JP2002510509A

JP2002510509A - Ｃ型肝炎ウイルスｎｓ５ｂ組成物およびその使用方法

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Publication number: JP2002510509A
Application number: JP2000542492A
Authority: JP
Inventors: マーク・エス・コレット
Original assignee: バイロファーマ・インコーポレイテッド
Priority date: 1998-04-02
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 2002-04-09
Also published as: WO1999051781A1; WO1999051781A9; CA2325016A1; AU768177B2; IL138804A0; EP1068362A1; EP1068362A4; AU3861099A

Abstract

(57)【要約】ＨＣＶ核酸および蛋白をここに開示する。本発明の組成物を用いる方法およびキットも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、さらに詳しくは、ＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子およびそれによりコードされる蛋白に関する。特に、本発明は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ配列を含む新規な組成物、機能的なＨＣＶＮＳ５Ｂ配列、ＨＣＶＮＳ
５Ｂ配列の機能的に改良された組成物、ならびにそのＮＳ５Ｂ配列の研究、診断
、治療および医薬の用途における使用に関する。

【０００２】（関連出願の相互参照）本願は、３５Ｕ.Ｄ.Ｃ.１１９条（ｅ）の下、１９９８年４月２日付け出願の米国仮出願６０／０８０５０９および１９９８年６月２３日付け出願の米国仮出
願６０／０９０３５６に対して優先権を主張するものであり、仮に本願明細書中
に十分に開示されているとしても、その各々の開示を出典明示により本明細書の
一部とするものである。

【０００３】（発明の背景）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界中に及ぶ、肝炎の主たる原因である。世
界保健機関は世界中で１億５千万の人が現在このウイルスに感染していると判断
している。大部分の感染は持続的となり、感染の約６０％が慢性の肝疾患に発展
する。慢性ＨＣＶ感染は肝硬変、肝細胞癌および肝不全を発病するに至りうる。最近、合衆国では、ＨＣＶによる肝炎を治療するのに、インターフェロンα（
ＩＦＮ）がよく効くとされている。ＩＦＮ治療は、患者の２０ないし４０％で、
血清酵素応答の改良が見られる。残りの患者はＩＦＮ治療に応答しない。応答し
た者で、その患者のうちわずか１０ないし２０％にて、アミノトランスフェラー
ゼ濃度の持続的改良が見られる；患者の大部分はＩＦＮ治療を中止すると元の状
態に戻ることとなる。ＩＦＮは慢性Ｃ型肝炎の第１治療薬であるが、その効果は
一定しておらず、治癒率は低く、付随する副作用はかなりのものである。

【０００４】開発中のＨＣＶワクチンは、一般に、推定ウイルス構造蛋白（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２
）の組換えバージョン、またはこれらの蛋白をコードする遺伝子からなる。ウイ
ルス中和抗体が存在し、惹起され得、そしてＨＣＶ感染を阻害または妨げること
ができると考えられる。しかし、今日まで、ＨＣＶに対して安全かつ効果的であ
ると証明されたワクチンはない。実際、予め存在する抗体で中和されない免疫学
的に別個のエンベロープ蛋白を示すウイルス単離体と同様、ＨＣＶが固有の遺伝
的多様性を示す場合、ワクチン開発は手に負えそうもない仕事であろう。ＨＣＶはインビトロにて未だ効果的に増殖させることができない。この不備に
よりＨＣＶ複製の幾つかの局面を完全に理解することが妨げられることとなる。
多くのＨＣＶ単離体が感染患者より分子的にクローンされ、かつ配列決定されて
いるが、効率的な複製を容易にするのに必要な配列特徴および因子について、研
究すべきことが多く残っている。種々の代替遺伝子発現系におけるこれらの配列
の研究より、ＨＣＶの分子生物学の知識は近年著しく拡張された。現存の知識お
よび関連するペスチウイルスおよびフラビウイルスを分子生物学的に理解するこ
とにより促進されたこれらの進歩は、抗ウイルス薬を開発する場合の適当な標的
である、ウイルス複製に不可欠なウイルスに特異な要素に対して重要な見解をも
たらした。

【０００５】上記したように、ＨＣＶは、遺伝学的に不均一なウイルスである。自然界に、
および感染個体に「準種（quasispecies）」として存在し、それは、いずれか特
定の供給源からのウイルス集団の範囲内で、ウイルス遺伝的物質が、同じではな
いが、密接に関連する配列の集合として存在することを意味する。このＨＣＶ配
列の遺伝的異質性は、ＨＣＶの正常な複製工程の間に導入された自然な誤りの結
果、宿主によりウイルスにかかる選択圧の結果、あるいは他の因子の結果である
かもしれない。ＨＣＶの準種特性は、宿主の防御系による排除を回避し、持続感
染を確立するウイルスの能力に帰するものであると考えられる。ＨＣＶの準種特性は、特にウイルスの効率的な複製のための制御系のない場合
に、「機能的」遺伝子およびゲノムの配列を限定することを困難にしている。し
かしながら、ＨＣＶ配列のセグメントの機能性は種々の代替発現系にて研究され
てきた。数種の遺伝子産物が、その遺伝子産物中の特定のアミノ酸配列モチーフ
の存在に基づき、存在すると予測される酵素学的活性を示すことで、インビトロ
アッセイにて機能的であることが明らかにされた。例えば、ＦＳ３蛋白はセリン
プロテイナーゼ、ヌクレオシドトリホスファターゼおよびヘリカーゼ活性を有し
、ＮＳ５Ｂ蛋白はＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）活性を有する
。

【０００６】近年におけるＨＣＶの感染分子クローンの研究（Kolykhalovら、Science ２７
７：５７０−５７４（１９９７）；Yanagiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：８７３８−８７４３（１９９７））により、完全な機能的ＨＣＶゲノムを定
義することが可能となり、その結果、一の特定の供給源から得られたＨＣＶのこ
の特定の株より由来の一連の機能的ＨＣＶ遺伝子産物を定めることができる。Ko
lykhalovらが機能的ゲノムを得ることの困難性は、１）感染患者におけるＨＣＶ
の極めて変動的な準種特性；２）臨床試料中のウイルスＲＮＡが少量であるため
、配列のインビトロ増幅（ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅）の必要性；および３
）（イー・コリにおける）分子クローニングの必要性、を含むことにあるとする
のは注目すべきことである。これらの態様は、各々、欠陥（機能性に乏しいまた
は非機能的）ＨＣＶ配列の可能性および提示を、あるいはＨＣＶ配列の転写また
は増幅において誤りを生じさせることができる。Kolykhalovらは、３４種の完全
なゲノム分子クローンより産生したＲＮＡがチンパンジーにて感染を示さなかっ
たことを示した。ヌクレオチド配列を分析し、完全に配列決定された６種の全長
クローンの間で多数の配列が変化していることがわかった。「コンセンサス配列
」のクローンを生成した場合のみ、正の感染性を測定することができた。Yanagi
らはまた、単一の供給源より得られた個々の分子クローンの間の高度の配列変動
性および全長分子クローンからのＲＮＡ転写物の非感染性を示した。Yanagiらは
、大部分のＨＣＶゲノムは不完全であると結論した。事実、最近の研究により、
分子クローニング操作の間の不完全なＨＣＶゲノムの優先的選択への傾向が示さ
れた（Fornsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：１３９０９−１３９１４（
１９９７））。Fornsらによれば、対照プラスミド由来の２５種のランダムクローンのうち、わずか８％だけがポリ蛋白合成に機能的であった。

