CN101580536A

CN101580536A - 含有烷基和芳基丙氨酸p2部分的丙型肝炎病毒的大环ns3-丝氨酸蛋白酶抑制剂

Info

Publication number: CN101580536A
Application number: CNA2009100067369A
Authority: CN
Inventors: S·文卡特拉曼; K·X·陈; A·阿拉萨潘; F·G·恩约罗格; V·M·基里亚瓦拉布汉; 覃天佑; B·A·麦克基特里克; A·J·普伦盖; V·S·马迪森
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme Corp
Priority date: 2000-04-19
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2009-11-18
Also published as: JP4748912B2; CA2406532A1; JP2003531199A; WO2001081325A3; PL358591A1; EP1274724A2; US6914122B2; NO20025030L; BR0110104A; SK14952002A3; PE20011288A1; US20020016294A1; CZ20023473A3; CN1432022A; AU2001253621A1; WO2001081325A2; RU2002131163A; CN1935833A; ZA200208014B; NZ521456A

Abstract

本发明公开了新的具有HCV蛋白酶抑制活性的大环化合物以及制备这些化合物的方法。在另一实施方案中，本发明公开了包括所述大环化合物的药用组合物以及使用它们治疗与HCV蛋白酶有关疾病的方法。

Description

含有烷基和芳基丙氨酸P2部分的丙型肝炎病毒的大环NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂

本申请是申请日为2001年4月17日、发明名称为“含有烷基和芳基丙氨酸P2部分的丙型肝炎病毒的大环NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂”的PCT/US01/12530的发明专利申请的分案申请，原申请的中国专利申请号为01810566.1。

技术领域

本发明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制剂，包含一种或多种这样的抑制剂的药用组合物、制备这样的抑制剂的方法和使用这样的抑制剂治疗丙型肝炎和相关疾病的方法。本发明尤其公开了作为HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的新的大环化合物。本文公开的内容与2000年4月5日提交的待审专利申请顺序号的内容有关。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)为一种(+)-有义单链RNA病毒，它作为主要病原体涉及非甲非乙型肝炎(NANBH)，尤其是与血液相关的NANBH(BB-NANBH)(参见国际专利申请公布号WO 89/04669和欧洲专利申请公布号EP 381216)。NANBH区别于其它类型的病毒诱发的肝病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、巨细胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)，也区别于其它形式的肝病，例如酒精中毒和原发性胆汁性肝硬变。

最近，多肽加工和病毒复制所必需的HCV蛋白酶已被鉴定，克隆和表达(参见例如美国专利号5,712,145)。这种约3000个氨基酸的多蛋白含有自氨基末端至羧基末端的核壳蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及几种非结构蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3为约68kda的蛋白，由HCV基因组的约1893个核苷酸编码，并且具有2个不同的结构域：(a)由约200个N-末端氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶结构域；和(b)在蛋白C-末端的RNA依赖性ATP酶结构域。由于蛋白质序列、整体三维结构和催化机制的相似性，NS3蛋白酶被认为是胰凝乳蛋白酶家族的一个成员。其它类似胰凝乳蛋白酶的酶为弹性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、血纤蛋白溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCV NS3丝氨酸蛋白酶担负在NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点的多肽(多蛋白)的蛋白酶解，因此在病毒复制期间负责生成四种病毒蛋白。HCV NS3丝氨酸蛋白酶已被作为抗病毒化学治疗学的具有吸引力的靶标。

已经测定NS4a蛋白(约6kda的多肽)为NS3的丝氨酸蛋白酶活性的辅因子。经NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶进行的NS3/NS4a接点的自动切割在分子内(即顺式)发生，同时其它的切割位点在分子间(即反式)进行。

HCV蛋白酶的天然切割位点的分析揭示在P1存在半胱氨酸，在P1’存在丝氨酸，并且这些残基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接点中严格保守。NS3/NS4a接点在P1包含苏氨酸，在P1’包含丝氨酸。假设NS3/NS4a上的Cys→Thr取代以解释该接点需要顺式而不是反式加工。参见例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci (USA)91：888-892，Failla等(1996)Folding&Design 1：35-42。NS3/NS4a切割位点也比其它的位点更耐受诱变。参见例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.68：7525-7533。也已发现切割位点的上游区域的酸性残基需要有效的切割。参见例如Komoda等(1994)J. Virol.68：7351-7357。

已报道的HCV蛋白酶抑制剂包括抗氧化剂(参见国际专利申请公布号WO 98/14181)、某些肽类和肽类似物(参见国际专利申请公布号WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.36：9340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.37：8906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.8：1713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制剂c的抑制剂(Martin等(1998)Biochem.37：11459-11468，选自人胰分泌型胰蛋白酶抑制剂(hPSTI-C3)和小体所有组成成分(minibody repertoires)(MBip)的抑制剂亲和性(Dimasi等(1997)J.Virol，71：7461-7469)，cV_HE2(“camelized”变体结构域抗体片段)(Martin等(1997)Protein Eng.10：607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.27：42-28)。设计用来选择性破坏丙型肝炎病毒RNA的核酶最近已被公开(参见BioWorld Today 9(217)：4(1998年11月10日))。

也参考1998年4月30日公开的PCT公布号WO 98/17679(VertexPharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公开的WO 98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公开的WO 99/07734(Boebringer Ingelheim Canada Ltd)。

HCV已参与肝硬变且参与诱导肝细胞癌。目前患有HCV感染的患者预后是很差的。由于缺乏与HCV感染有关的免疫或者缓解，HCV感染比起其它形式的肝炎更难以治疗。目前数据表明硬变诊断后四年的生存率小于50％。据诊断患有定位可切除肝细胞癌的患者具有10-30％的五年生存率，而那些患有定位不可切除肝细胞癌的患者具有小于1％的五年生存率。

参考A.Marchetti等Synlett，S1，1000-1002(1999)，其描述HCVNS3蛋白酶抑制剂的二环类似物的合成。其中所公开的化合物具有以下结构：

也参考WO 00/09558(受让人：Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物：

其中各元素在此定义。该系列的示例性化合物为：

也参考WO 00/09543(受让人：Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公开)，它公开了下式的肽衍生物：

其中各元素在此定义。该系列的示例性化合物为：

丙型肝炎的目前疗法包括干扰素-o(INF_α)以及用利巴韦林和干扰素进行的联合疗法。参见例如，Beremguer等(1998)Proc.Assoc.Am. Physicians 110(2)：98-112。这些疗法的持续应答率低且多发生副作用。参见例如，Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336：347。目前，没有疫苗可用于HCV感染。

2000年4月5日提交的待审专利申请，顺序号________，公开了某些作为HCV蛋白酶的抑制剂的大环化合物以及含有所述化合物的药用组合物。

丙型肝炎病毒感染需要新的治疗和疗法。因此，本发明一个目的是提供用于治疗或者预防或者改善丙型肝炎的一种或多种症状的化合物。

在此另一个目的是提供治疗或者预防或者改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。

本发明另一个目的是提供使用在此提供的化合物来调节丝氨酸蛋白酶，特别是HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的方法。

在此另一个目的是提供使用在此提供的化合物来调节HCV多肽的加工的方法。

发明概述

在本发明的许多实施方案中，提供一类新的大环HCV蛋白酶抑制剂，包含一种或多种所述化合物的药用组合物、制备包含一种或多种这样的化合物的药用制剂的方法、以及治疗、预防或者改善丙型肝炎的一种或多种症状的方法。也提供调节HCV多肽与HCV蛋白酶相互作用的方法。在此提供的化合物中，优选抑制HCV NS3/NS4a丝氨酸蛋白酶活性的化合物。本发明公开的化合物一般含有大约四个或更多个氨基酸残基以及少于大约十二个氨基酸残基。

在本发明的主要实施方案中，本发明提供式I的大环化合物：

式I

其中：

E、X和Y可以独立存在或不存在，如果存在则独立选自以下部分：烷基、芳基、烷基-芳基、杂烷基、杂芳基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、芳基醚、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、芳基砜、烷基-烷基亚砜、烷基-芳基亚砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基-芳基磺酰胺、芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、氨基甲酸芳基酯、烷基酰肼、烷基-芳基酰肼、烷基羟酰胺、烷基-芳基羟酰胺、烷基磺酰基、芳基磺酰基、杂烷基磺酰基、杂芳基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂烷基羰基、杂芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基或它们的组合，条件是E、X和Y又可以任选由下述部分取代：芳族、烷基、烷基-芳基、杂烷基、芳基-杂芳基、烷基-杂芳基、环烷基、烷基醚、烷基-芳基醚、烷基硫醚、烷基-芳基硫醚、烷基砜、烷基-芳基砜、烷基酰胺、烷基-芳基酰胺、烷基磺酰胺、烷基胺、烷基-芳基胺、烷基-芳基磺酰胺、烷基脲、烷基-芳基脲、氨基甲酸烷基酯、氨基甲酸烷基-芳基酯、卤素、羟基氨基、肼基甲酸烷基酯、肼基甲酸芳基酯；

R¹＝COR⁵或B(OR)₂，其中R⁵＝H、OH、OR⁸、NR⁹N¹⁰、CF₃、C₂F₅、C₃F₇、CF₂R⁶、R⁶、COR⁷，其中R⁷＝H、OH、OR⁸、CHR⁹R¹⁰或NR⁹R¹⁰，其中R⁶、R⁸、R⁹和R¹⁰独立选自：H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、环烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、CH(R¹’)COOR¹¹、CH(R¹’)CONR¹²R¹³、CH(R¹’)CONHCH(R²’)COOR¹¹、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONR¹²R¹³、CH(R¹’)CONHCH(R²’)R’、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)COOR¹¹、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONR¹²R¹³、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)COOR¹¹、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)CONR¹²R¹³、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)CONHCH(R⁵’)COOR¹¹、CH(R¹’)CONHCH(R²’)CONHCH(R³’)CONHCH(R⁴’)CONHCH(R⁵’)CONR¹²R¹³，其中R¹’、R²’、R³’、R⁴’、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³和R’独立选自：H、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、环烷基、烷基-芳基、烷基-杂芳基、芳基-烷基和杂芳烷基；

Z选自O、N或CH；

W可以存在或不存在，并且如果W存在，则W选自C＝O、C＝S、SO₂或C＝NR；

Q是(NR)_P、O、S、CH₂、CHR、CRR’或朝向V的双键；

A是O、CH₂、(CHR)_P、(CHR-CHR’)_P、(CRR’)_P、NR、S、SO₂、C＝O或键；

G是(CH₂)_P、(CHR)_P、(CRR’)_P、NR、O、S、SO₂、S(O)₂NH、C＝O或朝向E或V的双键；

V是CH、CR或N；

p是数字0-6；和

R、R’、R²、R³和R⁴独立选自：H；C1-C10烷基；C2-C10链烯基；C3-C8环烷基；C3-C8杂环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；杂芳基；烷基-芳基；烷基杂芳基；(环烷基)烷基和(杂环烷基)烷基，其中所述环烷基由3-8个碳原子、0-6个氧原子、氮原子、硫原子或磷原子组成，所述烷基由1-6个碳原子组成；所述烷基、杂烷基、链烯基、杂链烯基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基部分可以任选被取代，所述术语“被取代”指由一个或多个选自下述的部分任选和合适取代：烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、环烷基、杂环、卤素、羟基、硫代、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、磺酰胺、亚砜、砜、磺酰脲、酰肼和异羟肟酸酯和硫脲。

除了另有定义外，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的意义。因此，例如术语烷基(包括烷氧基的烷基部分)指通过从具有1-8个、优选1-6个碳原子的直链或支链饱和烃中除去一个原子而衍生的一价基团；

芳基-代表具有6-14个碳原子并且具有至少一个苯型环的碳环基团，所述碳环基团的所有可取代的芳族碳原子都作为可能的附着点。优选的芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚满基，特别是苯基和取代的苯基；

芳烷基-代表含有通过低级烷基连接的芳基的部分；

烷基芳基-代表含有通过芳基连接的低级烷基的部分；

环烷基-代表具有3-8个、优选5或6个碳原子、任选取代的饱和碳环；

杂环-除了以下定义的杂芳基外，代表具有至少一个中断碳环结构的O、S和/或N原子的饱和与不饱和环状有机基团，所述碳环结构由一个或多个环组成，其中每一个环是5、6或7元环并且可具有或不具有缺乏离域π电子的双键，所述环结构具有2-8个、优选3-6个碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-吗啉基、或2-或3-硫代吗啉基；

卤素-代表氟、氯、溴和碘；

杂芳基-代表环状有机基团，其具有至少一个中断碳环结构的O、S和/或N原子并且具有足够数目的离域π电子以提供芳香性，所述芳族杂环基团具有2-14、优选4或5个碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基、2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基、或3-或4-哒嗪基等。优选的杂芳基是2-、3-和4-吡啶基；这些杂芳基也可以被任选取代。

本发明也包括式I化合物的互变异构体、旋转异构体、对映异构体和其它光学异构体以及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

本发明的另一特点是含有作为活性成分的式I化合物(或它的盐、溶剂合物或异构体)与药学上可接受的载体或赋形剂的药用组合物。

本发明也提供制备式I化合物的方法以及治疗疾病如HCV和相关疾病的方法。所述治疗方法包括给予患有所述一种或多种疾病的患者治疗有效量的式I化合物或含有式I化合物的药用组合物。

也公开了式I化合物在制备用于治疗HCV和相关疾病的药物中的用途。

优选实施方案详述

在一个实施方案中，本发明公开了作为HCV蛋白酶、特别是HCVNS3/NS4a丝氨酸蛋白酶抑制剂的式I化合物：

其中各部分如上所定义。一些优选的实施方案包括、但不限于上述通式I中各官能度的下述定义；对于相同和附加官能度的其它所需定义可以在结构和本申请的权利要求中发现，其也在本发明的预期之中。在优选的实施方案中，式I中的R²可以选自以下部分：

E可以是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的环烷基，E的优选代表是：

R³的优选实施方案包括以下部分：

其中R³⁰＝H、CH₃或其它烷基；

R³¹＝OH、O-烷基、NH₂、N-烷基；和

R³²和R³³可以相同或不同，并且独立选自H、F、Cl、Br和CH₃。

X-Y部分的优选实施方案是以下结构：

在本申请的权利要求部分注释了式I所示化合物的上述各种定义的几种附加和进一步的改进。它们也由在说明书和权利要求中列出的多种化合物代表。认为这些改进、定义和限定代表了本申请的全部发明。

下面列出了显示出良好HCV蛋白酶抑制活性的本发明的代表化合物：

表1中列出了一些化合物的活性(以纳摩尔(nM)表示K_i值的范围)。表1中的实施例号指在本申请后面部分的实施例部分中的各结构式的编号。

表1：HCV蛋白酶连续测试结果

实施例号	K_i*nM
实施例号	K_i*nM	1	B
2	A	1	B
2	A	3	B
4	B	3	B
4	B	5	B
6	A	5	B
6	A	7	B
8	A	7	B
8	A	9	B

10	B
10	B	11	B
12	A	11	B
12	A	13	B
14	B	13	B
14	B	15	B
16	A	15	B
16	A	17	B
18	A	17	B
18	A	19	B
20	A	19	B
20	A	21	B
22	A	21	B
22	A	23	B
24	B	23	B
24	B	25	B
26	B	25	B
26	B	27	B
28	B	27	B
28	B	29	B
30	A	29	B
30	A	31	B
32	B	31	B
32	B	33	B
34	B	33	B
34	B	35	B
36	B	35	B
36	B	37	B
38	B	37	B
38	B	39	A

40	B
40	B	41	A
42	B	41	A
42	B	43	A
44	A	43	A
44	A	45	B
46	B	45	B
46	B	47	B
48	B	47	B
48	B	49	B
50	B	49	B
50	B	51	B
52	A	51	B
52	A	53	A
54	B	53	A

HCV连续测试Ki^*范围：

类别A＝0.001-1.0μM，类别B＝1.1-100μM

在本部分的较后部分叙述了一些合成本发明的各类化合物的方法，并且也用示意图描述，之后描述说明性的例子。

根据结构，本发明的化合物可以与有机或无机酸、或有机或无机碱形成药学上可接受的盐。用于形成这些盐的合适的酸的实例有盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸、抗坏血酸、马来酸、甲磺酸和其它本领域技术人员已知的无机酸和羧酸。对于与碱的盐的形成来说，合适的碱有例如NaOH、KOH、NH₄OH、氢氧化四烷基铵等。

在另一个实施方案中，本发明提供含上述发明的大环化合物作为活性成分的药用组合物。通常所述药用组合物还含有药学上可接受的载体稀释剂、赋形剂或载体(本文中将它们共同称为载体材料)。由于它们的HCV抑制活性，这些药用组合物在治疗丙型肝炎和相关疾病时有效。

在还一个实施方案中，本发明公开了制备含本发明大环化合物作为活性成分的药用组合物的方法。在本发明的药用组合物和方法中，活性成分一般与适合的根据计划的给药形式而选择的载体材料混合给予，包括：例如口服片剂、胶囊剂(固体填充、半固体填充或液体填充)、用于构成的散剂、口服凝胶剂、酏剂、可分散颗粒剂、糖浆剂、混悬剂等，并符合常规制药实践。例如，对于片剂或胶囊形式的口服制剂来说，所述活性药物成分可以与任何口服无毒性药学上可接受的惰性载体如乳糖、淀粉、蔗糖、纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、滑石、甘露醇、乙醇(液体形式)等结合。而且，当要求或需要时，在所述混合物中也可以掺入合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。散剂和片剂可以包含大约5-95％的本发明组合物。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖类、玉米增甜剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇和蜡。在润滑剂中可被提及用于这些剂型的有硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、瓜耳胶等。

当合适时也可以包括甜味剂、矫味剂和防腐剂。以下将更详细地叙述在以上所提及的一些术语，即崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂等。

另外，可以以持续释放形式制备本发明的组合物，以便提供任何一种或多种组分或活性成分的速率控制释放，从而得到最佳治疗效果，即HCV抑制活性等。用于持续释放的合适的剂型包括多层片或胶囊，所述多层片含有不同崩解速率的层或控释聚合物基质(浸渍有活性组分并以片剂形式成型)，所述胶囊含有这种浸透或包囊的多孔聚合物基质。

液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳剂。可被提及的例子有用于肠胃外注射的水或水-丙二醇溶液或向口服溶液、悬浮液和乳剂中添加增甜剂和遮光剂(pacifiers)。液体形式的制剂也可以包括用于鼻内给药的溶液。

适合用于吸入的气雾剂制剂可以包括溶液和粉末形式的固体，它们可以与药学上可接受的载体如惰性压缩气体如氮气混合。

为了制备栓剂，首先熔融低熔点的蜡例如脂肪酸甘油酯如可可脂的混合物，通过搅拌或类似的混合使活性成分均匀地分散到其中。然后将熔融均一的混合物倒入大小合适的模具中，冷却并从而固化。

也可包括临用前转变为用于口服或肠胃外给药的液体形式制剂的固体形式的制剂。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。

