g, 21,5 mmol) v bezvodom DMF (200 ml) a CH2CI2 (150 ml) pri -20 °C sa pridal NMM (5,90 ml, 53,7 mmol). Po miešaní pri tejto teplote 30 min sa reakčná zmes držala v mraznička cez noc (18 h). Nechala sa potom ohriať na izbovú teplotu a pridal sa EtOAc (450 ml), roztok soli (100 ml) a 5%-ná H3PO4 (100 ml). Po odseparovaní vrstiev sa organický roztok premyl s 5%-nou H3PO4 (100 ml), nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného (2 x 150 ml), vodou (150 ml) a roztokom soli (150 ml), vysušil sa (MgSO₄), prefiltroval sa, a skoncentroval sa vo vákuu, čím sa získal surový produkt viii (4,86 g) vo forme bielej tuhej látky, ktorá sa použila bez ďalšieho čistenia.

Krok 7

N-Boc-fenylglycín dimetylamid viii (4,70 g, surový) sa rozpustil v 4N HCI (60 ml, 240 mmol) a výsledný roztok sa miešal pri izbovej teplote. Postup reakcie sa sledoval pomocou TLC. Po 4 hodinách sa roztok vo vákuu skoncentroval, čím sa

-50získala zlúčenina ix vo forme bielej tuhej látky, ktorá sa použila v ďalšej reakcii bez ďalšieho čistenia. LRMS m/z MH⁺ = 179,0.

Krok 8

Požadovaná zlúčenina x sa pripravila podľa spôsobov opísaných v kroku 4. LRMS m/z MH⁺ = 465,1.

Krok 9

-51 Požadovaný medziprodukt A sa pripravil z tripeptidu x podľa spôsobov opísaných v kroku 7. LRMS m/z MH⁺ = 365,1.

Medziprodukt B

Krokl

(xii)

Požadovaný produkt xii sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 8, s použitím komerčne dostupného xi ako kopulačného partnera. Surový materiál bol dostatočne čistý pre ďalšie štúdie. Časť produktu sa vyčistil flash chromatografiou s použitím dichlórmetánu a MeOH (97:3). HRMS (FAB): vypočítané pre C25H40N3O7: 494,2866 (M + H)⁺; zistené: 494.2863.

Krok 2

HCl. H₂N

O

-52Požadovaný produkt B sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 7. Surový materiál sa použil bez ďalšieho čistenia.

Medziprodukt C

Krok 1

Požadovaná zlúčenina xiii sa pripravila podľa spôsobov opísaných v kroku 6 pre medziprodukt A.

Krok 2

Požadovaná zlúčenina xiv sa pripravila podľa spôsobov opísaných v kroku 7 pre medziprodukt A.

Krok 3

(XV)

-53Požadovaná zlúčenina xv sa pripravila podľa spôsobov opísaných v kroku 6 pre medziprodukt A. LRMS m/z MH⁺ = 451,1.

Krok 4

Požadovaný medziprodukt C sa pripravil podľa spôsobov opísaných v kroku 7 pre medziprodukt A. LRMS m/z MH⁺ = 351,1. Použil sa bez ďalšieho čistenia.

Medziprodukt D

BocHN

Požadovaný medziprodukt D sa pripravil zo zlúčeniny v podľa spôsobov opísaných v kroku 7 pre medziprodukt A. Použil sa bez ďalšieho čistenia.

Medziprodukt E

Krok 1

-54OH

BocHN ii .OH

O

CH₃

Civ) hci.h₂n

(xviii)

Požadovaný produkt xviii sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 8, s použitím komerčne dostupnej zlúčeniny xvii ako kopulačného partnera. Surový materiál bol dostatočne čistý pre ďalšie štúdie.

Požadovaný produkt E sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 7. Surový materiál sa použil bez ďalšieho čistenia.

Medziprodukt F

Krok 1

Požadovaný produkt xx sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 4, s použitím komerčne dostupnej zlúčeniny xix ako kopulačného partnera. Surový materiál bol dostatočne čistý pre ďalšie štúdie.

Krok 2

H •<X ,N

OH

YY

Hjt

°\ ^Ph (XX )

OH n ^Η0|·^Η2^ΝγΛ/^ΝχΛ I (F

•O. ^Ph

O ď?

Požadovaný produkt F sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt D.

Medziprodukt G

Krok 1

(g)

-56Požadovaný produkt G sa získal spôsobom opísaným pre medziprodukt A, krok 4, s použitím alylglycínu ako kopulačného partnera. Surový materiál bol dostatočne čistý. Surový produkt reagoval s 4N HCI/dioxánom a miešal sa pri izbovej teplote 50 min. Reakčná sa skoncentrovala dosucha, čím sa získal medziprodukt G, ktorý sa použil bez ďalšieho čistenia.

Príprava konečných produktov

Príklad 1

Príprava zlúčeniny vzorca 1

Roztok kyseliny 4-chlórpropiónovej (2,0 g, 10,8 mmol) zlúčeniny 1a v dichlórmetáne (200 ml) reagoval s CpRu(CH₃CN)₃ PF6 (4,7 g, 10,8 mmol, 1,0 ekvivalentov) a ohrieval sa pri spätnom toku 2 hodiny. Reakčná zmes sa ochladila na izbovú teplotu, keď sa vyzrážali bezfarebné kryštály produktu 1c. Kryštály sa prefiltrovali a premyli zmesou Et2O/CH2Cl2 (1:1) a vysušili sa vo vákuu. Bezfarebné kryštály (3,3 g) boli analyticky čisté. ¹H NMR (CD3C(O)CD3, 400 MHz, ppm, δ, J) 6,77 (d, 2 H, J = 7,0 Hz), 6,53 (d, 2 H, J = 7 Hz), 5,64 (s, 5 H), 2,87 (t, 2 H, J = 7,0 Hz), 2,74 (t, 2 H, J = 7,9 Hz); MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 350,9 (C14H14CIRu⁺, M⁺, 100); CHN vypočítané pre C14H₁₄CIF₆O₂PRu: C = 33,92 %, H =

-572,85 %, Cl = 7,15 %, P = 6,25 %; zistené: C = 34,04 %, H = 3,04 %, Cl = 7,09 %, P = 5,71 %.

Krok B

OH

Roztok Boc-cyklohexylglycín monohydrátu 1d (6,17 g, 24,00 mmol) v suchom CH2CI2 (50,0 ml) reagoval s 4-metylmorfolínom (2,64 g, 26,0 mmol, 1,1 ekvivalentu) a ochladil sa na -10 °C. Do tejto zmesi sa pridal izobuťylchlórformát (3,62 g, 3,5 ml,

1,1 ekvivalentu) a biela suspenzia sa miešala, až kým teplota kúpeľa nebola -5 °C. Meŕa-tyrozín metylester, hydrochloridová soľ (6,5 g, 26,5 mmol, 1,1 ekvivalentu), sa rozpustil v DMF (30 ml) v osobitnej kadičke a reagoval s 4-metylmorfolínom (2,64 g, 26,0 mmol, 1,1 ekvivalentu) a miešal sa pri izbovej teplote 15 min. Táto zmes sa pridala do reakcie, ktorú sprevádzal vznik CO2. Reakčná zmes sa miešala pri izbovej teplote 1 hodinu a zriedila sa s 1M vodným HCI (100 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s etylacetátom (3 χ 200 ml) a zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala s 1M HCI (1 x 100 ml), vodným NaOH (1 χ 100 ml), roztokom soli (1 x 100 ml), vysušila sa (Na₂SO4), skoncentrovala sa vo vákuu a vyčistila sa chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány 3:7), čím sa získalo 5,3 g (53 %) kopulovanej zlúčeniny 1f vo forme bezfarebnej peny.

Krok C

-58Roztok 1f (10 g, 23,04 mmol) sa rozpustil v HCI (4M roztok vdioxáne, 100 ml) a miešal sa pri izbovej teplote 2 až 4 hodiny. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a tuhá látka sa resuspendovala v éteri. Prefiltrovala sa a tuhá látka sa premyla s éterom, ktorý sa vysušil, výsledkom čoho bola bezfarebná tuhá látka 1g (8,2 g, 96 %); ¹H NMR (d₄-CD₃OD, 400 MHz, δ, ppm), 7,09 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 6,716,36 (m, 3 H), 4,69 (dd, 1 H, J = 6,0 Hz, 3,2 Hz), 3,69 (s, 3 H), 3,66 (d, 1 H, J = 5,2 Hz), 3,15-3,10 (dd, 1 H, J = 5,6 Hz, 4,0 Hz), 1,87-1,69 (m, 6 H), 1,32-1,10 (m, 5 H).

Krok D

OH o

= ^H ry o

Roztok kyseliny cyklopentadién-r|⁶-4-chlórfenylpropiónovej-ruténium hexánfluórfosfátu 1c (2,0 g, 4,0 mmol) v DMF (20 ml) reagoval s HOBt (810 mg, 6,0 mmol,

1,5 ekvivalentov) a s (2,6 g, 16,0 mmol, 4,0 ekvivalentov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCkHCI (888 mg, 5,0 mmol, 1,25 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 30 min pri 0 °C a do zmesi sa pridala sa aminová soľ 1 g (1,48 g, 4,0 mmol) a miešala sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa zriedil s H₂O (200 ml) a vyextrahoval sa do CH₂CI₂ (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1 χ 100 ml), NaHCO₃ (1 x 100 ml), roztokom soli (1 x 100 ml) a vysušili sa (Na₂SO₄),

-59prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu a hnedá tuhá látka 1h sa použila na cyklizáciu bez ďalšieho čistenia.

Krok E

Roztok kyseliny cyklopentadién^6-ruténium-4-chlórfenylpropiónovej-cyklohexylglycín-meŕa-tyrozín-OCH₃ 1h (1,47 g, surový) v suchom DMF (150 ml) reagoval s Cs₂CO₃ (2,40 g, 7,37 mmol, 5,0 ekvivalentov) a zbavil sa plynu prebublávaním suchého N₂ do reakčnej zmesi. Reakčná zmes sa miešala pri izbovej teplote 16 hodín a nadbytočný DMF sa oddestiloval. Zvyšok sa rozpustil v H₂O (200 ml) a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 x 100 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala roztokom soli (100 ml), vysušila sa (Na₂SO₄), prefiltrovala sa, a skoncentrovala sa vo vákuu a zvyšok sa použil na fotolytickú dekomplexáciu ruténia bez ďalšieho čistenia.

Surový ruténiový komplex sa rozpustil v acetonitrile (35 ml), zbavil sa plynu a bol fotolyzovaný v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nM) 48 hodín. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa chromatograficky vyčistil (SiO₂, EtOAc/hexány 7:3), čím sa získalo 360 mg (52 %) bezfarebnej tuhej látky 1i.

Krok F

-60Roztok bifenyléteru 1i (300 mg, 0,65 mmol) v CH₃OH (10 ml), CH₂CI₂ (20 ml) a H₂O (5 ml) reagoval s LiOH«H₂O (90 mg, 2,2 mmol, 3,4 ekvivalenty) a miešal sa 2 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila s vodnou HCI (6M) a vyextrahovala sa do CH₂CI₂ (3 x 30 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná kyselina 1j (200 mg, 66 %).

Roztok kyseliny 1j (100 mg, 0,22 mmol) v suchom DMF (2,5 ml) reagoval s HOOBt (45 mg, 0,33 mmol) a s Hunigovou zásadou (141 mg, 1,1 mmol, 5,0 ekvivalentov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (63 mg, 0,33 mmol, 1,5 ekvivalentu) a miešala sa 20 min. Reakčná zmes reagovala s amínom B (118 mg, 0,27 mmol, 1,22 ekvivalentu) a miešala sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 x 50 ml) a s EtOAc (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (2M), vodným NaOH (2M), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 1k (79 mg), ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 826 [(M+1)⁺, 100], 494 (20), 94 (30).

Roztok hydroxyamidu 1k (130 mg, 0,16 mmol) v DMF (2,0 ml) reagoval s Dess-Martinovým činidlom (130 mg, 0,32 mmol, 2,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH/CH₂CI₂, 1:49), čím sa získal oxidovaný produkt 1 (55 mg, 42 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 858 [(M+CH₃OH+1)⁺, 100], 824 [(M+1)⁺, 63].

Príklad 2

Príprava zlúčeniny vzorca 2

Krok A

C2)

Roztok terc-butylesteru 1 (50,0 mg, 60,0 pmol) reagoval s TFA/CH₂CI₂ (1:1,4 ml) a miešal sa 2 hodiny pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH₃OH/CH₂CI₂, 1:24). Po úplnom odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi (4,0 ml) a skoncentrovala sa, čím sa získala biela tuhá látka 2 (49 mg, 100 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 768 [(M+1)⁺, 100].

Príklad 3

Príprava zlúčeniny vzorca 3

Roztok kyseliny 1j (100 mg, 0,22 mmol) v suchom DMF (2,5 ml) reagoval s HOOBt (45 mg, 0,33 mmol) a s (141 mg, 1,1 mmol, 5,0 ekvivalentov). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (63 mg, 0,33 mmol, 1,5 ekvivalentov) a miešala sa 20 min. Reakčná zmes reagovala s amínom E (79 mg, 0,27 mmol, 1,22 ekvivalentov) a miešala sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 χ 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1M, 30 ml), s vodným NaOH (1M, 30 ml), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 3a (58 mg), ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 693 [(M+1)⁺, 100], 637 (41), 494 (55), 394 (51), 338 (13).

Krok B

(3)

-64Roztok alkoholu 3a (95 mg, 0,14 mmol) VCH2CI2 (2,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (116 mg, 0,28 mmol, 2,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH₂CI₂, 1:32), čím sa získal oxidovaný produkt 3 (47 mg, 42 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 691 (M+1)⁺.

Príklad 4

Príprava zlúčeniny vzorca 4

Krok A

Roztok ŕerc-butylesteru 3 (47,0 mg, 68,0 pmol) reagoval s HCI (4M dioxán, 5 ml) a miešal sa 25 hodín pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH₃OH/CH₂Ci₂, 1:24). Po úplnom odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi

-65(5,0 ml) a skoncentroval sa, čím sa získala biela tuhá látka 4 (43 mg, 100 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 635 [(M+1)⁺, 100)], 465 (62), 336 (62).

Príklad 5

Roztok kyseliny 4-chlórbutyrovej 5a (3,0 g, 15,10 mmol) v dichlóretáne (200 ml) reagoval s CpRu(CH3CN)3PF₆1b (6,6 g, 15,10 mmol, 1,0 ekvivalentu) a ohrieval sa pri spätnom toku 2,5 hodiny. Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a prefiltrovala sa. Filtrát sa skoncentroval vo vákuu a rozpustil sa v CH3CN (10 ml) a reagoval s Et₂0 vo veľkom nadbytku. Guma, ktorá sa vyzrážala, sa odseparovala vyliatím éteru a zvyšok sa rozpustil v CH₂CI₂/CH₃OH (1:1, 100 ml) a skoncentroval sa vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 5b vo forme hnedej tuhnúcej gumy (3,5 g, 46 %).

Krok B

(19}

-66ΟΗ

Roztok karboxylovej kyseliny 5b (3,12 g, 5,95 mmol) v suchom DMF (20 ml) reagoval s Hiinigovou zásadou (3,07 g, 24,0 mmol, 4,0 ekvivalenty, 4,4 ml) a HOBt (1,2 g, 8,93 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (1,35 g, 7,43 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 1 hodinu. Do tejto reakčnej zmesi sa pridal amín hydrochlorid 1g (2,65 g, 7,14 mmol, 1,2 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote. DMF sa oddestiloval a zvyšok sa zriedil vodou a vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2. Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaHCO3, vodnou HCI, roztokom soli, vysušili sa (Na2SO4), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu a surový produkt 5c (4,3 g) sa použil na cyklizáciu bez ďalšieho čistenia. ¹H NMR (d4-CD3OD, 400 MHz, Ô, ppm) 7,35 (t, 1 H), 6,72-6,60 (m, 5 H), 6,33-6,20 (dd, 2 H), 5,51 (s, 5 H), 4,19 (d, 1 H), 3,68 (s, 3 H), 3,19-2,83 (m, 2 H), 2,51-2,40 (m, 2 H), 2,40-2,25 (m, 2 H), 1,99-1,59 (m, 8 H), 1,35-0,98 (m, 5 H); MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita) 695,3 ([M-PFef, 100), 232 (20), 171 (30); HRMS vypočítané pre C34H42N2O5CIRu⁺ (M-PF6)⁺ 695,1832; zistené 695,1845.

Krok C

(5c) (5d)

-67Z roztoku chlór-zlúčeniny 5c (3,0 g, 3,6 mmol) v suchom DMF (300 ml) sa odstránil plyn s použitím suchého N₂ a Cs₂CO₃ (5,2 g, 16 mmol, 4,0 ekvivalenty) a miešal sa 16 hodín pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo DMF sa oddestilovalo a zvyšok sa zriedil vodou a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 χ 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO4), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu a sušili sa vo vákuu cez noc. Boli použité na fotolytické odstránenie Ru bez ďalšieho čistenia. MS FAB (NBA-G/TG-DMSO 695 ([M-PF₆]⁺, 100].

Cyklizovaná zlúčenina z predchádzajúceho kroku sa rozpustila v CH₃CN (35 ml) a fotolyzovala sa v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nm) 48 hodín. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa chromatograficky vyčistil (SiO₂, EtOAc/hexány, 1:1), čím sa získala bezfarebná tuhá látka 5d (600 mg, 34 %). ¹H NMR (CDCI3, 400 MHz, δ, ppm), 7,58 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 7,14 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 6,94 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 6,87 (dd, 1 H, J = 2,4, 5,6 Hz), 6,73 (d, 1 H J = 7,2 Hz), 6,59 (s, 1 H), 6,57 (s, 2 H), 6,39 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,51 (dt, 1 H, J = 2,8, 8,0 Hz), 3,80-3,62 (m, 1 H), 3,62 (s, 3 H), 3,05-3,00 (dd, 1 H, J = 2,8, 11,6 Hz), 2,85 (dd, 1 H, J = 8,4, 6,0 Hz), 2,76-2,72 (m, 1 H), 2,36-2,19 (m, 3 H), 2,02 (dd, 1 H, J = 6,4, 9,2 Hz), 1,8-1,73 (m, 1 H), 1,61-1,34 (m, 7 H), 1,41-0,71 (m, 7 H). MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita), 493 [(M+1)⁺, 100], 465 (20), 232 (30), 171 (40); HRMS vypočítané pre C29H₃₇N₂O₅ (M+1)⁺: 493,2702; zistené: 493,2699.

Krok D

Roztok éteru 5d (200 mg, 0,42 mmol) v CH₃OH (5 ml), CH₂CI₂ (10 ml) a H₂O (0,5 ml) reagoval s Ι_ίΟΗ·Η₂Ο (18 mg, 0,44 mmol, 1,1 ekvivalentu) a miešal sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila s vodnou HCI (12N, 1 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa získala kyselina 5e, ktorá bola použitá priamo v kopulačnej reakcii bez ďalšieho čistenia.

(5f)

Roztok kyseliny 5e v suchom DMF (5,0 mi) reagoval s HOOBt (103 mg, 0,63 mmol, 1,5 ekvivalentu), s Hunigovou zásadou (216 mg, 1,68 mmol, 4,0 ekvivalenty) a s amínom B (270 mg, 0,63 mmol, 1,47 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (101 mg, 0,52 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 x 50 ml) a EtOAc (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy boli vyextrahované s vodnou HCI (2M), vodným NaOH (2M), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 5f (177 mg), ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 840 [(M+1)⁺, 100], 394 (100).

Roztok alkoholu 5f (177 mg, 0,21 mmol) v CH2CI2 (10,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (178 mg, 0,42 mmol, 2,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 3 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH₂CI₂, 1:49), čim sa získal oxidovaný produkt 5 (23 mg, 13 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 870 [(M+CH₃OH+1)⁺, 50], 838 [(M+1)⁺, 100).

Príklad 6

Príprava zlúčeniny vzorca 6

-70Roztok terc-butylesteru 5 (50,0 mg, 60,0 pmol) reagoval s TFA/CH₂CI₂ (1:1,4 ml) a miešal sa 7 hodín pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH3OH/CH2CI2, 1:24). Po úplnom odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi (4,0 ml) a skoncentroval sa, čím vznikla biela tuhá látka 6 (14 mg, 100 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 782 [(M+1)⁺, 100).