【０００７】かくして、ＨＣＶ由来の配列の単なる知識では、かかる配列が有用なウイルス
遺伝子産物または機能的ウイルス遺伝子産物をコードすると結論付けるのに十分
ではないことはこれらの例示から明らかである。ＮＳ５Ｂ遺伝子に関する多くの部分的および完全な遺伝子配列が種々のデータ
ベースに入力されているが、ＲｄＲｐ活性のインビトロアッセイに基づいて機能
的であると証明されているのはこれら配列のうちほんのわずかにすぎない。本発明は、研究、診断、治療および医薬用途に用いるための、および効力のあ
る抗ウイルス剤を同定するアッセイにて用いるための、新規かつ機能的な、なら
びに機能上改良された、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ配列を提供するものである。

【０００８】発明の概要本発明は、ＲｄＲｐ活性を示すことのできる組み換えＨＣＶ蛋白が誘導されう
る新規ＨＣＶＮＳ５Ｂヌクレオチド配列を提供する。改良された機能活性を生じさせる配列の修飾も提供される。かかる機能的組み換えＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白は、研究、診断、治療および医薬への用途がある。特に、本発明の組み換えＨＣ
ＶＮＳ５Ｂ蛋白は抗ウイルス剤の発見戦略において有用である。

【０００９】本発明の好ましい具体例において、本発明のクローン４中に存在する配列番号
：１として同定されるＤＮＡ配列を含む単離核酸分子が提供される。典型的なＨ
ＣＶＮＳ５Ｂ蛋白は、クローン４によりコードされる配列番号（SEQ ID NO）：
２として同定されるアミノ酸配列を有する。配列番号：１の核酸配列に関連した
核酸配列を示すさらなる核酸分子は、それぞれ配列番号：８、９、１０、１１お
よび１２により同定されるＨＣＶＮＳ５Ｂのアミノ酸配列をコードする配列番号：３、４、５、６および７により同定される核酸配列を包含し（これらに限ら
ない）、やはり本発明の範囲内であると考えられる。これらの配列の保存的配列
または残基置換物もまた、本発明の範囲内であると考えられる。

【００１０】本発明のさらなる具体例において、機能的に改良されたＣ型肝炎ポリメラーゼ
核酸およびアミノ酸配列が提供される。典型的な配列は、配列番号：２により同
定されるアミノ酸配列に関連したアミノ酸配列をコードする核酸配列であって、
特定コドンが置換されて配列中において特定アミノ酸をコードするようになって
いるものを包含する。有用な変化の例は、成熟ＮＳ５Ｂ蛋白のアミノ酸位置番号
７５、１７７および５４３における変化を包含するが、これらに限らない。

【００１１】もう１つの具体例において、特定コドンが置換されてＮＳ５Ｂの既知配列中に
は通常見られないアミノ酸をコードするようになっている、機能的に改良された
Ｃ型肝炎ポリメラーゼ核酸およびアミノ酸配列が提供される。例えば、変化は、
成熟ＮＳ５Ｂ蛋白のアミノ酸位置番号１および２におけるもの（これらに限らな
い）を包含し、それらの変化は本発明にて有用である。

【００１２】上記のように、変種蛋白またはポリペプチドは本発明の範囲内であると考えら
れる。配列番号：１３はかかる変種配列の一例を示す。かかる変種はＨＣＶポリ
メラーゼ活性を有していてもよく、あるいは有していなくてもよい。これらの変
種は１またはそれ以上の変化を有していてもよく、その変化のそれぞれが１また
はそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換を含むものであってもよい
。好ましくは、変化はポリペプチドの構造または有用な特性に影響しないか、あ
るいは実質的に影響しないものである。よって、好ましくは、ＨＣＶＮＳ５Ｂ変種は上記のような機能的ＨＣＶＮＳ５Ｂ活性を有するものであってもよく、あるいはそれらはほとんど機能的でないかまたは不活性であってもよいが、元の
ポリペプチドの二次および三次構造を実質的に含むものである。かかるＮＳ５Ｂ
分子を用いて、ＨＣＶＮＳ５Ｂに結合するか、あるいはＨＣＶＮＳ５Ｂ活性に
影響する作用剤を同定してもよい。ＨＣＶＮＳ５Ｂ変種は天然に存在するもの（すなわち、天然源から精製または単離されたもの）あるいは合成されたもの（
すなわち、部位特異的突然変異法に供されたＤＮＡの生物学的発現により、ある
いは当該分野においてよく知られた化学合成法により得られるもの）のいずれで
あってもよい。

【００１３】本発明の核酸分子をベクター中に組み込んで発現させてもよい。かかるベクタ
ーは、例えば、プラスミド、複製コンピテントまたは欠陥ウイルスあるいはファ
ージベクターあるいはレプリコンの形態であってもよく、典型的には、複製開始
点、所望によりポリヌクレオチド発現用プロモーターおよび所望によりプロモー
ターのレギュレーターを備えたものであってもよい。ベクターは１またはそれ以
上の選択可能マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン
耐性遺伝子、あるいは哺乳動物ベクターの場合にはネオマイシン耐性遺伝子を含
んでいてもよい。ベクターは、例えばＲＮＡまたは蛋白を得るためにインビトロ
で使用されるものであってもよい。さらにベクターを用いて宿主細胞または生物
を形質転換、トランスフェクション、感染またはトランスダクションしてもよい
。さらに本発明は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の活性に影響する作用剤を同定するための、本発明のＨＣＶ核酸配列またはポリペプチドを有し、あるいは発現する宿
主細胞および生物の使用も企図する。