本发明的化合物也可以经皮传递。经皮化合物可以制备成乳膏、洗剂、气溶胶和/或乳剂并可以包括在经皮贴剂的基质中或者包含在如对该目的的领域是便利的贮库型中。

优选所述化合物通过口服给药。

药物制剂优选以单位剂量形式存在。在这样的形式中，制剂可分为包含适量活性成分的合适大小的单位剂量，例如达到所需目的的有效量。

按照具体的应用，本发明活性组合物在制剂的单位剂量中的量通常可以在约1.0毫克-1,000毫克，优选约1.0-950毫克，更优选约1.0-500毫克之间变化或者调整，一般为约1-250毫克。所使用的实际剂量可依患者的年龄、性别、体重和待治疗疾病的严重性而变化。这样的技术是本领域技术人员熟知的。

通常，包含活性成分的人口服剂型可每天给药1或2次。给药量和次数应根据主治医师的判断调节。口服给药的一般推荐每天剂量方案可以以单次或分开的剂量，在每天约1.0毫克-1,000毫克的范围内变化。

以下描述一些有用的术语：

胶囊剂-指由甲基纤维素、聚乙烯醇或变性明胶或淀粉制成以贮藏或容纳包含活性成分的组合物的特殊容器或者包封物。硬壳胶囊一般由相对高的明胶强度骨架和猪皮肤明胶的掺合物制成。胶囊本身可包含小量的染料、不透明剂、增塑剂和防腐剂。

片剂-指包含与合适的稀释剂一起的活性成分的压制或模压固体剂型。通过压制混合物或经湿法制粒、干法制粒或者紧压法得到的颗粒，可制备片剂。

口服凝胶剂-指分散或溶于亲水性半固体基质中的活性成分。

用于构成的粉末指包含活性成分和能够悬浮在水或汁剂中的适宜稀释剂的粉末掺合物。

稀释剂-指通常构成组合物或者剂型的主要部分的物质。合适的稀释剂包括糖类，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；衍生于小麦、玉米、大米和马铃薯的淀粉；以及纤维素例如微晶纤维素。组合物中稀释剂的量可在总组合物的约10-90％重量，优选约25-75％重量，更优选约30-60％重量，甚至更优选在约12-60％重量的范围内。

崩解剂-指加入到组合物中以帮助其分裂(崩解)并释放出药物的物质。合适的崩解剂包括淀粉；“冷水可溶的”变性淀粉例如羧甲基淀粉钠；天然和合成胶类如槐树豆胶(locust bean)、梧桐胶、瓜尔胶、西黄蓍胶和琼脂；纤维素衍生物如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；微晶纤维素和交联微晶纤维素如交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐如藻酸和藻酸钠；粘土如膨润土；以及泡腾混合物。组合物中崩解剂的量可在组合物的约2-15％重量，更优选约4-10％重量的范围内。

粘合剂-指使粉末粘合或者“胶着”在一起并通过使它们形成颗粒粘聚，因此在制剂中用作“粘合剂”的物质。粘合剂可增加已在稀释剂或者增量剂中可以得到的粘聚的强度。合适的粘合剂包括糖类如蔗糖；衍生于小麦、玉米、大米和马铃薯的淀粉；天然胶类如阿拉伯胶、明胶和西黄蓍胶；海藻衍生物如藻酸、藻酸钠和藻酸钙铵；纤维素材料如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；以及无机物例如硅酸铝镁。组合物中粘合剂的量可在组合物的约2-20％重量，更优选约3-10％重量，甚至更优选约3-6％重量的范围内。

润滑剂-指加入到剂型中以便在其被压制后通过减少摩擦或磨损确保片剂、颗粒剂等自模具或者冲模中脱出的物质。合适的润滑剂包括金属硬脂酸盐如硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸钾；硬脂酸；高熔点蜡；以及水溶性润滑剂如氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠、油酸钠、聚乙二醇和d’1-亮氨酸。压制前通常在很后的步骤中加入润滑剂，因为它们必须存在于颗粒的表面并介于它们与压片机的各部分之间。组合物中润滑剂的量可在组合物的约0.2-5％重量，优选约0.5-2％，更优选在约0.3-1.5％重量的范围内。

助流剂-防止结块并改善颗粒的流动性质以使流动平滑和均匀的物质。合适的助流剂包括二氧化硅和滑石粉。组合物中助流剂的量可在总组合物的约0.1％-5％重量，优选约0.5-2％重量的范围内。

着色剂-向组合物或者剂型提供着色的赋形剂。这样的赋形剂可包括食品级染料和吸附到合适的吸附剂例如粘土或氧化铝上的食品级染料。着色剂的量可在组合物的约0.1-5％重量，优选约0.1-1％重量之间变化。

生物利用度-指与标准物或者对照物比较，活性药物成分或者治疗部分自给药剂型吸收进入到全身循环中的速率和程度。

制备片剂的常规方法是已知的。这样的方法包括干法例如直接压制和经过紧压法产生的颗粒的压制，或者湿法或其它的特殊方法。制备其它给药形式例如胶囊剂、栓剂等的常规方法也是人们熟知的。

本发明的另一个实施方案公开以上公开的药用组合物用于治疗疾病例如丙型肝炎等的用途。方法包括给予患有这样一种或多种疾病和需要这样治疗的患者治疗有效量的本发明药用组合物。

如早先说明的那样，本发明也包括所述化合物的互变异构体、对映体和其它的立体异构体。因此，如本领域技术人员已知的那样，一些本发明化合物可以异构体形式存在。这样的变体包括在本发明的范围内。

本发明另一个实施方案公开制备在此公开的大环化合物的方法。通过本领域已知的几种技术可制备所述化合物。在以下反应方案中概述代表性的示例方法。应当理解虽然以下示例的方案叙述主要衍生自在P2位上的间-酪氨酸或赖氨酸的大环化合物的制备，但任何天然和非天然氨基酸的合适的取代将导致形成所需的基于这些取代的大环化合物。

以下是在叙述方案、制备和实施例中所使用的缩写：

THF 四氢呋喃

DMF N，N-二甲基甲酰胺

EtOAc 乙酸乙酯

AcOH 乙酸

HOOBt 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮

EDCl 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

NMM N-甲基吗啉

ADDP 1，1’-(偶氮二羰基)二哌啶

DEAD 偶氮二羧酸二乙基酯

MeOH 甲醇

EtOH 乙醇

Et₂O 乙醚

Bn 苄基

Boc 叔丁氧羰基

Cbz 苄氧羰基

Cp 环戊基二烯基

Ts 对甲苯磺酰基

Me 甲基

HATU 六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-

四甲基脲鎓(uronium)

Chg 环己基甘氨酸

Tyr 酪氨酸

G 甘油

TG 硫甘油

alloc 烯丙氧羰基

FMOC 9-芴基甲氧羰基

Dde N-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-基)乙基

tBu 叔丁基

equiv 当量

rel.int 相对强度

aq 含水的

rt 室温

satd 饱和的

Hex 己烷

NBA 硝基苯甲酸

PyBrOP 六氟磷酸三(吡咯烷基)溴代鏻

DMSO 二甲亚砜

TFA 三氟乙酸

HOBt 羟基苯并三唑

Hünigs base 二异丙基乙胺

BOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻

LDA 二异丙基氨基化锂

Ph₃P 三苯膦

LAH 氢化铝锂

DMAP 4-二甲基氨基吡啶

DCC 二环己基碳二亚胺

MCPBA 间氯过苯甲酸

BINAP 2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-联萘酚

MeCN 乙腈

Pr 丙基

Ac 乙酰基

Ph 苯基

合成本发明化合物的一般方案：在以下方案中n是数字1-6。

方案1：

由使用NMM、HOBt和EDCl将1a与二肽1b偶合得到中间体1c开始合成1e型化合物，其中R¹、R²、R³、R’如上所定义，R⁴是酰胺、氨基甲酸酯或氢，R是烷基、芳基或芳基烷基。经Cs₂CO₃在DMF中处理该中间体1c，随后光解得到化合物1d。将大环酯1d水解并与合适的胺中间体偶合生成1e型化合物。

方案2：

在方案2中概括式2e化合物的制备，其中R¹、R²、R³和n如上所定义，R’是烷基、杂烷基(OR”、SR’”、NR”R’”，其中R”和R’”是烷基)、在氧原子的邻、间或对位的卤素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5。在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下，将间-酪氨酸-二肽2a偶合成链烯基羧酸。将得到的产物硼氢化得到化合物2c。在Mitsunobu条件下通过使用三苯膦和ADDP完成大环化(Mitsunobu反应由D.L.Hughes在Org.Reactions，42(1992)335，JohnWiley&Sons，New York，L.Paquette，ed.中阐述)。用氢氧化锂将所述酯水解为酸后，将其偶合成胺中间体而得到2e。

方案3：

在方案3中概括式3e化合物的制备，其中R’、R¹、R²、R³、R和n如在方案1中所定义并且PG是Cbz、Boc或alloc。用DCC将化合物3a与取代的组氨酸衍生物偶合。将化合物3b脱保护并再用ω-溴代酸处理得到3c型化合物。在沸腾的甲基乙烯基酮中用NaI和Na₂CO₃完成3c的环化得到3d。通过酯的水解以及随后与合适的胺中间体偶合将化合物3d转变为3e型化合物。

方案4：

从4a型化合物开始制备4f型化合物，其中R’、R¹、R²、R³、R、n和PG如在方案1中所定义。通过用光气处理将4a的醇转变为4b。通过与alloc保护的1b和Et₃N偶合，将4b转变为4c。用Pd(PPh₃)₄将4c的alloc基团脱保护得到4d，将其在Mitsunobu条件下进行环化得到4e。水解4e的酯并再用EDCl、HOOBt与胺偶合得到4f型化合物。

方案5：

由已知的化合物5a开始制备5h型化合物，其中R¹、R²、R³、R’、PG和n如在方案1-3中所定义并且PG¹是Cbz或Boc，PG²是alloc。通过与ROH和TsOH一起回流，将酸5a转变为酯。通过用alloc-氯化物和三乙胺处理，使5b的酚氧转变为alloc基团而得到5c。通过使用DCC和HOBt与保护的环己基甘氨酸偶合，将5c的仲醇转变为5d型化合物。使用Pd(Ph₃P)₄和双甲酮，使5d化合物的alloc基团脱保护。将5e脱保护并用EDCl、HOOBt和合适的活化钌络合物处理，得到式5f的化合物。通过使用Cs₂CO₃并接着光解除去钌，将5f型化合物转变为式5g的环状化合物。水解5g的酯基并与胺中间体偶合得到5h型化合物。

方案6：

在方案6中概括式6f化合物的制备，其中R¹、R²、R³如上所定义，R’是烷基、杂烷基(OR”、SR’”、NR”R’”，其中R”和R’”是烷基)、在邻、间或对位的卤素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，PG是Cbz或Boc，n是0-5。在常规酯化条件(ROH、HCl)下，将间碘代苯基甘氨酸6a转变为它的酯。然后在HOOBt、EDCl·HCl和NMM存在下将所述产物偶合成N-保护的氨基酸。脱保护后，再将得到的胺偶合成末端链烯基羧酸而得到产物6d。使用钯催化剂的分子内Heck反应提供了所需的大环化合物6e(R.F.Heck，Org.React.，27(1989)345-390详细说明了Heck反应)。用氢氧化锂将所述酯水解为酸后，将其偶合成胺中间体而得到6f。

方案7：

在方案7中概括式7b化合物的制备，其中R¹、R²、R³如上所定义，R’是烷基、杂烷基(OR”、SR’”、NR”R’”，其中R”和R’”是烷基)、在邻、间或对位的卤素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，n是0-5。氢化6e的双键得到大环7a。将该酯水解为酸并接着与胺中间体偶合得到7b。

方案8：

在方案8中概括式8f化合物的制备，其中R¹、R²、R³如上所定义，R’是烷基、杂烷基(OR”、SR’”、NR”R’”，其中R”和R’”是烷基)、在氧原子的邻、间或对位的卤素取代基，R是烷基、芳基或烷基芳基，PG是Boc，n是0-5。在Mitsunobu条件(三苯膦和ADDP)下，将间-酪氨酸-二肽8a偶合成末端N-保护的氨基醇8b。除去保护基团得到二胺盐酸盐8d。通过使用光气或羰基二咪唑形成脲键完成大环化。然后用氢氧化锂将得到的酯水解成酸并接着偶合成胺中间体，得到所需的产物8f。

方案9：

通过在二噁烷中用HCl将9a脱保护并用EDCl、HOOBt与ω-羟基酸偶合开始合成9d型化合物，其中取代基R¹、R²、R³、R’、R和PG如在方案1中所定义，得到9b型化合物。用Ph₃p、ADDP将9b型化合物进一步环化生成9c型化合物。将环状化合物9c脱保护并与合适的胺中间体偶合生成9d型化合物。

方案10：

合成10i型化合物，其中R²’、R¹’、R¹、R³如在方案1中所定义，PG¹和PG²定义为保护基团，即Fmoc和Dde。P定义为固定所述化合物的聚合物载体，n是数字1-6。用于10i型分子合成的工艺是使用Fmoc保护基团的标准固相肽合成法。首先通过哌啶处理将Fmoc保护的Sasarin树脂10a脱保护，随后用HATU与Fmoc保护的氨基酸偶合，得到10b型化合物。除去10b的保护基团并用HATU与氨基酸偶合得到10c。经哌啶处理将附载于聚合物的10c脱保护并与羟基酸偶合得到10d型的羟基酰胺。使10d的保护基团开裂并用HATU与保护的赖氨酸衍生物偶合，得到10e型化合物。再一次将10e的保护基脱保护并与Fmoc保护的氨基酸偶合，得到10f型化合物。除去保护基团PG¹和PG²并用二酸和HATU环化得到大环10g。用Dess-Martin试剂将10g化合物氧化，最后用TFA从树脂中开裂得到10i化合物。

方案11：

从保护的酸11a开始合成11e型化合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和n如在方案1中所定义，PG²是Cbz，PG¹是Bn，PG是Boc。通过用EDCl、HOOBt工艺与赖氨酸衍生物偶合将11a转变为11b型化合物。用LiOH.H₂O水解11b的酯基团，随后与合适的胺中间体偶合得到11c化合物。再在二噁烷中用HCl处理并用EDCl、HOOBt与赖氨酸中间体偶合，形成11d型化合物。将11d化合物脱保护并用EDCl、HOOBt环化形成11e型化合物。

中间体的制备：

中间体A：

步骤1：

在0℃-5℃下，用2小时向搅拌的1-硝基丁烷(16.5g，0.16mol)和二羟乙酸在H₂O(28.1g，0.305mol)和MeOH(122mL)中的溶液中滴加入三乙胺(93mL，0.667mol)。将该溶液加温至室温，搅拌过夜并浓缩至干燥得到油状物。然后将该油状物溶于H₂O中并用10％HCl酸化至pH＝1，随后用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机溶液，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩至干燥，得到产物ii(28.1g，产率99％)。

步骤2：

向搅拌的原料ii(240g，1.35mol)的乙酸(1.25L)溶液中加入10％Pd/C(37g)。将得到的溶液在59psi下氢化3小时，然后在60psi下氢化过夜。然后将乙酸蒸发并与甲苯共沸3次，之后用MeOH和乙醚研磨。将该溶液过滤并与甲苯共沸两次，得到为灰白色固体的iii(131g，0.891mol，66％)。

步骤3：

在0℃下，向搅拌的氨基酸iii(2.0g，013.6mmol)在二噁烷(10mL)和H₂O(5mL)中的溶液中加入1NNaOH溶液(4.3mL，14.0mmol)。将得到的溶液搅拌10分钟，随后加入二碳酸二叔丁酯(0.110g，14.0mmol)并在0℃下搅拌15分钟。然后将该溶液加温至室温，搅拌45分钟并保存在冰箱中过夜，浓缩至干燥得到粗制物。向该粗制物在EtOAc(100mL)和冰中的溶液中加入KHSO₄(3.36g)和H₂O(32mL)并搅拌4-6分钟。然后分离有机层并将含水层用EtOAc萃取两次，用水、盐水洗涤合并的有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩至干燥，得到为澄清的树胶状物的产物iv(3.0g，产率89％)。

步骤4：

在-20℃下，向搅拌的iv(3.00g，12.0mmol)在DMF(15mL)和CH₂Cl₂(15mL)中的溶液中加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基吗啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)并搅拌10分钟，随后加入HCl·H₂N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。将得到的溶液在-20℃下搅拌2小时然后保存在冰箱中过夜并浓缩至干燥，随后用EtOAc(150mL)稀释。然后将所述EtOAc溶液用饱和NaHCO₃、H₂O、5％H₃PO₄、盐水洗涤两次，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩至干燥，得到产物v(4.5g，94％)。LRMS m/zMH⁺＝395.1。

步骤5：

将原料v(7.00g，17.8mmol)的无水乙醇(300mL)溶液在室温、氢气氛、Pd-C(300mg，10％)的存在下搅拌。该反应过程经tlc监测。2小时后，将该混合物通过硅藻土垫过滤并将得到的溶液在真空中浓缩，得到产物vi(5.40g，定量)。LRMS m/z MH⁺＝305.1。

步骤6：

在-20℃下，向二甲基胺盐酸盐(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸(4.50g，17.9mmol)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)在无水DMF(200mL)和CH₂Cl₂(150mL)中的溶液中加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在此温度下搅拌30分钟后，将该反应混合物保存在冰箱中过夜(18小时)。然后将其加温至室温并加入EtOAc(450mL)、盐水(100mL)和5％H₃PO₄(100mL)。分离各层后将该有机溶液用5％H₃PO₄(100mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2x150mL)、水(150mL)和盐水(150mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤并在真空中浓缩得到粗制产物viii(4.86g)，为白色固体，其没有进一步纯化而使用。

步骤7：

将N-Boc-苯基甘氨酸二甲基酰胺viii(4.70g，粗产物)溶于4NHCl(60mL，240mmol)中并将得到的溶液在室温下搅拌。该反应过程经TLC监测。4小时后，将该溶液在真空中浓缩，得到为白色固体的ix，其没有进一步纯化而用在以下反应中。LRMS m/z MH⁺＝179.0。

步骤8：

根据在步骤4中所述的偶合步骤制备所需的化合物x。LRMS m/zMH⁺＝465.1。

步骤9：

根据在步骤7中所述的步骤，从三肽x制备所需的中间体A。LRMS m/z MH⁺＝365.1。

中间体B：

步骤1：

使用可买到的xi作为偶合配偶体通过中间体A、步骤8所述的步骤得到所需产物xii。将该粗制物充分纯化以便进一步研究。用97/3二氯甲烷/MeOH经快速层析将部分产品纯化。HRMS(FAB)对于C₂₅H₄₀N₃O₇的计算值：494.2866(M+H)⁺。实测值：494.2863。