Príklad 7

Príprava zlúčeniny vzorca 7

Krok A

(7a) (7b)

Roztok alkoholu 7a (9,2 g, 54,1 mmol) v suchom CH2CI2 (200 ml) reagoval s DMSO (35 ml) a Et₃N (16,4 g, 16,3 mmol, 23,4 ml). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s Py*SO₃ (12,9 g, 81,2 mmol, 1,50 ekvivalentu) rozpustenom v DMSO (30 ml). Reakčná zmes sa miešala pri 0 °C na 0,5 hodiny a 6 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s Et₂O (100 ml)a H₂O (200 ml). Vrstvy sa odseparovali a vodná vrstva sa vyextrahovala s Et₂O (3 χ 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s HCI (2M, 3 x 100 ml), roztokom soli (1 x 100 ml), skoncentrovali sa vo vákuu a vyčistili sa chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 1:7), čím sa získal aldehyd 7b, ktorý po odstátí stuhol sa voskovitú tuhú látku (7,1 g, 77 %). CHN vypočítané pre C9H9CIO: C = 64,11 %, H = 5,38 %; zistené: C = 64,08 %, H = 5,30 %.

-71 Krok B

Roztok tietylfosfonoacetátu (6,72 g, 30 mmol, 1,2 ekvivalentu) v suchom THF (100 ml) reagoval s NaH (60%-ná disperzia, 1,5 g, 35 mmol, 1,4 ekvivalentu) pri 0 °C. Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri 25 °C, kým sa tvorba H₂ nezastavila. Pridal sa roztok aldehydu 7b (4,2 g, 25,0 mmol) v suchom THF (5,0 ml) a reakčná zmes sa miešala 36 hodín. Reakčná zmes sa zriedila s H₂O (100 ml) a vyextrahovala sa s Et₂O (3 x 70 ml). Zlúčená organická vrstva sa vysušila (MgSO₄), prefiltrovaia sa, skoncentrovala sa vo vákuu a chromatografovala sa, čím sa získal α,β-nenasýtený ester 7c (4,2 g, 71 %), ktorý sa použil na redukciu.

Krok C

í 7c)

Roztok α,β-nenasýteného esteru 7c (4,2 g, 8,0 mmol) v EtOAc (50 ml) reagoval s Pd/C (10% (hmotn.), 500 mg) a hydrogenoval sa 12 hodín pri 345 kPa (50 psí). Reakčná zmes sa prefiltrovaia cez vrstvu celitu a filtrát sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získala zredukovaná zlúčenina 7d (3,9 g, 93 %).

Krok D

Ci

-72Roztok esteru 7d (3,9 g, 16,2 mmol) v CH₃OH/THF/H₂O (1:1:0,1, 110 ml) reagoval s LiOH«H₂O (1,2 g, 30 mmol, 2,0 ekvivalenty) a miešal sa 5 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa zriedil s H₂O (100 ml) a vyextrahoval sa do Et₂O (3 x 50 ml). Vodná vrstva sa okyslila na pH ~ 1 (13M HCI) a zakalená vodná vrstva sa vyextrahovala s Et₂O (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (MgSO4), prefiltrovali sa, a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 7e (3,1 g, 96 %). CHN vypočítané pre Ο_1ΊΗι₃αθ₂: C = 62,12 %, H = 6,16 %; zistené: C = 62,27 %, H = 6,23 %.

Krok E

Roztok kyseliny 4-chlórfenylpentánovej 7e (3,0 g, 14,15 mmol) v dichlóretáne (150 ml) reagoval s CpRu(CH₃CN)₃PF₆ 1b (6,75 g, ,15,10 mmol, 1,0 ekvivalent) a ohrieval sa 2,5 hodiny pri spätnom toku. Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a prefiltrovala sa. Filtrát sa skoncentroval vo vákuu a rozpustil sa v CH₃CN (20 ml) a reagoval s Et₂O vo veľkom nadbytku. Vyzrážaná guma sa odseparovala vyliatím éteru, a zvyšok sa rozpustil v CH₂CI₂/CH₃OH (1:1, 100 ml) a skoncentroval sa vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 7f, hnedá tuhnúca guma (4,36 g, 58 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 379 [(M-PF₆)⁺, 100].

Krok F

‘COOH

Roztok karboxylovej kyseliny 7f (3,12 g, 5,95 mmol) v suchom DMF (20 ml) reagoval s Hunigovou zásadou (3,07 g, 24,0 mmol, 4,0 ekvivalenty, 4,4 ml) a s HOBt (1,2 g, 8,93 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (1,35 g, 7,43 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 1 hodinu. Do tejto reakčnej zmesi sa pridal amín hydrochlorid 1 g (2,65 g, 7,14 mmol, 1,2 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote. DMF sa oddestiloval a zvyšok sa zriedil s vodou a vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2. Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaHCO₃, vodnou HCl, roztokom soli, vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a surový produkt 7g (4,3 g) sa použil na ďalšiu cyklizáciu bez čistenia. ¹H NMR (d₄CD₃OD, 400 MHz, δ, ppm), 7,35 (t, 1 H), 6,72-6,60 (m, 5 H), 6,33-6,20 (dd, 2 H),

5,51 (s, 5 H), 4,19 (d, 1 H), 3,68 (s, 3 H), 3,19-2,83 (m, 2 H), 2,51-2,40 (m, 2 H), 2,40-2,25 (m, 2 H), 1,99-1,59 (m, 8 H), 1,35-0,98 (m, 5 H); MS (FAB, NBA-G/TGDMSO, m/z relatívna intenzita) 695,3 ([M-PF₆]⁺, 100), 232 (20), 171 (30); HRMS vypočítané pre C34H42N2O5CIRu⁺(M-PF6) 695,1832; zistené 695,1845.

Krok G

-74Z roztoku chlór-zlúčeniny 7g (3,0 g, 3,6 mmol) v suchom DMF (300 ml) sa odstránil plyn s použitím suchého N₂ a Cs₂CO₃ (5,2 g, 16 mmol, 4,0 ekvivalenty) a miešal sa 16 hodín pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo DMF sa oddestilovalo a zvyšok sa zriedil s vodou a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy boli vysušené (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sä vo vákuu a sušili sa cez noc vo vákuu. Použilo sa na fotolytické odstránenie Ru bez ďalšieho čistenia. MS FAB (NBA-G/TG-DMSO 695 ([M-PF₆]⁺, ].

Cyklizovaná zlúčenina z predchádzajúceho kroku sa rozpustila v CH₃CN (35 ml) a fotolyzovala sa v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nm) 48 hodín. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány 1:1), čím sa získala žltohnedá tuhá látka 7h (600 mg, 34 %). ¹H NMR (CDCI3i 400 MHz, Ô, ppm), 7,58 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 7,14 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 6,94 (d, 2 H, J = 8,4 Hz), 6,87 (dd, 1 H, J = 2,4, 5,6 Hz), 6,73 (d, 1 H, J = 7,2 Hz), 6,59 (s, 1 H), 6,57 (s, 2 H), 6,39 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 4,51 (dt, 1 H, J = 2,8, 8,0 Hz), 3,80-3,62 (m, 1 H), 3,62 (s, 3 H), 3,05-3,00 (dd, 1 H, J = 2,8, 11,6 Hz), 2,85 (dd, 1 H, J = 8,4, 6,0 Hz), 2,76-2,72 (m, 1 H), 2,36-2,19 (m, 3 H), 2,02 (dd, 1 H, J = 6,4, 9,2 Hz), 1,8-1,73 (m, 1 H), 1,61-1,34 (m, 7 H), 1,41-0,71 (m, 7 H). MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita), 493 [(M+1)⁺, ], 465 (20), 232 (30), 171 (40); HRMS vypočítané pre C2gH₃₇N₂O5 (M+1)⁺: 493,2702; zistené: 493,2699.

(ľh^-) (7i)

Roztok éteru 7h (220 mg, 0,46 mmol) v CH₃OH (3,0 ml), CH₂CI₂ (10 ml) a

H₂O (0,5 ml) reagoval s LiOH*H₂O (18 mg, 0,44 mmol, 1,1 ekvivalentu) a miešal sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila s vodnou HCI (13M, 1 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa získala kyselina 7i, ktorá sa použila priamo v kopulačnej reakcii bez ďalšieho čistenia.

-75Krok I

(7j)

Roztok kyseliny 7i v suchom DMF (3,0 ml) reagoval s HOOBt (94 mg, 0,75 mmol, 1,6 ekvivalentu), s Hunigovou zásadou (237 mg, 1,84 mmol, 4,0 ekvivalenty) a s amínom B (246 mg, 0,58 mmol, 1,47 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (110 mg, 0,58 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 25 min pri 0 °C. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Zlúčené vodné vrstvy sa vyextrahovali s CH₂CI₂ (3 χ 30 ml). Organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1M, 60 ml), vodným NaOH (60 ml), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 7j (230 mg), ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 854 [(M+1)⁺, 100], 479 (70), 327 (50), 271,1 (100).

Oj)

Roztok alkoholu 7j (220 mg, 0,26 mmol) v CH₂CI₂ (3,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (218 mg, 0,51 mmol, 2,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH2CI2, 1:24), čím sa získal oxidovaný produkt 7 (23 mg, 13 %) vo forme bezfarebného oleja. MS: (FAB, m/z relatívna intenzita) 852 [<M+1)⁺, 43), 796 (100), 768 (20), 461 (20), 433 (50), 405 (50), 336 (30), 294 (50).

Príklad 8

Príprava zlúčeniny vzorca 8

.OH

-77Roztok terc-butylesteru 7 (32,0 mg, 37,0 pmol) reagoval s TFA/CH2CI2 (1:1, 5,0 ml) a miešal sa 4 hodiny pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH3OH/CH2CI2, 1:24). Po úplnom odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi/CH3OH (4,0 ml) a skoncentroval sa, čím sa získala žltohnedá tuhá látka 8 (29,0 mg, 100 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 796 [(M+1)⁺, 100).

Príklad 9

Príprava zlúčeniny vzorca 9

Krok A

(Sa) Ole) (9b'j

Roztok Boc-glycínu 9a (1,75 g, 10,0 mmol) v suchom DMF (50 ml) reagoval s HOOBt (2,65 g, 15 mmol, 1,5 ekvivalentu) a EDCI (2,86 g, 15,0 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes reagovala s Hunigovou zásadou (5,16 g, 40 mmol, 4,0 ekvivalenty, 7,3 ml). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu a pridal sa mete-tyrozínOCH₃*HCI 1e (2,5 g, 11,5 mmol, 1,1 ekvivalentu) a miešal sa 12 hodín pri 25 °C. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa zriedil s vodným NaHCO₃ a vyextrahoval sa do CH2CI2. Zlúčené organické vrstvy sa skoncentrovali a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 1:1), čím sa získala bezfarebná tuhá látka 9b (3,4 g, 90 %).

-78KrokB

(9b) (9c)

Roztok 9b (4,6 g, 13,06 mmol) v HCI (4M roztok v dioxáne, 50 ml) sa miešal hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vysušil vo vysokom vákuu, čím sa získala zlúčenina 9c vo forme jemného prášku, ktorý sa použil v ďalšom kroku. ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz, δ, ppm), 8,67 (d, 1 H, J = 7,9 Hz), 7,10-7,07 (m, 1 H), 6,68-6,64 (m, 2 H), 4,75-4,70 (m, 1 H), 3,75-3,61 (m, 2 H), 3,66 (s, 3 H), 3,10 (dd, 1 H, J = 5,2, 8,5 Hz), 2,90 (dd, 1 H, J = 8,8 Hz, 5,0 Hz).

Krok C

Roztok [CpRu(kyselina r|⁶-4-chlórfenylpropiónová)]PF₆ 1c (3,0 g, 46,01 mmol) v suchom DMF (60 ml) reagoval s HOBt (1,3 g, 9,16 mmol, 1,5 ekvivalentu) a s Húnigovou zásadou (3,22 g, 4,60 ml, 25,0 mmol, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (1,75 g, 9,16 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 30 min pri 0 °C a pridal sa glycín, amónna soľ, 9c (1,75 g, 6,06 mmol, 1,0 ekvivalent). Reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote

-79a DMF sa oddestiloval vo vákuu. Zvyšok sa zriedil s vodnou HCI (1M, 100 ml) a vyextrahoval sa do CH2CI2 (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali v vodným NaHCO3 (1 x 100 ml), roztokom soli (50 ml), vysušili sa (Na2SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala hnedá tuhá látka 9d (1,5 g, 34 %), ktorá sa použila na cyklizáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 585 [(M-PF₆)⁺, 100], 459 (30), 373 (30), 198 (20).

Krok D

Z roztoku ruténiového komplexu 9d (1,5 g, 2,05 mmol) v suchom DMF (100 ml) sa odstránil plyn s použitím suchého N₂ pri izbovej teplote a pridal sa CS2CO3 (5,0 g, 15 mmol, 7,5 ekvivalentu) a miešal sa 12 hodín pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo DMF sa oddestiloval a zvyšok sa zriedil vodou (100 ml) a vyextrahoval sa s CH2CI2 (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali roztokom soli (100 ml), vysušili sa (Na2SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a sušili sa cez noc vo vákuu. Použili sa na fotolytické odstránenie Ru bez ďalšieho čistenia.

Cyklizovaná zlúčenina z predchádzajúceho kroku sa rozpustila v CH3CN (30 ml) a prefiltrovala sa do skúmavky z kremenného skla. Z roztoku sa odstránil plyn a fotolyzoval sa v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nm) 48 hodín. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc), čím sa získala žltohnedá tuhá látka 9e (230 mg, 30 %). ¹H NMR (CDCb, 400 MHz, δ, ppm), 7,23-7,18 (m, 2 H), 7,09-7,01 (m, 3 H), 6,76 (dd, 1 H, J = 2,4, 8,8 Hz), 6,66 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 6,47 (d, 1 H, J = 5,6 Hz), 6,17 (s, 1 H), 5,64 (s, 1 H), 4,69 (q, 1 H, J = 4,4 Hz), 3,77.(s, 3 H), 3,68-3,51 (m, 2 H), 3,35 (dd, 1 H, J = 4,0, 10,8 Hz), 3,05 (dd, 1 H, J = 5,2, 9,2 Hz), 2,96-2,92 (m, 2 H), 2,61-2,56 (m, 1 H), 2,30-2,29 (m, 1 H); ¹³C NMR: (CDCI₃, 100 MHz, Ô, ppm), 172,3, 171,4, 168,1,

-80159,9, 155,4, 137,6, 136,4, 131,0, 130,0, 129,5, 123,3, 122,4, 121,0, 117,7, 117,1, 53,6, 53,0, 43,6, 39,9, 36,1, 32,3. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 383 [(M+1)⁺, 100], 279 (20).

Krok E

Roztok cyklickej zlúčeniny 9e (150 mg, 0,4 mmol) v THF (4,0 ml), H₂O (4,0 ml) sa miešal 3 hodiny pri izbovej teplote s LiOH«H₂O (41,0 mg, 1,0 mmol, 2,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa okyslila s koncentrovanou HCI (2,0 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu. Tuhá látka 9f sa vysušila vo vákuu a použila sa na ďalšiu kopulačnú reakciu bez ďalšieho čistenia.

Roztok hydrolyzovanej kyseliny 9f v suchom DMF (4,0 ml) a CH₂CI₂ (4,0 ml) reagoval s HOOBt (103 mg, 0,58 mmol, 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C, a

-81 pridala sa Híinigova zásada (206 mg, 1,60 mmol, 4,0 ekvivalenty, 295 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (112 mg, 0,58 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 0,5 hodiny pri 0 °C a reagovala s amín hydrochloridom B (206 mg, 0,48 mmol, 1,2 ekvivalentu). Reakčná zmes sa držala v mrazničke 48 hodín a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH₂CI₂. Zvyšok sa zriedil s vodnou HCI a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 x 50 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala s vodnou HCI (1M, 3 x 50 ml), vodným NaOH (2M), roztokom soli (100 ml), vysušila sa (Na₂SO₄) a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok 9g (200 mg) sa oxidoval bez ďalšieho čistenia.

Roztok alkoholu 9g (200 mg, 0,27 mmol) v CH₂CI₂ (3,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (342 mg, 0,81 mmol, 3,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 3 hodiny pri izbovej teplote a zriedila sa s vodným NaHCO₃ ä s vodným Na₂S₂O₃. Reakčná zmes sa miešala 20 min pri izbovej teplote a reakčná zmes sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 x 30 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali roztokom soli (50 ml), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH (2M NH₃)/CH₂CI₂, 1:19), čím sa získal ketoamid 9 (100 mg, 50 %) bezfarebnej tuhej látky. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 742 ([M+1 ]⁺, 100), 686 (80).

-82Príklad 10

Príprava zlúčeniny vzorca 10

<10)

Krok A

Roztok terc-butylesteru 9 (100 mg, 0,13 mmol) v suchom CH2CI2 (4,0 ml) reagoval s TFA (4,0 ml) a miešal sa 5 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa opakovane rozpustil v zmesi toluén/CH₂CI₂ a skoncentroval sa vo vákuu niekoľkokrát, čím sa získala jemná bezfarebná tuhá látka 10. MS (FAB, NBA/DMSO, m/z relatívna intenzita), 686 [(M+1)⁺, 40], 460 (20), 307 (100), 289 (60); HRMS vypočítané pre C36H40N5O9 (M+1)⁺: 686,2825; zistené: 686,2840.

Príklad 11

Príprava zlúčeniny vzorca 11

Krok A

Do roztoku amín hydrochloridu 1g (1,20 g, 3,23 mmol), kyseliny 6-hepténovej (0,610 g, 4,68 mmol), HOOBt (0,765 g, 4,69 mmol) a EDCI (1,07 g, 5,58 mmol) v bezvodom DMF (50 ml) a CH₂CI₂ (50 ml) sa pri -20 °C pridal NMM (1,55 ml, 14,1 mmol). Po miešaní 30 min pri tejto teplote sa reakčná zmes držala 18 hodín v mrazničke. Potom sa nechala ohriať na izbovú teplotu. Pridal sa EtOAc (150 ml), roztok soli (50 ml) a 5%-ná H₃PO₄ (50 ml). Po odseparovaní sa organický roztok premyl 5%-nou H₃PO₄ (80 ml), nasýteným vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 80 ml), vodou (80 ml), a roztokom soli (80 ml), vysušil sa so síranom horečnatým, prefiltroval sa a skoncentroval sa vo vákuu. Chromatograficky (2 až 5% MeOH-CH₂CI₂) sa získala zlúčenina 11a (1,46 g, 3,28 mmol, kvantitatívne) vo forme bielej tuhej látky. ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO), δ 9,25 (s, 1 H), 8,31 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,70 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,05-7,01 (m, 1 H), 6,62-6,58 (m, 3 H), 5,82-5,72 (m, 1 H), 5,02-4,91 (m, 1 H), 4,43-4,38 (m, 1 H), 4,23-4,19 (m, 1 H), 3,55 (s, 3 H), 2,932,80 (m, 2 H), 2,51-1,97 (m, 2 H), 1,66-0,86 (m, 15 H); ¹³C NMR (d6-DMSO, 125 MHz), δ, 171,9, 171,8, 171,1,157,2, 138,6, 138,4, 129,1, 119,5, 115,8, 114,6, 113,5, 56,5, 53,5, 51,6, 36,5, 34,8, 32,8, 29,0, 28,0, 27,8, 25,8, 25,5, 24,8; HRMS, m/z

445,2683 (vypočítané pre C25H36N2O5: 445,2702, chyba: 4 ppm).