【００１４】本発明のさらにもう１つの具体例において、ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性に影響する作用剤を同定するための方法が提供される。かかる方法は、大量の
作用剤の法かを可能にする高処理量スクリーニング手順を含む。本発明のＨＣＶ
ＮＳ５Ｂ核酸およびポリペプチド、それらの変種、あるいは本発明方法を用いることにより同定される作用剤は、ＮＳ５Ｂ配列に対するそれらの影響がアンタ
ゴニスト的またはアゴニスト的のいずれであってもよい。これらの作用剤は、小
型分子、ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、免疫グロブリンまたはそれらのフ
ラグメント、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ペプチド−核酸抱合体、
リボザイム、ポリヌクレオチド等を包含する多くのクラスの分子を包含しうる。
特に、本発明の実施により同定されるアンタゴニスト的分子ならびにアゴニスト
的分子は広範で数多くの有用性を有すると考えられる。ＨＣＶＮＳ５Ｂ活性のアンタゴニストに関するかかる有用性は、ヒトまたは他の生きた宿主、ならびに
細胞、組織および器官培養のごときインビトロ系におけるＨＣＶ複製の抑制のた
めの使用を包含するが、これらに限らない。本発明の実施により同定されるＨＣ
ＶＮＳ５Ｂ活性のアゴニストもまた、生きた宿主およびインビトロの両方において数多くの有用性を有するであろう。例えば、かかる作用剤は、ＨＣＶ感染、
複製または疾病に関する動物モデル、ならびに生きた宿主または細胞、組織もし
くは器官培養におけるＨＣＶの増殖に関する動物モデルの開発において有用であ
ろう。

【００１５】本発明のもう１つの態様によれば、本明細書開示の組成物および方法の使用を
容易にするためのキットが提供される。典型的なキットは、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸およびポリペプチドまたはそれらの変種を、単独あるいは適当なベク
ターと組み合わせて含有する。本発明の組成物の特別な適用ならびに該適用を実
行するために必要な試薬の使用のためのプロトコールも含まれる。キットの試薬
は意図される適用に応じて様々である。かかる試薬は、バッファー、溶媒、培地
および溶液、基質およびコファクター、ベクターおよび宿主細胞、ならびに検出
またはリポーター試薬を包含するが、これらに限らない。バイアル、容器および
反応チャンバーのごとき他のアクセサリーを含んでいてもよい。

【００１６】以下の定義は本発明に関する主題の理解を助けるためのものである。本明細書の用語「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」はフラビウイルス科（
Flaviviridae family）のヘパウイルス属（hepacivirus genus）中に分類される
関連ウイルスの広範な群に属するものを意味する。本明細書の用語「核酸」または「核酸分子」は直鎖状または環状の１本鎖また
は２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子をいい、１本鎖の場合にはその相補的配列の
分子もいう。核酸分子を議論する場合、本明細書において特定の核酸分子の配列
または構造を通常の記載慣習に従って５’から３’の向きに記載することがある
。本発明の核酸に関して、用語「単離核酸」を時々用いる。この用語は、ＤＮＡ
について用いる場合、その起源生物の天然ゲノム中において隣接して連続してい
る配列から分離されたものである。例えば、「単離核酸」はプラスミドまたはウ
イルスベクターのごときベクター中に挿入されたＤＮＡ分子を含んでいてもよく
、あるいは原核細胞もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡ中に組み込
まれていてもよい。ＲＮＡについて用いる場合、用語「単離核酸」は、主として、上記単離ＤＮＡ
分子によりコードされるＲＮＡ分子をいう。あるいはまた、その用語は、その天
然状態（すなわち、細胞または組織中）において結合している他の核酸から十分
に分離されたＲＮＡ分子をいうこともある。さらに単離核酸（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）は、生物学的または合成的手段により直接生産され、その生産中に存在する
他の成分から分離されているものをいうことがある。

【００１７】核酸の特定配列の「天然対立遺伝子変種」、「変異体」および「誘導体」は、
特定配列に密接に関連しているが、配列または構造中の自然発生的または設計さ
れた変化を有していてもよい核酸配列をいう。密接に関連とは、配列のヌクレオ
チドの少なくとも７５％、しばしば９０％より多くが、特定の配列番号を用いて
表される核酸配列の一定の長さにわたって合致することを意味する。密接に関連
した核酸配列間の核酸配列中の変化または相違は、特定の核酸配列の複製または
重複の過程において自然に起こる配列中のヌクレオチド変化をいうことがある。
他の変化は、特別な目的のために特別に設計され特別な配列中に導入されたもの
、例えば、核酸の調節領域におけるアミノ酸コドンまたは配列の変化のようなも
のであってもよい。かかる特別な変化を、種々の突然変異法を用いてインビトロ
において生じさせてもよく、あるいは変化を誘導または選択する特定の選択条件
下において宿主生物中で生じさせてもよい。特別に得られるかかる配列の変種を
、元の配列の「変異体」または「誘導体」といってもよい。用語「類似性パーセント」、「同一性パーセント」および「相同性パーセント
」は、特定の核酸についていう場合、ウィスコンシン大学ＧＣＧソフトウェアプ
ログラム中に示されたように用いる。用語「ＮＳ５Ｂ」は、「ＮＳ５Ｂ蛋白」、「ＮＳ５Ｂポリペプチド」、「ＮＳ
５Ｂポリメラーゼ」またはこれらの用語の組み合わせを用いて呼ばれる蛋白をコ
ードする領域を特定するウイルスゲノムの３’末端付近にあるＨＣＶゲノムの一
部分をいう。天然状態のＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ
）として機能する。ＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸領域を「ＮＳ５Ｂ遺伝子」と
いうこともある。よって、用語「ＮＳ５Ｂ」は、それが用いられる文脈に応じて
、ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする核酸、ＮＳ５Ｂ遺伝子またはＮＳ５Ｂポリ
ペプチド、あるいはそれらの部分をいうことがある。さらにＮＳ５Ｂは、ＮＳ５
Ｂ核酸配列またはＮＳ５Ｂポリペプチドの自然対立遺伝子変種、変異体および誘
導体をいうことがある。ＮＳ５Ｂ核酸、ＮＳ５Ｂ遺伝子またはＮＳ５Ｂ蛋白は機
能的であてもよく、あるいは機能的でなくてもよい。また本発明は、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドまたは蛋白の活性部分、フラグメント、誘導体および機能的もしくは非機能的模倣物を包含する。ＨＣ
ＶＮＳ５Ｂの「活性部分」は、全長のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドより小さい
が、測定可能な生物学的活性を保持しているペプチドを意味する。