步骤2：

通过中间体A步骤7所述的步骤得到所需产物B。该粗制物没有进一步纯化而使用。

中间体C：

步骤1：

根据在中间体A步骤6中所述的偶合步骤制备所需化合物xiii。

步骤2：

根据在中间体A步骤7中所述的步骤制备所需化合物xiv。

步骤3：

根据在中间体A步骤6中所述的偶合步骤制备所需化合物xv。LRMS m/z MH⁺＝451.1。

步骤4：

根据在中间体A步骤7中所述的步骤制备所需中间体C。LRMSm/z MH⁺＝351.1。其没有进一步纯化而使用。

中间体D：

根据在中间体A步骤7中所述的步骤，由化合物v制备所需的中间体D。其没有进一步纯化而使用。

中间体E：

步骤1：

用可买到的xvii作为偶合配偶体，通过中间体A步骤8所述的步骤得到所需的产物xviii。将该粗制物充分纯化以便进一步研究。

步骤2：

通过中间体A步骤7所述的步骤得到所需的产物E。该粗制物没有进一步纯化而使用。

中间体F：

步骤1：

用可买到的xix作为偶合配偶体，通过中间体A步骤4所述的步骤得到所需的产物xx。将该粗制物充分纯化以便进一步研究。

步骤2：

通过中间体D中所述的步骤得到所需的产物F。

中间体G：

步骤1：

用烯丙基甘氨酸作为偶合配偶体，通过中间体A步骤4所述的步骤得到所需的产物G。将该粗制物充分纯化。将该粗制产物用4N HCl/二噁烷处理并在室温下搅拌50分钟。将该反应混合物浓缩至干燥，得到中间体G，其没有进一步纯化而使用。

实施例

实施例1：式1化合物的制备：

步骤A：

将1a的4-氯代丙酸(2.0g，10.8mmol)在二氯乙烷(200mL)中的溶液用CpRu(CH₃CN)₃PF₆(4.7g，10.8mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2小时。当产物1c的无色晶体沉淀析出时将该反应混合物冷却至室温。滤出所述晶体并用1∶1Et₂O/CH₂Cl₂的混合物洗涤，在真空中干燥。该无色晶体(3.3g)为分析纯。¹H NMR(CD₃C(O)CD₃，400MHz，ppm，δ，J)6.77(d，2H，J＝7.0Hz)，6.53(d，2H，J＝7Hz)，5.64(s，5H)，2.87(t，2H，J＝7.0Hz)，2.74(t，2H，J＝7.0Hz)；MS：(电喷雾，m/z相对强度)：350.9(C₁₄H₁₄ClRu⁺，M⁺，100)；对于C₁₄H₁₄ClF₆O₂PRu的CHN计算值C＝33.92％，H＝2.85％，Cl＝7.15％，P＝6.25％实测值：C＝34.04％，H＝3.04％，Cl＝7.09％，P＝5.71％。

步骤B：

将Boc-环己基甘氨酸一水合物1d(6.17g，24.00mmol)在无水CH₂Cl₂(50.0mL)中的溶液用4-甲基吗啉(2.64g，26.0mmol，1.1当量)处理并冷却至-10℃。向该混合物中加入氯甲酸异丁基酯(3.62g，3.5mL，1.1当量)并将该白色悬浮液搅拌直至浴温为-5℃。在一个单独的烧杯中将间-酪氨酸甲基酯盐酸盐(6.5g，26.5mmol，1.1当量)溶于DMF(30mL)中并用4-甲基吗啉(2.64g，26.0mmol，1.1当量)处理，在室温下搅拌15分钟。将该混合物加入到所述反应物中，同时伴有CO₂放出。将该反应混合物在室温下搅拌1小时并用1M HCl水溶液(100mL)稀释。用乙酸乙酯(3x200mL)萃取含水层并用1M HCl(1x100mL)、NaOH水溶液(1x100mL)、盐水(1x100mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，EtOAc/己烷3/7)纯化，得到5.3g(53％)偶合化合物1f，为无色泡沫。

步骤C：

将1f(10g，23.04mmol)的溶液溶于HCl(在二噁烷中的4M溶液，100mL)中并在室温下搅拌2-4小时。将反应混合物在真空中浓缩并将固体重悬浮在乙醚中。将其过滤并将固体用乙醚洗涤，干燥得到无色固体1g(8.2g，96％)¹H NMR(d₄-CD₃OD，400MHz，δ，ppm)7.09(t，1H，J＝8.0Hz)，6.71-6.36(m，3H)，4.69(dd，1H，J＝6.0Hz，3.2Hz)，3.69(s，3H)，3.66(d，1H，J＝5.2Hz)，3.15-3.10(dd，1H，J＝5.6Hz，4.0Hz)，1.87-1.69(m，6H)，1.32-1.10(m，5H)。

步骤D：

将六氟·磷酸(η-茂)·[η⁶-(4-氯代苯基)]合钌基丙酸(cyclopentadiene-η⁶-4-chlorophenylpropionic acid-ruthenium hexanesafluorophosphate)1c(2.0g，4.0mmol)的DMF(20mL)溶液用HOBt(810mg，6.0mmol，1.5当量)和Hünigs base(2.6g，16.0mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl·HCl(888mg，5.0mmol，1.25当量)处理。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟并将胺盐1g(1.48g，4.0mmol)加入到该混合物中，在室温下搅拌12小时。将所述反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(200mL)稀释残余物，萃取进CH₂Cl₂(3x100mL)中。将合并的有机层用HCl水溶液(1x100mL)、NaHCO₃(1x100mL)、盐水(1x100mL)萃取并干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，并且棕色固体1h没有进行任何进一步纯化而用于环化作用。

步骤E：

将(η-茂)·[η⁶-(4-氯代苯基)]合钌基丙酸(cyclopentadiene-η⁶-ruthenium-4-chlorophenylpropionic acid)-环己基甘氨酸-间酪氨酸-OCH₃1h(1.47g，粗制)在无水DMF(150mL)中的溶液用Cs₂CO₃(2.40g，7.37mmol，5.0当量)处理并通过将干N₂通入所述反应混合物中鼓泡进行脱气。将该反应混合物在室温下搅拌16小时并蒸馏除去过量的DMF。将残余物溶于H₂O(200mL)并用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。用盐水(100mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，所述残余物没有进一步纯化而用于钌的光解解络。

将粗制钌络合物溶于乙腈(35mL)中，脱气并在Raynot(λ＝350nM)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷7∶3)纯化，得到360mg(52％)无色固体1i。

步骤F：

将二苯基醚1i(300mg，0.65mmol)在CH₃OH(10mL)、CH₂Cl₂(20mL)和H₂O(5mL)中的溶液用LiOH·H₂O(90mg，2.2mmol，3.4当量)处理并在室温下搅拌2小时。将该反应混合物用HCl水溶液(6M)酸化并萃取到CH₂Cl₂(3x30mL)中。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩得到无色酸1j(200mg，66％)。

步骤G：

将酸1j(100mg，0.22mmol)在无水DMF(2.5mL)中的溶液用HOOBt(45mg，0.33mmol)和Hünigs base(141mg，1.1mmol，5.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.5当量)处理，搅拌20分钟。将反应混合物用胺B(118mg，0.27mmol，1.22当量)处理并在室温下搅拌12小时。在真空中浓缩该反应混合物并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x50mL)和EtOAc(3x50mL)萃取含水层。用HCl水溶液(2M)、NaOH水溶液(2M)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩得到无色固体1k(79mg)，其用于氧化。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：826[(M+1)⁺，100]，494(20)，94(30)。

步骤H：

将羟基酰胺1k(130mg，0.16mmol)的DMF(2.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(130mg，0.32mmol，2.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并将该混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂：1∶49)纯化，得到氧化的产物1(55mg，42％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：858[(M+CH₃OH+1)⁺，100]，824[(M+1)⁺，63]。

实施例2：式2化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯1(50.0mg，60.0μmol)的溶液用TFA/CH₂Cl₂(1∶1，4mL)处理并在室温下搅拌2小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。脱保护完成后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(4.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体2(49mg，100％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：768[(M+1)⁺，100]。

实施例3：式3化合物的制备：

步骤A：

将酸1j(100mg，0.22mmol)在无水DMF(2.5mL)中的溶液用HOOBt(45mg，0.33mmol)和Hünigs base(141mg，1.1mmol，5.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.5当量)处理，搅拌20分钟。将反应混合物用胺E(79mg，0.27mmol，1.22当量)处理并在室温下搅拌12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取含水层。用HCl水溶液(1M，30mL)、NaOH水溶液(1M，30mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，得到无色固体3a(58mg)，其用于氧化。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：693[(M+1)⁺，100]，637(41)，494(55)，394(51)，338(13)。

步骤B：

将醇3a(95mg，0.14mmol)的CH₂Cl₂(2.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(116mg，0.28mmol，2.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并将该混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶32)纯化，得到氧化的产物3(47mg，42％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：691(M+1)⁺。

实施例4：式4化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯3(47.0mg，68.0μmol)的溶液用HCl(4M二噁烷，5mL)处理并在室温下搅拌25小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。脱保护完成后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(5.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体4(43mg，100％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：635[(M+1)⁺，100]，465(62)，336(62)。

实施例5：式5化合物的制备：

步骤A：

将4-氯代丁酸5a(3.0g，15.10mmol)的二氯乙烷(200mL)溶液用CpRu(CH₃CN)₃PF₆ 1b(6.6g，15.10mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2.5小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤。在真空中浓缩滤液并溶于CH₃CN(10mL)中，用大量过量的Et₂O处理。经滗析乙醚将分离出的树胶状物分离并将残余物溶于CH₂Cl₂/CH₃OH(1∶1，100mL)中，在真空中浓缩得到5b，为可以固化的棕色树胶状物(3.5g，46％)。

步骤B：

将羧酸5b(3.12g，5.95mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液用Hünigs base(3.07g，24.0mmol，4.0当量，4.4mL)和HOBt(1.2g，8.93mmol，1.5当量)处理。将反应混合物冷却至0℃并用EDCl(1.35g，7.43mmol，1.25当量)处理，搅拌1小时。向所述反应混合物中加入胺盐酸盐1g(2.65g，7.14mmol，1.2当量)并将反应混合物在室温下搅拌12小时。蒸馏出DMF并将残余物用水稀释，用CH₂Cl₂萃取含水层。用NaHCO₃水溶液、HCl水溶液、盐水萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，将没有进一步纯化的粗制产物5c(4.3g)用于环化作用。¹H NMR(d₄-CD₃OD，400MHz，δ，ppm)7.35(t，1H)，6.72-6.60(m，5H)，6.33-6.20(dd，2H)，5.51(s，5H)，4.19(d，1H)，3.68(s，3H)，3.19-2.83(m，2H)，2.51-2.40(m，2H)，2.40-2.25(m，2H)，1.99-1.59(m，8H)，1.35-0.98(m，5H)；MS：(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：695.3([M-PF₆]⁺，100)，232(20)，171(30)；HRMS对于C₃₄H₄₂N₂O₅ClRu⁺(M-PF₆)⁺的计算值695.1832；实测值695.1845。

步骤C：

将氯代化合物5c(3.0g，3.6mmol)在无水DMF(300mL)中的溶液用干燥N₂和Cs₂CO₃(5.2g，16mmol，4.0当量)脱气并在室温下搅拌16小时。馏出溶剂DMF并将残余物用水稀释，用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤，在真空中浓缩并在真空下干燥过夜。它没有进一步纯化而用于光解除去Ru。MS FAB(NBA-G/TG-DMSO 695)([M-PF6]⁺，100)。

将来自上述步骤的环化化合物溶于CH₃CN(35mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到褐色固体5d(600mg，34％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz，δ，ppm)7.58(d，1H，J＝7.6Hz)，7.14(t，1H，J＝8.0Hz)，6.94(d，2H，J＝8.4Hz)，6.87(dd，1H，J＝2.4，5.6Hz)，6.73(d，1H，J＝7.2Hz)，6.59(s，1H)，6.57(s，2H)，6.39(d，1H，J＝8.0Hz)，4.51(dt，1H，J＝2.8，8.0Hz)，3.80-3.62(m，1H)，3.62(s，3H)，3.05-3.00(dd，1H，J＝2.8，11.6Hz)，2.85(dd，1H，J＝8.4，6.0Hz)，2.76-2.72(m，1H)，2.36-2.19(m，3H)，2.02(dd，1H，J＝6.4，9.2Hz)，1.8-1.73(m，1H)，1.61-1.34(m，7H)，1.41-0.71(m，7H)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：493[(M+1)⁺，100]，465(20)，232(30)，171(40)；HRMS对于C₂₉H₃₇N₂O₅(M+1)⁺的计算值：493.2702；实测值493.2699。

步骤D：

将醚5d(200mg，0.42mmol)在CH₃OH(5mL)、CH₂Cl₂(10mL)和H₂O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H₂O(18mg，0.44mmol，1.1当量)处理并在室温下搅拌12小时。将该反应混合物用HCl水溶液(12N，1mL)酸化并在真空中浓缩，得到酸5e，其没有进一步纯化直接用于偶合作用。

步骤E：

将酸5e的无水DMF(5.0mL)溶液用HOOBt(103mg，0.63mmol，1.5当量)、Hünigs base(216mg，1.68mmol，4.0当量)和胺B(270mg，0.63mmol，1.47当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(101mg，0.52mmol，1.25当量)处理，在室温下搅拌12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。将含水层用CH₂Cl₂(3x50mL)和EtOAc(3x50mL)萃取。用HCl水溶液(2M)、NaOH水溶液(2M)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩得到无色固体5f(177mg)，其用于氧化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：840[(M+1)⁺，100]，394(100)。

步骤F：

将醇5f(177mg，0.21mmol)的CH₂Cl₂(10.0mL)溶液用Dess-Marin试剂(178mg，0.42mmol，2.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌3小时并将该混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶49)纯化，得到氧化的产物5(23mg，13％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：870[(M+CH₃OH+1)⁺，50]，838[(M+1)⁺，100]。

实施例6：式6化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯5(50.0mg，60.0μmol)的溶液用TFA/CH₂Cl₂(1∶1，4mL)处理并在室温下搅拌7小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。完成脱保护后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷(4.0mL)反复处理并浓缩，得到白色固体6(14mg，100％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：782[(M+1)⁺，100]。

实施例7：式7化合物的制备：

步骤A：

将醇7a(9.2g，54.1mmol)的无水CH₂Cl₂(200mL)溶液用DMSO(35mL)和Et₃N(16.4g，16.3mmol，23.4mL)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用溶于DMSO(30mL)中的Py·SO₃(12.9g，81.2mmol，1.50当量)处理。将该反应混合物在0℃下搅拌0.5小时并在室温下搅拌6小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用Et₂O(100mL)和H₂O(200mL)稀释。分离各层并用Et₂O(3x100mL)萃取含水层。用HCl(2M，3x100mL)、盐水(1x100mL)萃取合并的有机层，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶7)纯化，得到醛7b，其放置后固化为蜡状固体(7.1g，77％)。对于C₉H₉ClO的CHN计算值：C＝64.11％，H＝5.38％；实测值：C＝64.08％，H＝5.30％。

步骤B：

在0℃下，将thiethylphosponoacetate(6.72g，30mmol，1.2当量)的无水THF(100mL)溶液用NaH(60％分散体，1.5g，35mmol，1.4当量)处理。将该反应混合物在25℃下搅拌1小时直至不再放出H₂。加入醛7b(4.2g，25.0mmol)的无水THF(5.0mL)溶液并将该反应混合物搅拌36小时。将反应混合物用H₂O(100mL)稀释并用Et₂O(3x70mL)萃取。干燥(MgSO₄)合并的有机层，过滤，在真空中浓缩并层析，得到α，β-不饱和酯7c(4.2g，71％)，其用于还原作用。

步骤C：

将α，β-不饱和酯7c(4.2g，8.0mmol)的EtOAc(50mL)溶液用Pd/C(10％w/w，500mg)处理并在50psi下氢化12小时。将该反应混合物通过硅藻土塞子过滤并在真空中浓缩滤液，得到还原的化合物7d(3.9g，93％)。

步骤D：

将所述酯7d(3.9g，16.2mmol)的CH₃OH/THF/H₂O(1∶1∶0.1，110mL)溶液用LiOH·H₂O(1.2g，30mmol，2.0当量)处理并在室温下搅拌5小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用H₂O(100mL)稀释，萃取进Et₂O(3x50mL)中。将含水层酸化至pH～1(13M HCl)并用Et₂O(3x100mL)萃取混浊的含水层。干燥(MgSO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩，得到无色固体7e(3.1g，96％)。对于C₁₁H₁₃C1O₂的CHN计算值：C＝62.12％，H＝6.16％；实测值：C＝62.27％，H＝6.23％。

步骤E：

将4-氯代苯基戊酸7e(3.0g，14.15mmol)的二氯乙烷(150mL)溶液用CpRu(CH₃CN)₃PF₆1b(6.75g，15.10mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2.5小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤。在真空中浓缩滤液并溶于CH₃CN(20mL)中，用大量过量的Et₂O处理。经滗析乙醚将分离出的树胶状物分离并将残余物溶于CH₂Cl₂/CH₃OH(1∶1，100mL)中，在真空中浓缩得到7f，为棕色树胶状物，其可以固化(4.36g，58％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：379[(M-PF₆)⁺，100]。

步骤F：

将羧酸7f(3.12g，5.95mmol)的无水DMF(20mL)溶液用Hünigsbase(3.07g，24.0mmol，4.0当量，4.4mL)和HOBt(1.2g，8.93mmol，1.5当量)处理。将反应混合物冷却至0℃并用EDCl(1.35g，7.43mmol，1.25当量)处理并搅拌1小时。向所述反应混合物中加入胺盐酸盐1g(2.65g，7.14mmol，1.2当量)并将反应混合物在室温下搅拌12小时。蒸馏出DMF并将残余物用水稀释，用CH₂Cl₂萃取含水层。用NaHCO₃水溶液、HCl水溶液、盐水萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，所述粗制产物7g(4.3g)没有纯化用于进一步的环化作用。¹H NMR(d₄-CD₃OD，400MHz，δ，ppm)7.35(t，1H)，6.72-6.60(m，5H)，6.33-6.20(dd，2H)，5.51(s，5H)，4.19(d，1H)，3.68(s，3H)，3.19-2.83(m，2H)，2.51-2.40(m，2H)，2.40-2.25(m，2H)，1.99-1.59(m，8H)，1.35-0.98(m，5H)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：695.3([M-PF₆]⁺，100)，232(20)，171(30)；HRMS对于C₃₄H₄₂N₂O₅ClRu⁺(M-PF₆)的计算值695.1832；实测值695.1845。

步骤G：

用干燥N₂和Cs₂CO₃(5.2g，16mmol，4.0当量)将氯代化合物7g(3.0g，3.6mmol)的无水DMF(300mL)溶液脱气并在室温下搅拌16小时。馏出溶剂DMF并将残余物用水稀释，用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤，在真空中浓缩并在真空中干燥过夜。它没有进一步纯化而用于光解除去Ru。MS FAB(NBA-G/TG-DMSO)695[(M-PF6)⁺，100]。