-84Krok B

(11a)

Do roztoku 11a (1,46 g, 3,28 mmol) v bezvodom THF (60 ml) v dusíkovej atmosfére pri 0 °C sa opatrne pridal roztok bóranu a THF (12 ml, 1,0M, 12 mmol). Výsledný roztok sa miešal 1 hodinu 40 min pri 0 °C v dusíkovej atmosfére. Potom sa pridal etanol (4 ml) a tlmivý roztok pH 7 (8 ml), potom sa pridal vodný 30%-ný roztok H2O2 (7,5 ml). Po miešaní 20 min pri 0 °C sa ohrial na izbovú teplotu a miešal sa 2 hodiny. Pridal sa EtOAc (200 ml) a roztok soli (100 ml) a vrstvy sa oddelili. Vodný roztok sa vyextrahoval s EtOAc (2 x 150 ml). Zlúčený organický roztok sa vysušil so síranom horečnatým, prefiltroval sa, skoncentroval sa vo vákuu. Chromatografiou (2 až 5% MeOH-CH₂CI₂) sa získala zlúčenina 11b (1,05 g, 2,18 mmol, 68 %) vo forme bielej tuhej látky. ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO), δ, 9,25 (s, 1 H), 8,30 (d, J = 7,2 Hz, 1 H), 7,68 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,05-7,01 (m, 1 H), 6,62-6,58 (m, 3 H), 4,43-4,18 (m, 3 H), 3,55 (s, 3 H), 3,37-3,33 (m, 2 H), 2,93-2,80 (m, 2 H), 2,20-2,03 (m, 2 H), 1,66-0,87 (m, 19 H); ¹³C NMR (d6-DMSO, 125 MHz), d 172,1, 171,8, 171,2, 157,2, 138,4, 129,1, 119,5, 115,8, 113,5, 60,7, 56,5, 53,5, 51,7, 36,5, 35,1, 32,6, 32,4, 29,0, 28,5, 28,0, 25,8, 25,6, 25,4, 25,2, ; HRMS, m/z 463,2813 (vypočítané pre Ο₂₅Η₃6Ν₂Ο₅: 463,2808, chyba: 1 ppm).

Krok C

(11b)

<11c)

-85Do roztoku fenolalkoholu 11b (1,00 g, 2,16 mmol) tri-n-butylfosfínu (1,10 ml, 4,28 mmol) v bezvodom CH2CI2 (100 ml) a THF (40 ml) pri 0 °C sa pridal ADDP (1,08 g, 4,28 mmol). Po miešaní 1 hodinu pri 0 °C sa roztok ohrial na izbovú teplotu a miešal sa 3 hodiny v dusíkovej atmosfére. TLC ukázala úplné spotrebovanie počiatočného materiálu. Po odstránení rozpúšťadla vo vákuu sa zvyšok čiastočne vyčistil chromatograficky (0 až 3% MeOH v CH₂CI₂), čím sa získal makrolyt 11c (650 mg, 1,46 mmol, 68 %). ¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO), δ, 8,58 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,76 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,18-7,14 (m, 1 H), 6,76-6,65 (m, 3 H), 4,77-4,71 (m, 1 H),

4,32 (t, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,97-3,93 (m, 1 H), 3,82-3,78 (m, 1 H), 3,67 (s, 3 H), 3,183,14 (m, 1 H), 2,98-2,92 (m, 2 H), 2,32-2,25 (m, 1 H), 2,02-2,01 (m, 1 H), 1,99-0,87 (m, 19 H); ¹³C NMR (d₆-DMSO, 125 MHz), δ 172,1, 171,6, 171,4, 160,1, 158,8, 139,0, 129,1, 121,1, 113,0, 111,9, 66,4,56,1,52,0, 50,1,40,6,34,9,34,2,28,7, 28,3, 26,8, 26,3, 25,9, 25,5, 25,2, 24,2; HRMS, m/z 445,2685 (vypočítané pre C₂5H₃₆N₂O₅: 445,2702, chyba: 4 ppm).

Krok D

f11d)

Vodný roztok hydroxidu lítneho (70 mg, 15 ml H₂O, 2,92 mmol) sa pridal do roztoku metylesteru 11c (330 mg, 0,742 mmol) v THF (20 ml) a etanolu (10 ml) pri teplote miestnosti. Zmes sa miešala pri teplote miestnosti 3 hodiny. Vývoj reakcie sa monitoroval pomocou TLC. Potom sa roztok skoncentroval vo vákuu. Pridal sa EtOAc (100 ml), 6N HCI roztok (10 ml) a voda (50 ml) a vrstvy sa oddelili. Vodný roztok sa extrahoval s EtOAc (2 x 80 ml). Organické roztoky sa spojili, sušili so síranom horečnatým, filtrovali a skoncentrovali vo vákuu za vzniku zlúčeniny 11d (260 mg, 0,604 mmol, 81 %) ako bielej tuhej látky.

¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 8,43 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,73 (d, J = 9,3 Hz, 1 H), 7,17-7,13 (m, 1 H), 6,77-6,66 (m, 3 H), 4,67-4,62 (m, 1 H), 4,32-4,28 (m, 1 H), 3,98-863,93 (m, 1 H), 3,81-3,75 (m, 1 H), 3,17-3,13 (m, 1 H), 2,97-2,90 (m, 1 H), 2,32-2,26 (m, 1 H), 2,01-1,97 (m, 1 H), 1,67-0,85 (m, 19 H); ¹³C NMR (d6-DMSO, 125 MHz), δ

173,2,171,6, 171,3, 158,8, 139,3, 129,0, 121,1, 113,1, 111,9, 66,4, 56,1, 50,8, 35,1,

34,3, 28,8, 28,3, 26,9, 26,3, 25,9, 25,6, 25,5, 25,2, 24,2; HRMS, m/z 431,2564 (vypočítané pre C25H₃₆N2O₅: 431,2546, chyba: 4 ppm).

Krok E

(I1e)

Do roztoku kyseliny 11d (0,140 g, 0,325 mmol), amínu B (0,140 g, 0,325 mmol), HOOBt (56 mg, 0,343 mmol) a EDCI (75 mg, 0,391 mmol) v bezvodom DMF (40 ml) a CH₂CI₂ (20 ml) pri -20 °C sa pridal NMM (0,107 ml, 0,973 mmol). Po miešaní počas 30 min pri tejto teplote sa reakčná zmes držala 18 hodín v mrazničke. Potom sa pridal EtOAc, roztok soli a 5%-ná H₃PO₄. Odseparovaný organický roztok sa premyl postupne s 5%-nou H₃PO₄, nasýteným vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného, vodou a roztokom soli, vysušil sa so síranom horečnatým, prefiltroval sa, a skoncentroval sa vo vákuu. Flash chromatografiou (2 až 5% MeOH-CH2Cl2) sa získala zlúčenina 11e vo forme zmesi diastereomérov (0,170 g, 0,211 mmol, 65 %) vo forme bielej tuhej látky, ktorá sa použila v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

-87KrokF

Do zmesi hydroxyamidu 11e (0,29 g, 0,36 mmol) a Dess-Martinovho činidla (0,45 g, 1,06 mmol) pri izbovej teplote sa pridal bezvodý CH2CI2 (60 ml), DMF (3 ml) a DMSO (3 ml). Výsledný roztok sa prudko miešal 2,5 hodiny pri izbovej teplote. Pridalo sa ďalšie množstvo Dess-Martinovho činidla (300 mg, 0,71 mmol) a reakčná zmes sa miešala ďalšiu hodinu. Pridal sa nasýtený vodný roztok hydrogénuhličitanu sodného a siričitanu sodného (oba po 40 ml) a zmes sa prudko miešala 10 min, potom sa pridal EtOAc (200 ml) a voda (30 ml) a vrstvy sa odseparovali. Organický roztok sa premyl 5%-ným roztokom H3PO4 (2 x 100 ml) a nasýteným roztokom NaHCO₃ (100 ml), vysušil sa síranom horečnatým, prefiltroval sa a skoncentroval sa vo vákuu. Flash chromatografiou (1 až 5% MeOH-CFhCh) sa získala zlúčenina 11 (100 mg, 0,124 mmol, 35 %) vo forme bielej tuhej látky. ¹H NMR (400 MHz, d6DMSO), δ, 8,79-8,69 (m, 2 H), 8,36-8,16 (m, 2 H), 7,72-7,68 (m, 1 H), 7,42-7,33 (m, 5 H), 7,17-7,13 (m, 1 H), 6,77-6,63 (m, 3 H), 5,30-5,27 (m, 1 H), 5,09-5,04 (m, 1 H), 4,85-4,76 (m, 1 H), 4,29-4,25 (m, 1 H), 3,98-3,74 (m, 1 H), 3,02-2,85 (m, 2 H), 2,322,27 (m, 1 H), 2,04-1,96 (m, 1 H), 1,72-0,81 (m, 35 H); ¹³C NMR (d6-DMSO, 125

MHz), δ, 196,5,. 196,2, 171,65, 171,61, 171,5, 171,14, 171,07, 169,4, 167,6, 160,7, 158,84, 158,79, 139,5, 139,3, 136,6, 136,5, 128,92, 128,90, 128,7, 128,6, 128,1, 127,7, 127,4, 124,9, 121,34, 121,28, 113,1, 112,9, 112,0, 111,9, 81,3, 66,34, 66,30, 56,92, 56,87, 56,3, 56,2, 53,4, 53,3, 51,5, 50,9, 41,5, 41,4, 40,8, 40,7, 36,6, 36,1,

-8834,4, 34,3, 31,8, 31,6, 30,4, 29,1, 28,9, 28,4, 28,3, 27,5, 26,8, 26,21, 26,17, 25,9, 25,59, 25,55, 25,0, 24,2, 18,74, 18,66,13,5, 13,4; HRMS, m/z 804,4542 (vypočítané pre C25H36N2O5: 804,4548, chyba: 1 ppm).

Príklad 12

Príprava zlúčeniny vzorca 12

Roztok ŕerc-butylesteru 11 (56,8 mg, 0,0706 mmol) v kyseline trifluóroctovej (15 ml) a CH2CI2 (15 ml) sa miešal 4 hodiny pri izbovej teplote. Po odstránení prchavých látok vo vákuu sa zvyšok rozpustil v 50%-nom MeOH-CH₂CI₂ (3 ml) a skoncentroval sa dosucha vo vákuu, čím sa získala špinavobiela tuhá látka 12 (50 mg, 0,0669 mmol, 95 %). ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO), δ, 8,75-8,71 (m, 2 H), 8,36-8,16 (m, 2 H), 7,72-7,69 (m, 1 H), 7,39-7,31 (m, 5 H), 7,17-7,13 (m, 1 H), 6,76-896,63 (m, 3 H), 5,37-5,35 (m, 1 H), 5,07-5,04 (m, 1 H), 4,85-4,76 (m, 1 H), 4,29-4,25 (m, 1 H), 3,97-3,74 (m, 4 H), 3,02-2,86 (m, 2 H), 2,32-2,26 (m, 1 H), 2,01-1,97 (m, 1 H), 1,70-0,82 (m, 26 H); ¹³C NMR (d6-DMSO, 125 MHz), δ, 196,5, 196,2, 171,63, 171,59, 171,52, 171,48, 171,1, 171,06, 167,4, 160,6, 158,82, 158,78, 153,4, 139,4, 137,1, 137,0, 128,91, 128,88, 128,7, 128,65, 128,61, 128,5, 128,43, 128,39, 128,33, 128,32, 128,14, 128,12, 128,0, 127,7, 127,63, 127,59, 127,5, 127,4, 126,8, 121,3,

115,9, 113,1, 112,9, 112,8, 112,0, 111,9, 111,88, 66,33, 66,29, 56,3, 56,2, 56,17, 53,34, 53,31, 53,27, 51,1, 50,9, 41,5, 40,84, 40,77, 40,7, 40,6, 40,56, 40,53, 40,5, 38,7, 38,6, 38,56, 38,53, 36,6, 36,1, 34,4, 34,3, 31,8, 31,6, 29,4, 29,1, 29,0, 28,9,

28,4, 28,3, 28,2, 26,9, 26,8, 26,79, 26,20, 26,16, 25,88, 25,86, 25,79, 25,75, 25,71,

25,66, 25,57, 24,54, 25,4, 25,0, 24,2, 18,7, 18,6, 13,5, 13,4; HRMS, m/z 748,3947 (vypočítané pre C25H36N2O5: 748,3922, chyba: 3 ppm).

Príklad 13

Príprava zlúčeniny vzorca 13

(13)

Krok A

Požadovaná zlúčenina 1£a sa pripravila podľa spôsobu v príklade 11, krok A, s výnimkou substitúcie kyseliny 6-hydroxyhexánovej za kyselinu 6-hepténovú (39 %)·

-90KrokB

Požadovaná zlúčenina 13b sa pripravila zo zlúčeniny 13a podľa spôsobu v príklade 11, krok C, s výťažkom 74 %.

Krok C

Požadovaná makrocyklická kyselina 13c sa pripravila zo zodpovedajúceho metylesteru 13b podľa spôsobu v príklade 11, krok D, s výťažkom 88 % vo forme bielej tuhej látky.

Krok D

(«c)

Cb)

CH₃ (I3d)

Požadovaná zlúčenina 13d sa pripravila zo zlúčeniny 13c a B podľa spôsobu v príklade 11, krok E, s výťažkom 48 %.

Krok E

Príklad 14

Príprava zlúčeniny vzorca 14

92Krok A

Požadovaná zlúčenina 14 sa pripravila zo zlúčeniny 13 podľa spôsobu v príklade 12, krok A, s kvantitatívnym výťažkom.

-93Roztok 3-jód-fenylalanínu 15a (2,50 g, 8,59 mmol) a koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovej (2 ml, 24 mmol) v metanole sa ohrieval 18 hodín do spätného toku. Odstránením rozpúšťadiel vo vákuu sa získala biela tuhá látka 15b, ktorá sa použila v kroku B bez ďalšieho čistenia.

Krok B

C 15b)

Požadovaná zlúčenina 15c sa pripravila s 84%-ným výťažkom zo zlúčeniny 15b podľa spôsobu v príklade 11, krok A. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

(15c) (l5d)

Požadovaná zlúčenina 15d sa pripravila zo zlúčeniny 15c podľa spôsobu v príklade 11, krok A (kvantitatívne). Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok D

(15d) (15e)

-94Požadovaná zlúčenina 15e sa pripravila so 68%-ným výťažkom zo zlúčeniny 15d podľa spôsobu v príklade 11, krok A. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok E .OMe <15e) (I5f)

Roztok 15e (1,16 g, 2,04 mmol), trietylamínu (2,90 ml, 20,6 mmol) v bezvodom acetonitrile (25 ml) a DMF (20 ml) v hrubostennej skúmavke sa 5 min prebublával s argónom. Do tohto roztoku pri izbovej teplote rýchlo pridalo tetrakistrifenylfosfín paládium (0) (235 mg, 0,203 mmol). Skúmavka sa zatvorila teflónovým uzáverom na závit a ohrievala sa na 85 až 90 °C v olejovom kúpeli. Po 3 hodinách miešania sa ochladila na izbovú teplotu, opatrne sa otvorila a vyliala sa na EtOAc (100 ml). Roztok sa premyl 5%-nou H3PO4 (4 x 50 ml) a vodou (50 mi). Organická vrstva sa vysušila síranom horečnatým, prefiltrovala sa, skoncentrovala sa vo vákuu. Flash chromatografiou (1 až 4% MeOH-ChbCh) sa získala makrocyklická zlúčenina 15f (330 mg, 0,749 mmol, 37 %).

Krok F (159)

-95Požadovaná zlúčenina 15 g sa pripravila kvantitatívne zo zlúčeniny 15f podľa spôsobu v príklade 11, krok D. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Požadovaná zlúčenina 15h sa pripravila so 77%-ným výťažkom zo zlúčeniny 15g podľa spôsobu v príklade 11, krok F. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

(15)

-96Požadovaná zlúčenina 15 sa pripravila s 55%-ným výťažkom zo zlúčeniny 15h podľa spôsobu v príklade 1, krok H.

Príklad 16

Príprava zlúčeniny vzorca 16

(15)

spôsobu v príklade 12, krok A.

Príklad 17

Príprava zlúčeniny vzorca 17

-97KrokA

<15f) _07a)

Do roztoku 15f (150 mg, 0,340 mmol) v EtOH (10 ml) a EtOAc (5 ml) sa pridalo 10%-né paládium na uhlíku (20 mg). Suspenzia sa miešala vo vodíkovej atmosfére 8 hodín, počas ktorých sa postup reakcie sledoval s použitím TLC. Po prefiltrovaní cez vrstvu celitu sa rozpúšťadlá odstránili vo vákuu, čím sa získal produkt vo forme bielej tuhej látky 17a (150 mg, 0,339 mmol, kvantitatívne). Použil sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok B

(17b) (17a)

Požadovaná zlúčenina 17b sa pripravila zo zlúčeniny 17a podľa spôsobu v príklade 11, krok D. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

(17c)

Požadovaná zlúčenina 17c sa pripravila so 73%-ným výťažkom (kroky B a C) zo zlúčeniny 17b podľa spôsobu v príklade 11, krok E. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

>ch₃

Požadovaná zlúčenina 17 sa pripravila so 46%-ným výťažkom zo zlúčeniny 17 c podľa spôsobu v príklade 11, krok F.

-99Príklad 18

Príprava zlúčeniny vzorca 18

(18)

Krok A

(17)

Požadovaná zlúčenina 18 sa pripravila kvantitatívne zo zlúčeniny 17 podľa spôsobu v príklade 12, krok A.

Príklad 19

Príprava zlúčeniny vzorca 19

-100 Krok A

Požadovaná zlúčenina 19b sa pripravila so 64%-ným výťažkom zo zlúčenín 1g a 19a podľa spôsobu v príklade 11, krok C.

(ΐθο')

Požadovaná zlúčenina 19c sa pripravila zo zlúčeniny 19b podľa spôsobu v príklade 1, krok C. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok C

-101 -

Do suspenzie diamínovej soli 19c (75 mg, 1,52 mmol) a karbonyl diimidazolu (260 mg, 1,60 mmol) v acetonitrile (400 ml) sa pri izbovej teplote pridal trietylamín (0,26 ml, 1,85 mmol). Zmes sa miešala 3 dni. Rozpúšťadlo sa odstránilo vo vákuu. Zvyšok sa rozpustil v EtOAc/THF (100/50 ml) a roztok sa premyl 5%-nou H3PO4, vysušil sa síranom horečnatým, prefiltrovala sa, skoncentroval sa vo vákuu. Flash chromatografiou (2 až 10% MeOH-CH₂CI₂) sa získala zlúčenina 19d (290 mg, 0,651 mmol, 43 %) vo forme bielej tuhej látky.

Cl9d)

Požadovaná zlúčenina 19e sa pripravila s 97%-ným výťažkom zo zlúčeniny 19d podľa spôsobu v príklade 11, krok D. Použila sa v nasledujúcej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok E

(19e)

(b)

-102 -

<19f)

Požadovaná zlúčenina 19f sa pripravila so 66%-ným výťažkom zo zlúčeniny 19e a B podľa spôsobu v príklade 11, krok E.

Požadovaná zlúčenina 19 sa pripravila so 66%-ným výťažkom zo zlúčeniny 19f podľa spôsobu v príklade 11, krok F. Dva produkty sa čiastočne odseparovali flash chromatografiou (0 až 5% MeOH-CHkCh).

Príklad 20

Príprava zlúčeniny vzorca 20

(2(0

- 103-

Požadovaná zlúčenina 20 sa v príklade 12, krok A.

pripravila zo zlúčeniny 19 podľa spôsobu

Príklad 21

Príprava zlúčeniny vzorca 21

Roztok 5-hexén-1-olu 21a (10 g, 50 mmol) v dietyléteri (100 ml) reagoval s trietylamínom (10,1 g, 100 mmol, 2,0 ekvivalenty) a ochladil sa na 0 °C. Po kvapkách sa pridal roztok fosgénu v benzéne (20%, 100 ml, 20 g, 200 mmol, 4,0

-104ekvivalenty) a reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote. Vyzrážaný trietylamín hydrochlorid sa prefiltroval a filtrát sa skoncentroval vo vákuu. Zvyšok 21b sa použil priamo na ďalšie štúdie bez čistenia.

Roztok 1f (8,0 g, 18,43 mmol) v CH₂CI₂ (100 ml) reagoval s trietylamínom (2,43 g, 24,0 mmol, 1,3 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na -78 °C a po kvapkách sa pridal alylchlórformát (2,9 g, 24 mmol, 1,3 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote a reakčná zmes sa zriedila s H₂O (100 ml) a vodnou HCI (2M, 200 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s EtOAc (3 χ 200 ml). Zlúčené EtOAc vrstvy sa vyextrahovali s použitím roztoku soli, vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali vo vákuu, a zvyšok 21c sa priamo použil na Boe odstránenie ochrany. ¹H NMR (CHCb, 300 MHz, δ, ppm), 7,29 (t, 1 h, J = 6,0 Hz), 7,06-6,98 (m, 3 H), 6,41 (d, 1 H, J = 5,4 Hz), 6,05-5,95 (m, 1 H), 5,42 (dd, 1 H, J = 1,2, 13,2), 5,31 (dd, 1 H, J = 1,2, 13,2), 5,10 (d, 1 H, J = 6,6 Hz), 4,91-4,87 (q, 1 H), 4,74 (d, 1 H, J = 4,5 Hz), 3,95-3,92 (m, 1 H), 3,70 (s, 3 H), 3,12 (d, 1 H, J = 4,2 Hz), 1,81-1,51 (m, 6 H), 1,43 (s, 9 H), 1,21-0,91 (m, 6 H).