【００１８】ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドの「フラグメント」、「部分」は、少なくとも約５個ないし７個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７個ないし９個の
連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９個ないし１３個の連続したアミノ
酸、そして最も好ましくは少なくとも約１２個ないし３０個またはそれ以上の連
続したアミノ酸からなるアミノ酸残基の並びを意味する。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチド配列、抗原決定基、ウイルス性抗原またはエピトープのフラグメントは
、ＨＣＶＮＳ５Ｂアミノ酸配列の一部分に対する免疫応答を誘導するために有用である。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドまたはそのフラグメントの「誘導体」は、蛋白のアミノ酸配列を変化させることにより、例えば、蛋白をコードする核酸を処理
することにより、あるいは蛋白自体を変化させることにより修飾されたポリペプ
チドをいう。天然アミノ酸配列のかかる誘導体は、１個またはそれ以上のアミノ
酸挿入、付加、欠失または置換を包含してもよく、元のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドの必須活性を変化させるものであってもよく、変化させないものでもよい
。上記のごとく、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドまたは蛋白は、ＨＣＶ
ＮＳ５Ｂポリペプチドに由来し、ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドの少なくとも１の特性または他の特徴を保持しているアナログ、フラグメント、誘導体または変
異体を包含する。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドの異なる「変種」は天然に存在する。これらの変種は、蛋白をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の相違によ
り特徴づけられる対立遺伝子であってもよく、あるいは異なるＲＮＡプロセッシ
ングまたは翻訳後修飾を含むものであってもよい。当業者は、１個または複数個
のアミノ酸の置換、欠失、付加または置換を有する変種を製造することができる
。これらの変種は、とりわけ、（ａ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が保存
的または非保存的アミノ酸で置換されている変種、（ｂ）１個またはそれ以上の
アミノ酸がＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドに付加されている変種、（ｃ）１個またはそれ以上のアミノ酸が置換基を有する変種、ならびに（ｄ）ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドが、例えば抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオ
チン部分等のような有用な特性をＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドに付与しうる融合パートナー、蛋白タグまたは他の化学的部分のごとき別のペプチドまたはポリ
ペプチドと融合している変種、を包含しうる。本発明の他のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドは、１の種に由来するアミノ酸残基が保存的位置または非保存的位置
において別の種の対応残基で置換されている変種を包含する。もう１つの具体例
において、非保存的位置におけるアミノ酸残基が保存的または非保存的残基で置
換される。遺伝学的（抑制、欠失、突然変異等）、化学的、および酵素的方法を
包含するこれらの変種を得る方法は当業者に知られている。別の核酸プロセッシング形態ならびに別の修飾後修飾形態を包含する、かかる
対立遺伝子変種、アナログ、フラグメント、誘導体、変異体、および修飾体は、
ＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチドの生物学的特性を保持するＨＶＢＮＳ５Ｂポリペ
プチドの誘導体を生じ、それらは本発明の範囲内に包含される。

【００１９】本明細書の用語「機能的」とは、核酸配列が、列挙されたアッセイまたは目的
に関して機能的であることを意味する。語句「必須として含む」は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に用いる場合
、配列番号で示す配列の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に
ついていう場合、その語句はその配列自体およびその配列の基本的かつ新規な特
徴に影響しない分子修飾体を包含する。「レプリコン」は遺伝学的エレメント、例えば、プラスミド、コスミド、バク
ミド、ファージまたはウイルスであって、それ自身の制御下でよく複製できるも
のである。レプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、１本鎖または２本鎖
であってよい。「ベクター」はプラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスの
ごときレプリコンであり、別の遺伝学的配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡいずれか）がそれに結合していて該結合配列またはエレメントの複製を引き
起こすものであってもよい。「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例
えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター
等のごとき転写および翻訳制御配列を有していてもよく、ポリペプチドをコード
する配列の宿主細胞または生物中での発現を容易ならしめる核酸セグメントをい
う。

【００２０】本明細書の用語「オリゴヌクレオチド」とは、本発明のプライマーおよびプロ
ーブをいい、２個またはそれ以上、好ましくは３個以上のリボ−またはデオキシ
リボ核酸から構成される核酸分子とし定義される。オリゴヌクレオチドの正確な
サイズは種々の因子およびオリゴヌクレオチドの個々の適用および用途に依存す
る。本明細書の用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまた
は核酸をいい、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでもよく、例えば精製制限酵素消化
物中に本来的に存在するものであっても、あるいは合成により製造されるもので
あってもよく、当該プローブに相補的な配列にアニールでき、あるいは特異的に
ハイブリダイゼーションできるものである。プローブは１本鎖または２本鎖であ
ってよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブ源および使用方法を包含す
る多くの因子に依存する。例えば、診断への適用に関しては、標的配列の複雑さ
に応じて、典型的にはオリゴヌクレオチドプローブは１５〜２５個またはそれ以
上のヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもよい
。本明細書でいうプローブは、特定の標的核酸配列の異なる鎖に対して「実質的
に」相補的であるように選択される。このことは、１セットの前以て決定された
条件下で対応する標的鎖に「特異的にハイブリダイゼーション」またはアニール
するためにはプローブが十分に相補的でなければならないことを意味する。それ
ゆえ、プローブ配列は標的の正確な相補配列を反映するものである必要はない。
例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプローブの５’または３’末端に
結合していて、プローブ配列の残りの部分が標的鎖に相補的なものであってもよ
い。あるいはまた、非相補的塩基またはより長い配列がプローブ中に入っていて
もよいが、標的核酸配列に対して十分な相補性を有していて、プローブ配列が特
異的にアニールすることが条件である。用語「特異的にハイブリダイゼーション」は、十分な相補性を有する２個の１
本鎖核酸分子間の会合であって、当該分野において広く使用される前以て決定さ
れた条件下でのかかるハイブリダイゼーションを可能にする会合をいう（時々、
「実質的に相補的」という）。詳細には、該用語は、本発明の１本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡ分子中に含まれる実質的に相補的な配列とオリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションをいい、非相補的配列の１本鎖核酸とオリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションを実質的に排除する。

【００２１】本明細書の用語「プライマー」は、ＲＮＡまたはＤＮＡであるオリゴヌクレオ
チドをいい、１本鎖または２本鎖であってよく、生物学的システムに由来するも
の、制限酵素での消化により得られるもの、あるいは合成により製造されるもの
のいずれでであってもよく、正しい環境に置かれた場合に、鋳型に依存した核酸
合成のイニシエーターとして機能的に作用しうるものである。適当な核酸鋳型、
核酸の適当なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適当なコファク
ターならびに適当な温度およびｐＨのごとき適当な条件とともに存在する場合、
ポリメラーゼまたは類似の活性の作用によるヌクレオチド付加によって３’末端
においてプライマーが伸長されて、プライマー伸長生成物が生じうる。プライマ
ーは個々の条件および適用に関する必須因子に応じて様々な長さであってよい。
例えば、診断への適用においては、典型的には、オリゴヌクレオチドプライマー
は１５〜２５個またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。所望伸長生成物の
合成を開始させるためには、すなわち、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合
成の開始に使用される適当に並置されたプライマーの３’ヒドロキシル部分を提
供するに十分な様式で所望鋳型鎖とアニールできるためには、プライマーは、所
望鋳型に対して十分に相補的でなくてはならない。プライマー配列が所望鋳型に
正確な相補物である必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が相補的プ
ライマーの５’末端に結合していてもよい。あるいはまた、非相補的塩基がオリ
ゴヌクレオチドプライマー配列中に入っていてもよいが、プライマー配列が所望
鋳型鎖に対して十分な相補性を有し、伸長生成物の合成のための鋳型−プライマ
ー複合体を機能的に提供することが条件となる。本明細書記載のアミノ酸残基は
「Ｌ」異性体が好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性体の残基がＬ−アミノ酸残
基の代わりにあってもよいが、ポリペプチドの所望特性が保持されることが条件
である。本明細書に示されるすべてのアミノ酸残基配列は、右から左にアミノ末端から
カルボキシ末端とする慣用的なものである。