将来自上述步骤的环化化合物溶于CH₃CN(35mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到褐色固体7h(600mg，34％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz，δ，ppm)7.58(d，1H，J＝7.6Hz)，7.14(t，1H，J＝8.0Hz)，6.94(d，2H，J＝8.4Hz)，6.87(dd，1H，J＝2.4，5.6Hz)，6.73(d，1H，J＝7.2Hz)，6.59(s，1H)，6.57(s，2H)，6.39(d，1H，J＝8.0Hz)，4.51(dt，1H，J＝2.8，8.0Hz)，3.80-3.62(m，1H)，3.62(s，3H)，3.05-3.00(dd，1H，J＝2.8，11.6Hz)，2.85(dd，1H，J＝8.4，6.0Hz)，2.76-2.72(m，1H)，2.36-2.19(m，3H)，2.02(dd，1H，J＝6.4，9.2Hz)，1.8-1.73(m，1H)，1.61-1.34(m，7H)，1.41-0.71(m，7H)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：493[(M+1)⁺，100]，465(20)，232(30)，171(40)；HRMS对于C₂₉H₃₇N₂O₅(M+1)⁺的计算值：493.2702；实测值：493.2699。

步骤H：

将醚7h(220mg，0.46mmol)在CH₃OH(3.0mL)、CH₂Cl₂(10mL)和H₂O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H₂O(18mg，0.44mmol，1.1当量)处理并在室温下搅拌12小时。将该反应混合物用HCl水溶液(13M，1mL)酸化并在真空中浓缩，得到酸7i，其没有进一步纯化直接用于偶合作用。

步骤I：

将酸7i的无水DMF(3.0mL)溶液用HOOBt(94mg，0.75mmol，1.6当量)、Hünigs base(237mg，1.84mmol，4.0当量)和胺B(246mg，0.58mmol，1.47当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(110mg，0.58mmol，1.25当量)处理，在0℃下搅拌25分钟、12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取合并的含水层。用HCl水溶液(1M，60mL)、NaOH水溶液(60mL)萃取有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩得到无色固体7j(230mg)，其用于氧化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：854[(M+1)⁺，100]，479(70)，327(50)，271.1(100)。

步骤J：

将醇7j(220mg，0.26mmol)的CH₂Cl₂(3.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(218mg，0.51mmol，2.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌并将该混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂1∶24)纯化，得到氧化产物7(23mg，13％)，为无色固体。MS：(FAB，m/z相对强度)：852[(M+1)⁺，43]，796(100)，768(20)，461(20)，433(50)，405(50)，336(30)，294(50)。

实施例8：式8化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯7(32.0mg，37.0μmol)的溶液用TFA/CH₂Cl₂(1∶1，5.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。完成脱保护后将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用庚烷/CH₃OH(4.0mL)反复处理并浓缩，得到褐色固体8(29.0mg，100％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：796[(M+1)⁺，100]。

实施例9：式9化合物的制备：

步骤A：

将Boc-甘氨酸9a(1.75g，10.0mmol)的无水DMF(50mL)溶液用HOOBt(2.65g，15mmol，1.5当量)和EDCl(2.86g，15.0mmol，1.5当量)处理。将该反应混合物用Hünigs base(5.16g，40mmol，4.0当量，7.3mL)处理。将该反应混合物搅拌1小时并加入间酪氨酸-OCH₃·HCl 1e(2.5g，11.5mmol，1.1当量)，在25℃下搅拌12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用NaHCO₃水溶液稀释，萃取到CH₂Cl₂中。浓缩合并的有机层并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到无色固体9b(3.4g，90％)。

步骤B：

将9b(4.6g，13.06mmol)的HCl(在二噁烷中的4M溶液，50mL)溶液在室温下搅拌3小时。将反应混合物在真空中浓缩并将残余物在高真空中干燥，得到为细粉末的9c，其用于下一步骤中。¹H NMR(CD₃OD，400MHz，δ，ppm)8.67(d，1H，J＝7.9Hz)，7.10-7.07(m，1H)，6.68-6.64(m，2H)，4.75-4.70(m，1H)，3.75-3.61(m，2H)，3.66(s，3H)，3.10(dd，1H，J＝5.2，8.5Hz)，2.90(dd，1H，J＝8.8Hz，5.0Hz)。

步骤C：

将[CpRu(η⁶-4-氯代苯基丙酸)]PF₆ 1c(3.0g，46.01mmol)的无水DMF(60mL)溶液用HOBt(1.3g，9.16mmol，1.5当量)和Hünigs base(3.22g，4.60mL，25.0mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(1.75g，9.16mmol，1.5当量)处理。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟并加入甘氨酸铵盐9c(1.75g，6.06mmol，1.0当量)。将该反应混合物在室温下搅拌12并在真空中蒸馏出DMF。将残余物用HCl水溶液(1M，100mL)稀释并萃取入CH₂Cl₂(3x100mL)。将合并的有机层用NaHCO₃水溶液(1x100mL)、盐水(50mL)萃取，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，得到棕色固体9d(1.5g，34％)，其用于环化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：585[(M-PF₆)⁺，100]，459(30)，373(30)，198(20)。

步骤D：

在室温下用干燥N₂将钌络合物9d(1.5g，2.05mmol)的无水DMF(100mL)溶液脱气并加入Cs₂CO₃(5.0g，15mmol，7.5当量)，在室温下搅拌12小时。蒸馏除去溶剂DMF并将残余物用水(100mL)稀释，用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。用盐水(100mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩并在真空中干燥过夜。它没有进一步纯化而用于光解除去Ru。

将来自上述步骤的环化化合物溶于CH₃CN(30mL)中并过滤到石英管中。将该溶液脱气并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc)纯化，得到褐色固体9e(230mg，30％)。¹H NMR(CDCl₃，400MHz，δ，ppm)7.23-7.18(m，2H)，7.09-7.01(m，3H)，6.76(dd，1H，J＝2.4，8.8Hz)，6.66(d，1H，J＝7.6Hz)，6.47(d，1H，J＝5.6Hz)，6.17(s，1H)，5.64(s，1H)，4.69(q，1H，J＝4.4Hz)，3.77(s，3H)，3.68-3.51(m，2H)，3.35(dd，1H，J＝4.0，10.8Hz)，3.05(dd，1H，J＝5.2，9.2Hz)，2.96-2.92(m，2H)，2.61-2.56(m，1H)，2.30-2.29(m，1H)；¹³C NMR：(CDCl₃，100MHz，δppm)172.3，171.4，168.1，159.9，155.4，137.6，136.4，131.0，130.0，129.5，123.3，122.4，121.0，117.7，117.1，53.6，53.0，43.6，39.9，36.1，32.3。MS(电喷雾，m/z相对强度)：383[(M+1)⁺，100]，279(20)。

步骤E：

在室温下将环状化合物9e(150mg，0.4mmol)在THF(4.0mL)、H₂O(4.0mL)中的溶液与LiOH·H₂O(41.0mg，1.0mmol，2.5当量)一起搅拌3小时。将该反应混合物用浓HCl(2.0mL)酸化并在真空中浓缩。在真空中干燥固体9f并且没有进一步纯化而将其用于进一步的偶合作用。

步骤F：

将水解的酸9f在无水DMF(4.0mL)和CH₂Cl₂(4.0mL)中的溶液用HOOBt(103mg，0.58mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigsbase(206mg，1.60mmol，4.0当量，295μL)。向该混合物中加入EDCl(112mg，0.58mmol，1.5当量)并将该反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，用胺盐酸盐B(206mg，0.48mmol，1.2当量)处理。将该反应混合物贮存在冰箱中48小时并在真空中浓缩除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用HCl水溶液(2M)稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。将合并的有机层用HCl水溶液(1M，3x50mL)、NaOH水溶液(2M)、盐水(100mL)萃取，干燥(Na₂SO₄)并在真空中浓缩。不经进一步纯化而将残余物9g(200mg)氧化。

步骤G：

将醇9g(200mg，0.27mmol)的CH₂Cl₂(3.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(342mg，0.81mmol，3.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌3小时并用NaHCO₃水溶液和Na₂S₂O₃水溶液稀释。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟并将该反应混合物用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取。用盐水(50mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩，将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH(2M NH₃)/CH₂Cl₂ 1∶19)纯化，得到酮酰胺9(100mg，50％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：742([M+1]⁺，100)，686(80)。

实施例10：式I0化合物的制备

步骤A：

将叔丁基酯9(100mg，0.13mmol)的无水CH₂Cl₂(4.0mL)溶液用TFA(4.0mL)处理并在室温下搅拌5小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶解于甲苯/CH₂Cl₂中并在真空中浓缩数次，得到细的无色固体10。MS：(FAB，NBA/DMSO，m/z相对强度)：686[(M+1)⁺，40]，460(20)，307(100)，289(60)；HRMS对于C₃₆H₄₀N₅O₉(M+1)⁺的计算值：686.2825；实测值：686.2840。

实施例11：式11化合物的制备

步骤A：

在-20℃下，向胺盐酸盐1g(1.20g，3.23mmol)、6-庚烯酸(0.610g，4.68mmol)、HOOBt(0.765g，4.69mmol)和EDCl(1.07g，5.58mmol)在无水DMF(50mL)和CH₂Cl₂(50mL)中的溶液中加入NMM(1.55mL，14.1mmol)。在此温度下搅拌30分钟后，将该反应混合物保存在冰箱中18小时。然后将其温热至室温。加入EtOAc(150mL)、盐水(50mL)和5％H₃PO₄(50mL)。分层后，将该有机溶液用5％H₃PO₄(80mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(2x 80mL)、水(80mL)和盐水(80mL)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。快速层析(2-5％MeOH-CH₂Cl₂)，得到11a(1.46g，3.28mmol，定量)，为白色固体。¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ9.25(s，1H)，8.31(d，J＝7.2Hz，1H)，7.70(d，J＝9.2Hz，1H)，7.05-7.01(m，1H)，6.62-6.58(m，3H)，5.82-5.72(m，1H)，5.02-4.91(m，1H)，4.43-4.38(m，1H)，4.23-4.19(m，1H)，3.55(s，3H)，2.93-2.80(m，2H)，2.51-1.97(m，2H)，1.66-0.86(m，15H)；¹³C NMR：(d₆-DMSO，125MHz)，δ171.9，171.8，171.1，157.2，138.6，138.4，129.1，119.5，115.8，114.6，113.5，56.5，53.5，51.6，36.5，34.8，32.8，29.0，28.0，27.8，25.8，25.5，24.8；HRMS，m/z 445.2683(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：445.2702，误差：4ppm)。

步骤B：

在氮气氛、0℃下，小心地向11a(1.46g，3.28mmol)的无水THF(60mL)溶液中加入硼烷-THF溶液(12mL，1.0M，12mmol)。将得到的溶液在0℃、氮气氛下搅拌1小时40分钟。然后加入乙醇(4mL)和pH 7缓冲液(8mL)，随后加入30％H₂O₂水溶液(7.5mL)。在0℃下搅拌20分钟后，将其加温至室温并搅拌2小时。加入EtOAc(200mL)和盐水(100mL)并分离各层。用EtOAc(2x150mL)萃取含水溶液。用硫酸镁干燥合并的有机溶液，过滤并在真空中浓缩。快速层析(2-5％MeOH-CH₂Cl₂)，得到11b(1.05g，2.18mmol，68％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz，d₆-DMSO)δ9.25(s，1H)，8.30(d，J＝7.2Hz，1H)，7.68(d，J＝9.2Hz，1H)，7.05-7.01(m，1H)，6.62-6.58(m，3H)，4.43-4.18(m，3H)，3.55(s，3H)，3.37-3.33(m，2H)，2.93-2.80(m，2H)，2.20-2.03(m，2H)，1.66-0.87(m，19H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，125MHz)，d 172.1，171.8，171.2，157.2，138.4，129.1，119.5，115.8，113.5，60.7，56.5，53.5，51.7，36.5，35.1，32.6，32.4，29.0，28.5，28.0，25.8，25.6，25.4，25.2；HRMS，m/z463.2813(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：463.2808，误差：1ppm)。

步骤C：

在0℃向酚醇11b(1.00g，2.16mmol)和三正丁基膦(1.10mL，4.28mmol)在无水CH₂Cl₂(100mL)和THF(40mL)中的溶液中加入ADDP(1.08g，4.28mmol)。在0℃下搅拌1小时后，将该溶液加温至室温并在氮气氛下搅拌3小时。TLC指示原料完全消耗。在真空中除去溶剂后，将残余物经快速层析(0-3％MeOH的CH₂Cl₂溶液)部分纯化，得到大环化合物11c(650mg，1.46mmol，68％)。¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ8.58(d，J＝8.3Hz，1H)，7.76(d，J＝9.2Hz，1H)，7.18-7.14(m，1H)，6.76-6.65(m，3H)，4.77-4.71(m，1H)，4.32(t，J＝8.5Hz，1H)，3.97-3.93(m，1H)，3.82-3.78(m，1H)，3.67(s，3H)，3.18-3.14(m，1H)，2.98-2.92(m，2H)，2.32-2.25(m，1H)，2.02-2.01(m，1H)，1.99-0.87(m，19H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，125MHz)，δ172.1，171.6，171.4，160.1，158.8，139.0，129.1，121.1，113.0，111.9，66.4，56.1，52.0，50.1，40.6，34.9，34.2，28.7，28.3，26.8，26.3，25.9，25.5，25.2，24.2；HRMS，m/z 445.2685(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：445.2702，误差：4ppm)。

步骤D：

在室温下，将氢氧化锂水溶液(70mg，15mL H₂O，2.92mmol)加入到甲基酯11c(330mg，0.742mmol)在THF(20mL)和乙醇(10mL)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌3小时。由TLC监测该反应过程。将该溶液在真空中浓缩后，加入EtOAc(100mL)、6N HCl溶液(10mL)和水(50mL)并分离各层。用EtOAc(2x80mL)萃取含水溶液。合并有机溶液、经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩，得到11d(260mg，0.604mmol，81％)，为白色固体。¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ8.43(d，J＝8.3Hz，1H)，7.73(d，J＝9.3Hz，1H)，7.17-7.13(m，1H)，6.77-6.66(m，3H)，4.67-4.62(m，1H)，4.32-4.28(m，1H)，3.98-3.93(m，1H)，3.81-3.75(m，1H)，3.17-3.13(m，1H)，2.97-2.90(m，1H)，2.32-2.26(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.67-0.85(m，19H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，125MHz)，δ173.2，171.6，171.3，158.8，139.3，129.0，121.1，113.1，111.9，66.4，56.1，50.8，35.1，34.3，28.8，28.3，26.9，26.3，25.9，25.6，25.5，25.2，24.2；HRMS，m/z 431.2564(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：431.2546，误差：4ppm)。

步骤E：

在-20℃下，向酸11d(0.140g，0.325mmol)、胺B(0.140g，0.325mmol)、HOOBt(56mg，0.343mmol)和EDCl(75mg，0.391mmol)在无水DMF(40mL)和CH₂Cl₂(20mL)中的溶液中加入NMM(0.107mL，0.973mmol)。在此温度下搅拌30分钟后，将该反应混合物保存在冰箱中18小时。然后加入EtOAc、盐水和5％H₃PO₄。用5％H₃PO₄、饱和碳酸氢钠水溶液、水和盐水顺序洗涤分离的有机溶液，经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。快速层析(2-5％MeOH-CH₂Cl₂)得到11e，为非对映异构体的混合物(0.170g，0.211mmol，65％)，为白色固体，其没有进一步纯化而用于下一步反应中。

步骤F：

在室温下，向羟基酰胺11e(0.29g，0.36mmol)和Dess-Martin试剂(0.45g，1.06mmol)的混合物中加入无水CH₂Cl₂(60mL)、DMF(3mL)和DMSO(3mL)。将得到的溶液在室温下剧烈搅拌2.5小时。加入多量的Dess-Martin试剂(300mg，0.71mmol)并将该反应混合物再搅拌1小时。加入饱和碳酸氢钠水溶液和亚硫酸氢钠溶液(各40mL)并将该混合物剧烈搅拌10分钟，然后加入EtOAc(200mL)和水(30mL)并分离各层。用5％H₃PO₄溶液(2x100mL)和饱和NaHCO₃溶液(100mL)洗涤有机溶液，经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。快速层析(1-5％MeOH-CH₂Cl₂)得到11(100mg，0.124mmol，35％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz，d₆-DMSO)δ8.79-8.69(m，2H)，8.36-8.16(m，2H)，7.72-7.68(m，1H)，7.42-7.33(m，5H)，7.17-7.13(m，1H)，6.77-6.63(m，3H)，5.30-5.27(m，1H)，5.09-5.04(m，1H)，4.85-4.76(m，1H)，4.29-4.25(m，1H)，3.98-3.74(m，1H)，3.02-2.85(m，2H)，2.32-2.27(m，1H)，2.04-1.96(m，1H)，1.72-0.81(m，35H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，125MHz)，δ196.5，196.2，171.65，171.61，171.5，171.14，171.07，169.4，167.6，160.7，158.84，158.79，139.5，139.3，136.6，136.5，128.92，128.90，128.7，128.6，128.1，127.7，127.4，124.9，121.34，121.28，113.1，112.9，112.0，111.9，81.3，66.34，66.30，56.92，56.87，56.3，56.2，53.4，53.3，51.5，50.9，41.5，41.4，40.8，40.7，36.6，36.1，34.4，34.3，31.8，31.6，30.4，29.1，28.9，28.4，28.3，27.5，26.8，26.21，26.17，25.9，25.59，25.55，25.0，24.2，18.74，18.66，13.5，13.4；HRMS，m/z 804.4542(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：804.4548，误差：1ppm)。

实施例12：式12化合物的制备

步骤A：

将叔丁基酯11(56.8mg，0.0706mmol)在三氟乙酸(15mL)和CH₂Cl₂(15mL)中的溶液在室温下搅拌4小时。在真空中除去挥发性物后，将残余物溶于50％MeOH-CH₂Cl₂(3mL)中并在真空中浓缩至干燥，得到灰白色固体12(50mg，0.0669mmol，95％)。¹H NMR(400MHz，d₆-DMSO)δ8.75-8.71(m，2H)，8.36-8.16(m，2H)，7.72-7.69(m，1H)，7.39-7.31(m，5H)，7.17-7.13(m，1H)，6.76-6.63(m，3H)，5.37-5.35(m，1H)，5.07-5.04(m，1H)，4.85-4.76(m，1H)，4.29-4.25(m，1H)，3.97-3.74(m，4H)，3.02-2.86(m，2H)，2.32-2.26(m，1H)，2.01-1.97(m，1H)，1.70-0.82(m，26H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，125MHz)，δ196.5，196.2，171.63，171.59，171.52，171.48，171.1，171.06，167.4，160.6，158.82，158.78，153.4，139.4，137.1，137.0，128.91，128.88，128.7，128.65，128.61，128.5，128.43，128.39，128.33，128.32，128.14，128.12，128.0，127.7，128.7，127.63，127.59，127.5，127.4，126.8，121.3，115.9，113.1，112.9，112.8，112.0，111.9，111.88，66.33，66.29，56.3，56.2，56.17，53.34，53.31，53.27，51.1，50.9，41.5，40.84，40.77，40.7，40.6，40.56，40.53，40.5，38.7，38.6，38.56，38.53，36.6，36.1，34.4，34.3，31.8，31.6，29.4，29.1，29.0，e28.9，28.4，28.3，28.2，26.9，26.8，26.79，26.20，26.16，25.88，25.86，25.79，25.75，25.71，25.66，25.57，25.54，25.4，25.0，24.2，18.7，18.6，13.5，13.4；HRMS，m/z 748.3947(对于C₂₅H₃₆N₂O₅的计算值：748.3922，误差：3ppm)。