(21c)

- 105Roztok 21c (1,5 g) v HCI (4M vdioxáne, 100 ml) sa miešal 3 hodiny pri izbovej teplote. Úbytok počiatočného materiálu sa sledoval s použitím TLC a keď sa počiatočný materiál stratil, reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok 21 d sa usušil v pumpe. Použil sa na kopulačnú reakciu bez ďalšieho čistenia.

Krok D

(21 e)

Roztok amín hydrochloridu 21 d (4,0 g, 8,9 mmol) v CH2CI2 (50 ml) reagoval s trietylamínom (2,73 g, 27 mmol, 3,0 ekvivalenty, 3,8 ml) a ochladil sa na -78 °C. Po kvapkách sa pridal roztok chlórformátu 21b (2,3 g, 13,3 mmol, 1,5 ekvivalentu) v CH₂CI₂ (30 ml). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote a zriedila sa s vodnou HCI (1M, 150 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s EtOAc (3 x 100 ml). Zlúčené etylacetátové vrstvy sa vyextrahovali s H₂O (100 ml), roztokom soli (100 ml), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 3:7), Čím sa získala zlúčenina 21 e vo forme bezfarebnej tuhej látky (5 g, 80 %).

Krok E

-106 -

Roztok alloc-chránenej zlúčeniny 21 e (4,0 g, 7,2 mmol) v suchom THF (60,0 ml) reagoval s dimediónom (2,01 g, 14,4 mmol, 2,0 ekvivalenty), Pd(PPh3)4 (830 mg, 0,71 mmol, 10 mol%) pri 0 °C a miešal sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAč/hexány, 3:7), čím sa získal alkohol bez ochrannej skupiny 21f vo forme bezfarebnej tuhej látky (2,7 g, 79 %). ¹H NMR (CDCI3, 300 MHz, δ, ppm), 7,44 (bs, 1 H), 7,09 (s, 1 H, J = 6,0 Hz), 6,75-6,72 (m, 2 H), 6,58-6,48 (m, 2 H), 5,81-5,71 (m, 1 H), 5,55 (d, 1 H, J = 7,2 Hz, 4,98 (ddd, 1 H, J = 1,5, 1,2, 9 Hz), 4,92 (dd, 1 H, J = 4,5, 0,9 Hz), 4,88-4,83 (m, 1 H), 4,12-3,97 (m, 1 H), 3,71 (s, 3 H), 3,09-2,98 (m, 2 H), 2,08-2,03 (m, 2 H), 1,722-1,40 (m, 10 H), 1,24-0,94 (m, 5 H); ¹³C NMR (100 MHz, δ), 171,6, 157,3, 156,6, 138,3, 136,6, 129,8, 123,5, 120,6, 117,0, 114,9, 114,6, 65,7, 60,1, 53,2, 52,5, 40,4, 37,1, 33,3, 29,6, 28,6, 28,3, 26,0, 25,9, 25,1;

CHN: vypočítané pre C25H36N2O6: C = 65,20 %, H = 7,88 %, N = 6,08 %; zistené: C = 64,90 %, H = 7,98 %, N = 6,01 %.

Roztok alkénu 21f (650 mg, 1,4 mmol) v bezvodom THF (5,2 ml) sa ochladil na 0 °C a reagoval s BH₃*THF (1M roztok v THF, 4,2 ml, 4,2 mmol, 3,0 ekvivalenty).

- 107Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a opatrne sa pridal EtOH (2,0 ml) za vzniku plynného vodíku. Po ukončení vývoja H2 reakčná zmes reagovala s tlmivým roztokom pH 7 a s vodným H2O2 (30%, 5,0 ml) pri 0 °C. Ľadový kúpeľ sa odstránil a zmes sa miešala 3 až 4 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa vyextrahovala s EtOAc (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s H2O, roztokom soli, vysušili sa (MgSO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 3:7), čím vznikol hydroborátovaný produkt vo forme bezfarebnej tuhej látky 21 g (400 mg, 60 %) [a]_D 86,4 (c 0,3 CHCI3, 25 °C); ¹H NMR (CDCI₃, 400 MHz, δ), 7,26 (s, 1 H), 7,08 (t, 1 H, J = 5,7 Hz), 6,83 (d, 1 H, J = 6,0 Hz), 6,71 (dd, 1 H, J = 1,2, 4,5 Hz), 6,57 (bs, 1 H), 6,54 (d, 1 H, J = 5,7 Hz), 5,68 (d, 1 H, J = 6,9 Hz), 4,85 (dq, 1 H, J = 4,2, 1,8 Hz), 4,05-3,97 (m, 3 H), 3,69 (s, 3 H), 3,60 (t, 2 H, J = 4,8 Hz), 3,08-2,97 (m, 2 H), 1,771,53 (m, 10 H), 1,42-1,25 (m, 4 H), 1,24-0,92 (m, 5 H); ¹³C NMR (CDCI₃,100 MHz, δ ) 171,8, 171,8, 157,6, 156,9, 136,9, 130,0, 120,8, 117,0, 114,8, 65,7, 62,7, 60,3, 53,3, 52,7, 40,5, 37,4, 32,5, 29,7, 29,0, 28,8, 26,2, 26,0, 25,6, 25,4 MS (FAB, NBA/DMSO, m/z relatívna intenzita) 479 ([M+1 ]⁺, 100), 296 (40), 196 (25), 156 (25), 136 (25), 112 (20). HRMS vypočítané pre C25H39N2O7 (M+1)⁺: 479,2760; zistené

479,2757.

Roztok PPh₃ (385 mg, 1,47 mmol, 1,75 ekvivalentov) VCH2CI2 (10 ml) reagoval so zlúčeninou 21 g (400 mg, 0,84 mmol) a ochladil sa na 0 °C. Po kvapkách sa pridal roztok DEAD (220 mg, 1,26 mmol, 1,5 ekvivalentu) v CH2CI2 (10 ml) a miešal sa 3 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo

-108 vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 1:9), čím sa získal cyklický produkt 21 h vo forme bezfarebnej tuhej látky (110 mg, 25 %).

Roztok cyklického karbamátu 21 h (200 mg, 0,44 mmol) vdioxáne (30 ml), CH3OH (20 ml) a CH₂CI₂ (20 ml) reagoval s LiOH*H₂O (80 mg, 2,0 mmol, 4,5 ekvivalentu) a miešal sa 4 hodiny pri izbovej teplote. Reakcia sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s HCI (4M roztok vdioxáne, 10 ml). Voda sa odstránila lyofilizáciou, čím sa získala kryštalická kyselina 21i, ktorá sa použila priamo v kopulačnej reakcii.

Krok I

(21j)

-109 Roztok hydrolyzovanej kyseliny 21i (210 mg, 0,47 mmol) v suchom DMF (5,0 ml) a CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s HOOBt (125 mg, 0,70 mmol, 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C a pridala sa Hunigova zásada (258 mg, 2,0 mmol, 4,0 ekvivalenty, 369 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (134 mg, 0,70 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 0,5 hodiny pri 0 °C a reagovala s amín hydrochloridom B (253 mg, 0,58 mmol, 1,25 ekvivalentu). Reakčná zmes sa držala v mrazničke 24 hodín a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH2CI2. Zvyšok sa zriedil vodnou HCI (2M, 30 ml) a vyextrahoval sa s CH2CI2 (3 χ 50 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala vodnou HCI (2M, 30 ml), vodným NaOH (1M), roztokom soli (2 x 50 ml), vysušila sa (MgSO₄) a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok 21 j (220 mg) sa oxidoval bez ďalšieho čistenia.

Roztok alkoholu 21 j (220 mg, 0,26 mmol) v CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (200 mg, 0,47 mmol, 1,8 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri izbovej teplote a zriedila sa vodným NaHCO₃ (15 ml) a vodným Na₂S₂O₃ (15 ml). Reakčná zmes sa miešala 20 min pri izbovej teplote a vyextrahovala sa s CH₂CI₂ (3 x 30 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným Na2CO₃, vysušili sa (Na2SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu

-110a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH (2M NH3/CH₂CI₂, 1:20), čím sa získal ketoamid 21 (60 mg, 27 %) bezfarebnej tuhej látky.

Príklad 22

Príprava zlúčeniny vzorca 22

Roztok ŕerc-butylesteru 21 (50 mg, 0,059 mmol) v suchom CH₂CI₂ (2,0 ml) reagoval s TFA (2,0 ml) a miešal sa 4 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa opakovane rozpustil v heptánoch/CH₂CI₂ a skoncentroval sa vo vákuu niekoľkokrát, čím sa získala jemná žltohnedá tuhá látka 22 (47 mg), ktorá sa vysušila vo vákuu.

-111 Príklad 23

Príprava zlúčeniny vzorca 23

(23a)

Roztok kyseliny 1d (255 mg, 1,0 mmol) v DMF (2,0 ml) reagoval s HOBt (202 mg, 1,5 ekvivalentu) a s Hunigovou zásadou (517 mg, 4,0 mmol, 4,0 ekvivalenty, 738 μΙ). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s DCC (258 mg, 1,25 mmol, 1,25 ekvivalentu). Po miešaní zmesi 1 hodinu sa pridal histidín-OCH₃«2HCI 23a (242,0 mg, 1,0 mmol) a zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a vyextrahovala sa v EtOAc (3 x 50 ml) a vodnom NaHCO₃ (50 ml). Zlúčená organická vrstva sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH2CI2, 1:19), čím sa získal dipeptid 23b vo forme bezfarebnej tuhej látky (380 mg, 93 %). ¹H NMR (d6-DMSO, 400 MHz, δ, ppm), 8,17 (d, 1 H, J =7,2 Hz), 7,48 (s, 1 H), 6,77 (s, 1 H), 6,57 (bs, 1 H), 5,54 (d, 1 H, J = 7,6 Hz), 4,47 (q, 1 H, J = 7,2 Hz), 3,79 (t, 1 H, J = 8,4 Hz), 3,55 (s, 3 H), 3,363,20 (m, 2 H), 2,94-2,82 (m, 2 H), 1,70-1,47 (bm, 6 H), 1,35 (s, 9 H), 1,46-0,85 (m, 5 H): ¹³C NMR (d₆-DMSO, 100 MHz, δ, ppm), 172,5, 171,9, 157,3, 155,9, 135,4, 78,6,

59,5, 52,9, 52,3, 34,1, 29,6, 28,9, 28,6, 26,5, 26,3, 26,0, 25,2, FAB MS: (NBA-G/TGDMSO, m/z relatívna intenzita) 409. [(M+1)⁺, 100], 353 (10), 170 (20); HRMS vypočítané pre C20H33N4O6: 409,2451: zistené 409,2466; CHN vypočítané pre

-112C20H32N4O5: c = 58,81 %, H = 7,90 %, N = 13,72 %; zistené: C = 58,50 %, H = 7,78 %, N = 13,43 %.

Krok B

Roztok kyseliny ω-brómhepténovej (223 mg, 1,0 mmol) v DMF (3,0 ml) reagoval s amín hydrochloridom 23b ( 380 mg, 1,0 mmol, 1,0 ekvivalent) bez ochrannej skupiny a pridala sa Hunigova zásada (387 mg, 3,0 mmol, 3,0 ekvivalenty). Reakčná zmes reagovala s PyBroP (465 mg, 1,0 mmol) a miešala sa 3 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (S1O2, CH₃OH/CH₂CI₂, T.19), čím sa získala bezfarebná tuhá látka (220 mg, 50 %). MS (FAB) 515,2 [(M+1)⁺, 100], 513,2 [(M+1)⁺, 95)], 469 (60), 433 (20), 170 (40). HRMS vypočítané pre C2₃H₃8BrN₄O₄: 513,2076, zistené: 513,2073.

Roztok bróm-zlúčeniny' 23c (100 mg, 0,23 mmol) v 2-butanóne (4,0 ml) reagoval s Na₂CO₃ (31,0 mg, 0,29 mmol, 1,25 ekvivalentu) a s Lil (50 mg, 0,37 mmol, 1,3 ekvivalentu) a ohrieval sa 24 hodín do spätného toku. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa zriedil vodou. Zvyšok sa vyextrahoval

-113s CH2CI2 (3 χ 30 ml). Zlúčená organická vrstva sa vysušila (Na₂SC>4) sa vyčistila sa chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH2CI2, 1:19), čím sa získala cyklizované zlúčenina 23d (25 mg, 31 %); R,: 0,68 (2M NH₃ v CH₃OH/CH₂CI₂, 1:19), ¹H NMR (CDCI₃, 400

MHz, δ, ppm), 8,17 (d, 1 H, J = 8,8 Hz), 7,33 (s, 1 H), 6,48 (d, 1 H, J = 8,4 Hz), 4,904,85 (m, 1 H), 4,26 (t, 1 H, J = 8,0 Hz), 3,82-3,74 (m, 2 H), 3,69 (s, 3 H), 3,16-3,11 (m, 2 H), 2,91-2,84 (m, 1 H), 2,30-2,01 (m, 2 H), 1,65-1,59 (m, 11 H), 1,18-0,96 (m, 11 H): ¹³C NMR (CDCI₃, 100 MHz, δ, ppm), 172,8, 172,4, 171,9, 138,2, 136,8, 57,6,

52,5, 51,7, 46,6, 41,6, 36,0, 30,9, 29,5, 28,8, 27,3, 26,7, 26,4, 26,3, 26,2, 25,2, 24,8,

MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 433,1 [(M+1)⁺, 100]; HRMS: vypočítané pre C23H37N4O4: 433,2815, zistené: 433,2822.

Roztok metylesteru 23d (200 mg, 0,46 mmol) v CH₃OH (5,0 ml), H₂O (0,5 ml) reagoval s Ι_ιΟΗ·Η2θ (30 mg, 0,75 mmol, 1,6 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 15 hodín pri izbovej teplote a skoncentrovala sa vo vákuu a vysušila sa v pumpe, čím sa získala zlúčenina 23e, ktorá sa použila priamo v kopulačnej reakcii.

Krok E

(23e)

-114-

Roztok kyseliny 23e v CH2CI2 (3,0 ml), DMF (5,0 ml) reagoval s HOOBt (115 mg, 0,70 mmol, 1,5 ekvivalentu) a EDCI (113 mg, 0,60 mmol, 1,25 ekvivalentu). Reakčná zmes potom reagovala s Et₃N (190 mg, 1,88 mmol, 271 μΙ, 4,0 ekvivalenty) a amín hydrochloridom B (201 mg, 0,5 mmol, 1,1 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 13 hodín pri izbovej teplote a zriedila sa s H2O. Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 x 50 ml) a zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali vodným NaOH (1M, 50 ml) a vysušili sa (Na₂SO₄). Vysušená organická vrstva sa prefiltrovala a skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa získal bezfarebný zvyšok 23f (442 mg), ktorý sa vysušil vo vákuu a priamo sa použil na ďalšiu oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 794 [(M+1)⁺, 100],

Krok F

o o

- 115 Roztok hydroxyamidu 23f (50 mg, 0,064 mmol) v CH2CI2 (3,0 ml) reagoval s Dess-Martinovým činidlom (53 mg, 0,13 mmol, 2,0 ekvivalenty) a miešal sa 3 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa zriedila vodným nasýteným roztokom Na2S₂O₃ (20 ml) a miešala sa 15 min pri izbovej teplote. Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 x 30 ml). Organická vrstva sa vysušila (Na₂SO₄), prefiltrovalá sa, skoncentrovala sa vo vákuu a vyčistila sa chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH₂CI₂, 1:15), čím sa získal ketoamid 23 (20 mg, 40 %); MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita) 824 [(M+CH₃OH)⁺, 100], 792 [(M+1)⁺, 60], 447 (20); HRMS vypočítané pre C42H62N7O8 (M+1)⁺: 792,4660, zistené 792,4659.

Príklad 24

Príprava zlúčeniny vzorca 24

Krok A

(24)

-116Roztok ŕerc-butylesteru 23 (17 mg, 21,5 μιηοΐ) v suchom CH2CI2 (2,0 ml) reagoval s TFA (2,0 ml) a miešal sa 8 hodín pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH3OH/CH2CI2, 1:19). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa opakovane rozpustil v CH₃OH/heptánoch/CH2CI2 a niekoľkokrát sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 24 vo forme jemnej bezfarebnej tuhej látky (7 mg). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 768 [(M+CH₃OH)⁺, 100], 736 [(M+1)⁺, 60], 46 (10).

Príklad 25

Príprava zlúčeniny vzorca 25

Krok A

(25a) (1b) (25b)

Roztok Boc-4-chlórfenyIaIanínu 25a (523 mg, 1,75 mmol) v dichlóretáne (37 ml) reagoval s CpRu(CH₃CN)₃ PFô 1b (760 mg, 1,75 mmol, 1,0 ekvivalent) a ohrieval sa 2 hodiny do spätného toku. Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a prefiltrovala sa. Filtrát sa skoncentroval vo vákuu a rozpustil sa v minimálnom objeme CH3CN a reagoval s veľkým nadbytkom Et₂O. Vyzrážaná tuhá látka sa odseparovala a rozpustila v CH2CI2/CH3OH (1:1, 50 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 25b vo forme hnedej peny (640 mg, 69 %).

-117KrokB

Roztok karboxylovej kyseliny 25b (2,4 g, 3,80 mmol) v suchom DMF (15 ml) reagoval s Hunigovou zásadou (1,64 g, 12,64 mmol, 4,0 ekvivalenty, 2,9 ml) a HOBt (661 mg, 4,38 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (699 mg, 3,95 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 15 min. Do tejto reakčnej zmesi sa pridal amín hydrochlorid 1g (1,50 g, 4,00 mmol, 1,2 ekvivalentu)a reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote. DMF sa oddestiloval a zvyšok sa zriedil vodou (30 ml) a vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali vodným NaHCO₃ (30 ml), vodnou HCI (30 ml), roztokom soli, vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a surový produkt 25c (2,5 g, 69 %) sa použil na ďalšiu cyklizáciu bez čistenia.

Krok C

(25d)

-118Z roztoku zlúčeniny 25c (100 mg, 0,11 mmol) v suchom DMF (10 ml) sa suchým N₂ odstránil plyn a reagoval s Cs₂CO₃ (170 mg, 0,5 mmol, 5,0 ekvivalentov) a miešal sa 12 hodín pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo DMF sa oddestilovalo a zvyšok sa zriedil vodou (35 ml) a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a sušili sa cez noc vo vákuu. Použilo sa na fotolytické odstránenie Ru bez ďalšieho čistenia.

Cyklizovaná zlúčenina z predchádzajúceho kroku sa zriedila v CH₃CN a fotolyzovala sa 48 hodín v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nm). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 2:1), čím sa získala zlúčenina 25d vo forme hnedastej tuhej látky (29 mg, 46 %). MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z, relatívna intenzita), 580 [(M+1)⁺, 80], 524 (100), 418 (40), 462 (30), 452 (20), 313 (60), 253 (20).

Roztok esteru 25d (150 mg, 0,26 mmol) v THF (3 ml), CH₃OH (3,0 ml) a H₂O (3,0 ml) reagoval s LiOH*H₂O (18 mg, 0,43 mmol, 1,65 ekvivalentu) a miešal sa 35 min pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila koncentrovanou HCI (13M, 1 ml) a vyextrahovala v CH₂CI₂ (3 χ 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa a skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala kyselina 25e, ktorá sa použila priamo v kopulačnej reakcii bez ďalšieho čistenia.

Krok E

-119-

Roztok kyseliny 25e (150 mg, 0,27 mmol) v suchom CH2CI2 (2,0 ml) reagoval s HOBt (62 mg, 0,40 mmol) a s HOnigovou zásadou (139 mg, 1,1 mmol, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (53 mg, 0,34 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 30 min. Reakčná zmes reagovala s amínom F (88 mg, 0,29 mmol, 1,22 ekvivalentu) a držala sa 12 hodín v mrazničke. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (50 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1M, 3 x 20 ml), vodným NaOH (1M, 3 x 20 ml), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 25f (138 mg), ktorá sa použila na oxidáciu.

Krok F

BocHN

O

H

Bn

O

-120-

Roztok alkoholu 25f (140 mg, 0,143 mmol) v CH₂CI₂/THF (1:1, 5,0 ml) reagoval s Dess-Martinovým činidlom (121 mg, 0,42 mmol, 3,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH3OH/CH₂CI₂, 1:32), čím sa získal oxidovaný produkt 25 (57 mg, 41 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky.