【００２２】用語「単離蛋白」または「単離精製蛋白」を本明細書に時々使用する。この用
語は、主として、本発明の単離核酸分子の発現により生成される蛋白をいう。あ
るいはまた、この用語は、本来的には関連している他の蛋白から十分に分離され
て、「実質的に純粋」な形態で存在する蛋白をいう。「単離」は、他の成分また
は材料との人工的または合成的混合物を排除すること、あるいは基本的活性を妨
害せず、例えば精製不十分、安定化剤添加、または例えば免疫原性調合物もしく
は医薬上許容される調合物中への配合によっって存在する可能性のある不純物の
存在を意味するのではない。用語「実施知的に純粋」は、少なくとも５０〜６０重量％の物質（例えば、核
酸、オリゴヌクレオチド、蛋白等）を含む調合物をいう。より好ましくは、調合
物は少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９５重量％の化合物を含む。
純度は、化合物に適した方法により測定される（例えば、クロマトグラフィー法
、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析等）。「成熟蛋白」または「成熟ポリペプチド」は、ポリ蛋白前駆体からの蛋白分解
プロセッシングのごとき発生の過程でポリペプチドに通常生じるプロセッシング
後のポリペプチド配列を有するポリペプチドを意味する。成熟蛋白の配列または
境界を示す際に、成熟蛋白配列の１番目のアミノ酸をアミノ酸残基１とする。よ
って、成熟ＮＳ５Ｂ蛋白の１番目のアミノ酸残基は、すべての既知ＨＣＶ配列に
関してセリン残基である。本明細書にて用いるように、成熟蛋白のアミノ酸１に
先行する天然には見られないアミノ酸残基を−１、−２、−３などとする。組み
換え発現系に関しては、メチオニンイニシエーターコドンがしばしば翻訳効率化
の目的で使用される。よって、ＮＳ５Ｂの場合、メチオニンコドンをセリンコド
ンの直前に置いてもよい。得られたポリペプチド中のこのメチオニン残基は、本
明細書によれば、成熟ＮＳ５Ｂ蛋白配列に対して−１の位置に置かれている。

【００２３】用語「タグ」、「タグ配列」または「蛋白タグ」は、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸、ペプチドもしくは蛋白または他
の化学物質のいずれかである化学的部分をいい、別の配列に付加された場合、特
に、該別の配列の検出または単離においてさらなる有用性を提供し、あるいは有
用な特性を該別の配列に付与するものである。よって、例えば、ホモポリマー核
酸配列または捕捉オリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸配列をプライマーま
たはプローブに付加して、その後行う伸長生成物またはハイブリダイゼーション
生成物の単離を容易ならしめてもよい。蛋白タグの場合、ヒスチジン残基（例え
ば、４個ないし８個の連続したヒスチジン残基）を蛋白のアミノまたはカルボキ
シ末端に付加して、キレート金属クロマトグラフィーによる蛋白の単離を容易な
らしめてもよい。別法として、特定の抗体分子または他の分子（例えば、フラッ
グエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスのヘマグルチ
ニン蛋白の膜貫通エピトープ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合蛋
白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ等）と反応するエピトープまたは結合決定基である、アミノ酸配列、ペプ
チド、蛋白または融合パートナーを蛋白に付加して、アフィニティーまたは免疫
アフィニティークロマトグラフィーのごとき手順による蛋白の単離を容易ならし
めてもよい。化学タグ部分は、核酸または蛋白のいすれかに付加でき、アビジン
試薬との相互作用により単離または検出を容易ならしめることのできるビオチン
のごとき分子等を包含する。他の多くのタグ部分が当業者に知られ、考えられて
おり、それらはこの定義の範囲内である。

【００２４】本明細書の用語「リポーター」、「リポーターシステム」、「リポーター遺伝
子」、または「リポーター遺伝子産物」は作動性の遺伝子システムを意味し、該
システム中において、核酸は、例えば生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジ
オイムノアッセイ、または比色法、蛍光法、化学発光法または他の方法により容
易に測定できるリポーターシグナルを発現の際に生じる遺伝子産物をコードして
いる遺伝子を含んでいる。核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであってよく、直鎖状また
は環状であってよく、１本鎖または２本鎖であってよく、アンチセンスまたはセ
ンス鎖であってよく、リポーター遺伝子産物の発現に必要な制御エレメントに作
動可能に連結されている。必要な制御エレメントは、リポーターシステムの性質
およびリポーター遺伝子がＤＮＡ形態かＲＮＡ形態かにより様々であるが、プロ
モーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグフ
ナル等のごときエレメント（これらに限らない）を包含しうる。用語「形質転換」、「トランスフェクト」、「ドランスデュース」は、各酸を
細胞または宿主生物中に導入する方法または手段をいい、同じ意味を表すために
混用することがある。かかる方法は、トランスフェクション、エレクトロポレー
ション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ−融合等を包含するが、これらに限
らない。導入された核酸は受容細胞または生物の核酸中に組み込まれ（共有結合し）て
もよく、組み込まれなくてもよい。細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞におい
て、例えば、導入された核酸は、プラスミドのごときエピソームエレメントまた
は独立したレプリコンであってもよい。あるいはまた、導入された核酸は受容細
胞または生物の核酸中に組み込まれるようになり、当該細胞または生物中で安定
に維持され、さらに継代され、あるいは受容細胞または生物の子孫細胞または生
物に遺伝されるものであってもよい。他の様式において、導入された核酸は受容
細胞または生物中に一時的にのみ存在するもであってもよい。

【００２５】「クローン」または「クローン細胞集団」は、単一細胞または共通の祖先から
有糸分裂により派生する細胞集団である。「細胞系」は、インビトロにおいて多くの世代にわたり安定に増殖しうる一次
細胞のクローンまたは細胞集団である。「免疫応答」は、機能的な免疫系を有する宿主においてウイルス抗原のごとき
抗原により引き起こされる反応を意味する。免疫応答は、その性質において体液
性、すなわち免疫グロブリンまたは抗体の産生を含むもの、あるいはその性質に
おいて細胞性、すなわち種々のタイプのＢおよびＴリンパ球、樹状細胞、マクロ
ファージ、抗原提示細胞等を含むもの、あるいはそれらの両方であってよい。免
疫応答は、サイトカイン、リンフカイン等のごとき種々のエフェクター分子の産
生または生成を含むものであってもよい。インビトロおよび種々の細胞または動
物系の両方において免疫応答を測定することができる。かかる免疫応答は宿主を
疾病から防御することにおいて重要である可能性があり、予防的および治療的に
用いることができる。「ウイルス抗原」は、宿主の機能的免疫系の反応を起こさせる潜在能力を有す
るウイルス由来のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白配列、セグメントまたはエ
ピトープである。「抗体」または「抗体分子」は、特異的抗原に結合する、抗体およびそのフラ
グメントを包含する免疫グロブリンである。該用語はポリクローナル、モノクロ
ーナル、キメラ、および二特異性抗体を包含する。本明細書において使用するよ
うに、抗体または抗体分子は両方とも無傷の免疫グロブリン分子ならびにＦａｂ
、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当該分野で知られた免疫グロ
ブリン分子の部分のごとき免疫学的に活性のある免疫グロブリンの分子の部分を
包含する。本明細書の用語「生きた宿主」はヒトでない自立性存在を意味する。