实施例13：式13化合物的制备

步骤A：

除了用6-羟基己酸代替6-庚烯酸(39％)外，根据实施例11、步骤 A的方法制备所需的化合物13a。

步骤B：

根据实施例11、步骤C的方法由13a制备所需的化合物13b，产率74％。

步骤C：

根据实施例11、步骤D的方法，由相应的甲基酯13b制备所需的大环酸13c，产率88％，为白色固体。

步骤D：

根据实施例11、步骤E的方法，由13c和B制备所需的化合物13d，产率48％。

步骤E：

根据实施例11、步骤F的方法，由13d制备所需的化合物13，产率70％。

实施例14：式14化合物的制备

步骤A：

根据实施例12、步骤A的方法，以定量的产率由13制备所需的化合物14。

实施例15：式15化合物的制备

步骤A：

将3-碘代-苯基丙氨酸(analine)15a(2.50g，8.59mmol)和浓盐酸(2mL，24mmol)的甲醇溶液加热至回流18小时。在真空中除去溶剂，得到白色固体15b，其没有进一步纯化而用于步骤B中。

步骤B：

根据实施例11、步骤A的方法，由15b制备所需的化合物15c，产率84％。其没有进一步纯化而用于下一反应中。

步骤C：

根据实施例11、步骤A的方法，由15c制备所需的化合物15d(定量)。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤D：

根据实施例11、步骤A的方法，由15d制备所需的化合物15e，产率68％。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤E：

将装在厚壁管中的15e(1.16g，2.04mmol)、三乙胺(2.90mL，20.6mmol)在无水乙腈(25mL)和DMF(20mL)中的溶液经氩气起泡5分钟。在室温下向该溶液中快速加入四(三苯膦)钯(0)(235mg，0.203mmol)。将该管用Teflon螺旋盖密封并在油浴中加热至85-90℃。搅拌3小时后，将其冷却至室温，小心打开并倒在EtOAc(100mL)上。将该溶液用5％H₃PO₄(4x50mL)和水(50mL)洗涤。经硫酸镁干燥有机层，过滤并在真空中浓缩。快速层析(1-4％MeOH-CH₂Cl₂)，得到大环化合物15f(330mg，0.749mmol，37％)。

步骤F：

根据实施例11、步骤D的方法，由15f定量制备所需的化合物15g。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤G：

根据实施例11、步骤F的方法，由15g制备所需的化合物15h，产率为77％。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤H：

根据实施例1、步骤H的方法，由15h制备所需的化合物15，产率为55％。

实施例16：式16化合物的制备

步骤A：

根据实施例12、步骤A的方法，由15定量制备所需的化合物16。

实施例17：式17化合物的制备

步骤A：

向15f(150mg，0.340mmol)在EtOH(10mL)和EtOAc(5mL)中的溶液中加入10％披钯碳(20mg)。将该悬浮液在氢气下搅拌8小时，在此期间用TLC监测反应过程。通过硅藻土垫过滤后，在真空中除去溶剂，得到产物，为白色固体17a(150mg，0.339mmol，定量)。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤B：

根据实施例11、步骤D的方法，由17a制备所需的化合物17b。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤C：

根据实施例11、步骤E的方法，由17b制备所需的化合物17c，产率为73％(步骤B和C)。其没有进一步纯化用于下一反应中。

步骤D：

根据实施例11、步骤F的方法，由17c制备所需的化合物17，产率为46％。

实施例18：式18化合物的制备

步骤A：

根据实施例12、步骤A的方法，由17定量制备所需的化合物18。

实施例19：式19化合物的制备

步骤A：

根据实施例11、步骤C的方法，由1g和19a制备所需的化合物19b，产率为64％。

步骤B：

根据实施例1、步骤C的方法，由19b制备所需的化合物19c。其没有进一步纯化而用于下一反应中。

步骤C：

在室温下，向二胺盐19c(75mg，1.52mmol)和羰基二咪唑(260mg，1.60mmol)在乙腈(400mL)中的悬浮液中加入三乙胺(0.26mL，1.85mmol)。将该混合物搅拌3天。在真空中除去溶剂。将残余物溶于EtOAc/THF(100/50mL)中并将该溶液用5％H₃PO₄洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并在真空中浓缩。快速层析(2-10％MeOH-CH₂Cl₂)，得到19d(290mg，0.651mmol，43％)，为白色固体。

步骤D：

根据实施例11、步骤D的方法，由19d制备所需的化合物19e，产率为97％。其没有进一步纯化而用于下一反应中。

步骤E：

根据实施例11、步骤E的方法，由19e和B制备所需的化合物19f，产率为66％。

步骤F：

根据实施例11、步骤F的方法，由19f制备所需的化合物19，产率为66％。将两种产物经快速层析(0-5％MeOH-CH₂Cl₂)部分分离。

实施例20：式20化合物的制备

步骤A：

根据实施例12、步骤A的方法，由19制备所需的化合物20。

实施例21：式21化合物的制备

步骤A：

将5-己烯-1-醇21a(10g，50mmol)的乙醚(100mL)溶液用三乙胺(10.1g，100mmol，2.0当量)处理并冷却至0℃。滴加入光气的苯溶液(20％，100mL，20g，200mmol，4.0当量)并将该反应混合物在室温下搅拌12小时。过滤分离出的三乙胺盐酸盐并在真空中浓缩滤液。残余物21b没有纯化直接用于进一步的研究。

步骤B：

将1f(8.0g，18.43mmol)的CH₂Cl₂(100mL)溶液用三乙胺(2.43g，24.0mmol，1.3当量)处理。将该反应混合物冷却至-78℃并滴加入氯甲酸烯丙基酯(2.9g，24mmol，1.3当量)。将该反应混合物在室温下搅拌12小时并将该反应混合物用H₂O(100mL)和HCl水溶液(2M，200mL)稀释。用EtOAc(3x200mL)萃取含水层。用盐水萃取合并的EtOAc层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，残余物21c直接用于Boc脱保护。¹H NMR(CHCl₃，300MHz，δ，ppm)7.29(t，1H，J＝6.0Hz)，7.06-6.98(m，3H)，6.41(d，1H，J＝5.4Hz)，6.05-5.95(m，1H)，5.42(dd，1H，J＝1.2，13.2)，5.31(dd，1H，J＝1.2，13.2)，5.10(d，1H，J＝6.6Hz)，4.91-4.87(q，1H)，4.74(d，1H，J＝4.5Hz)，3.95-3.92(m，1H)，3.70(s，3H)，3.12(d，1H，J＝4.2Hz)，1.81-1.51(m，6H)，1.43(s，9H)，1.21-0.91(m，6H)。

步骤C：

将21c(1.5g)的HCl(4M，在二噁烷中，100mL)溶液在室温下搅拌3小时。原料消失后进行TLC，并且一旦原料消失则将该反应混合物在真空中浓缩，将残余物21d在泵中干燥。其没有进一步纯化而用于偶合作用。

步骤D：

将胺盐酸盐21d(4.0g，8.9mmol)的CH₂Cl₂(50mL)溶液用三乙胺(2.73g，27mmol，3.0当量，3.8mL)处理并冷却至-78℃。滴加入氯甲酸酯21b(2.3g，13.3mmol，1.5当量)的CH₂Cl₂(30mL)溶液。将该反应混合物在室温下搅拌过夜并用HCl水溶液(1M，150mL)稀释。用EtOAc(3x100mL)萃取含水层。将合并的乙酸乙酯层用H₂O(100mL)、盐水(100mL)萃取，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷3∶7)纯化，得到21e，为无色固体(5g，80％)。

步骤E：

在0℃下，将alloc-保护的化合物21e(4.0g，7.2mmol)的无水THF(60.0mL)溶液用双甲酮(dimedione)(2.01g，14.4mmol，2.0当量)、Pd(PPh₃)₄(830mg，0.71mmol，10mol％)处理并在室温下搅拌1小时。将该反应混合物在真空中浓缩，将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷，3∶7)纯化，得到脱保护的醇21f，为无色固体(2.7g，79％)。¹H NMR(CDCl₃，300MHz，δppm)7.44(bs，1H)，7.09(s，1H，J＝6.0Hz)，6.75-6.72(m，2H)，6.58-6.48(m，2H)，5.81-5.71(m，1H)，5.55(d，1H，J＝7.2Hz)，4.98(ddd，1H，J＝1.5，1.2，9Hz)，4.92(dd，1H，J＝4.5，0.9Hz)，4.88-4.83(m，1H)，4.12-3.97(m，1H)，3.71(s，3H)，3.09-2.98(m，2H)，2.08-2.03(m，2H)，1.722-1.40(m，10H)，1.24-0.94(m，5H)；¹³C NMR(100MHz，δ)171.6，157.3，156.6，138.3，136.6，129.8，123.5，120.6，117.0，114.9，114.6，65.7，60.1，53.2，52.5，40.4，37.1，33.3，29.6，28.6，28.3，26.0，25.9，25.1；对于C₂₅H₃₆N₂O₆的CHN计算值：C＝65.20％，H＝7.88％，N＝6.08％；实测值：C＝64.90％，H＝7.98％，N＝6.01％。

步骤F：

将烯21f(650mg，1.4mmol)的无水THF(5.2mL)溶液冷却至0℃并用BH₃·THF(在THF中的1M溶液，4.2mL，4.2mmol，3.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并小心加入EtOH(2.0mL)，同时有氢气放出。在氢气完全放出后，将该反应混合物用pH 7缓冲液处理并在0℃下用H₂O₂水溶液(30％，5.0mL)处理。除去冰浴并将该混合物在室温下搅拌3-4小时。将该反应混合物用EtOAc(3x100mL)萃取。用H₂O、盐水萃取合并的有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷，3∶7)纯化，得到硼氢化的产物，为无色固体21g(400mg，60％)[α]_D 86.4(c 0.3CHCl₃，25℃)；¹HNMR(CDCl₃，400MHz，δ)7.26(s，1H)，7.08(t，1H，J＝5.7Hz)，6.83(d，1H，J＝6.0Hz)，6.71(dd，1H，J＝1.2，4.5Hz)，6.57(bs，1H)，6.54(d，1H，J＝5.7Hz)，5.68(d，1H，J＝6.9Hz)，4.85(dq，1H，J＝4.2，1.8Hz)，4.05-3.97(m，3H)，3.69(s，3H)，3.60(t，2H，J＝4.8Hz)，3.08-2.97(m，2H)，1.77-1.53(m，10H)，1.42，1.25(m，4H)，1.24-0.92(m，5H)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz，δ)171.8，171.8，157.6，156.9，136.9，130.0，120.8，117.0，114.8，65.7，62.7，60.3，53.3，52.7，40.5，37.4，32.5，29.7，29.0，28.8，26.2，26.0，25.6，25.4，MS(FAB，NBA/DMSO，m/z，相对强度)479([M+1]⁺，100)，296(40)，196(25)，156(25)，136(25)，112(20)。HRMS对于C₂₅H₃₉N₂O₇(M+1)⁺的计算值：479.2760；实测值：479.2757。

步骤G：

将PPh₃(385mg，1.47mmol，1.75当量)的CH₂Cl₂(10mL)溶液用化合物21g(400mg，0.84mmol)处理并冷却至0℃。滴加入DEAD(220mg，1.26mmol，1.5当量)的CH₂Cl₂(10mL)溶液并在室温下搅拌3小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶9)纯化，得到环状产物21h，为无色固体(110mg，25％)。

步骤H：

将环状氨基甲酸酯21h(200mg，0.44mmol)在二噁烷(30mL)、CH₃OH(20mL)和CH₂Cl₂(20mL)中的溶液用LiOH·H₂O(80mg，2.0mmol，4.5当量)处理并在室温下搅拌4小时。将该反应物在真空中浓缩并用HCl(在二噁烷中的4M溶液，10mL)稀释。经冷冻干燥机除去水，得到直接用于偶合作用的晶体酸21i。

步骤I：

将水解的酸21i(210mg，0.47mmol)在无水DMF(5.0mL)和CH₂Cl₂(5.0mL)中的溶液用HOOBt(125mg，0.70mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigs base(258mg，2.0mmol，4.0当量，369μL)。向该混合物中加入EDCl(134mg，0.70mmol，1.5当量)并将该反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，用胺盐酸盐B(253mg，0.58mmol，1.25当量)处理。将该反应混合物贮存在冰箱中24小时并在真空中浓缩以除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用HCl水溶液(2M，30mL)稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用HCl水溶液(2M，30mL)、NaOH水溶液(1M)、盐水(2x50mL)萃取合并的有机层，干燥(MgSO₄)并在真空中浓缩。将没有进一步纯化的残余物21j(220mg)氧化。

步骤J：

将醇21j(220mg，0.26mmol)的CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(200mg，0.47mmol，1.8当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌1小时并用NaHCO₃水溶液(15mL)和Na₂S₂O₃水溶液(15mL)稀释。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟并用CH₂Cl₂(3×30mL)萃取反应混合物。用Na₂CO₃水溶液萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH(2MNH₃)/CH₂Cl₂1∶20)纯化，得到酮酰胺21(60mg，27％)，为无色固体。

实施例22：式22化合物的制备

步骤A：

将叔丁基酯21(50mg，0.059mmol)的无水CH₂Cl₂(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于庚烷/CH₂Cl₂中，在真空中浓缩数次，得到细的褐色固体22(47mg)，将其在真空中干燥。

实施例23：式23化合物的制备

步骤A：

将酸1d(255mg，1.0mmol)的DMF(2.0mL)溶液用HOBt(202mg，1.5当量)和Hünigs base(517mg，4.0mmol，4.0当量，738μL)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用DCC(258mg，1.25mmol，1.25当量)处理。将该混合物搅拌1小时后，加入组氨酸-OCH₃·2HCl 23a(242.0mg，1.0mmol)并在室温下搅拌过夜。将该反应混合物在真空中浓缩并萃取入EtOAc(3x 50mL)和NaHCO₃水溶液(50mL)。在真空中浓缩合并的有机层并将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)纯化，得到二肽23b，为无色固体(380mg，93％)。¹H NMR(d₆-DMSO，400MHz，δ，ppm)8.17(d，1H，J＝7.2Hz)，7.48(s，1H)，6.77(s，1H)，6.57(bs，1H)，5.54(d，1H，J＝7.6Hz)，4.47(q，1H，J＝7.2Hz)，3.79(t，1H，J＝8.4Hz)，3.55(s，3H)，3.36-3.20(m，2H)，2.94-2.82(m，2H)，1.70-1.47(bm，6H)，1.35(s，9H)，1.46-0.85(m，5H)；¹³C NMR(d₆-DMSO，100MHz，δppm)172.5，171.9，157.3，155.9，135.4，78.6，59.5，52.9，52.3，34.1，29.6，28.9，28.6，26.5，26.3，26.0，25.2；FAB MS：(NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)409[(M+1)⁺，100]，353(10)，170(20)；HRMS对于C₂₀H₃₃N₄O₆的计算值：409.2451；实测值：409.2466；对于C₂₀H₃₂N₄O₅的CHN计算值：C＝58.81％，H＝7.90％，N＝13.72％；实测值：C＝58.70％，H＝7.78％，N＝13.43％。

步骤B：

将ω-溴代庚烯酸(223mg，1.0mmol)的DMF(3.0mL)溶液用脱保护的胺盐酸盐23b(380mg，1.0mmol，1.0当量)处理并加入Hünigs base(387mg，3.0mmol，3.0当量)。将该反应混合物用PyBroP(465mg，1.0mmol)处理并在室温下搅拌3小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂，1∶19)纯化，得到无色固体(220mg，50％)。MS(FAB)515.2[(M+1)⁺，100]，513.2[(M+1)⁺，95]，469(60)，433(20)，170(40)。HRMS对于C₂₃H₃₈BrN₄O₄的计算值：513.2076，实测值：513.2073。

步骤C：

将溴代化合物23c(100mg，0.23mmol)的2-丁酮(4.0mL)溶液用Na₂CO₃(31.0mg，0.29mmol，1.25当量)和LiI(50mg，0.37mmol，1.3当量)处理并在回流下加热24小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物用水稀释。将残余物用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层并经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)纯化，得到环化的化合物23d(25mg，31％)；R_f：0.68(2M NH₃，在CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19中)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz，δ，ppm)8.17(d，1H，J＝8.8Hz)，7.33(s，1H)，6.48(d，1H，J＝8.4Hz)，4.90-4.85(m，1H)，4.26(t，1H，J＝8.0Hz)，3.82-3.74(m，2H)，3.69(s，3H)，3.16-3.11(m，2H)，2.91-2.84(m，1H)，2.30-2.01(m，2H)，1.65-1.59(m，11H)，1.18-0.96(m，11H)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz，δppm)172.8，172.4，171.9，138.2，136.8，57.6，52.5，51.7，46.6，41.6，36.0，30.9，29.5，28.8，27.3，26.7，26.4，26.3，26.2，25.2，24.8；MS：(电喷雾，m/z相对强度)433.1[(M+1)⁺，100]；HRMS对于C₂₃H₃₇N₄O₄的计算值：433.2815；实测值：433.2822。

步骤D：

将甲基酯23d(200mg，0.46mmol)在CH₃OH(5.0mL)和H₂O(0.5mL)中的溶液用LiOH·H₂O(30mg，0.75mmol，1.6当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌15小时并在真空中浓缩，在泵中干燥得到水解的化合物23e，其直接用于偶合作用。

步骤E：

将酸23e在CH₂Cl₂(3.0mL)和DMF(5.0mL)中的溶液用HOOBt(115mg，0.70mmol，1.50当量)和EDCl(113mg，0.60mmol，1.25当量)处理。然后将该反应混合物用Et₃N(190mg，1.88mmol，271μL，4.0当量)和胺盐酸盐B(201mg，0.5mmol，1.1当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌13小时并用H₂O稀释。用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取含水层并将合并的有机层用NaOH水溶液(1M，50mL)萃取，干燥(Na₂SO₄)。过滤干燥的有机层并在真空中浓缩，得到无色残余物23f(442mg)，将其在真空中干燥并直接用于进一步的氧化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：794[(M+1)⁺，100]。