Príklad 26

Príprava zlúčeniny vzorca 26

(26)

-121 Roztok benzylesteru 25 (30 mg, 38,0 μιτιοΙ) vCH₃OH/THF (1:1, 4,0 ml) reagoval s Pd/C (20 mg, 10 %) a nechal sa cez tento roztok prebublávať H2. Pridala sa kvapka kyseliny octovej, aby sa redukcia urýchlila. Reakčná zmes sa prefiltrovala cez vrstvu celitu a filtrát sa skoncentroval vo vákuu. Zvyšok 26 sa analyzoval bez ďalšieho čistenia.

Roztok kyseliny 25e (100 mg, 0,17 mmol) v suchom CH2CI2 reagoval s HOOBt (41 mg, 0,26 mmol) a s Hunigovou zásadou (91 mg, 0,70 mmol, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (35 mg, 0,22 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 30 min. Reakčná zmes reagovala s amínom D (71 mg, 0,22 mmol, 1,22 ekvivalentu) a držala sa v mrazničke 12 hodín. Reakčná

-122 zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 χ 30 ml). Organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1M, 30 ml), vodným Na₂CO₃ (1M, 30 ml), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 27a vo forme bezfarebnej tuhej látky (119 mg), ktorá sa použila na oxidáciu. MS (FAB), 842 [(M+1), 100], 765 (20), 735 (10), 657 (20), 575 (10), 492 (10), 464 (20), 446 (30). HRMS vypočítané pre C₄₆H₆oN₅Oio (M+1)⁺: 842,4339; zistené 842,4336.

Krok B

Roztok alkoholu 27a (120 mg, 0,143 mmol) v CH₂CI₂/THF (1:1, 3,0 ml) reagoval s Dess-Martinovým činidlom (180 mg, 0,42 mmol, 3,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH/CH₂CI₂, 1:32), čím vznikol oxidovaný produkt 27 vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS (FAB, NBA-G/TGDMSO, m/z relatívna intenzita): 840 [(M+1)⁺, 50]⁺. HRMS vypočítané pre C46H58N5O10 (M+1)⁺: 840,4184; zistené 840,4199.

Príklad 28

Príprava zlúčeniny vzorca 28

-123-

(28)

Roztok benzylesteru 27 (40 mg, 47,0 pmoi) vCH₃OH/THF (1:1, 6,0 ml) reagoval s Pd/C (30 mg, 10 %) a cez tento roztok sa nechal prebublávať H₂. Pridala sa kvapka kyseliny octovej, aby sa urýchlila redukcia. Reakčná zmes sa prefiltrovala cez vrstvu celitu a filtrát sa skoncentroval vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 28.

Príklad 29

Príprava zlúčeniny vzorca 29

(29)

-124KrokA

Roztok 4-chlórfenylalanínu 29a (1,5 g, 7,5 mmol) v THF (20 ml) a H₂O (20 ml) reagoval s NaOH (900 mg, 22,5 mmol, 3,0 ekvivalenty) a ochladil sa na 0 ’C. Po kvapkách sa pridal roztok acetylchloridu (707 mg, 9,00 mmol, 1,25 ekvivalentu) v THF (10 ml) a reakčná zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila s vodnou HCI (1M, 10 ml) a vyextrahovala sa s CH2CI2 (3 x 30 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 29b, ktorá sa použila v ďalšej reakcii bez čistenia.

Krok B

(29b)

Roztok N-acetyl-4-chlórfenylalanínu 29b (1,39 g, 5,75 mmol) v dichlóretáne (118 ml) reagoval s CpRu(CH3CN)₃ PF₆ 1b (2,5 g, 5,8 mmol, 1,0 ekvivalent) a ohrieval sa 2 h do spätného toku. Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a prefiltrovala sa. Filtrát sa skoncentroval vo vákuu a rozpustil sa v CH₃CN (15 ml) a reagoval s Et₂O (150 ml). Vyzrážaná guma sa odseparovala vyliatím éteru, a zvyšok sa rozpustil v CH₂CI₂/CH₃OH (1:1, 50 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 29c vo forme hnedej peny (2,2 g, 69 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 408 Í(M-PF₆)⁺' 100].

- 125 -

Roztok karboxylovej kyseliny 29c (2,0 g, 4,00 mmol) v suchom DMF (20 ml) reagoval s Hunigovou zásadou (2,06 g, 16,0 mmol, 4,0 ekvivalenty, 2,9 ml) a s HOBt (810 mg, 6,0 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a potom reagovala s EDCI (888 mg, 5,0 mmol, 1,25 ekvivalentu) a miešala sa 0,5 hodiny. Do tejto reakčnej zmesi sa pridal amín hydrochlorid 1g (1,48 g, 7,14 mmol,

1,2 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote. DMF sa oddestiloval a zvyšok sa zriedil vodou a vodná vrstva sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 χ 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaHCO₃ (200 ml), vodnou HCI (100 ml), roztokom soli, vysušili sa (Na2SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a surový produkt 29d (1,2 g, 38 %) sa použil na cyklizáciu bez ďalšieho čistenia.

(29e) (29d)

-126Z roztoku chlórzlúčeniny 29d (1,2 g, 1,5 mmol) v suchom DMF (120 ml) sa odstránil plyn s použitím suchého N₂, reagoval s Cs₂CO₃ (2,4 g, 7,4 mmol, 5,0 ekvivalentov) a miešal sa 23 hodín pri izbovej teplote. Rozpúšťadlo DMF sa oddestilovalo a zvyšok sa zriedil vodou (300 ml) a vyextrahoval sa s propionitrilom (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vysušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a sušili sa cez noc vo vákuu. Použilo sa na fotolytické odstránenie Ru bez ďalšieho čistenia.

Cyklizovaná zlúčenina z predchádzajúceho kroku sa rozpustila v CH₃CN (40 ml) a fotolyzovala s v Raynotovom fotochemickom reaktore (λ = 350 nm) 48 hodín. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO_2l EtOAc/hexány, 4:1), čím sa získala žltohnedá tuhá látka 29e (240 mg, 38 %). MS (FAB, NBA-G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita), 522 [(M+1)⁺, 100].

Krok E

Roztok esteru 29e (200 mg, 0,42 mmol) vCH₃OH (5 ml), CH₂CI₂ (13 ml) a H₂O reagoval s LÍOHH2O (41 mg, 1,0 mmol, 2,4 ekvivalenty) a miešal sa 3 hodiny pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa okyslila s vodnou HCI (13M, 1 ml) a vyextrahovala sa s CH₂CI₂ (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa usušili (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala kyselina 29f (178 mg), ktorá sa použila priamo na kopulačnú reakciu bez ďalšieho čistenia.

Krok F

-127-

(29g)

Roztok kyseliny 29f (90 mg, 0,18 mmol) v suchom DMF (1,0 ml) reagoval s HOBt (45 mg, 0,33 mmol, 1,6 ekvivalentu), s Hunigovou zásadou (142 mg, 1,1 mmol, 5,0 ekvivalentov)a s amínom B (118 mg, 0,28 mmol, 1,47 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (63 mg, 0,33 mmol, 1,6 ekvivalentu) a miešala sa 20 min 12 hodín pri 0 °C. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Zlúčené vodné vrstvy sa vyextrahovali s CH₂CI₂ (3 x 30 ml) a s EtOAc (3 x 30 ml). Organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaOH (2M, 30 ml), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 29 g (50 mg, 32 %), ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 883 [(M+1)⁺, 100], 522 (30), 394 (60).

Krok G

AcHN

-128-

(29)

Suspenzia alkoholu 29g (50 mg, 60,0 μιτιοΙ) v CH2CI2 (2,0 ml) reagovala s Dess-Martinovým činidlom (40 mg, 0,94 mmol, 2,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 3 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH/CH₂CI₂, 1:32), čím sa získal oxidovaný produkt 29 (41 mg, 80 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS: (FAB, m/z relatívna intenzita) 881 [(M+1)⁺, 100], 825 (170), 248 (100).

Príklad 30

(30)

-129Roztok terc-butylesteru 29 (23,0 mg, 26,0 pmol) reagoval s TFA/CH₂CI₂ (1:1, 2,0 ml) a miešal sa 4 hodiny pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH3OH/CH₂CI₂, 1:24). Po odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi/CH₂CI₂ (4,0 ml) a skoncentroval sa, čím sa získala žltohnedá tuhá látka 30 (13,0 mg, 100 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita) 825 [(M+1)⁺, 100].

Príklad 31

Príprava zlúčeniny vzorca 31

Roztok kyseliny 29f (150 mg, 0,29 mmol) v suchom DMF (4,0 ml), CH₂CI₂ (3,0 mi) reagoval s HOBt (58 mg, 0,44 mmol) a s Hunigovou zásadou 149 mg, 1,1 mmol, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (82

-130mg, 0,44 mmol, 1,5 ekvivalentu) a miešala sa 30 min. Reakčná zmes reagovala s amínom E (88 mg, 0,29 mmol, 1,22 ekvivalentu) a miešala sa 12 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zriedila sa s H₂O (30 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s CH₂CI₂ (3 x 30 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali sa vodnou HCI (1M, 3 x 20 ml), vodným NaOH (1M, 3x 20 ml), vysušili sa (Na₂SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala bezfarebná tuhá látka 31a (56 mg, ktorá sa použila na oxidáciu. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 750 [(M+1)⁺, 20], 663 (10), 522 (10), 416 (20), 247 (30).

Krok B

<31)

Roztok alkoholu 31a (56 mg, 75 μίτιοΙ) vCH₂CI₂ (5,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (93 mg, 0,22 mmol, 3,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa miešala 4 hodiny pri izbovej teplote a zmes sa koncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, CH₃OH/CH₂CI₂, 1:19), čím sa získal oxidovaný produkt 31 (34 mg, 60 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívne intenzita): 748 [(M+1)⁺, 35], 692 (5), 279 (100).

Príklad 32

Príprava zlúčeniny vzorca 32

- 131 -

Roztok ŕerc-butylesteru 31 reagoval s TFA/CH2CI2 (1:1, 4,0 ml) a miešal sa 4 hodiny pri izbovej teplote. Úbytok esteru na základnú čiaru sa sledoval s použitím TLC (CH3OH/CH2CI2, 1:24). Po odstránení ochrany sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu a zvyšok opakovane reagoval s heptánmi/CH₂Cl2 (4,0 ml) a skoncentroval sa, čím sa získala zlúčenina 32 vo forme žltohnedej tuhej látky.

Príklad 33

Príprava zlúčeniny vzorca 33

o

-132-

Krok A

(33b)

O

Roztok kyseliny 33a (4,5 g, 25,0 mmol) v dioxáne (30 ml) a benzéne (80 ml) reagoval s BnOH (8,0 g, 74 mmol, 3,0 ekvivalenty) a TsOH hbO (713 mg, 3,75 mmol, 10 mol%). Reakčná zmes sa ohrievala 5 hodín pri spätnom toku, voda sa oddelila použitím Dean-Starkovho prístroja. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (S1O2, EtOAc/hexány 3:7), čím sa získal benzylester 33b vo forme bezfarebného oleja (4,2 g, 62 %); R₇: 0,22 (EtOAc/hexány, 3:7); ¹³C NMR (CH₃OD, 75 MHz, δ): 175,1, 158,2, 139,7, 130,3, 129,5, 129,3, 121,7,

117,4, 114,6, 73,1, 67,6, 41,6; MS (FAB, G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita): 351 ([M+DMSOj⁺, 70), 273 ([M+1]⁺, 100), 255 (20), 227 (30), 181 (40); HRMS: vypočítané pre Ci₆Hi₇O₄ (M+1)⁺ 272,1049; zistené 272,1054.

Krok B

O (33c) (33b)

Roztok benzylesteru 33b (3,8 g, 12,9 mmol) VCH2CI2 (100 ml) reagoval s Et₃N (1,55 g, 15,4 mmol, 2,2 ml, 1,1 ekvivalentu), ochladil sa na -78 °C (2-PrOH, suchý ľad) a po kvapkách sa pridal roztok alyl chlórformátu (1,84 g, 15,36 mmol, 1,1 ekvivalentu) v CH2CI2 (10 ml). Reakčná zmes sa nechala ohriať na izbovú teplotu a zriedila sa s vodnou HCI (1M, 100 ml). Reakčná zmes sa vyextrahovala s EtOAc (3 χ 100 ml). Zlúčená organická vrstva sa premyla s vodnou HCI (100 ml, 1M), roztokom soli (100 ml), vysušila sa (MgSO₄), skoncentrovala sa vo vákuu, čím sa

-133získala zlúčenina 33c, ktorá sa použila v nasledujúcom kroku bez ďalšieho čistenia. Ra 0,43 (EtOAc/Hex 7:13); ¹³C NMR (CH₃OD, 75 MHz, ÔO, 174,8, 162,5, 155,0,

152,5, 140,3, 137,1, 132,8, 130,3, 129,6, 129,5, 129,4, 123,2, 120,3, 119,4, 72,7, 70,1,67,7,41,2,29,9.

Roztok Boc-cyklohexylglycín monohydrátu 1d (6,02 g, 23,4 mmol, 2,0 ekvivalenty) sa rozpustil v CH2CI2 a vysušil sa (MgSCU). Zmes sa prefiltrovala a zvyšok sa ďalej azeotropne sušil s toluénom. Zvyšok sa rozpustil v CH2CI2 a reagoval s HOBt (4,73 g, 35,1 mmol, 2,9 ekvivalentu), EDCI (6,7 g, 35,1 mmol, 2,9 ekvivalentu) a Hunigovou zásadou (8,31 g, 64,3 mmol, 11 ml). Miešalo sa 30 min pri izbovej teplote a pridal sa alloc-chránený alkohol 33c (4,3 g, 12,04 mmol). Reakčná zmes sa miešala 36 hodín pri izbovej teplote a zriedila sa s vodnou HCI (1M, 100 ml) a vyextrahovala sa s EtOAc (3 x 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaOH (1M, 100 ml), roztokom soli (100 ml), vysušili sa, skoncentrovali sa vo vákuu a vyčistili sa chromatograficky (S1O2, EtOAc/Hex, 1:4), čím sa získal depsipeptid 33d (7,1 g, 100 %). Rf: 0,18 (EtOAc/Hex, 1:4); HRMS: vypočítané pre C2sH₃₄O₇ (M-Boc)⁺ 496,2335, zistené 496,2333.

( 33d )

(33e)

-134 Roztok alloc-chráneného depsipeptidu 33d (7,8 g, 13,0 mmol) v suchom THF (200 ml) reagoval v atmosfére N₂ s dimediónom (3,27 g, 23,4 mmol, 2,0 ekvivalenty) a Pd(Ph₃P)₄ (780 mg, 0,67 mmol, 5 mol %). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri izbovej teplote a úbytok reaktantu sa sledoval s použitím TLC (EtOAc/Hex, 1:4). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAč/hexány 1:4), čím sa získal fenol 33e (5,2 g, 78 %) vo forme bezfarebnej peny. R_f: 0,52 (EtOAč/hexány, 3:7); ¹H NMR (d₄-CD₃OD, 300 MHz, δ)

7,4-7,19 (m, 5 H), 7,15-6,99 (m, 1 H), 6,68-6,55 (m, 4 H), 5,43-5,01 (m, 3 H), 4,6 (bs, 2 H), 4,11-4,00 (m, 1 H), 3,18-2,91 (m, 2 H), 1,80-1,55 (bs, 6 H), 1,39 (s, 9 H), 1,21-0,89 (m, 6 H); ¹³C NMR (CH3OD, 75 MHz, δ, zmes diastereomérov) 171,6, 169,4,169,3, 161,1, 157,1, 157,0, 137,2, 136,9, 135,4, 135,3, 129,2, 129,1, 128,2, 128,2, 128,0, 120,3, 120,1, 116,0, 115,9, 113,6, 94,8, 79,3, 73,6, 73,5, 66,7, 66,6, 58,6, 58,5, 40,0, 39,9, 36,8, 29,1, 27,7, 27,3, 25,5. MS (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita) 1023 ([M+1]⁺, 20), 412 ([M-Boc]⁺, 100), 202 (40) HRMS vypočítané pre C24H₃oN0₅ (M-Boc)⁺ 412,2123: zistené 412,2119.

Roztok amínu 33e chráneného skupinou Boe (5,2 g, 10,7 mmol) sa miešal s HCI (4M, dioxán, 200 ml, 800 mmol, 80 ekvivalentov) až do úbytku počiatočného materiálu na základnú čiaru podľa TLC (EtOAc/Hex 3:7). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a vysušila sa vo vysokom vákuu a zvyšok 33f sa priamo použil v ďalšom kroku. ¹H NMR (d₄-CD₃OD, 300 MHz, δ), 7,40-3,23 (m, 5 H), 7,07 (q, 1 H, J = 13 Hz), 6,77-6,6 (m, 3 H), 5,33-5,41 (m, 1 H), 5,3-5,05 (2 AB, 2 H), 3,993,85 (m, 1 H), 3,35-2,2 (m, 2 H), 2,00-1,5 (m, 5 H), 1,50-0,80 (m, 6 H); MS (FAB,

-135G/TG-DMSO, m/z relatívna intenzita): 412 ([M+1]⁺, 100); HRMS: vypočítané pre C24H30NO5; M+ 412,2123: zistené 412,2139.

Krok F

Roztok [CpRu(kyselina r|⁶-4-chlórfenylpropiónová)]PF61c (2,0 g, 4,03 mmol) v suchom DMF (20 ml) reagoval s HOBt (835 mg, 6,0 mmol, 1,5 ekvivalentu) a s Hu nigovou zásadou (2,06 g, 2,95 ml, 16 mmol, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s EDCI (1,15 g, 6,0 mmol, 1,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 30 min pri 0 °C a pridal sa amín hydrochlorid 33f (1,8 g, 4,03 mmol, 1,0 ekvivalent) v suchom DMF (10 ml). Reakčná zmes sa miešala 12 hodín pri izbovej teplote a DMF sa oddestiloval vo vákuu. Zvyšok sa zriedil s vodnou HCI (1M, 100 ml) a vyextrahoval sa do CH2CI2 (3 χ 100 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodným NaHCO3 (3 χ 50 mi), roztokom soli (100 ml), vysušili sa (Na2SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala hnedá tuhá látka 33g (3,5 g), ktorá sa použila na cyklizáciu; MS: elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita) 743 [(M-PF6)⁺, 100], 304 (60); HRMS: vypočítané pre C38H4iNO₆CI¹⁰²Ru (M-PF₆)⁺ 744,1666: zistené 744,1694.

Krok G

-136-

(33g·) (331^

Z roztoku komplexu r)⁶-ruténia 33g (3,5 g, 3,93 mmol) v suchom DMF (300 ml) sa odstránil plyn s použitím suchého N2 a reagoval s CS2CO3 (6,5 g, 19,95 mmol, 5,0 ekvivalentov) a miešal sa 16 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu, aby sa odstránil DMF, a zvyšok sa zriedil s H2O (100 ml). Reakčná zmes sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 x 100 ml). Zlúčené CH2CI2 vrstvy sa vyextrahovali s roztokom soli, vysušili sa (Na2SO4), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu, čím sa získala zlúčenina 33h, ktorá sa použila priamo na fotolýzu; MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita) 708 [(M-PF6)⁺, 100]; HRMS: vypočítané pre C38H4oN06i0₂Ru (M-PF₆)⁺: 708,1892; zistené: 708,1918.