【００２６】発明の詳細な説明ＨＣＶは輸血に伴う、特発性の非Ａ、非Ｂ肝炎の主要な原因病原体である。多
くのＨＣＶ感染患者は慢性肝炎になり、これが最終的に硬変症に至り、しばしば
肝細胞の癌腫を進行させる。この疾患の新しい有効治療法が差し迫って必要とさ
れている。ＨＣＶは、およそ９.４キロベースの(＋)鎖の鎖状ＲＮＡゲノムを有する包膜(
enveloped)ウイルスである。この核酸は、ウイルス性および細胞性プロテアーゼ
により少なくとも９つの異なるウイルス性ポリペプチドにプロセッシングされる
巨大ポリ蛋白をコードする。本発明の１の態様において、本発明はＨＣＶ感染患者由来のＨＣＶ遺伝物質を
提供する。本発明はさらに、これらの配列および、ＲｄＲｐ活性を有する配列か
ら発現されるＨＣＶ組換えＮＳ５Ｂ蛋白を提供する。組換えＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子配列の発現は、細菌、酵母、哺乳動物、昆虫および植物細胞系を包含する、これらには限定されない様々な系において、ならび
に、感染、形質移入、形質導入または遺伝子組換え昆虫、動物または植物のよう
な生物体において行うことができる。本発明の一態様においては、感染後、培養
中の昆虫細胞内でＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子配列を発現させるための組換えバキュロウイルスを構築した。

【００２７】ＨＣＶに感染した患者の血清から抽出したＲＮＡを、ＮＳ５Ｂ遺伝子配列を増
幅するために設計したプライマーオリゴヌクレオチドを用いて逆転写酵素-ネステッドポリメラーゼ連鎖反応法に供した。ネステッドＰＣＲ反応のためのプライ
マーはＮＳ５Ｂ遺伝子のバキュロウイルス発現輸送ベクターへの直接クローニン
グを可能にし、確認されたＮＳ５Ｂコード配列の第一アミノ酸のすぐ前に開始メ
チオニンコドンを提供する。数個の輸送ベクタークローンからのＮＳ５Ｂ遺伝子
を配列決定し、組換えバキュロウイルスを作成するのに用いた。これらのウイル
スでＳｆ９細胞を感染させた後、ＨＣＶＮＳ５Ｂ配列特異的抗血清を用いてウエスタン免疫ブロットを行うことにより、６８キロダルトンのＮＳ５Ｂ蛋白の明
らかな産生が示された。

【００２８】本発明の他の側面において、発現し、精製し、およびＲｄＲｐ活性を評価する
ＮＳ５Ｂ配列は、高活性、ほとんど活性なし、若しくは全く活性なし、と変動す
るレベルのＲｄＲｐ活性を有する可能性があり、ゆえに、機能的な配列、あまり
機能的でない配列、若しくは全く機能的でない配列をそれぞれ表す可能性がある
。そのような配列も、本発明に従い活性を評価する。本発明の更なる側面において、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を特に変化さ
せることによりＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白を修飾することができ、これにより修飾された機能性を有するＲｄＲｐ酵素を得る。そのような変化はわずかであってもよ
く、ヌクレオチド配列の場合におけるような保存的置換を示してもよく、コード
されるアミノ酸を変化させるまたは変化させないコドン配列の変化であってもよ
く、またはアミノ酸配列に関して、保存的な残基の置換、付加または欠失を生じ
る変化であってもよい。本発明のさらに更なる側面において、本発明の配列から誘導されるＮＳ５Ｂ核
酸およびポリペプチドは、研究、診断、治療および医薬上の適用に関連する多数
の方法、アッセイおよびキットに、およびＨＣＶ疾患の予防および治療のための
抗ウイルス法の開発に利用できる。本明細書に記載する発見に基づき、ＮＳ５Ｂ遺伝子または蛋白のヌクレオチド
またはアミノ酸配列に関する単純な知識または単なる検討だけでは、特定のＮＳ
５Ｂ配列が酵素活性または機能的有用性を有する配列を表すことを推論若しくは
予測し得るのには不充分であることは明らかである。

【００２９】ＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸分子およびＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の調製ならびにアッセイ
法およびキットにおけるその使用。Ａ.核酸分子本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸分子は２つの一般法により調製することができる：(１)それらは適当な化学的出発物質から合成することがで
き、あるいは(２)それらは生物学的供給源から単離することができる。両方法は
当該分野で周知のプロトコールを利用する。本明細書中にＨＣＶＮＳ５Ｂ配列に関して提供されるようなヌクレオチド配列情報を利用して、オリゴヌクレオチド合成による本発明の単離核酸分子の調製
が可能になる。合成オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems ３８ＡＤＮＡ
合成装置または同様の装置に用いられるホスホルアマダイト(phosphoramadite) 法により調製することができる。生じた構築物は、高速液体クロマトグラフィー
(ＨＰＬＣ)のような当該分野で公知の方法に従い精製することができる。本発明
のＤＮＡ分子のような、長い、二本鎖のポリヌクレオチドは、現在のオリゴヌク
レオチド合成法に固有のサイズ制限のために、複数段階で合成されなければなら
ない。つまり、例えば３キロベースの二本鎖分子は、適当な相補性の数個の小セ
グメントとして合成することができる。このように作成された相補的セグメント
は、各セグメントが隣接セグメントの接着のための適当な付着末端を有するよう
に連結することができる。隣接セグメントは全３キロベースの二本鎖分子を構築
するために、ＤＮＡリガーゼの存在下で付着末端をアニーリングすることにより
連結することができる。そのように構築された合成ＤＮＡ分子を次いでクローニ
ングし、適当なベクターにおいて増幅することができる。

【００３０】ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白をコードしている核酸配列は、適当な生物源から当該分野で公知の方法を用いて単離することができる。例えば、ＨＣＶに感染した患者
の血清から単離されたＲＮＡを、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白をコードするｃＤＮＡ分子の作成のための適当な出発物質として使用することができる。本発明に従い、本発明のＤＮＡ分子の蛋白コード領域と適当なレベルの配列相
同性を有する核酸は、適度に厳密なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用
いて同定することができる。例えばハイブリダイゼーションは、例えば５×ＳＳ
Ｃ、５×デンハルト試薬、１.０％ＳＤＳ、１００μｇ/ｍｌの変性、断片化サケ
精子ＤＮＡ、０.０５％ピロリン酸ナトリウムおよび５０％までのホルムアミド;
を含むハイブリダイゼーション溶液を用いて行うことができる。ハイブリダイゼ
ーションは３７〜４２℃で、少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーションの
後、フィルターを次のように洗浄する。(１)室温にて２×ＳＳＣおよび１％ＳＤ
Ｓ中で５分間;(２)室温にて２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ中で１５分間;(３) ３７℃にて１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で３０分〜１時間;(４)４２-６５℃に
て１×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中で２時間。溶液は３０分ごとに変える。