步骤F：

将羟基酰胺23f(50mg，0.064mmol)的CH₂Cl₂(3.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(53mg，0.13mmol，2.0当量)处理并在室温下搅拌3小时。将该反应混合物用饱和Na₂S₂O₃水溶液(20mL)稀释并在室温下搅拌15分钟。用CH₂Cl₂(3x 30mL)萃取含水层。干燥(Na₂SO₄)有机层，过滤，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂，1∶15)纯化，得到酮酰胺23(20mg，40％)；MS：(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：824[(M+CH₃OH)⁺，100]，792[(M+1)⁺，60]，447(20)；HRMS对于C₄₂H₆₂N₇O₈(M+1)⁺的计算值：792.4660；实测值：792.4659。

实施例24：式24化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯23(17mg，21.5μmol)的无水CH₂Cl₂(2.0mL)溶液用TFA(2.0mL)处理并在室温下搅拌8小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于CH₃OH/庚烷/CH₂Cl₂中，在真空中浓缩数次得到24，为细的无色固体(7mg)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：768[(M+CH₃OH)⁺，100]，736[(M+1)⁺，60]，46(10)。

实施例25：式25化合物的制备：

步骤A：

将Boc-4-氯代苯基丙氨酸25a(523mg，1.75mmol)的二氯乙烷(37mL)溶液用CpRu(CH₃CN)₃PF₆1b(760mg，1.75mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤。在真空中浓缩滤液并溶于最少量的CH₃CN中，用大量过量的Et₂O处理。将分离出的固体分离并溶于CH₂Cl₂/CH₃OH(1∶1，50mL)中，在真空中浓缩得到25b，为棕色泡沫(640mg，69％)。

步骤B：

将羧酸25b(2.4g，3.80mmol)的无水DMF(15mL)溶液用Hünigsbase(1.64g，12.64mmol，4.0当量，2.9mL)和HOBt(661mg，4.38mmol，1.5当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(699mg，3.95mmol，1.25当量)处理，搅拌15分钟。向该反应混合物中加入胺盐酸盐1g(1.50g，4.00mmol，1.2当量)并将反应混合物在室温下搅拌12小时。蒸馏出DMF并将残余物用水(30mL)稀释，用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取含水层。用NaHCO₃水溶液(30mL)、HCl水溶液(30mL)、盐水萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，将粗制产物25c(2.5g，69％)不经纯化用于进一步的环化作用。

步骤C：

用干燥的N₂将化合物25c(100mg，0.11mmol)的无水DMF(10mL)溶液脱气并用Cs₂CO₃(170mg，0.5mmol，5.0当量)处理，在室温下搅拌12小时。蒸馏出溶剂DMF并将残余物用水(35mL)稀释，用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤，在真空中浓缩并在真空中干燥过夜。其没有进一步纯化而用于光解除去Ru。

将得自以上步骤的环化化合物溶于CH₃CN中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷2∶1)纯化，得到25d，为褐色固体(29mg，46％)；MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)：580[(M+1)⁺，80]，524(100)，418(40)，462(30)，452(20)，313(60)，253(20)。

步骤D：

将酯25d(150mg，0.26mmol)在THF(3mL)、CH₃OH(3.0mL)和H₂O(3.0mL)中的溶液用LiOH·H₂O(18mg，0.43mmol，1.65当量)处理并在室温下搅拌35分钟。将该反应混合物用浓HCl(13M，1mL)酸化并萃取进CH₂Cl₂(3x50mL)中。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩得到酸25e，其没有进一步纯化直接用于偶合作用。

步骤E：

将酸25e(150mg，0.27mmol)的无水CH₂Cl₂(2.0mL)溶液用HOBt(62mg，0.40mmol)和Hünigs base(139mg，1.1mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(53mg，0.34mmol，1.25当量)处理，搅拌30分钟。将该反应混合物用胺F(88mg，0.29mmol，1.22当量)处理并贮存在冰箱中12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(50mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取含水层。用HCl水溶液(1M，3x20mL)、NaOH水溶液(1M，3x20mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩得到无色固体25f(138mg)，将其用于氧化作用。

步骤F：

将醇25f(140mg，0.143mmol)的CH₂Cl₂∶THF(1∶1，5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(121mg，0.42mmol，3.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并将该混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶32)纯化，得到氧化产物25(57mg，41％)，为无色固体。

实施例26：式26化合物的制备：

步骤A：

将苄基酯25(30mg，38.0μmol)的CH₃OH/THF(1∶1，4.0mL)溶液用Pd/C(20mg，10％)处理并将氢气通入其起泡。加入一滴乙酸以加速还原作用。将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并在真空中浓缩滤液。没有进一步纯化而对残余物26进行分析。

实施例27：式27化合物的制备：

步骤A：

将酸25e(100mg，0.17mmol)的无水CH₂Cl₂溶液用HOOBt(41mg，0.26mmol)和Hünigs base(91mg，0.70mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(35mg，0.22mmol，1.25当量)处理，搅拌30分钟。将该反应混合物用胺D(71mg，0.22mmol，1.22当量)处理并贮存在冰箱中12小时。将反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取含水层。用HCl水溶液(1M，30mL)、Na₂CO₃水溶液(1M，30mL)萃取有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩得到27a无色固体(119mg)，其用于氧化作用。MS(FAB)，842[(M+1)，100]，765(20)，735(10)，657(20)，575(10)，492(10)，464(20)，446(30)。HRMS对于C₄₆H₆₀N₅O₁₀(M+1)⁺的计算值：842.4339；实测值：842.4336。

步骤B：

将醇27a(120mg，0.143mmol)的CH₂Cl₂∶THF(1∶1，3.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(180mg，0.42mmol，3.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌2小时并将混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶32)纯化，得到氧化产物27，为无色固体。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)，840[(M+1)⁺，50]。HRMS对于C₄₆H₅₈N₅O₁₀(M+1)⁺的计算值：840.4184；实测值：840.4199。

实施例28：式28化合物的制备：

步骤A：

将苄基酯27(40mg，47.0μmol)的CH₃OH/THF(1∶1，6.0mL)溶液用Pd/C(30mg，10％)处理并将氢气通入其起泡。加入一滴乙酸以加速还原作用。将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并在真空中浓缩滤液得到28。

实施例29：式29化合物的制备：

步骤A：

将4-氯代苯基丙氨酸29a(1.5g，7.5mmol)在THF(20mL)和H₂O(20mL)中的溶液用NaOH(900mg，22.5mmol，3.0当量)处理并冷却至0℃。滴加入乙酰氯(707mg，9.00mmol，1.25mmol)的THF(10mL)溶液并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将该反应混合物用HCl水溶液(1M，10mL)酸化并用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩得到29b，其没有纯化用于下一步骤中。

步骤B：

将N-乙酰基-4-氯代苯基丙氨酸29b(1.39g，5.75mmol)的二氯乙烷(118mL)溶液用CpRu(CH₃CN)₃PF₆ 1b(2.5g，5.8mmol，1.0当量)处理并在回流下加热2小时。将该反应混合物冷却至0℃并过滤。在真空中浓缩滤液并溶于CH₃CN(15mL)中，用Et₂O(150mL)处理。经滗析所述醚将分离出的树胶状物分离并将残余物溶于CH₂Cl₂/CH₃OH(1∶1，50mL)中，在真空中浓缩得到29c，为棕色泡沫(2.2g，69％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：408[(M-PF₆)⁺，100]。

步骤C：

将羧酸29c(2.0g，4.00mmol)的无水DMF(20mL)溶液用Hünigsbase(2.06g，16.0mmol，4.0当量，2.9mL)和HOBt(810mg，6.0mmol，1.5当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃然后用EDCl(888mg，5.0mmol，1.25当量)处理并搅拌0.5小时。向该反应混合物中加入胺盐酸盐1g(1.48g，7.14mmol，1.2当量)并将该反应混合物在室温下搅拌12小时。蒸馏出DMF并将残余物用水稀释，将含水层用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。用NaHCO₃水溶液(200mL)、HCl水溶液(100mL)、盐水萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，将粗制产物29d(1.2g，38％)不经进一步纯化用于环化作用。

步骤D：

用干燥N₂将氯代化合物29d(1.2g，1.5mmol)的无水DMF(120mL)溶液脱气并用Cs₂CO₃(2.4g，7.4mmol，5.0当量)处理，在室温下搅拌23小时。蒸馏出溶剂DMF并将残余物用水(300mL)稀释，用丙腈(3x100mL)萃取。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩，在真空中干燥过夜。其没有进一步纯化用于光解除去Ru。

将来自以上步骤的环化化合物溶于CH₃CN(40mL)中并在Raynot(λ＝350nm)中光解48小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷4∶1)纯化，得到褐色固体29e(240mg，38％)。MS(FAB，NBA-G/TG-DMSO，m/z相对强度)，522[(M+1)⁺，100]。

步骤E：

将酯29e(200mg，0.42mmol)在CH₃OH(5mL)、CH₂Cl₂(13mL)和H₂O(2.0mL)中的溶液用LiOH·H₂O(41mg，1.0mmol，2.4当量)处理并在室温下搅拌3小时。将该反应混合物用HCl水溶液(13M，1mL)酸化并萃取进CH₂Cl₂(3x50mL)和EtOAc(3x 50mL)中。干燥(Na₂SO₄)合并的有机层，过滤并在真空中浓缩得到酸29f(178mg)，其没有进一步纯化直接用于偶合作用。

步骤F：

将酸29f(90mg，0.18mmol)的无水DMF(1.0mL)溶液用HOBt(45mg，0.33mmol，1.6当量)、Hünigs base(142mg，1.1mmol，5.0当量)和胺B(118mg，0.28mmol，1.47当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(63mg，0.33mmol，1.6当量)处理并在0℃下搅拌20分钟、12小时。将该反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x30mL)和EtOAc(3x30mL)萃取合并的含水层。用NaOH水溶液(2M，30mL)萃取有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，得到无色固体29g(50mg，32％)，将其用于氧化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：883[(M+1)⁺，100]，522(30)，394(60)。

步骤G：

将醇29g(50mg，60.0μmol)的CH₂Cl₂(2.0mL)悬浮液用Dess-Martin试剂(40mg，0.94mmol，2.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌3小时并将混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂1∶32)纯化，得到氧化产物29(41mg，80％)，为无色固体。MS：(FAB，m/z，相对强度)：881[(M+1)⁺，100]，825(170)，248(100)。

实施例30：式30化合物的制备：

将叔丁基酯29(23.0mg，26.0μmol)的溶液用TFA/CH₂Cl₂(1∶1，2.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。完成脱保护后，将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复用庚烷/CH₂Cl₂(4.0mL)处理，浓缩得到褐色固体30(13.0mg，100％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：825[(M+1)⁺，100]。

实施例31：式31化合物的制备：

步骤A：

将酸29f(150mg，0.29mmol)在无水DMF(4.0mL)、CH₂Cl₂(3.0mL)中的溶液用HOBt(58mg，0.44mmol)和Hünigs base(149mg，1.1mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(82mg，0.44mmol，1.5当量)处理，搅拌30分钟。将该反应混合物用胺E(88mg，0.29mmol，1.22当量)处理并在室温下搅拌12小时。将反应混合物在真空中浓缩并用H₂O(30mL)稀释。用CH₂Cl₂(3x30mL)萃取含水层。用HCl水溶液(1M，3x20mL)、NaOH水溶液(1M，3x20mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩，得到无色固体31a(56mg)，其用于氧化作用。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：750[(M+1)⁺，20]，663(10)，522(10)，416(20)，247(30)。

步骤B：

将醇31a(56mg，75μmol)的CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(93mg，0.22mmol，3.0当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌4小时并将混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(SiO₂，CH₃OH/CH₂Cl₂1∶19)纯化，得到氧化产物31(34mg，60％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：748[(M+1)⁺，35]，692(5)，279(100)。

实施例32：式32化合物的制备：

步骤A：

将叔丁基酯31的溶液用TFA/CH₂Cl₂(1∶1，4.0mL)处理并在室温下搅拌4小时。使所述酯相对于基线消失，之后进行TLC(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶24)。完成脱保护后，将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复用庚烷/CH₂Cl₂(4.0mL)处理，浓缩得到32，为褐色固体。

实施例33：式33化合物的制备：

步骤A：

将酸33a(4.5g，25.0mmol)在二噁烷(30mL)和苯(80mL)中的溶液用BnOH(8.0g，74mmol，3.0当量)和TsOH·H₂O(713mg，3.75mmol，10mol％)处理。当用迪安-斯达克装置分离水时，将该反应混合物在回流下加热5小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷3∶7)纯化，得到苄基酯33b，为无色油状物(4.2g，62％)；R_f：0.22(EtOAc/己烷3∶7)；¹³C NMR(CH₃OD，75MHz，δ)：175.1，158.2，139.7，130.3，129.5，129.3，121.7，117.4，114.6，73.1，67.6，41.6；MS(FAB，G/TG-DMSO，m/z，相对强度)：351([M+DMSO]⁺，70)，273([M+1]⁺，100)，255(20)，227(30)，181(40)；HRMS：对于C₁₆H₁₇O₄(M+1)⁺的计算值：272.1049；实测值：272.1054。

步骤B：

将苄基酯33b(3.8g，12.9mmol)的CH₂Cl₂(100mL)溶液用Et₃N(1.55g，15.4mmol，2.2mL，1.1当量)处理，冷却至-78℃(2-PrOH，干冰)并滴加入氯甲酸烯丙基酯(1.84g，15.36mmol，1.1当量)的CH₂Cl₂(10mL)溶液。将该反应混合物加温至室温并用HCl水溶液(1M，100mL)稀释。用EtOAc(3x100mL)萃取反应混合物。用HCl水溶液(100ml，1M)、盐水(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO₄)，在真空中浓缩得到33c，其没有进一步纯化用于下一步骤中。R_f：0.43(EtOAc/Hex7∶13)；¹³C NMR(CH₃OD，75MHz，δ)：174.8，162.5，155.0，152.5，140.3，137.1，132.8，130.3，129.6，129.5，129.4，123.2，120.3，119.4，72.7，70.1，67.7，41.2，29.9。

步骤C：

将Boc-环己基甘氨酸一水合物1d(6.02g，23.4mmol，2.0当量)的溶液溶于CH₂Cl₂中并干燥(MgSO₄)。将该混合物过滤并再将残余物与甲苯一起共沸干燥。将残余物溶于CH₂Cl₂中并用HOBt(4.73g，35.1mmol，2.9当量)、EDCl(6.7g，35.1mmol，2.9当量)和Hünigs base(8.31g，64.3mmol，11mL)处理。将其在室温下搅拌30分钟，加入alloc保护的醇33c(4.3g，12.04mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌36小时并用HCl水溶液(1M，100mL)稀释，用EtOAc(3x100mL)萃取。用NaOH水溶液(1M，100mL)、盐水(100mL)萃取合并的有机层，干燥，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，EtOAc/Hex 1∶4)纯化，得到缩肽(depsipeptide)33d(7.1g，100％)。R_f：0.18(EtOAc/Hex 1∶4)；HRMS：对于C₂₈H₃₄O₇(M-Boc)⁺的计算值：496.2335；实测值：496.2333。

步骤D：

将alloc-保护的缩肽33d(7.8g，13.0mmol)的无水THF(200mL)溶液在氮气氛下用双甲酮(3.27g，23.4mmol，2.0当量)和Pd(Ph₃P)₄(780mg，0.67mmol，5mol％)处理。将该反应混合物在室温下搅拌1小时并在反应物消失后进行TLC(EtOAc/Hex 1∶4)。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶4)纯化，得到酚33e(5.2g，78％)，为无色泡沫状物。R_f：0.52(EtOAc/己烷3∶7)；¹H NMR(d₄-CD₃OD，300MHz，δ)：7.4-7.19(m，5H)，7.15-6.99(m，1H)，6.68-6.55(m，4H)，5.43-5.01(m，3H)，4.6(bs，2H)，4.11-4.00(m，1H)，3.18-2.91(m，2H)，1.80-1.55(bs，6H)，1.39(s，9H)，1.21-0.89(m，6H)；¹³C NMR(CH₃OD，75MHz，δ，非对映异构体的混合物)171.6，169.4，169.3，161.1，157.1，157.0，137.2，136.9，135.4，135.3，129.2，129.1，128.2，128.2，128.0，120.3，120.1，116.0，115.9，113.6，94.8，79.3，73.6，73.5，66.7，66.6，58.6，58.5，40.0，39.9，36.8，29.1，27.7，27.3，25.5。MS(电喷雾，m/z，相对强度)1023([2M+1]⁺，20)；512([M+1]⁺，20)，412([M-Boc]⁺，100)，202(40)HRMS对于C₂₄H₃₀NO₅(M-Boc)⁺的计算值：412.2123；实测值：412.2119。

步骤E：

将Boc-保护的胺33e(5.2g，10.7mmol)的溶液与HCl(4M，二噁烷，200mL，800mmol，80当量)一起搅拌直至经TLC(EtOAc/Hex 3∶7)指示原料相对于基线消失。将该反应混合物在真空中浓缩并在高真空中干燥，残余物33f直接用于下一步骤中。¹H NMR(d₄-CD₃OD，300MHz，δ)：7.40-3.23(m，5H)，7.07(q，1H，J＝13Hz)，6.77-6.6(m，3H)，5.33-5.41(m，1H)，5.3-5.05(2AB，2H)，3.99-3.85(m，1H)，3.35-22(m，2H)，2.00-1.5(m，5H)，1.50-0.80(m，6H)；MS：(FAB，G/TG-DMSO，m/z，相对强度)：412([M+1]⁺，100)；HRMS：对于C₂₄H₃₀NO₅M⁺的计算值：412.2123；实测值：412.2139。

步骤F：

将[CpRu(η⁶-4-氯代苯基丙酸)]PF₆ 1c(2.0g，4.03mmol)的无水DMF(20mL)溶液用HOBt(835mg，6.0mmol，1.5当量)和Hünigs base(2.06g，2.95mL，16mmol，4.0当量)处理。将该反应混合物冷却至0℃并用EDCl(1.15g，6.0mmol，1.5当量)处理。将该反应混合物在0℃下搅拌30分钟。将胺盐酸盐加入到在无水DMF(10mL)中的33f(1.8g，4.03mmol，1.0当量)中。将该反应混合物在室温下搅拌12小时并真空蒸馏出DMF。将残余物用HCl水溶液(1M，100mL)稀释并萃取到CH₂Cl₂(3x100mL)中。用NaHCO₃水溶液(3x50mL)、盐水(100mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩得到棕色固体33g(3.5g)，其用于环化作用。MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：743[(M-PF₆)⁺，100]，304(60)；HRMS：对于C₃₈H₄₁NO₆Cl¹⁰²Ru(M-PF₆)⁺的计算值：744.1666；实测值：744.1694。

步骤G：

将η⁶-钌络合物33g(3.5g，3.93mmol)的无水DMF(300mL)溶液用干燥的氮气脱气并用Cs₂CO₃(6.5g，19.95mmol，5.0当量)处理，在室温下搅拌16小时。将该反应混合物在真空中浓缩以除去DMF，用H₂O(100mL)稀释残余物。将该反应混合物用CH₂Cl₂(3x100mL)萃取。用盐水萃取合并的CH₂Cl₂层，干燥(Na₂SO₄)，过滤并在真空中浓缩得到33h，其直接用于光解作用。MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：708[(M-PF₆)⁺，100]；HRMS：对于C₃₈H₄₀NO₆₁0₂Ru(M-PF₆)⁺的计算值：708.1892；实测值：708.1918。