-137 Z roztoku cyklizovaného ruténiového komplexu 33h (3,5 g, 3,9 mmol) v CH3CN (60 ml) sa odstránil plyn a fotolyzoval sa v skúmavke z kremičitého skla pri λ = 350 nm v dvoch dávkach po 48 hodín. Reakčná zmes sa zlúčila spolu a vyčistila sa chromatograficky (SiO₂, CH₂Cl2/Et₂O, 9:1), čím sa získal cyklický depsipeptid vo forme zmesi diastereomérov (700 mg, 34 %). Diastereoméry sa odseparovali ďalšou chromatografiou (hexány/CH₂CI₂/Et₂O, 6:3:1), čím sa získali dva stereoméry 33i (370 mg, 18 %) a 33j (216 mg, 11 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. R/ = 0,28 (hexány: EtOAc 3:2); [a]_D = 25 (c 0,15, CHCI₃, 20 °C): IR (čistý, cm-¹) 3329 (w), 2960 (m), 2926 (s), 2854 (s), 1745 (s), 1680 (m), 1589 (m), 1506 (m), 1446 (m), 1365 (w), 1259 (s), 1099 (m), 1030 (s), 800 (s), 752 (m), 698 (w), 619 (w): ¹H NMR (CDCb, 300 MHz, δ), 7,36-7,23 (m, 5 H), 7,18-6,99 (m, 4 H), 6,81 (d, 1 H, J = 7,5 Hz), 6,74 (dd, 1 H, J = 2,7, 5,7 Hz), 6,30 (s, 1 H), 5,75 (d, 1 H, J = 7,2 Hz), 5,61 (dd, 1 H, J = 2,4 Hz, 5,4 Hz), 5,18, 5,14 (AB, 2 H, J = 12,3 Hz), 4,23 (dd, 1 H, J = 4,2 Hz,

3,3 Hz), 3,26-3,01 (m, 2 H), 2,98-2,85 (m, 2 H), 2,68-2,64 (m, 1 H), 2,38-2,34 (m, 1 H), 1,96-1,51 (m, 6 H), 1,51-0,96 (M, 5 H) ¹³C NMR: (CDCI₃, 75 MHz, δ, ppm),

177,3, 171,1, 168,7, 159,8, 155,3, 138,6, 135,4, 134,9, 131,2, 129,7, 129,2, 128,7,

126,6, 126,1, 123,3, 120,8, 120,8, 117,5, 114,2, 71,8, 57,5, 56,9, 41,5, 39,0, 35,7,

32,6, 31,3,, 29,0, 27,6, 26,0, 25,9. FAB (NBA/DMSO, m/e, relatívna intenzita) 542 [(M+1)⁺, 100], 514 (15), 450 (5), 307 (8), 232 (5), 154,1 (17), 136 (14) HRMS: vypočítané pre C33H36NO6 (M+1)⁺ 542,2543: zistené: 542,2541. CHN vypočítané pre C₃₃H35NO6.0,5H₂O; C = 71,98 %, H = 6,59 %, N = 2,54 %; zistené C = 72,56 %,

H = 7,05 %, N = 2,63 %.

Roztok benzylesteru 33i (360 mg, 0,66 mmol) v CH₃OH/EtOAc (1:1, 50 ml) reagoval s Pd(OH)₂ a hydrogenoval sa (345 kPa (50 psí)) 12 hodín. Reakčná zmes

-138 sa prefiltroval cez vrstvu celitu a koláč sa opláchol s CH3OH/CH2CI2 (1:1, 50 ml). Filtrát sa skoncentroval vo vákuu a zvyšok 33k (330 mg) sa použil na kopulačnú reakciu bez čistenia. R/ = 0,58 (CH3OH/CH2CI2, 1:19). MS: (elektrónový sprej, m/z, relatívna intenzita) 827,2 [(M+1)⁺, 100], 694 (20), 539 (40), 466 (10), 174 (70). HRMS: vypočítané pre C46H58N4O10 (M+1)⁺827,4231: zistené: 827,4215.

Krok J

Roztok kyseliny 33k (165 mg, 0,31 mmol) v suchom DMF (5,0 ml) a CH₂CI₂ (5,0 ml) reagoval s HOBt (83 mg, 0,46 mmol, 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C a pridala sa Hunigova zásada (159 mg, 1,23 mmol, 4,0 ekvivalenty, 229 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (89 mg, 0,47 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri 0 ’C a reagovala s amín hydrochloridom B (159 mg, 0,372 mmol, 1,2 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 48 hodín pri izbovej teplote a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH2CI2. Zvyšok sa zriedil s vodou a vyextrahoval sa s CH2CI2 (3 χ 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali s vodnou HCI (1M, 3 χ 50 ml), vodným NaOH (1M, 3 x 50 ml), roztokom soli (100 ml) a skoncentrovali sa vo vákuu. Zvyšok 33I sa oxidoval bez ďalšieho čistenia.

-139 Krok K

Roztok alkoholu 33I (330 mg, 0,4 mmol) v CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (424 mg, 1,00 mmol, 2,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri izbovej teplote a zriedila sa s vodným NaHCO₃ (50 ml) a s vodným Na₂S₂O3 (50 ml). Reakčná zmes sa miešala 20 min pri izbovej teplote a reakčná zmes sa vyextrahovala s CH2CI2 (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali roztokom soli (50 ml), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovaii sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok a vyčistil chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 1:1), čím sa získal ketoamid 33 (180 mg, 55 %) bezfarebnej tuhej látky. Rf : 0,63 (CH₃OH/CH₂CI₂, 1:19); MS (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 857,2 ([M+CH₃OH]⁺,40), 825,2 ([M+1]⁺, 100).

Príklad 34

Príprava zlúčeniny vzorca 34

(34)

-140 Krok A

(34)

Roztok oxidovaného depsipeptidu 33 (160 mg, 0,2 mmol) v suchom CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s TFA (5,0 ml) a miešal sa 7 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa opakovane rozpustil v CH₃OH/CH₂Cl2/hexány (1:1:1) a niekoľkokrát sa skoncentroval vo vákuu , čím sa získala žltohnedá tuhá látka 34 (133 mg, 86 %), ktorá sa sušila vo vákuu MS: Elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 767.2 [(M+1)⁺, 100], 481 (5), 269 (25), 191 (90).

Príklad 35

Príprava zlúčeniny vzorca 35

Krok A

-141 -

Roztok kyseliny 33k (165 mg, 0,31 mmol) v suchom DMF (5,0 ml) a CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s HOBt (83 mg, 0,46 mmol; 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C a pridala sa Hunigova zásada (159 mg, 1,23 mmol, 4,0 ekvivalenty, 229 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (89 mg, 0,47 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri 0 °C a reagovala s amín hydrochloridom A (159 mg, 0,372 mmol, 1,2 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 48 hodín pri izbovej teplote a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH2CI2. Zvyšok sa zriedil vodou a vyextrahoval sa s CH2CI2 (3 x 50 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala s vodnou HCI (1M, 3 x 50 ml), vodným NaOH (1M, 3 x 50 ml), roztokom soli (100 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok 35a sa oxidoval bez ďalšieho čistenia. MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 798,2 [(M+1)⁺, 30], 479 (10), 391 (20), 180(100).

Krok B

-142-

Roztok alkoholu 35a (190 mg, 0,24 mmol) v CH2CI2 (10 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (423 mg, 1,0 mmol, 4,0 ekvivalenty) a miešal sa 1 hodinu pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa zriedila vodným NaHCO₃ (50 ml) a vyextrahovala sa VCH2CI2 (3 x 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali vodným nasýteným roztokom Na₂S2O₃, roztokom soli (3 x 50 ml), vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a vyčistili sa chromatograficky (S1O2, acetón/hexány 3:7 -a 1:1, čím sa získal oxidovaný produkt 35 (163 mg, 86 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky. MS (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 796 [(M+1)⁺, 100], 508 (20), 269 (20).

Príklad 36

Príprava zlúčeniny vzorca 36

Krok A p

(36a)

(36)

Roztok BH₃THF (1M v THF, 100 mmol, 100 ml, 3,0 ekvivalenty) sa po kvapkách pridal do roztoku alkénu (5,0 g, 35 mmol) v THF (100 ml) pri 0 °C a miešal sa 1 hodinu. Reakčná zmes reagovala po kvapkách s etanolom (20 ml). Po

-143 ukončení vzniku plynného vodíka reakčná zmes reagovala s tlmivým roztokom pH 7 (100 ml) a H2O2 (30 objemov, 100 ml). Reakčná zmes sa miešala 4 hodiny pri izbovej teplote a reakcia sa zastavila s vodnou HCI (100 ml). Vodná vrstva sa vyextrahovala s Et₂O (3 χ 100 ml). Zlúčené éterické vrstvy sa vyextrahovali vodným NaOH (1M, 100 ml), roztokom soli (100 ml), vysušili sa (MgSO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a vyčistili sa chromatograficky (SiO₂, EtOAc/hexány, 2:3), čím sa získal alkohol vo forme bezfarebnej kvapaliny (2,9 g, 52 %).

Roztok hydroxylovaného esteru v THF/H2O/CH3OH (100 ml, 1:1:1) reagoval s Ľ1OH.H2O (2,1 g, 51,2 mmol, 3,0 ekvivalenty) a miešal sa 3 dni pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a vodná vrstva sa vyextrahovala s éterom (2 x 40 ml). Vodná vrstva sa okyslila na pH ~ 1 a vyextrahovala sa do EtOAc (3 χ 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali roztokom soli (100 ml), vysušili sa (MgSO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok 36b sa použil tak ako bol v kopulačnej reakcii v kroku B. ¹H NMR (300 MHz, CD3OD, δ), 3,53 (t, 2 H, J = 6,6 Hz), 2,72 (t, 2 H, J = 7,2 Hz), 1,59 (t, 2 H, J = 7,5 Hz), 1,5 (t, 2 H, J = 7,5 Hz), 1,38-1,33 (m, 6 H).

(36c )

Roztok kyseliny ω-hydroxyl heptánovej 36b (1,01 g, 6,93 mmol) VCH2CI2 (40 ml) reagoval s Hunigovou zásadou (1,97 g, 15,24 mmol, 2,2 ekvivalentu, 2,81 ml) a amín hydrochloridom 33f (3,1 g, 6,93 mmol, 1,0 ekvivalentu). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a reagovala s PyBrOP (3,22 g, 6,93 mmol, 1,0 ekvivalent). Reakčná zmes sa miešala cez noc pri izbovej teplote a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok sa vyčistil chromatograficky (EtOAc/hexány 1:1), čím sa získal depsipeptid

-144 36c (2,5 g, 66 %) vo forme bezfarebného viskózneho oleja. ¹H NMR (CD3OD, 400 MHz, δ, ppm), 8,07 (t, 1 H), 7,33-7,21 (m, 4 H), 7,09-7,02 (m, 1 H), 6,67-6,63 (m, 3 H), 5,25-5,06 (m, 1 H), 5,08 (q, 2 H, J = 7,5 Hz), 4,36-4,33 (m, 1 H), 3,51 (dd, 2 H, J = 5,4 Hz, 0,9 Hz), 3,11-2,96 (m, 2 H), 2,22-2,17 (m, 1 H), 1,99-0,90 (m, 14 H). ¹³C NMR: (CD3OD, 75 MHz, δ, ppm, zmes diastereomérov): 172,1, 172,0, 171,8, 171,1,

170,9, 169,5, 169,3, 157,1, 157,0, 137,3, 137,0, 135,3, 135,2, 129,2, 129,1, 128,2, 128,0, 127,9, 120,3, 120,0, 116,0, 115,9, 113,6, 94,8, 73,6, 73,4, 66,8, 66,7, 60,2,

57,3, 39,6, 36,7, 28,9, 28,0, 25,6, 20,9, 19,5, 13; MS (FAB, NBA DMSO, m/z relatívna intenzita)·. 562 [(M+Na)⁺, 20], 540 [(M+1)⁺, 100), 412 (15), 240 (50), 112 (80).

Krok C

Roztok alkoholu 36c (2,5 g, 4,63 mmol) v suchom CH2CI2 (50 ml) reagoval s trifenylfosfínom (2,67 g, 10,2 mmol, 2,2 ekvivalentu) v atmosfére N₂ a ochladil sa na 0 °C. Reakčná zmes reagovala s DEAD (1,61 g, 9,26 mmol, 2,0 ekvivalenty) v CH₂CI₂ (30 ml). Reakčná zmes sa ohriala na izbovú teplotu a miešala sa 2 hodiny. Skoncentrovala sa vo vákuu a vyčistila sa chromatograficky (Et₂O/hex, 1:3), čím sa získal cyklický produkt 36d (530 mg, 21 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky.

MS (FAB, NBA, DMSO, m/z relatívna intenzita), 522 [(M+1)⁺, 100], 494 (60), 268 (20), 222 (20); HRMS vypočítané pre C₃iH4oN0₆: (M+1)⁺: 522, 2856; zistené: 522,2864.

-145Krok D

H (36ď)

Roztok benzylesteru 36d (242 mg, 0,47 mmol) v metanole (30 ml) reagoval s Pd/C (10% hmotn.) a hydrogenoval sa vParrovom hydrogenačnom prístroji 14 hodín pri 276 kPa (40 psí). Reakčná zmes sa prefiltrovala cez vrstvu celitu a filtrát sa skoncentroval vo vákuu, čím vznikla bezfarebná tuhá látka 36e (181 mg, 93 %), ktorá sa použila v kopulačnej reakcii.

Krok E

<36e)

Roztok hydrolyzovanej kyseliny 36e (167 mg, 0,39 mmol) v CH2CI2 (4,0 ml) reagoval s HOOBt (95 mg, 0,58 mmol, 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C a pridala sa Hunigova zásada (202 mg, 1,56 mmol, 4,0 ekvivalenty, 288 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (111 mg, 0,58 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa

-146miešala 0,5 hodiny pri 0 °C a reagovala s amín hydrochloridom (186 mg, 0,47 mmol, 1,20 ekvivalentu). Reakčná zmes sa držala v mrazničke 24 hodín a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH2CI2. Zvyšok sa zriedil s vodnou HCI (2M, 30 ml) a vyextrahoval sa s CH₂CI₂ (3 χ 50 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala s vodnou HCI (2M, 30 ml), vodným NaOH (1M), roztokom soli (2 x 50 ml), vysušila sa (MgSO₄) a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok 36f (100 mg) sa oxidoval bez ďalšieho čistenia. HRMS vypočítané pre C^HeoNsOg (M+1)⁺:

Roztok alkoholu 36f (100 mg, 0,13 mmol) v CH₂CI₂ (5,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (100 mg, 0,23 mmol, 1,8 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 2 hodiny pri izbovej teplote a zriedila sa vodným NaHCO₃ (15 ml) a vodným Na₂S₂O₃ (15 ml). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, acetón/hexány, 3:7), čím sa získal ketoamid 36 (61 mg, 61 %) vo forme bezfarebnej tuhej látky; MS (FAB, NBA/DMSO, m/z relatívna intenzita): 77Q [(M+1)⁺, 100], 731 (10), 598 (25), 570 (15), 485 (20), 358 (20), 247 (50).

Príklad 37

Príprava zlúčeniny vzorca 37

147 -

(33j) (37a)

Roztok benzylesteru 33j (230 mg, 0,42 mmol) v CHaOH/EtOAc (1:1, 50 ml) reagoval s Pd(OH)₂ a hydrogenoval sa 12 hodín (345 kPa (50 psí)).Reakčná zmes sa prefiltrovala cez vrstvu celitu a koláč sa prepláchol s CH₃OH/CH₂CI₂ (1:1, 50 ml). Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok 37a (177 mg, 93 %) sa použil na kopulačnú reakciu bez čistenia.

(37b)

-148Roztok kyseliny 37a (177 mg, 0,33 mmol) v suchom DMF (5,0 ml) a CH₂CI₂ (5,0 ml) reagoval s HOBt (88 mg, 0,49 mmol, 1,5 ekvivalentu) a ochladil sa na 0 °C a pridala sa Hunigova zásada (175 mg, 1,35 mmol, 4,0 ekvivalenty, 251 μΙ). Do tejto zmesi sa pridal EDCI (95 mg, 0,49 mmol, 1,5 ekvivalentu) a reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri 0 °C a reagovala s amín hydrochloridom B (170 mg, 0,39 mmol, 1,2 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 48 hodín pri izbovej teplote a skoncentrovala sa vo vákuu, aby sa odstránil DMF a CH2CI2. Zvyšok sa zriedil vodou a vyextrahoval sa s CH2CI2 (3 x 50 ml). Zlúčená organická vrstva sa vyextrahovala vodným NaOH (1M, 2 χ 50 ml), roztokom soli (100 ml) a skoncentrovala sa vo vákuu. Zvyšok 37b (315 mg) sa oxidoval bez ďalšieho čistenia.

Krok C

Roztok alkoholu 37b (315 mg, 0,4 mmol) v CH₂CI₂ (5,0 ml) reagoval s DessMartinovým činidlom (424 mg, 1,00 mmol, 2,5 ekvivalentu). Reakčná zmes sa miešala 1 hodinu pri izbovej teplote a zriedila sa s vodným NaHCO₃ (50 ml) a vodným Na₂S₂O₃ (50 ml). Reakčná zmes sa miešala 20 min pri izbovej teplote a vyextrahovala sa s CH₂CI₂ (3 χ 50 ml). Zlúčené organické vrstvy sa vyextrahovali roztokom soli, vysušili sa (Na₂SO₄), prefiltrovali sa, skoncentrovali sa vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂ EtOAc/hexány, 1:1), čím sa získal ketoamid 37 (210 mg, 66 %) bezfarebnej tuhej látky. R/ : 0,63 (CH₃OH/CH₂CI₂,

-149 1:19); MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 857 ([M+CH₃OH]⁺, 33), 825 ([M+1]⁺, 40), 191 (100).

Príklad 38

Príprava zlúčeniny vzorca 38

Krok A o

(38)

Roztok oxidovaného depsipeptidu 37 (200 mg, 0,24 mmol) v suchom CH2CI2 (5,0 ml) reagoval s TFA (5,0 ml) a miešal sa 7 hodín pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa opakovane rozpustil vCH₃OH/CH₂CI₂/hexánoch (1:1:1) a skoncentroval sa niekoľkokrát vo vákuu, čím sa získala žltohnedá tuhá látka 38 (130 mg, 87 %), ktorá sa vysušila vo vákuu; MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita): 769 ([M+1 j⁺, 45), 294 (45), 191 (100).

Príklad 39

Príprava zlúčeniny vzorca 39

(22)

Roztok kyseliny 22 (40 mg, 0,06 mmol) v CH₂CI₂ (0,5 ml) a DMF (0,5 ml) sa ochladil na 0 °C a reagoval s Me₂NH.HCI (15 mg, 0,18 mmol, 3,0 ekvivalenty) a s Hunigovou zásadou (31 mg, 0,24 mmol, 44 μΙ, 4,0 ekvivalenty). Reakčná zmes reagovala s PyBrOP (55 mg, 0,12 mmol, 2,0 ekvivalenty) a držala sa 12 hodín v mrazničke. Žltá reakčná zmes sa skoncentrovala vo vákuu a zvyšok sa vyčistil chromatograficky (SiO₂, gradient EtOAc/hexány 3:2 -> 1:0), aby sa získal nečistý produkt, ktorý sa ešte raz vyčistil s použitím zmesi acetón/hexány (1:6), čím sa získal dimetylamid 39 vo forme bezfarebnej tuhej látky (14 mg, 35 %). MS: (elektrónový sprej, m/z relatívna intenzita)·. 79í [(M+1)⁺, 50], 391 (40), 276 (50), 176 (100).

Príklad 40

Príprava zlúčeniny vzorca 40

-151

(40)

Všeobecný spôsob na kopulačné reakcie s tuhou fázou

Syntéza sa uskutočnila v reakčnej nádobe, ktorá bola vyrobená z tela polypropylénovej injekčnej striekačky s pripevnenou polypropylénovou fritou na dolnom konci. Aminokyseliny chránené skupinou Fmoc sa spojili štandardnými spôsobmi s tuhou fázou. Do každej reakčnej nádoby sa umiestnilo 100 mg počiatočnej FmocSieberovej živice (približne 0,035 mmol). Živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (2-krát). Ochranná skupina Fmoc sa odstránila pôsobením s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF počas 20 min. Živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát). Kopulačná reakcia sa uskutočnila v DMF (2 ml) s použitím 0,12 mmol Fmoc-aminokyseliny, 0,12 mmol HATU a 0,24 mmol DIPEA. Po trepaní 2 hodiny sa z reakčnej nádoby odstránila kvapalina a živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát). Kopulačný cyklus sa zopakoval s nasledujúcou Fmoc-aminokyselinou alebo koncovou skupinou.