【００３１】特定の配列相同性を有する核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するた
めに要求される厳密条件を計算するための一つの一般式は次のようである(Sambr
ook ら, 1989): Tm=81.5℃＋16.6Log[Na⁺]＋0.41(% G＋C)-0.63(% ホルムアミド)-600/二本鎖中の塩基対数

【００３２】前式の実例として、[Ｎａ＋]＝[０.３６８]および５０％ホルムアミド、４２％のＧＣ含量および平均２００ベースのプローブサイズを用いると、Ｔ_mは５７ ℃である。相同性が１％減るごとにＤＮＡ二本鎖のＴ_mは１〜１.５℃低下する。
つまり、約７５％以上の配列同一性を有する目的物は、４２℃のハイブリダイゼ
ーション温度を用いて観察されることになる。そのような配列は本発明の配列と
実質的に相同であると考える。本発明の核酸は、いずれかの市販のクローニングベクター中にＤＮＡとして保
持することができる。一態様においてクローンは、pBluescript プラスミド(ストラタジーン、La Jolla, CA)のようなプラスミドクローニング/発現ベクターま
たは、適当な大腸菌宿主細胞中で増殖するpFastBac ベクター(Gibco-BRL, Gaith
ersburg, MD)のような組換えバキュロウイルス輸送ベクター中に保持する。本発明の核酸は、本発明の核酸の配列変種を作成するための出発物質として、
部位特異的突然変異誘発法を含むがこれには限定されない、当該分野で周知の多
くの合成および分子生物学的方法を用いて使用することもできる。特定の突然変
異は、酵素活性が増大するなどの特徴が変化したＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白を生じる可能性がある。本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白コード核酸分子には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよびそのフラグメントが含まれ、これらは一本若しくは二本鎖であっ
てもよい。つまり本発明は、本発明で同定した配列のいずれかの配列を実質上有
するｃＤＮＡの選抜セグメントのような、本発明の核酸分子の少なくとも一つの
配列とハイブリダイゼーションすることができる配列を有するオリゴヌクレオチ
ド(ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖)を提供する。そのような
オリゴヌクレオチドはさらに、別のＨＣＶＮＳ５Ｂをコードする核酸を検出または単離するためのプローブおよびプライマーとしてさらに有用である。

【００３３】Ｂ．蛋白本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂは、多くの既知の方法に従う種々の操作にて調製することができる。分配および沈殿方法、アフィニティ精製方法、従来のクロマト
グラフィー法、高性能クロマトグラフィー法などを含む、種々の技法により、蛋
白は適当な供給源、例えば、増殖細胞、組織または器官より精製することができ
る。ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸分子の利用可能性は、当該分野にて公知のインビトロでの発現方法を用いて蛋白を産生を可能にすることである。例え
ば、インビトロにてＲＮＡを合成するためにｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５などの
適当なインビトロ転写ベクターにｃＤＮＡまたは遺伝子をクローンし、つづいて
適当な無細胞翻訳系、例えば、小麦麦芽の抽出物、ウサギ網状赤血球またはＨｅ
Ｌａ細胞中でそのＲＮＡを無細胞翻訳に付することができる。インビトロの転写
および翻訳系は市販されている（例えば、Promega Biotech、Madison、WI；Gibc
o-BRL、Gaitherburg、MD)。

【００３４】また、本発明の好ましい具体例によれば、多量のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白を、適当な原核または真核生物系、例えば、細菌、真菌、哺乳類または植物系で発現さ
せることで産生することができる。例えば、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ分子の一部ま
たはすべてを、イー・コリなどの細菌細胞中の発現に適するプラスミドベクター
に、あるいは昆虫細胞中の発現のためのバキュロウイルスベクターに挿入しても
よい。かかるベクターは、宿主細胞（例えば、イーコリまたは昆虫細胞）中のＤ
ＮＡの発現に不可欠な調節エレメントを含み、それは宿主細胞中のＤＮＡの発現
を可能とするように配置される。このような発現に不可欠な調節要素は、プロモ
ーター配列、転写開始および終止配列、エンハンサー配列、翻訳調制御列等を包
含する。組換え原核または真核生物系での遺伝子発現により産生されるＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白またはその誘導体は、当該分野にて公知の方法に従って精製することがで
きる。一の具体例において、組換え蛋白を宿主細胞より発現させ、つづいて分泌
させ、その周辺培地からの精製が容易である、市販の発現／分泌系を使用するこ
とができる。発現／分泌ベクターを使用しないとした場合、別法としては、発現
細胞、組織または器官の抽出物から標準的蛋白精製法により、またはアフィニテ
ィ分離法、例えば、組換え蛋白に特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用に
より、もしくはＮ−末端またはＣ−末端を５〜８個のヒスチジン残基でタグ化し
た組換え蛋白を単離するためのニッケルカラムにより、組換え蛋白を精製するこ
とが挙げられる。かかる方法は当業者により一般に使用されている。

【００３５】上記した方法により調製される本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白は、標準的技法に従って分析することができる。例えば、かかる蛋白は、電気泳動分析に、およ
びアミノ酸配列分析に、ならびに公知方法に従って構造を決定するための結晶学
的分析に付すことができる。かかる分析により、ＮＳ５Ｂ蛋白の機能性に関する
、およびその機能性に影響を及ぼす手段について、例えば、ＮＳ５Ｂ蛋白の機能
を阻害しうる分子を設計するにおいて、有用な情報が得られる。