步骤H：

将环化的钌络合物33h(3.5g，3.9mmol)的CH₃CN(60mL)溶液脱气并在石英管中在λ＝350nm下、分两批光解，各进行48小时。将所述反应混合物集中在一起并经层析(SiO₂，CH₂Cl₂/Et₂O 9/1)纯化，得到环状缩肽，为非对映异构体的混合物(700mg，34％)。将这些非对映异构体经层析(己烷/CH₂Cl₂/Et₂O 6∶3∶1)分离，得到两种非对映异构体33i(370mg，18％)和33j(216mg，11％)，为无色固体。R_f0.28(己烷：EtOAc3∶2)；[α]_D＝25(c 0.15，CHCl₃，20℃)：IR(纯的，cm^-1)3329(w)，2960(m)，2926(s)，2854(s)，1745(s)，1680(m)，1589(m)，1506(m)，1446(m)，1365(w)，1259(s)，1099(m)，1030(s)，800(s)，752(m)，698(w)，619(w)；¹H NMR(CDCl₃，300MHz，δ)：7.36-7.23(m，5H)，7.18-6.99(m，4H)，6.81(d，1H，J＝7.5Hz)，6.74(dd，1H，J＝2.7，5.7Hz)，6.30(S，1H)，5.75(d，1H，J＝7.2Hz)，5.61(dd，1H，J＝2.4Hz，5.4Hz)，5.18，5.14(AB，2H，J＝12.3Hz)，4.23(dd，1H，J＝4.2Hz，3.3Hz)，3.26-3.01(m，2H)，2.98-2.85(m，2H)，2.68-2.64(m，1H)，2.38-2.34(m，1H)，1.96-1.51(m，6H)，1.51-0.96(m，5H)；¹³C NMR：(CDCl₃，75MHz，δ，ppm)177.3，171.1，168.7，159.8，155.3，138.6，135.4，134.9，131.2，129.7，129.2，128.7，126.6，126.1，123.3，120.8，120.8，117.5，114.2，71.8，57.5，56.9，41.5，39.0，35.7，32.6，31.3，29.0，27.6，26.0，25.9。FAB(NBA/DMSO，m/e，相对强度)：542[(M+1)⁺，100]，514(15)，450(5)，307(8)，232(5)，154.1(17)，136(14)；HRMS：对于C₃₃H₃₆NO₆(M+1)⁺的计算值542.2543；实测值：542.2541；对于C₃₃H₃₅NO₆·0.5H₂O的CHN计算值：C 71.98％，H6.59％，N 2.54％；实测值：C 72.56％，H 7.05％，N 2.63％。

步骤I：

将苄基酯33i(360mg，0.66mmol)的CH₃OH/EtOAc(1∶1，50mL)溶液用Pd(OH)₂处理并氢化(50psi)12小时。将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并将滤饼用CH₃OH/CH₂Cl₂(1∶1，50mL)冲洗。在真空中浓缩滤液，将残余物33k(330mg)不经纯化用于偶合作用。R_f：0.58(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)；MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：827.2[(M+1)⁺，100]，694(20)，539(40)，466(10)，174(70)；HRMS：对于C₄₆H₅₈N₄O₁₀(M+1)⁺的计算值：827.4231；实测值：827.4215。

步骤J：

将酸33k(165mg，0.31mmol)在无水DMF(5.0mL)和CH₂Cl₂(5.0mL)中的溶液用HOBt(83mg，0.46mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigs base(159mg，1.23mmol，4.0当量，229μL)。向该混合物中加入EDCl(89mg，0.47mmol，1.5当量)并将该反应混合物在0℃下搅拌1小时，用胺盐酸盐B(159mg，0.372mmol，1.2当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌48小时并在真空中浓缩以除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用水稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用HCl水溶液(1M，3X50mL)、NaOH水溶液(1M，3x50mL)和盐水(100mL)萃取合并的有机层并在真空中浓缩。不经进一步纯化而将残余物33l氧化。

步骤K：

将醇33l(330mg，0.4mmol)的CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(424mg，1.00mmol，2.5当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌1小时并用NaHCO₃水溶液(50mL)和Na₂S₂O₃水溶液(50mL)稀释。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取反应混合物。用盐水(50mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到酮酰胺33(180mg，55％)，为无色固体。R_f：0.63(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)；MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：857.2([M+CH₃OH]⁺，40)，825.2([M+1]⁺，100)。

实施例34：式34化合物的制备：

步骤A：

将氧化的缩肽33(160mg，0.2mmol)的无水CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)处理并在室温下搅拌7小时。将该反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于CH₃OH/CH₂Cl₂/己烷(1∶1∶1)中并在真空中浓缩数次，得到褐色固体34(133mg，86％)，将其在真空中干燥。MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：769.2[(M+1)⁺，100]，481(5)，269(25)，191(90)。

实施例35：式35化合物的制备：

步骤A：

将酸33k(165mg，0.31mmol)在无水DMF(5.0mL)和CH₂Cl₂(5.0mL)中的溶液用HOBt(83mg，0.46mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigs base(159mg，1.23mmol，4.0当量，229μL)。向所述混合物中加入EDCl(89mg，0.47mmol，1.5当量)并将该反应混合物在0℃下搅拌1小时，用胺盐酸盐A(159mg，0.372mmol，1.2当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌48小时并在真空中浓缩以除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用水稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用HCl水溶液(1M，3x50mL)、NaOH水溶液(1M，3x50mL)、盐水(100mL)萃取合并的有机层并在真空中浓缩。不经进一步纯化将残余物35a氧化。MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：798.2[(M+1)⁺，30]，479(10)，391(20)，180(100)。

步骤B：

将醇35a(190mg，0.24mmol)的CH₂Cl₂(10mL)溶液用Dess-Martin试剂(423mg，1.0mmol，4.0当量)处理并在室温下搅拌1小时。将该反应混合物用NaHCO₃水溶液(50mL)稀释并萃取到CH₂Cl₂(3x50mL)中。用饱和Na₂S₂O₃水溶液、盐水(3x50mL)萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，丙酮/己烷3∶7-＞1∶1)纯化，得到氧化的产物35(163mg，86％)，为无色固体。MS：(电喷雾，m/z，相对强度)：796[(M+1)⁺，100]，508(20)，269(20)。

实施例36：式36化合物的制备：

步骤A：

在0℃下，将BH₃·THF(1M，在THF中，100mmol，100mL，3.0当量)的溶液滴加入到烯(5.0g，35mmol)的THF(100mL)溶液中并搅拌1小时。将该反应混合物用乙醇(20mL)处理。当不再放出氢气后，将反应混合物用pH 7缓冲液(100mL)和H₂O₂(30体积，100mL)处理。将该反应混合物在室温下搅拌4小时并用HCl水溶液(100mL)猝灭。用Et₂O(3x100mL)萃取含水层。将合并的醚层用NaOH水溶液(1M，100mL)、盐水(100mL)萃取，干燥(MgSO₄)，过滤，在真空中浓缩并经层析(SiO₂，EtOAc/己烷2/3)纯化，得到为无色液体的醇(2.9g，52％)。

将羟基化酯的THF/H₂O/CH₃OH(100mL，1∶1∶1)溶液用LiOH·H₂O(2.1g，51.2mmol，3.0当量)处理并在室温下搅拌3天。将该反应混合物在真空中浓缩并将含水层用乙醚(2x40mL)萃取。将含水层酸化至pH～1并萃取到EtOAc(3x50mL)中。用盐水(100mL)萃取合并的有机层，干燥(MgSO₄)，过滤，在真空中浓缩并将残余物36b用于步骤B中的偶合作用。¹H NMR(300MHz，CD₃OD，δ)3.53(t，2H，J＝6.6Hz)，2.72(t，2H，J＝7.2Hz)，1.59(t，2H，J＝7.5Hz)，1.5(t，2H，J＝7.5Hz)，1.38-1.33(m，6H)。

步骤B：

将ω-羟基庚酸36b(1.01g，6.93mmol)的CH₂Cl₂(40mL)溶液用Hünigs base(1.97g，15.24mmol，2.2当量，2.81mL)和胺盐酸盐33f(3.1g，6.93mmol，1.0当量)处理。将所述反应混合物冷却至0℃并用PyBrOP(3.22g，6.93mmol，1.0当量)处理。将反应混合物在室温下搅拌过夜并将反应混合物在真空中浓缩。将残余物经层析(EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到缩肽36c(2.5g，66％)，为无色粘性油状物。¹H NMR(CD₃OD，400MHz，δ，ppm)：8.07(t，1H)，7.33-7.21(m，4H)，7.09-7.02(m，1H)，6.67-6.63(m，3H)，5.25-5.06(m，1H)，5.08(q，2H，J＝7.5Hz)，4.36-4.33(m，1H)，3.51(dd，2H，J＝5.4Hz，0.9Hz)，3.11-2.96(m，2H)，2.22-2.17(m，1H)，1.99-0.90(m，14H)。¹³C NMR：(CD₃OD，75MHz，δ，ppm，非对映异构体的混合物)172.1，172.0，171.8，171.1，170.9，169.5，169.3，157.1，157.0，137.3，137.0，135.3，135.2，129.2，129.1，128.2，128.0，127.9，120.3，120.0，116.0，115.9，113.6，94.8，73.6，73.4，66.8，66.7，60.2，57.3，39.6，36.7，28.9，28.0，25.6，20.9，19.5，13；MS(FAB，NBA DMSO，m/z，相对强度)：562[(M+Na)⁺，20]，540[(M+1)⁺，100]，412(15)，240(50)，112(80)。

步骤C：

在氮气氛下，将醇36c(2.5g，4.63mmol)的无水CH₂Cl₂(50mL)溶液用三苯膦(2.67g，10.2mmol，2.2当量)处理并冷却至0℃。将该反应混合物用DEAD(1.61g，9.26mmol，2.0当量)在CH₂Cl₂(30mL)中处理。将反应混合物加温至室温并搅拌2小时。将其在真空中浓缩并经层析(Et₂O/Hex 1∶3)纯化得到环状产物36d(530mg，21％)，为无色固体。MS：(FAB，NBA，DMSO，m/z，相对强度)：522[(M+1)⁺，100]，494(60)，268(20)，222(20)；HR S对于C₃₁H₄₀NO₆(M+1)⁺的计算值：522.2856；实测值：522.2864。

步骤D：

将苄基酯(242mg，0.47mmol)的甲醇(30mL)溶液用Pd/C(10％重量)处理并在Parr上、40psi下氢化14小时。将该反应混合物通过硅藻土垫过滤并在真空中浓缩滤液，得到无色固体36e(181mg，93％)，其用于偶合作用。

步骤E：

将水解的酸36e(167mg，0.39mmol)的CH₂Cl₂(4.0mL)溶液用HOOBt(95mg，0.58mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigsbase(202mg，1.56mmol，4.0当量，288μL)。向该混合物中加入EDCl(111mg，0.58mmol，1.5当量)，将反应混合物在0℃下搅拌0.5小时，并用胺盐酸盐(186mg，0.47mmol，1.20当量)处理。将该反应混合物在冰箱中贮存24小时并在真空中浓缩以除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用HCl水溶液(2M，30mL)稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用HCl水溶液(2M，30mL)、NaOH水溶液(1M)、盐水(2x50mL)萃取合并的有机层，干燥(MgSO₄)并在真空中浓缩。不经进一步纯化而将残余物36f(100mg)氧化。HRMS对于C₄₂H₆₀N₅O₉(M+1)⁺的计算值：778.4391；实测值：778.4399。

步骤F：

将醇36f(100mg，0.13mmol)的CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(100mg，0.0.23mmol，1.8当量)处理。将反应混合物在室温下搅拌2小时并用NaHCO₃水溶液(15mL)和Na₂S₂O₃水溶液(15mL)稀释。将反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，丙酮/己烷3∶7)纯化，得到酮酰胺36(61mg，61％)，为无色固体。MS(FAB，NBA/DMSO，m/z相对强度)：776[(M+1)⁺，100]，731(10)，598(25)，570(15)，485(20)，358(20)，247(50)。

实施例37：式37化合物的制备：

步骤A：

将苄基酯33j(230mg，0.42mmol)的CH₃OH/EtOAc(1∶1，50mL)溶液用Pd(OH)₂处理并氢化(50psi)12小时。将该反应混合物通过硅藻土塞过滤并将滤饼用CH₃OH/CH₂Cl₂(1∶1，50mL)冲洗。将该反应混合物在真空中浓缩，不经纯化而将残余物37a(177mg，93％)用于偶合作用。

步骤B：

将酸37a(177mg，0.33mmol)在无水DMF(5.0mL)和CH₂Cl₂(5.0mL)中的溶液用HOBt(88mg，0.49mmol，1.5当量)处理并冷却至0℃，加入Hünigs base(175mg，1.35mmol，4.0当量，251μL)。向该混合物中加入EDCl(95mg，0.49mmol，1.5当量)并将反应混合物在0℃下搅拌1小时，用胺盐酸盐B(170mg，0.39mmol，1.2当量)处理。将该反应混合物在室温下搅拌48小时并在真空中浓缩以除去DMF和CH₂Cl₂。将残余物用水稀释并用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用NaOH水溶液(1M，2X50mL)、盐水(100mL)萃取合并的有机层并在真空中浓缩。不经进一步纯化而将残余物37b(315mg)氧化。

步骤C：

将醇37b(315mg，0.4mmol)的CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用Dess-Martin试剂(424mg，1.00mmol，2.5当量)处理。将反应混合物在室温下搅拌1小时并用NaHCO₃水溶液(50mL)和Na₂S₂O₃水溶液(50mL)稀释。将该反应混合物在室温下搅拌20分钟并将反应混合物用CH₂Cl₂(3x50mL)萃取。用盐水萃取合并的有机层，干燥(Na₂SO₄)，过滤，在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO2，EtOAc/己烷1∶1)纯化，得到酮酰胺37(210mg，66％)，为无色固体。R_f：0.63(CH₃OH/CH₂Cl₂ 1∶19)；MS：(电喷雾，m/z相对强度)：857([M+CH₃OH]⁺，33)，825([M+1]⁺，40)，191(100)。

实施例38：式38化合物的制备：

步骤A：

将氧化的缩肽37(200mg，0.24mmol)的无水CH₂Cl₂(5.0mL)溶液用TFA(5.0mL)处理并在室温下搅拌7小时。将反应混合物在真空中浓缩并将残余物反复溶于CH₃OH/CH₂Cl₂/己烷(1∶1∶1)中，在真空中浓缩数次，得到褐色固体38(130mg，87％)，将其在真空中干燥。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：769([M+1]⁺，45)，294(45)，191(100)。

实施例39：式39化合物的制备：

步骤A：

将酸22(40mg，0.06mmol)在CH₂Cl₂(0.5mL)和DMF(0.5mL)中的溶液冷却至0℃并用Me₂NH·HCl(15mg，0.18mmol，3.0当量)和Hünigs base(31mg，0.24mmol，44μL，4.0当量)处理。然后将反应混合物用PyBrOP(55mg，0.12mmol，2.0当量)处理并贮存在冰箱中12小时。将该黄色反应混合物在真空中浓缩并将残余物经层析(SiO₂，EtOAc/己烷梯度3∶2→1∶0)纯化，得到不纯的产物，将其用(丙酮/己烷1∶6)再纯化一次得到二甲基酰胺39，为无色固体(14mg，35％)。MS：(电喷雾，m/z相对强度)：791[(M+1)⁺，50]，391(40)，276(50)，176(100)。

实施例40：式40化合物的制备：

用于固相偶合反应的一般步骤：

在由底部安装有聚丙烯玻璃料的聚丙烯注射器筒构成的反应容器中进行合成。在标准固相技术下将Fmoc-保护的氨基酸偶合。在每一个反应容器中装载100mg起始Fmoc-Sieber树脂(大约0.035mmol)。将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(2次)。通过用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟除去Fmoc保护基团。用2mL份的DMF洗涤所述树脂(4次)。用0.12mmol Fmoc-氨基酸、0.12mmolHATU和0.24mmol DIPEA在DMF(2mL)中进行偶合。振荡2小时后，对所述反应容器进行排液并将树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)。用下面的Fmoc-氨基酸或封端基团重复偶合循环。

方案10：

将Fmoc-Sieber树脂40a(0.035mmol)用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟，随后用2mL份的DMF洗涤(4次)。将DMF(2mL)加入到该树脂中，随后加入Fmoc-苯基甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室温下振荡2小时后，将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)，得到结合树脂的化合物40b。将结合树脂的化合物40b用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟。随后用2mL份的DMF洗涤(4次)。将DMF(2mL)加入到该树脂中，随后加入Fmoc-甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室温下振荡2小时后，将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)得到结合树脂的化合物40c。将结合树脂的化合物40c用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟，随后用2mL份的DMF洗涤(4次)。将DMF(2mL)加入到该树脂中，随后加入N-Fmoc-丙基异丝氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室温下振荡2小时后，将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)得到结合树脂的化合物40d。将结合树脂的化合物40d用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟，随后用2mL份的DMF洗涤(4次)。将DMF(2mL)加入到该树脂中，随后加入Fmoc-赖氨酸(Dde)(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室温下振荡2小时后，将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)得到结合树脂的化合物40e。将结合树脂的化合物40e用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟，随后用2mL份的DMF洗涤(4次)。将DMF(2mL)加入到该树脂中，随后加入Fmoc-环己基甘氨酸(0.12mmol)、HATU(0.12mmol)和DIPEA(0.24mmol)。在室温下振荡2小时后，将所述树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)得到结合树脂的化合物40f。将结合树脂的化合物40f用2mL哌啶的DMF溶液(20％v/v)处理20分钟。用2mL份的DMF洗涤所述树脂(4次)得到结合树脂的化合物40g。将结合树脂的化合物40g用2mL份肼的DMF溶液(2％v/v)处理5分钟(3次)。将该树脂用2mL份的DMF洗涤(4次)得到结合树脂的化合物40h。在室温下将结合树脂的化合物40h用在2mL DMF中的0.035mmol戊二酸、0.07mmolHATU和0.14mmol DIPEA处理16小时。将该树脂用2mL份的DMF(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗涤得到结合树脂的化合物40i。在室温下将结合树脂的化合物40i用0.14mmol Dess-Martin periodinane和0.14mmolt-BuOH在2mL DCM中的溶液处理4小时。将该树脂用2mL份iPrOH在DCM中的溶液(20％v/v)、THF、THF的水溶液(50％v/v)(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗涤得到结合树脂的化合物40j。将结合树脂的化合物40j用4mL TFA的DCM溶液(2％v/v)处理5分钟。将滤液加入到1mL的AcOH中并将该溶液经真空离心浓缩，得到化合物40(0.0117g，产率48％)。MS(LCMS-电喷雾)698.2MH⁺。