Schéma 10

152-

(4οη

(4θΟ

-153-

Fmoc-Sieberova živica 40a (0,035 mmol) 20 min reagovala s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF, potom sa živica premývala s 2 ml objemami DMF (4-krát). Do živice sa pridal DMF (2 ml), potom Fmoc-fenylglycín (0,12 mmol), HATU (0,12 mmol) a DIPEA (0,24 mmol). Po trepaní 2 hodiny pri izbovej teplote sa živica premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40b. Na zlúčeninu viazanú na živicu 40b sa 20 min pôsobilo s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF, potom sa premývala s 2 ml objemami DMF (4-krát). Do živice sa pridal DMF (2 ml), potom Fmoc-glycín (0,12 mmol), HATU (0,12 mmol) a DIPEA (0,24 mmol). Po trepaní 2 hodiny pri izbovej teplote sa živica premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40c. Na zlúčeninu viazanú na živicu 40c sa 20 min pôsobilo s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF, potom sa premývala s 2 ml objemami DMF (4-krát). Do živice sa pridal DMF (2 ml), potom NFmoc-propylizoserín (0,12 mmol), HATU (0,12 mmol) a DIPEA (0,24 mmol). Po trepaní 2 hodiny pri izbovej teplote sa živica premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40d. Zlúčenina viazaná na živicu 40d 20 min reagovala s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF, potom sa premývalo s 2 ml objemami DMF (4-krát). Do živice sa pridal DMF (2 ml), potom Fmoc-lyzín (Dde) (0,12 mmol), HATU (0,12 mmol) a DIPEA (0,24 mmol). Po trepaní 2 hodiny pri izbovej teplote sa živica premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40e. Zlúčenina viazaná na živicu 40e reagovala 20 min s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF, potom sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát). Do živice sa pridal DMF (2 ml), potom Fmoc-cyklohexylglycín (0,12 mmol), HATU (0,12 mmol) a DIPEA (0,24 mmol). Po trepaní 2 hodiny pri izbovej teplote sa živica premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát),

-154čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40f. Zlúčeninu viazaná na živicu 40f reagovala 20 min s 2 ml 20%-ného roztoku (objem/objem) piperidínu v DMF. Živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40g. Zlúčenina viazaná na živicu 40g 5 min reagovala s 2 ml objemami 2%ného roztoku (objem/objem) hydrazínu v DMF (3-krát). Živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40h. Zlúčenina viazaná na živicu 40h reagovala 16 hodín pri izbovej teplote s 0,035 mmol kyseliny glutarovej, 0,07 mmol HATU a 0,14 mmol DIPEA v 2 ml DMF. Živica sa premyla s 2 ml objemami DMF (4-krát), THF (4-krát) a DCM (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40i. Zlúčenina viazaná na živicu 40i reagovala 4 hodiny pri izbovej teplote s 0,14 mmol roztokom Dess-Martinovho perjodinanu a 0,14 mmol ŕ-BuOH v 2 ml DCM. Živica sa premyla s 2 ml objemami 20%-ného roztoku (objem/objem) iPrOH v DCM, THF, 50%-ného roztoku (objem/objem) THF vo vode (4-krát), THF (4-krát) a DCM (4-krát), čím sa získala zlúčenina viazaná na živicu 40j. Zlúčenina viazaná na živicu 40j reagovala 5 min so 4 ml 2%-ného roztoku (objem/objem) TFA v DCM. Filtrát sa pridal do 1 ml AcOH a roztok sa skoncentroval vákuovou centrifugáciou, čím sa získala zlúčenina 40 (0,0117 g, výťažok 48 %). MS (LCMSelektrosprej) 698,2 MH⁺.

Príklady 41 až 53

Príprava zlúčenín vzorcov 41 až 53

(41)

(42)

-155-

(46)

156-

(49)

(50)

-157-

Zlúčeniny 41 až 53 sa syntetizovali s použitím spôsobu s tuhou fázou, ktorá je podobná spôsobu uvedenému pre syntézu v príklade 40.

(54)

-158Krok A

Do miešaného roztoku Boc-cyklohexylglycínu-OH (2,33 g, 9,07 mmol) v DMF (20 ml) a CH₂CI₂ (20 ml) sa pridal HOBT (1,48 g, 9,07 mmol), EDCI (1,91 g, 9,97 mmol) a NMM (2,99 ml, 27,2 mmol). Roztok sa miešal 10 min pri 20 °C, potom sa pridal H-Lys(Z)-OMe.HCI a miešal sa pol hodiny pri -20 °C a držal sa cez noc v mrazničke. Roztok sa potom skoncentroval dosucha, vyextrahovai sa s EtOAc, nasýteným NaHCO₃. Zlúčená organická vrstva sa premyla s H₂O, vysušila sa nad Na₂SO4 a skoncentrovala sa dosucha, čím sa získala biela tuhá látka (4,83 g, MH⁺ = 534,1).

Krok B

Do miešaného roztoku 54b (4,86 g, 8,76 mmol) v MeOH (10 ml) a H₂0 (7 ml) sa pridal LiOH (70 mg, 11,4 mmol). Vytvorila sa biela zrazenina a roztok sa miešal cez noc pri izbovej teplote a potom sa skoncentroval dosucha. Surový materiál sa potom rozdelil medzi CH₂CI₂ a vodu. Organická vrstva sa odseparovala a premyla roztokom soli, vysušila sa nad Na₂SO4, prefiltrovala sa a skoncentrovala sa dosucha, čím sa získala zlúčenina 54c (4,55 g, MH⁺ = 520,1).

-159KrokC

Do miešaného chladeného roztoku 54c (4,3 g, 8,27 mmol) v DMF (40 ml) a CH₂CI₂ (40 ml) sa pri -20 °C pridal HOBT (1,35 g, 8,27 mmol), EDCI (1,74 g, 9,1 mmol) a NMM (2,73 ml, 8,27 mmol). Výsledný roztok sa miešal 10 min pri -20 °C, potom sa pridal amín G (2,32 g, 8,27 mmol) a miešal sa pol hodiny pri -20 °C a cez noc sa držal v mrazničke. Použil sa spôsob z kroku A, čím sa získala zlúčenina 54d (6,21 g, MH⁺ = 746,2).

-160Roztok 54d (6,16 g, 8,26 mmol) v 4N HCI/dioxáne (40 ml) sa miešal 1 hodinu pri izbovej teplote a skoncentroval sa dosucha, čím sa získal surový produkt 54e (5,70 g, výťažok 100 %, MH⁺ = 646,3).

Do miešaného chladeného roztoku Boc-Glu(OBn)-OH v DMF (25 ml) a CH₂CI₂ (25 ml) sa pri -20 °C pridal HOBT (1,29 g, 7,92 mmol), EDCI (1,66 g, 8,71 mmol) a NMM (2,61 ml, 23,7 mmol). Výsledný roztok sa miešal 19 min pri -20 °C, potom sa pridala zlúčenina 54e (5,4 g, 7,916 mmol) a miešal sa pol hodiny pri -20 °C a cez noc sa držal v mrazničke. Použil sa spôsob z kroku A, čím sa získal surový produkt (7,14 g, výťažok 93,5 %).

Krok F

-161 -

Do miešaného roztoku 54f (6,9 g, 7,15 mmol) v absolútnom EtOH (350 ml) sa pridal 10%-ný Pd/C (2,8 g), v 50%-nej H₂O (hmotnosť/hmotnosť). Výsledný roztok sa prečistil s H₂ a miešal sa cez noc pod balónom s H₂. Roztok sa potom prefiltroval cez celit a filtrát sa premyl s EtOH/CH₂CI₂ a potom sa skoncentroval dosucha, čím sa získala biela tuhá látka (1,44 g). Tuhá látka sa premyla 25%-ným H₂O/MeOH a prefiltrovala sa cez sintrový lievik, potom sa zmrazila a lyofilizovala, čím sa získala zlúčenina 54g (4,12 g, výťažok 77,5 %, MH⁺ = 743,2).

Do miešaného chladeného roztoku 54g (0,5 g, 6,7 mmol) v DMF (50 ml) a CH₂CI₂ (50 ml) sa pri -20 °C pridal HOBT (0,219 g, 1,34 mmol), EDCI (0,219 g,

1,34 mmol), EDCI (0,271 g, 1,41 mmol) a NMM (0,296 ml, 2,69 mmol). Výsledný roztok sa miešal 25 min pri -20 °C a potom sa držal cez noc v mrazničke. Roztok sa

-162 skoncentroval dosucha, potom sa vyextrahoval s EtOAc nasýteným NaHCO3. Zlúčená organická vrstva sa potom skoncentrovala dosucha, čím sa získala zlúčenina 54h (254 mg, MH⁺ = 725,2).

Do miešaného roztoku 54h (0,2 g, 0,27 mmol) v bezvodom CH2CI2 (20 ml) sa pridal Dess-Martinov perjodinan (0,234 g, 0,55 mmol). Výsledný roztok sa miešal 1 hodinu pri izbovej teplote. Do tohto roztoku sa pridal po kvapkách počas pol hodiny roztok H2O (0,010 ml) v CH₂CI₂ (20 ml) a prudko sa miešal ďalšie 2 hodiny. Roztok sa potom miešal pol hodiny s Na₂S₂O₃/nasýteným NaHCO₃ (1:1). Organická vrstva sa odseparovala a premyla sa s H₂O, roztokom soli, vysušila sa ad Na₂SO4, prefiltrovala sa, skoncentrovala sa dosucha a vyčistila sa stĺpcovou chromatografiou na silikagéli a eluovala sa s 10%-ným MeOH/CH₂CI₂, čím sa získala zlúčenina 54 (17 mg, 62%, MH⁺= 723,2).

Test na inhibičnú aktivitu HCV proteázy

Spektrofotometrický test

Spektrofotometrický test na HCV serínovú proteázu sa uskutočnil na zlúčeninách podľa vynálezu s použitím spôsobu, ktorý opísali R. Zhang a spol., Analytical Biochemistry, 270 (1999), 268-275, opis ktorého sa sem referenčne

-163začleňuje. Test založený na proteolýze chromogénnych esterových substrátov je vhodný na priebežnú kontrolu NS3 proteázovej aktivity HCV. Substráty boli odvodené zo strany P spojovacej sekvencie NS5A-NS5B (Ac-DTEDWX(Nva), kde X = A alebo P), ktorého C-terminálne karboxylové skupiny sa esterifikovali jedným zo štyroch rôznych chromoforických alkoholov (3- alebo 4-nitrofenol, 7-hydroxy-4metyl-kumarín, alebo 4-fenylazofenol). Nižšie sa uvádza syntéza, vlastnosti a aplikácia týchto nových spektrofotometrických esterových substrátov v skríningu a podrobnom kinetickom vyhodnotení inhibítorov NS3 proteázy HCV.

Materiály a spôsoby

Materiály

Chemické reagencie na tlmivé roztoky použité v teste sa získali zo Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Reagencie na syntézu peptidov sa získali od firiem Aldrich Chemicals, Novabiochem (San Diego, California), Applied Biosystems (Foster City, California) a Perseptive Biosystems (Framingham, Massachusetts). Peptidy sa syntetizovali manuálne alebo na automatickom syntetizátore ABI, model 431A (od firmy Applied Biosystems). Spektrometer UV/VIS model LAMBDA 12 bol z firmy Perkin Elmer (Norwalk, Connecticut) a UV platničky s 96 jamkami dodala firma Corning (Corning, New York). Zariadenie na predhrievanie sa získalo od firmy USA Scientific (Ocala, Florida) a trepačka na 96-jamkové platničky bola z firmy Labline Instruments (Melrose Park, Illinois). Čítacie zariadenie na mikrotitračné platničky s monochrometrom Spectramax Plus sa získalo z firmy Molecular Devices (Sunnyvale, California).

Príprava enzýmu

Rekombinantná heterodimérna HCV NS3/NS4A proteáza (reťazec 1a) sa pripravila s použitím spôsobov, ktoré už boli publikované (D.L. Sali a spol., Biochemistry, 37 (1998) 3392-3401). Koncentrácie proteinov sa stanovili spôsobom farbiva Biorad s použitím rekombinantných HCV proteázových štandardov, ktoré boli predtým kvantifikované analýzou aminokyselín. Pre začatím testu sa tlmivý roztok na uchovávanie enzýmov (50 mM fosforečnan sodný, pH 8,0, 300 mM NaCl,

-16410% glycerol, 0,05% lauryl maltozid a 10 mM DTT) vymenil za testovací tlmivý roztok (25 mM MOPS, pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% lauryl maltozid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT) s použitím kolóny Biorad Bio-Spin P-6.

I ₍

Syntéza a čistenie substrátu

Syntéza substrátov sa uskutočnila podľa vyššie uvedenej publikácie R. Zhang a spol. a začala sa ukotvením Fmoc-Nva-OH na 2-chlórtriylchloridovú živicu podľa štandardného protokolu (K. Barlos a spol., Int. J. Pept. Protein Res., 37 (1991), 513-520). Peptidy sa následne pospájali s použitím Fmoc chémie, buď manuálne alebo automaticky na syntetizátore peptidov ABI, model 431. Nacetylované a úplne chránené peptidické fragmenty sa odštiepili zo živice buď 10%nou kyselinou octovou (HOAc) a 10%-ným trifluóretanolom (TFE) v dichlórmetáne (DCM) 30 min, alebo 2%-nou kyselinou trifluóroctovou (TFA) v DCM 10 min. Zlúčený filtrát a DCM sa azeotropne odparili (alebo sa opakovane extrahovali vodným roztokom Na₂CO₃), aby sa odstránila kyselina použitá na štiepenie. DCM fáza sa vysušila nad Na₂SO₄ a odparila sa.

Esterové substráty sa spojili s použitím štandardných kopulačných reakcií kyselina-alkohol (K. Holmber a spol., Acta Chem. Scand. B33 (1979) 410-412). Peptidické fragmenty sa rozpustili v bezvodom pyridíne (30 až 60 mg/ml), do ktorého sa pridalo 10 molárnych ekvivalentov chromoforu a katalytické množstvo (0,1 ekvivalentu) kyseliny para-toluénsulfónovej (pTSA). Na začatie kopulačných reakcií sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (DCC, 3 ekvivalenty). Vznik produktu sa sledoval pomocou HPLC a zistilo sa, že reakcia je ukončená po 12 až 72 hodinách pri izbovej teplote. Pyridínové rozpúšťadlo sa odparilo vo vákuu a ďalej sa odstránilo azeotropným odparovaním s toluénom. Z peptidového esteru sa odstránila ochranná skupina s použitím 95%-nej TFA v DSM počas 2 hodín, a vyextrahoval sa trikrát bezvodým etyléterom, aby sa odstránil nadbytočný chromofor. Substrát bez ochrannej skupiny sa čistil s použitím HPLC s obrátenou fázou na kolóne C3 alebo C8 s 30%-ným až 60%-ným acetonitrilovým gradientom (s použitím šiestich objemov kolóny). Celkový výťažok po čistení pomocou HPLC bol približne 20 až 30 %. Molekulová hmotnosť sa potvrdila elektrosprejovou ionizačnou hmotnostnou

-165 spektroskopiou. Substráty sa skladovali vo forme suchého prášku v podmienkach desikácie.

Spektrá substrátov a produktov

Spektrá substrátov a zodpovedajúcich chromoforových produktov sa získali v testovacom tlmivom roztoku pH 6,5. Extinkčné koeficienty sa určovali pri optimálnej vlnovej dĺžke v 1 cm kyvetách (340 nm pre 3-Np a HMC, 370 nm pre PAP a 400 nm pre 4-Np) s použitím viacerých riedení. Optimálna vlnová dĺžka bola definovaná ako vlnová dĺžka, pri ktorej sa nameria maximálny frakčný rozdiel v absorbancii medzi substrátom a produktom (OD produktu - OD substrátu/OD substrátu).

Proteázový test

HCV proteázové testy sa uskutočnili pri 30 °C s použitím 200 μΙ reakčnej zmesi v 96-jamkovej mikrotitračnej platničke. Podmienky testovacieho tlmivého roztoku (25 mM MOPS pH 6,5, 300 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% lauryl maltozid, 5 μΜ EDTA a 5 μΜ DTT) sa optimalizovali pre heterodimér NS3/NS4A (D. L. Sali a spol., ibidem). V typickom prípade sa 150 μΙ zmesí tlmivého roztoku, substrátu a inhibítora sa umiestnili do jamiek (výsledná koncentrácia DMSO 4 % objemové) a nechali sa predinkubovať približne 3 minúty pri 30 °C. Päťdesiat μΙ predohriatej proteázy (12 nM, 30 °C) v testovacom tlmivom roztoku sa potom použilo na začatie reakcie (výsledný objem 200 μΙ). Platničky sa sledovali počas celého trvania testu (60 minút) na zmenu v absorbancii pri vhodnej vlnovej dĺžke (340 nm pre 3-Np a HMC, 370 nm pre PAP, a 400 nm pre 4-Np) s použitím čítacieho zariadenia na mikrotitračné platničky Spectromax Plus vybaveného monochrometrom (prijateľné výsledky sa dajú dosiahnuť s čítacími zariadeniami, ktoré používajú prahové filtre). Proteolytické štiepenie esterickej väzby medzi Nva a chromoforom sa sledovalo pri vhodnej vlnovej dĺžke proti prázdnej vzorke bez enzýmu ako kontrole neenzymatickej hydrolýzy. Vyhodnotenie kinetických parametrov substrátu sa uskutočnilo v rozsahu 30-násobnej koncentrácie substrátu (~6 až 200 μΜ). Počiatočné rýchlosti sa stanovili s použitím lineárnej regresie a kinetické konštanty

- 166sa získali vadením údajov do Michaelis-Mentenovej rovnice s použitím nelineárnej regresnej analýzy (Mac Curve Fit 1.1, K. Raner). Hodnoty obratu (k_cat) sa vypočítali za predpokladu, že enzým bol plne aktívny.

Vyhodnotenie inhibítorov a inaktivátorov

Inhibičné konštanty (K,) pre kompetitívne inhibítory Ac-D-(D-Gla)-L-l-(Cha)-COH (27), Ac-DTEDVVA(Nva)-OH a Ac-DTEDWP(Nva)-OH sa stanovili experimentálne v určených koncentráciách enzýmu a substrátu nanesením Vq/ví oproti koncentrácii inhibítora ([l]₀) podľa modifikovanej Michaelis-Mentenovej rovnice pre kompetitívnu inhibičnú kinetiku: Vq/ví = 1 +[l]o/(Kj(1 +[Sjo/K_m)), kde v₀ je neinhibovaná počiatočná rýchlosť, v_f je počiatočná rýchlosť v prítomnosti inhibítora v ktorejkoľvek koncentrácii inhibítora ([l]₀) a [S]_o je koncentrácia použitého substrátu. Výsledné údaje sa dosadili s použitím lineárnej regresie a výsledný sklon 1/(K,(1 +[S]o/Km) sa použil na vypočítanie hodnoty K,.

Získané hodnoty K, pre rôzne makrocykly podľa vynálezu sú uvedené vo vyššie uvádzanej Tabuľke 1, kde zlúčeniny sa zoradili podľa rozsahu hodnoty Kí. Z týchto testovacích výsledkov osobe oboznámenej s problematikou bude zrejmé, že zlúčeniny podľa vynálezu majú vynikajúce použitie ako inhibítory NS3 serínových proteáz.

Spôsob bunkového biotestu

Bunkový biotest pre serínovú proteázu HCV sa uskutočnil na zlúčeninách podľa vynálezu podľa spôsobu opísaného S. Agrawalom a spol., Development and characterization of hepatitis C virus serine protease cell-based trans-cleavage assay, Hepatology, dodatok k ročníku 30 (č. 4, časť 2, október 1999), Abstrakt č. 615 (Proceedings of AASLD 50th Annual Meeting, Dallas, Texas, november 5-9, 1999), opis ktorého sa tu referenčne začleňuje. Test sa uskutočnil na bunkách HeLa/Huh7, ktoré boli ko-transfekované s plazmidom, ktorý exprimuje reporterový proteínový substrát obsahujúci štiepnu rozpoznávaciu sekvenciu NS5A/5B a expresný vektor 1BNS4A₂i-32 GS-GSNS₃.₈i I17K a YFPnl ako proteín interného štandardu na kontrolu cytotoxicity. Proteázová aktivita sa merala SDS-PAGE elektroforézou celkových bunkových lyzátov a potom Western blotovacím

- 167spôsobom s použitím monoklonálnej protilátky namierenej proti reportér substrátu. Kvantifikovanie štiepenia substrátu sa uskutočnilo skenovaním imunoblotu na fosfoimageri.

Materiály

Plazmidové DNA pBFP-5A/5B-GFP: Reporterový gén, ktorý exprimuje substrát, kóduje fúzny proteín zahŕňajúci N' terminálovú modrú fluorescenčnú proteínovú (BFP) doménu a C' terminálovú zelenú fluorescenčnú proteínovú (GFP) doménu oddelenú 25 aminokyselinami odvodenými zo štiepnej rozpoznávacej sekvencie NS5A/5B. GFP aj BFP sú v podstate homologické autofluorescenčné proteíny, ktoré emitujú zelené alebo modré svetlo, keď sú excitované UV svetlom zodpovedajúcej vlnovej dĺžky. Štyri substitúcie v aminokyselinách chromoforu GFP zmenia vlnovú dĺžku emisie a prekonvertujú proteín na BFP.

Substrát a výsledné GFP a BFP produkty možno stanoviť v bunkových lyzátoch imunologickými spôsobmi s použitím monoklonálnej protilátky, ktorá rozpoznáva oba proteíny.

Reporterový gén BFP-5A/5B-GFP obsahuje kódujúce sekvencie autofluorescenčných proteínov BFP a GFP (Quantum Biotechnologies, Inc., Montreal, Kanada), ktoré sú oddelené štiepnou rozpoznávacou sekvenciou NS5A/5B, ktorá je klonovaná medzi miestami reštrikčných endonukleáz Nhe I a Bam Hl klonovacieho vektoru pQBI25 (Quantum Biotechnologies, Inc.). Expresia fúzneho proteinu je pod kontrolou urýchľovača promótora CMV IE. Sekvencia hovädzieho rastového hormónu p (A) vektora poskytuje signál polyadenylácie pre mRNA. štiepna sekvencia NS5A/5B je: SSGADTEDWCCSMSYTWTGALVTP. Na validáciu klónu sa použilo sekvenovanie DNA.

P1B002: 1ĎNS4A21-32GS-GS NS 3-81 I17K: Proteáza podtypu 1b sa klonovala ako fragment Xba1/Not1 sa promótorom CMV vo vektore pCIneo.

-168YFPnl: YFPnl sa kúpil od firmy Clontech (Palo Alto, California). Pridanie tretieho plazmidu do transfekcie poskytuje proteín interného štandardu na kontrolu cytotoxicity a neovplyvňuje percento štiepenia proteázy.

Plazmidové DNA sa udržiavali a množili v bunkách DH5a (získané od Life Technologies) v médiu LB pri vhodnom výbere antibiotík, a boli čistené s použitím súprav QIAfilter Plasmid (Qiagen, Valencia, California).

Bunková kultúra

Bunky HeLa sa kultivovali a množili v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu EMEM; BioWhittaker, Walkersville, Maryland) obohatenom o 10% fetálne teľacie sérum (FCS), 2 mM glutamínu, a 100 U/ml penicilínu/streptomycínu (BioWhittaker), 2% NaHCO3.

Bunky Huh7 sa kultivovali a množili v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu (DMEM; BioWhittaker) obohatenom o 10% fetálne teľacie sérum (FCS), 100 U/ml penicilínu/streptomycínu (BioWhittaker) a 5 ml NEAA (100x; BioWhittaker)/l.

Deň pred transfekciou

Bunky HeLa sa vysiali do 24-jamkových platničiek (Falcon 3047 platničky) s hustotou 6x10⁴ buniek/jamka a kultivovali sa cez noc pri 37 °C v termostate s 5% CO₂.

Deň transfekcie

Plazmidové DNA sa zriedili do výslednej koncentrácie 0,05 pg/μΙ vo vode bez nukleázy (Promega, Madison, Wisconsin, katalógové číslo P119C). 0,75 pg BFP5A/5B-GFP sa zlúčilo a zmiešalo s 0,175 pg P1B002 (0,23X) a 0,02 pg YFPnl. DNA sa doplnili na výsledný objem 60 pl s EMEM bez FBS, glutamínu a antibiotík. Pridal sa pomer 5 pl objemu SuperFect Reagent (Qiagen, katalógové číslo 301305) na celkové pg DNA a zmes sa miešala na miešačke vortexového typu približne 10 sekúnd a inkubovala sa 10 min pri izbovej teplote, aby mohol vzniknúť komplex. Kým sa vytváral komplex, rastové médium z platničiek s bunkovými kultúrami sa

-169 odsalo a bunky sa premyli 1x s 1 ml PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ (BioWhittaker). Do skúmavky obsahujúce transfekčné komplexy sa pridalo sa 350 μΙ EMEM (obohatené zodpovedajúcimi prísadami - kompletné médium) a zmes sa 2- až 3-krát napipetovala a vypustila. Celý objem sa preniesol do jednotlivých jamiek 24jamkovej kultivačnej platničky. Bunky HeLa sa inkubovali s transfekčnými komplexmi približne 3 hodiny pri 37 °C a 5% CO₂. Médium obsahujúce transfekčné komplexy sa z buniek odsalo. Bunky sa jedenkrát premyli približne v 1 ml PBS, PBS sa odsalo a pridalo sa 495 μΙ kompletného EMEM, potom sa pridalo 5 μΙ zlúčeniny/jamka. Bunky sa inkubovali 22 až 24 hodín pri 37 °C a 5% CO₂.

Príprava bunkových lyzátov

Médium z každej jamky sa odsalo a 1x sa premylo s DPBS. Bunky sa získali v 100 μΙ 1χ Tris-SDS-BME tlmivého roztoku na vzorky (separačný systém OWL, Portsmouth, New Hampshire, katalógové číslo ER33) a preniesli sa do mikrocentrifugačných skúmaviek. Roztok sa potom varil 3 až 5 min, aby sa bunky lyžovali. Na SDS-PAGE gél sa naložil objem 10 μΙ/jamka. Lyzáty sa rozdelili elektroforézou na 10 cm x 10 cm 12,5% SDS-PAGE (Owl Scientific, katalógové číslo OG-0125B) a elektroforéza sa spustila pri 30 mamp v tlmivom roztoku Trisglycín-SDS (Owl Scientific). Pred použitím sa membrána PVDF (Immobilon-P; veľkosť pórov 0,45 μΓη; Millipore, Bedford, Massachusetts) namočila do 100%-ného metanolu sa 10 sekúnd a blot sa potom umiestnil do destilovanej vody. Proteíny sa preniesli na 90 min na filtrové membrány PVDF (0,45 μηη, Millipore) pri 108 mamp na gél s použitím polosuchého elektroblotera.

Zisťovanie proteínov prostredníctvom ECF Western blotovacieho spôsobu (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Anglicko, katalógové číslo RPN 5780). Membránové filtre PVDF boli zastavené 5%-ným blokovacím činidlom (zo súpravy) približne v 10 ml PBS obsahujúcom 0,05% Tween 20, pH 7,4 (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri, katalógové číslo 3563) cez noc v chladničke pri 2 až 4 °C. Nasledujúce deň sa membrány krátko dvakrát opláchli s TPBS obsahujúcim 0,05% premývací tlmivý roztok Tween 20, potom sa premyl trikrát, vždy po 5 min, v PBS obsahujúcom 0,05% Tween 20, pH 7.4. Membrány sa inkubovali 30 min v 12

-170 ml objemoch s riedením 1:3000 anti-GFP monoklonálnej protilátky (Clontech, Palo Alto, California) v PBS obsahujúcom 0,05% Tween 20, pH 7,4, a zároveň sa pridal 1%-ný BSA (albumín, hovädzí, katalógové číslo A-2153, Sigma) na zníženie pozadia. Membrány sa dvakrát krátko premyli s TPBS, potom trikrát, vždy po 5 min, vpremývacom tlmivom roztoku TPBS. Membrány sa inkubovali 30 min v 12 ml objemoch s riedením 1:600 anti-fluoresceínom viazaného anti-myšacieho Ig v TPBS. Membrány sa krátko dvakrát premyli s TPBS, potom trikrát po 5 min v premývacom tlmivom roztoku TPBS. Na amplifikáciu signálu so substrátovými membránami ECF sa inkubovali 30 min v 10 ml konjugátu anti-fluoresceín alkalickej fosfatázy s riedením 1:2500. Membrány sa dvakrát krátko prepláchli s TPBS, potom trikrát po 5 min v premývacom tlmivom roztoku TPBS. Roztok ECF substrátu sa pripravil podľa návodu výrobcu (alikvotné časti a zmrazenie), membrány sa inkubovali 2 až 3 minúty, nadbytočný reagent sa odstránil, membrány sa potom blotovali s filtračným papierom, sušili sa na vzduchu 9 až 10 minút a potom sa skenovali.

Skenovanie membrán

Blot sa umiestnil na skle fosfoimageru Storm 860. Nastavila sa modrá chemoluminiscencia, veľkosť 200 pixcelov, napätie 700 PMT. V programe ImageQuant sa otvoril súbor a kvantifikoval sa vytvorením štvorcov okolo prúžkov znamenajúcich substrát (S), produkt (P) a internú kontrolu (IC). Percento štiepenia substrátu sa meralo ako P/(S+P)x100.

Inhibícia štiepenia v dôsledku liečiva sa merala ako prirovnanie voči kontrole, ktorá sa zahrnula do každého blotu. Výsledok sa vytvoril v Exceli. Výsledky niektorých zlúčenín sú uvedené nižšie:

Zlúčenina z príkladu 36: EC₅₀ = 9 μιη

Zlúčenina z príkladu 35: EC50 = 20 gm

Z týchto výsledkov osobe oboznámenej s problematikou by bolo jasné, že zlúčeniny podľa vynálezu sa dajú výborne využiť ako inhibítory NS3 serínových proteáz.

Claims (30)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Makrocyklické zlúčeniny včítane ich enantiomérov, stereoizomérov, rotamérov a tautomérov, a ich farmaceutický prijateľných solí alebo ,solvátov všeobecného vzorca kde

   E, X a Y môžu byť nezávisle od seba prítomné alebo neprítomné, a ak sú prítomné, nezávisle od seba sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej: alkyl, aryl, alkylaryl, heteroalkyl, heteroaryl, arylheteroaryl, alkylheteroaryl, cykloalkyl, alkyléter, alkylaryléter, aryléter, alkylamino, arylamino, alkylarylamino, alkylsulfid, alkylarylsulfid, arylsulfid, alkylsulfón, alkylarylsulfón, arylsulfón, alkylalkylsulfoxid, alkylarylsulfoxid, alkylamid, alkylarylamid, arylamid, alkylsulfónamid, alkylarylsulfónamid, arylsulfónamid, alkylmočovina, alkylarylmočovina, arylmočovina, alkylkarbamát, alkylarylkarbamát, arylkarbamát, alkylhydrazid, alkylarylhydrazid, alkylhydroxamid, alkylarylhydroxamid, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroalkylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, alkylkarbonyl, arylkarbonyl, heteroalkylkarbonyl, heteroarylkarbonyl, alkoxykarbonyl, aryloxykarbonyl, heteroaryloxykarbonyl, alkylaminokarbonyl, arylaminokarbonyl, heteroarylaminokarbonyl alebo ich kombinácie, za predpokladu, že E, X a Y môžu byť dodatočne substituované substituentami vybranými zo skupiny, ktorú tvorí aromatická časť, alkyl, alkylaryl, heteroalkyl, arylheteroaryl, alkylheteroaryl, cykloalkyl, alkyléter, alkylaryléter, alkylsulfid, alkylarylsulfid, alkylsulfón, alkylarylsulfón, alkylamid, alkylarylamid, alkylsulfónamid, alkylamíny, alkylarylamíny, alkylarylsulfónamid, alkylmočovina, alkylarylmočovina, alkylkarbamát, alkylarylkarbamát, halogén, hydroxylamino, alkylkarbazát, arylkarbazát;

   -172 R¹ znamená COR⁵ alebo B(OR)2, kde R⁵ znamená H, OH, OR⁸, NR⁹R¹⁰, CF3, C₂F₅, C3F7, CF₂R⁶, R⁶, COR⁷, kde R⁷znamená H, OH, OR⁸, CHR⁹R¹⁰ alebo NR⁹R¹⁰, kde R⁶, R⁸, R⁹ a R¹⁰ sa nezávisle od seba vyberú zo skupiny, ktorú tvorí H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, cykloalkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl, CH(R¹')COOR¹¹, CH(R^1,)CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)R',

   CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)COOR¹¹,

   CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONR¹²R¹³,

   CH(R¹’)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)COOR¹¹,

   CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONR¹²R¹³,

   CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONHCH(R^5,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONHCH(R^3,)CONHCH(R^4,)CONHCH(R⁵')CONR¹²R¹³, kde R¹', R²', R³', R⁴', R⁵', R¹¹, R¹², R¹³, a R' sú nezávisle od seba volené zo skupiny, ktorú tvorí H, alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, cykloalkyl, alkylaryl, alkylheteroaryl, arylalkyl a heteroaralkyl;

   Z sa volí z O, N, alebo CH;

   W môže byť prítomné alebo neprítomné, a ak W je prítomné, W sa volí z C=O, C=S, SO₂ alebo C=NR;

   Q je (NR)_P, O, S, CH₂, CHR, CRR' alebo dvojitá väzba na V;

   A je O, CH₂, (CHR)p, (CHR-CHR')_P, (CRR')_P, NR, S, SO₂, C=O alebo väzba;

   G je (CH₂)_P, (CHR)p, (CRR')_P, NR, O, S, SO₂, S(O)₂NH, C=O, alebo dvojitá väzba na E alebo V;

   V je CH, CR alebo N;

   p je číslo medzi 0 až 6; a

   R, R', R², R³, a R⁴ sa nezávisle od seba vyberú zo skupiny, ktorú tvorí H; C1-C10 alkyl; C₂-C₁₀ alkenyl; C₃-C₈ cykloalkyl; C₃-C₈ heterocykloalkyl, aryl, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, ketón, aldehyd, kyano, nitro; heteroaryl; alkylaryl; alkylheteroaryl; (cykloalkyl)alkyl a (heterocykloalkyl)alkyl, kde uvedený cykloalkyl tvorí tri až osem atómov uhlíka, a nula až šesť atómov kyslíka, dusíka, síry alebo fosforu, a uvedený alkyl pozostáva z jedného až šiestich atómov uhlíka;

   - 173 pričom uvedený alkyl, heteroalkyl, alkenyl, heteroalkenyl, aryl, heteroaryl, cykloalkyl a heterocykloalkyl môže byť voliteľne substituovaný, pričom uvedený výraz substituovaný sa týka voliteľnej a vhodnej substitúcie s jedným alebo viacerými substituentami, ktoré sa vyberú zo skupiny, ktorú tvorí alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl, aralkyl, cykloalkyl, heterocyklus, halogén, hydroxy, tio, alkoxy, aryloxy, alkyltio, aryltio, amino, amido, ester, karboxylová kyselina, karbamát, močovina, ketón, aldehyd, kyano, nitro, sulfónamid, sulfoxid, sulfón, sulfonylmočovina, hydrazid a hydroxamát a tiomočovina.
2. 2. Makrocyklické zlúčeniny nároku 1, kde R¹ znamená COR⁵ a R⁵ znamená H, OH, COOR^{7 8} alebo CONR⁹R¹⁰.
3. 3. Makrocyklické zlúčeniny nároku 2, kde R¹ znamená COCONR⁹R¹⁰ a R⁹ znamená H, R¹⁰ znamená H, CH(R^1,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONR¹²R¹³, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)COOR¹¹, CH(R¹')CONHCH(R^2,)CONR¹²R¹³ alebo CH(R^1,)CONHCH(R^2,)(R’).
4. 4. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 3, kde R¹⁰ znamená CH(R^1,)CONHCH(R^2,)COOR¹¹, CH(R^1,)CONHCH(R^2,)CONR¹²R¹³ alebo CH(R^1,)CONHCH(R²')(R'), kde R¹' znamená H alebo alkyl, a R^2, sa volí zo skupiny zahrnujúcej fenyl, substituovaný fenyl, heteroatómom substituovaný fenyl, tiofenyl, cyklohexyl, cyklopentyl, cyklopropyl, piperidyl, pyridyl a 2-indanyl.
5. 5. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 4, kde R^1, znamená H.
6. 6. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 5, kde R²' znamená fenyl, tiofenyl, cyklohexyl, 2-indanyl, cyklopentyl, pyridyl, fenyl(4-HNSO2NH2), R¹¹ znamená H alebo ŕerc-butyl, R¹² a R¹³ znamenajú metyl, a R'je hydroxymetyl alebo ŕerc-butoxymetyl.
7. 7. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 1, kde R² je vybrané zo skupiny zahrnujúcej nasledujúce skupiny:

   -174-
8. 8. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 7, kde R¹ znamená COR⁵ a R⁵ znamená H, OH, COOR⁸ alebo CONR⁹R¹⁰.
9. 9. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 8, kde V znamená CH.
10. 10. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 9, kde Q znamená NR alebo O.
11. 11. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 10, kde G znamená CH₂.

    -175
12. 12. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 11, kde A znamená O, NR, CH=CH alebo CH₂.
13. 13. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 12, kde E znamená alkyl, aryl, heteroalkyl, heteroaryl, alkyl, aryl alebo cykloalkyl.
14. 14. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 13, kde E je vybrané zo skupiny zahrnujúcej nasledujúce skupiny:
15. 15. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 14, kde R³ je vybrané zo skupiny zahrnujúcej nasledujúce skupiny:

    VIA/· *VW» *wv*

    f))n = 0-2 COR³¹

    COR

    COR

    R³² R³³

    - 176kde R³⁰ znamená H, CH₃ alebo iné alkylové skupiny;

    R³¹ znamená OH, O-alkyl, NH₂, N-alkyl; a

    R³² a R³³ môžu byť rovnaké alebo rôzne a môžu znamenať nezávisle H, F, Cl, Br a CH₃.
16. 16. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 15, kde Z znamená N a R⁴ znamená H.
17. 17. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 16, kde W znamená C=O.
18. 18. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 17, kde skupina X-Y je vybraná zo skupiny zahrnujúcej CpC^ alkyl, alkyl, cykloalkyl, heteroalkyl, arylalkyl, aryl, heteroaryl a alkylaryl.
19. 19. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 18, kde kde R^b je napojený priamo na A a R^c je napojený priamo na W; a skupina U¹, U², U³, U⁴, U⁵, a U⁶ vytvárajú buď šesťčlenný uhlíkový kruh, alebo päť- alebo šesťčlenný kruh s jedným alebo viacerými heteroatómami;

    R^a je H, alkyl, alkoxy, hydroxy, alkyltio, halogén, nitro, kyano, karboxylová kyselina, ester, amid, amino, nitril alebo CF₃;

    R^b je väzba, Ci-C₆ alkyl, C₂-C₆ alkenyl, C₂-C₆ alkinyl, O, S, SO₂, NH, O(alkyl), S(alkyl), SO₂(alkyl) alebo N(alkyl); a

    R^c je väzba, C1-C6 alkyl, C₂-C6 alkenyl, C₂-C6 alkinyl, O, S, SO₂, NH, O(alkyl), S(alkyl), SO₂(alkyl), N(alkyl) alebo CH₂-N(alkyl), pričom CH₂ je napojené na aromatické jadro.

    -17720. Makrocyklické zlúčeniny podľa nároku 18, kde skupina X-Y je vybraná zo skupiny zahrnujúcej nasledujúcie skupiny:
20. 21. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa makrocyklickú zlúčeninu podľa nároku 1 ako účinnú látku.

    t ý m, že obsahuje
21. 22. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 21 porúch spojených s vírusom hepatitídy C.

    na použitie na liečenie
22. 23. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 21,vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič.

    -178,
23. 24. Makrocyklická zlúčenina podľa nároku 1 v terapeutických množstvách na použitie na liečenie porúch spojených s HCV proteázou.
24. 25. Použitie makrocyklickej zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu lieku na liečenie porúch spojených s HCV proteázou.
25. 26. Spôsob výroby farmaceutického prostriedku na liečenie porúch spojených s HCV proteázou, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa uvedenie zlúčeniny podľa nároku 1 do úzkeho kontaktu s farmaceutický prijateľným nosičom.
26. 27. Makrocyklické zlúčeniny vykazujúce inhibičnú aktivitu HCV proteázy včítane ich enantiomérov, stereoizomérov, rotamérov a tautomérov, a ich farmaceutický prijateľných solí alebo solvátov, ktoré sú vybrané zo zlúčenín vzorcov uvedených nižšie:

    179-

    -180-

    181

    Ο

    -182 -

    AcHN

    -183

    - 184-

    Η₂

    -185-

    186-

    -187
27. 28. Farmaceutický prostriedok na liečenie porúch spojených s HCV proteázou, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo jednej alebo viacerých makrocyklických zlúčenín podľa nároku 27 a farmaceutický prijateľný nosič.

    , I
28. 29. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje antivirotikum.
29. 30. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28 alebo 29, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje interferón.
30. 31. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 30, vyznačujúci sa t ý m, že antivirotikom je ribavirín a interferónom je a-interferón.