实施例41-53：式41-53化合物的制备：

使用与实施例40的合成所示相似的固相法，合成化合物41-53。

实施例54：式54化合物的制备：

步骤A：

向搅拌的Boc-环己基甘氨酸-OH(2.33g，9.07mmol)在DMF(20mL)和CH₂Cl₂(20mL)中的溶液中加入HOBT(1.48g，9.07mmol)、EDCl(1.91g，9.97mmol)和NMM(2.99mL，27.2mmol)。将该溶液在-20℃下搅拌10分钟，随后加入H-Lys(Z)-OMe·HCl并在-20℃下搅拌半小时，保存在冰箱中过夜。然后将该溶液浓缩至干燥，之后用EtOAc、饱和NaHCO₃萃取。用H₂O、盐水洗涤合并的有机层，经Na₂SO₄干燥并浓缩至干燥，得到白色固体(4.83g，MH⁺＝534.1)。

步骤B：

向搅拌的54b(4.86g，8.76mmol)在MeOH(10mL)和H₂O(7mL)中的溶液中加入LiOH(70mg，11.4mmol)。形成白色沉淀并将该溶液在室温下搅拌过夜，然后浓缩至干燥。然后将该粗制物分配在CH₂Cl₂和水之间。分离有机层并用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩至干燥，得到54c(4.55g，MH⁺＝520.1)。

步骤C：

在-20℃下，向搅拌的54c(4.3g，8.27mmol)在DMF(40mL)和CH₂Cl₂(40mL)中的冷溶液中加入HOBT(1.35g，8.27mmol)、EDCl(1.74g，9.1mmol)和NMM(2.73mL，8.27mmol)。将得到的溶液在-20℃下搅拌10分钟，随后加入胺G(2.32g，8.27mmol)并在-20℃下搅拌半小时，保存在冰箱中过夜。按照步骤A的后处理步骤得到54d(6.21g，MH⁺＝746.2)。

步骤D：

将54d(6.16g，8.26mmol)的4N HCl/二噁烷(40mL)溶液在室温下搅拌1小时并浓缩至干燥，得到粗制产物54e(5.70g，产率100％，MH⁺＝646.3)。

步骤E：

在-20℃下，向搅拌的Boc-Glu(OBn)-OH在DMF(25mL)和CH₂Cl₂(25mL)中的冷溶液中加入HOBT(1.29g，7.92mmol)、EDCl(1.66g，8.71mmol)和NMM(2.61mL，23.7mmol)。将得到的溶液在-20℃下搅拌10分钟，随后加入54e(5.4g，7.916mmol)并在-20℃下搅拌半小时，保存在冰箱中过夜。按照步骤A的后处理步骤得到粗制产物(7.14g，产率93.5％)。

步骤F：

向搅拌的54f(6.9g，7.15mmol)的无水EtOH(350mL)溶液中加入在50％H₂O(w/w)中的10％Pd/C(2.8g)。将得到的溶液用H₂净化并在H₂氛下搅拌过夜。然后将该溶液通过硅藻土过滤并用EtOH/CH₂Cl₂洗涤滤液，然后浓缩至干燥，得到白色固体(1.44g)。将该固体用25％H₂O/MeOH洗涤并过滤通过烧结的漏斗，然后冷冻并冻干得到54g(4.12g，产率77.5％，MH⁺＝743.2)。

步骤G：

在-20℃下，向搅拌的54g(0.5g，6.7mmol)在DMF(50mL)和CH₂Cl₂(50mL)中的冷溶液中加入HOBT(0.219g，1.34mmol)、EDCl(0.271g，1.41mmol)和NMM(0.296mL，2.69mmol)。将得到的溶液在-20℃下搅拌25分钟，然后保存在冰箱中过夜。将该溶液浓缩至干燥，随后用EtOAc、饱和NaHCO₃萃取。然后将合并的有机层浓缩至干燥，得到54h(254mg，MH⁺＝725.2)。

步骤H：

向搅拌的54h(0.2g，0.27mmol)的无水CH₂Cl₂(20mL)溶液中加入Dess-Martin periodinane(0.234g，0.55mmol)。将得到的溶液在室温下搅拌1小时。用半小时向该溶液中滴加入H₂O(0.010mL)的CH₂Cl₂(20mL)溶液并再剧烈搅拌2小时。然后将该溶液与50％Na₂S₂O₃/50％饱和NaHCO₃一起搅拌半小时。分离有机层并用水、盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩至干燥并在硅胶上经柱层析纯化，用10％MeOH/CH₂Cl₂洗脱，得到54(17mg，62％，MH⁺＝723.2)。

HCV蛋白酶抑制活性试验

分光光度试验：按照由R.Zhang等，Analytical Biochemistry，270(1999)268-275描述的方法(其公开通过引用结合到本文中)，对本发明化合物进行HCV丝氨酸蛋白酶的分光光度试验。基于显色酯底物的蛋白酶解试验适用于HCV NS3蛋白酶活性的连续监测。底物衍生于NS5A-NS5B接合序列(Ac-DTEDVVX(Nva)，其中X＝A或者P)的P侧，其C-末端羧基用4种不同的显色醇(3-或4-硝基苯酚、7-羟基-4-甲基香豆素或4-苯基偶氮苯酚)中的一种酯化。下面提出这些新的分光光度酯底物的合成、表征以及应用于高通量筛选和HCV NS3蛋白酶抑制剂的详细的动力学评价。

材料与方法：

材料：用于与试验有关的缓冲液的化学试剂得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。用于肽合成的试剂得自AldrichChemicals，Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。肽由人工合成或者在型号431A的自动ABI合成仪(得自Applied Biosystems)上合成。型号LAMBDA 12的UV/VIS分光计得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)和96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。预温热封闭剂得自USA Scientific(Ocala，Florida)和96孔板旋涡仪得自Labline Instruments(Melrose Park，lllinois)。具有单色光源的Spectramax Plus微量滴定板读数器得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。

酶制备：通过采用先前公开的方法(D.L.Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制备重组异源二聚体(heterodimeric)的HCV NS3/NS4A蛋白酶(株1a)。使用先前经氨基酸分析定量的重组HCV蛋白酶标准物，通过Biorad染色法测定蛋白浓度。试验开始前，采用Biorad Bio-SpinP-6预装柱，将酶储备缓冲液(50mM磷酸钠pH 8.0，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麦芽糖苷和10mM DTT)交换为试验缓冲液(25mM MOPS pH 6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麦芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)。

底物合成和纯化：如由R.Zhang等(出处同上)报道的那样进行底物的合成并且使用标准方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)，通过将Fmoc-Nva-OH固定到2-氯三苯甲基氯树脂上启动。随后，或者人工或者在型号431的自动ABI肽合成仪上，采用Fmoc化学装配肽。或者通过在二氯甲烷(DCM)中的10％乙酸(HOAc)和10％三氟乙醇(TFE)30分钟，或者通过在DCM中的2％三氟乙酸(TFA)10分钟，自树脂裂解N-乙酰化和充分保护的肽片段。共沸蒸发(或者经Na₂CO₃水溶液反复提取)合并的滤液和DCM洗液，除去在裂解中所用的酸。经Na₂SO₄干燥DCM相并且蒸发。

采用标准酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)，410-412)装配酯底物。将肽片段溶于无水吡啶(30-60mg/ml)中，向其中加入10摩尔等价物的发色团和催化量(0.1eq.)的对甲苯磺酸(pTSA)。加入二环己基碳二亚胺(DCC，3eq.)以启动偶合反应。经HPLC监测产物形成并发现反应在室温下12-72小时后完成。真空蒸发吡啶溶剂并经用甲苯共沸蒸发进一步除去。用95％在DCM中的TFA将肽酯脱保护2小时并用无水乙醚提取3次以除去过量的发色团。经反相HPLC在C3或C8柱上纯化脱保护的底物，用30％-60％乙腈(使用6个柱体积)梯度洗脱。HPLC纯化后总收率为约20-30％。经电喷雾离子质谱证实分子量。在干燥下，以干燥粉末形式贮存底物。

底物和产物的波谱：在pH 6.5的试验缓冲液中得到底物和相应显色团产物的波谱。采用多倍稀释，在最佳脱峰波长下，1-cm比色杯(340nm对3-Np和HMC，370nm对PAP和400nm对4-Np)中测定消光系数。最佳脱峰波长定义为在底物与产物之间产生吸收度最大相对差异的波长(产物OD-底物OD/底物OD)。

蛋白酶试验：在96孔微量滴定板中，采用200μl反应混合物在30℃下进行HCV蛋白酶试验。使试验缓冲液条件(25mM MOPS pH 6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％十二烷基麦芽糖苷、5μM EDTA和5μM DTT)对NS3/NS4A异源二聚体最佳化(D.L.Sali等，出处同上)。通常，将150μl缓冲液、底物和抑制剂的混合物加入到各孔(DMSO最终浓度，4％v/v)中并且在30℃下预孵育约3分钟。然后将50μl在试验缓冲液中预温热的蛋白酶(12nM，30℃)用于启动所述反应(最终体积200μl)。采用配有单色光源的Spectromax Plus微量滴定板读数器(通过利用截断滤膜的板读数器可得到可以接受的结果)，在试验全程(60分钟)监测板在合适的波长(对于3-Np和HMC为340nm，对于PAP为370nm，对于4-Np为400nm)下吸光度的变化。在合适的波长下监测Nva与发色团之间的酯键的蛋白酶剪切，相对于作为非酶促水解的对照的无酶空白。于30倍底物浓度范围(～6-200μM)内进行底物动力学参数的评价。采用线性回归测定最初速度，并且采用非线性回归分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)，通过将数据拟合到Michaelis-Menten方程式中获得动力学常数。假设酶完全活化，以计算转化数(K_cat)。

抑制剂和灭活剂的评价：按照竞争抑制作用动力学的重排Michaelis-Menten方程式v_o/v_i＝1+[1]_o/(K_i(1+[S]_oK_m))(其中v_o为未抑制的初始速度，v_i为在任何给出的抑制剂浓度([1]_o)下，在抑制剂存在下的初始速度，且[S]_o为所使用的底物浓度)，通过v_o/v_i对抑制剂浓度([1]_o)作图，在固定的酶和底物的浓度下，可实验测定竞争性抑制剂Ac-D-(D-Gla)-L-1-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH的抑制常数(K_i)。采用线性回归拟合所得数据，并将所得到的斜率1/(K_i(1+[S]_o/K_m)用于计算K_i值。

在以上提及的表1中给出了所得到的本发明各大环化合物的K_i值，其中按K_i值的范围的顺序排列化合物。从这些试验结果，技术人员应该意识到本发明化合物作为NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂具有优良的用途。

细胞生物测定方法：按照由S.Agrawal等，“Development andCharacterization of Hepatitis C Virus Serine Protease Cell-based Trans-Cleavage Assay”(丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶细胞-基反式切割测定法的开发和鉴定)，Hepatology Supplement to Volume 30(No.4，第2部分，1999年10月)，Abstract No.615(Proceedings of AASLD 50^tn AnnualMeeting，Dallas，Texas，1999年11月5-9日)(其公开通过引用结合到本文中)描述的方法，对本发明化合物进行HCV丝氨酸蛋白酶的细胞生物测定。在用质粒(表达包含NS5A/5B切割识别序列的报道蛋白底物)和1BNS4A_21-32GS-GSNS_3-81l17K表达载体以及作为控制细胞毒性的内标蛋白的YFPnl共转染的Hela/Huh7细胞中进行所述测定。通过全细胞溶胞产物的SDS-PAGE随后通过采用针对报道底物的单克隆抗体的蛋白质印迹检测，测量蛋白酶活性。通过在磷光成像仪上扫描免疫印迹进行底物切割的定量。

材料：

质粒DNAs

pBFP-5A/5B-GFP：表达所述底物的报道基因编码融合蛋白，后者包括被衍生于NS5A/5B切割识别序列的25个氨基酸分开的N’末端蓝色荧光蛋白(BFP)结构域和C’末端绿色荧光蛋白(GFP)结构域。当经合适波长的UV光激发时，GFP和BFP均为分别发射绿光或蓝光的基本上均匀的自动荧光蛋白。在GFP的发色团中的四个氨基酸取代改变发射波长并把蛋白转变为BFP。

采用识别两种蛋白的单克隆抗体，通过免疫学方法在细胞溶胞产物中可检测底物和得到的GFP和BFP产物。

BFP-5A/5B-GFP报道基因包含BFP和GFP自动荧光蛋白编码序列(Quantum Biotechnologies，Inc.，Montreal，Canada)，所述序列被NS5A/5B切割识别序列分开，在pQB125克隆载体(QuantumBiotechnologies，Inc.)的Nhe I和Bam HI限制性内切核酸酶位点之间被克隆。融合蛋白的表达处于CMV IE启动子-增强子的控制下。载体的牛生长激素p(A)序列向mRNA提供多腺苷酸化信号。NS5A/5B切割序列为：SSGADTEDVVCCSMSYTWTGALVTP。用DNA测序来证实克隆。

P1BOO2：1bNS4A21-32GS-GS NS 3-81l17K：将亚型1b蛋白酶克隆为在载体pClneo中的CMV启动子后的Xba1/Not1片段。

YFPn1：YFPn1购自CLONTECH(Palo Alto，California)。将第三种质粒加入到转染提供控制细胞毒性的内标蛋白且不影响蛋白酶切割的百分率。

在合适的抗生物素选择下，于LB培养基中，在DH5α细胞(得自Life Technologies)中维持和繁殖质粒DNAs，并且采用QIAfilter PlasmidKits(Qiagen，Valencia，California)纯化。

细胞培养：

在补充有10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和100u/ml青霉素-链霉素(BioWhitaker)、2％NaHCO₃的Eagle氏极限必需培养基(EMEM；BioWhittaker，Walkersville，Maryland)中维持和繁殖Hela细胞。

在补充有10％胎牛血清(FCS)、100u/ml青霉素-链霉素(BioWhitaker)和5ml NEAA(100x；BioWhittaker)/L的Dulbecco改进的Eagle氏培养基(DMEM；BioWhittaker)中维持和繁殖Huh7细胞。

SOP方法

转染前一天：

以6×10⁴细胞/孔的密度将Hela细胞接种在24孔板(Falcon 3047板)中并于37℃下在5％CO₂孵育器中生长过夜。

转染当天：

将质粒DNAs在不含有核酸酶的水中稀释至最终浓度0.05μg/μl(Promega，Madison，Wisconsin，分类号P119C)。合并0.75μgBFP-5A/5B-GFP并与0.175μg P1B002(0.23X)和0.02μg的YFPn1混合。用不含有FBS、谷氨酰胺和抗生素的EMEM使DNAs的最终体积达到60μl。按5μl体积/μg总DNA的比例加入SuperFectReagent(Qiagen，目录号301305)，并在室温下将混合物涡旋约10秒钟且孵育10分钟以形成复合物。

当形成复合物时，吸出细胞培养板中的生长培养基，并用1ml不含有Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(BioWhitaker)洗涤细胞1次。将350μlEMEM(补充有合适的补充物-完全培养基)加入到包含转染复合物的试管中并将混合物上下吸打2-3次。将全部体积转移至24孔培养板的一个孔中。在37℃下和5％CO₂中，将Hela细胞与转染复合物孵育约3小时。通过吸出从细胞中除去包含转染复合物的培养基。

在约1ml PBS中洗涤细胞一次，将PBS吸出，加入495μl完全EMEM随后加入5μl化合物/孔。在37℃下和5％CO₂中，将细胞孵育22-24hr。

细胞溶胞产物的制备

自每孔吸出培养基并用DPBS洗涤1次。将细胞收获在100μl的1x Tris-SDS-BME样品缓冲液(OWL分离系统，Portsmouth，NewHampshire，编号ER33)中，并且转移至微量离心管中。然后，将其煮沸3-5分钟以裂解细胞。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上以10μl/孔进行加样。在10cmx10cm 12.5％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Owl Scientific，编号OG-0125B)上，在tris-甘氨酸-SDS缓冲液(Owl Scientific)中，于30mamp下经电泳将溶胞产物分离。使用前，将PVDF膜(Immobilon-P；.45μm孔径；Millipore，Bedford，Massachusetts)在100％甲醇中浸泡10秒钟，然后将印迹置于蒸馏水中。采用半-干燥电印迹仪在每块凝胶108mamp下90分钟将蛋白转移至PVDF滤膜(0.45μm，Miillipore)。

经ECF蛋白质印迹的蛋白的检测(Amersham Pharmacia Biotech，LittleChalfont，England)，目录号RPN 5780)。在冰箱中，于2-4℃下，通过在～10ml的包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS(Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri，目录号3563)中的5％封闭剂(得自试剂盒)，将PVDF滤膜封闭过夜。次日，用包含0.05％吐温20的TPBS洗涤缓冲液短暂冲洗膜两次，然后在包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS中洗涤三次，每次5分钟。在包含0.05％吐温20、pH 7.4的PBS中，将膜在12ml抗-GFP单克隆抗体的1∶3000稀释液中孵育30分钟(Clontech，Palo Alto，California)，而在同时加入1％BSA(牛白蛋白，得自Sigma的目录号A-2153)以减少背景。用TPBS短暂洗涤膜两次，然后在TPBS洗涤缓冲液中洗涤三次，每次5分钟。将膜在12ml在TPBS中的1∶600稀释抗荧光素-连接的抗小鼠Ig中孵育30分钟。用TPBS短暂洗涤膜两次，然后在TPBS洗涤缓冲液洗涤三次，5分钟。为用ECF底物放大信号，将膜在10ml的1∶2500抗荧光素碱性磷酸酶缀合物中孵育30分钟。用TPBS短暂冲洗膜两次，然后在TPBS洗涤缓冲液中冲洗三次，5分钟。按照制造商的说明书(等分试样和冷冻)，制备ECF底物溶液，将膜孵育2-3分钟，排出过量的试剂，然后用滤纸吸干，风干9-10分钟，然后扫描。

扫描膜：将印迹放在Storm 860磷光成像仪的玻璃上。设立蓝色化学发光，200像素大小，700PMT电压。在ImageQuant中打开文件并通过产生围绕代表底物(S)、产物(P)和内部对照物(IC)的条带的正方形定量化。底物的切割百分率可作为P/(S+P)x100测量。与包括在每个印迹上的药物对照品的重复试验相比，测量由药物引起的切割的抑制作用。在Excel中建立报告。一些化合物的结果如下：

实施例36的化合物：EC₅₀＝9μm

实施例35的化合物：EC₅₀＝20μm

根据这些试验结果，本领域技术人员应该意识到本发明化合物作为NS3-丝氨酸蛋白酶抑制剂具有优良的用途。

Claims

1.一种表现出HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括所述化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体和互变异构体，以及所述化合物的药学上可接受的盐或溶剂合物，所述化合物选自具有下示结构的化合物：

2.一种用于治疗与HCV蛋白酶有关疾病的药用组合物，所述组合物包括治疗有效量的一种或多种权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物和药学上可接受的载体。

3.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备用于治疗与HCV蛋白酶有关疾病的药物中的应用。