【００３６】Ｃ．アッセイ方法および装置本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ配列は、研究、診断、治療および医薬用途にて有用性を有する種々の操作に用いることができる。本発明の組成物を用いる代表的方
法を以下に記載する。一の態様において、本発明の核酸配列およびこれら配列に相補的な配列を、生
体または合成調製物中の関連する核酸を検出、標識、同定または単離するための
プローブまたはプライマーとして用いることができる。例えば、本発明の核酸配
列を試料中のＨＣＶの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブと
して用いることができる。さらに、かかるハイブリダイゼーションプローブが当
該分野にて周知の技法によりハイブリダイズする核酸を単離するのに、上記した
プローブを使用することができる。加えて、本発明の核酸配列は、逆転写酵素−
ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などの技法を用いて、ＨＣＶまたは関連
する核酸を検出または単離するためのプライマーとして用いることができる。さ
らに、適当な一対のプライマーをネステッドＰＣＲ法にて用いることもできる。
かかるプライマー、一対のプライマーおよびプローブは、本発明のＮＳ５Ｂ配列
のいずれかの部分を示す。使用するＮＳ５Ｂ遺伝子の実際の配列は個々の用途に
従って変化するであろう。その上さらに、付加的な配列を、ＨＣＶプライマーま
たはプローブ配列、例えば、ホモポリマー末端（タグ）、有用な制限酵素認識部
位を示す配列、特定のアミノ酸残基をコードする配列、開始もしくは終止コドン
またはすぐ近くにある特定の用途に有用な可能性のある他の配列に加えることが
できる。典型的には、本発明の配列と同一であるか、または相補的である、長さ
が１０ないし８０個のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼー
ションプローブとして、またはＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマーとして有用で
ある。また、例えば、完全なＮＳ５Ｂ配列を捕獲ハイブリダイゼーションプロー
ブとして利用することもできる。

【００３７】本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブとして有用ないくつか
の例は、表１に列挙した配列、これらの配列に相補的な配列およびこれらの配列
の一部を含む。

【００３８】表１プローブおよびプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド５'-TCAATGTCCTACACATGGAC-３' 配列番号１４５'-CTACACATGG-３' 配列番号１５５'-CTCTGATTACACCATGCGCTGCGGAGGAGAGCAAGCTGCCC-３' 配列番号１６５'-AATGCGCTGAGCAACTCTTTGCTGCGCC-３' 配列番号１７５'-CCATAACATGGTCTATGCCACAACATCCCGCAGCGCAAGCCAGCGGC-３' 配列番号１８５'-GAAGAAGGTAACTTTTGACAGG-３' 配列番号１９５'-CAAGTCCTGGATGACCACTACCG-３' 配列番号２０５'-GACGTGCTCAAGGA-３' 配列番号２１５'-ATGAAGGCGAAGGCGTCC-３' 配列番号２２５'-GGAAGAAGCCTGTAAG-３' 配列番号２３５'-GAACCTATCCAGCAAGGCCGTTAA-３' 配列番号２４５'-ACCAGAGAAAGGAGGCCGC-３' 配列番号２５５'-ACCCAGACTTGGGG-３' 配列番号２６５'-TCTCCACCCTTCCTCAGGCT-３' 配列番号２７５'-CGAGTTCCTGGTGAATGCC-３' 配列番号２８５'-TGCCCTATGGGCTTCGCATATGAC-３' 配列番号２９５'-TTTCGACTCAACGGTCACCGAGAAT-３' 配列番号３０５'-GTTGAGGAGTCAATT-３' 配列番号３１５'-TTGGCCCCCGAAGCCAGACA-３' 配列番号３２５'-AAGGTCGCTTACAGAGC-３' 配列番号３３５'-ATCGGGGGTCCCCTGAC-３' 配列番号３４５'-TAACTCAAAAGGGCAGAG-３' 配列番号３５５'-ATGTTACTTGAAGGCCTCT-３' 配列番号３６５'-GATGCTTGTGTGCGGAGACGACCTC-３' 配列番号３７５'-GGTCGCGCACGATGCATCTGGCAAAAGGGTA-３' 配列番号３８５'-CACCACCCCTCTTGCGCGG-３' 配列番号３９５'-CTCCATCCTTCTAGCTCAGGAGCAA-３' 配列番号４０５'-AGTTACTGTCCCAGGGGGGG-３' 配列番号４１５'-TCCGGCTGCGTCCCAGT-３' 配列番号４２５'-CCGACCCCGCTGGTTCATGTGGTGCC-３' 配列番号４３５'-CTACCTGCTCCCGAACCGA-３' 配列番号４４５'-CTACCTGCTCCCCAACCGA-３' 配列番号４５

【００３９】加えて、本発明の核酸配列は、部位特異的突然変異誘発法を含む、当該分野に
て公知の種々の方法を用い、本発明の配列の変種または変異体を生成するための
プライマーとして用いることができる。もう一つ別の態様において、本発明の核酸配列を用い、感染性ウイルス、ベク
ターまたはレプリコンを構築または生成することができ、あるいはその中に挿入
することができる。本発明の機能的に優れたＮＳ５Ｂ配列の、機能性の乏しいま
たは非機能的なカウンターパートへの付与または置換は、得られるウイルスまた
は複製ユニットの感染および複製特性を改良するのに役立つであろう。例えば、
Riceら（ＰＣＴＷＯ９８／３９０３１）はＨＣＶの感染性核酸を付与する。この感染性クローンでコードされたＮＳ５Ｂポリメラーゼは、本発明のポリメラー
ゼよりもそのＲｄＲｐ活性の点で実質的に劣っていることを本発明において明ら
かにする。したがって、RiceらのＮＳ５Ｂコード化遺伝子を本発明の遺伝子と置
換すれば、ＮＳ５Ｂ遺伝子の改良特性および本発明のコードされた蛋白により、
ウイルス複製が改良された結果が得られるであろう。かかる置換は当該分野にて
周知の標準的遺伝子工学操作により行うことができる。得られた感染性核酸は、
生存宿主およびインビトロ系において、限定されるものではないが、改良された
または高レベルの感染性ウイルスＲＮＡ合成、改良レベルの感染性ウイルス産生
および改良されたウイルス複製を含め、最近のＨＣＶの感染性クローンに比べて
かなり優れている。ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼの機能が重要である他の系における、例えば、相補系またはトランス相補系、レプリコン系、欠陥ウイルス、
欠陥干渉性粒子などにおける使用もまた、本発明の核酸配列の使用から利益があ
るであろう。

【００４０】もう一つ別の具体例において、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白に対する免疫応答を惹起するための方法にて本発明の核酸配列を用いることができる。例えば、発現オペ
ロンに作動的に結合した本発明のＮＳ５Ｂコード化核酸配列を、生存宿主または
機能的免疫系を有するヒトの、細胞に、特に樹状突起細胞などの抗原提示細胞に
直接導入することができる。配列の導入は、トランスフェクション、形質転換ま
たは形質導入法を利用してもよく、あるいはＮＳ５Ｂ核酸配列を被覆した粒子、
例えば、プラスミドを被覆した金粒子の物理的摂取を含む。細胞内に入ると、Ｎ
Ｓ５Ｂ配列は、発現およびプロセッシングを行い、宿主免疫系に対して提示され
る。かかる方法は、生存宿主における、およびヒトにおける体液性または細胞性
免疫応答の惹起において、およびＨＣＶ用のワクチンにおいて有用である。

【００４１】さらに、本発明の核酸配列は、ＮＳ５Ｂ蛋白を発現する細胞系または細胞シス
テムの生成において用いることができる。機能的なＮＳ５Ｂ蛋白を本発明のＮＳ
５Ｂ遺伝子より発現するかかる細胞系は、ＨＣＶに対するアンタゴニストまたは
アゴニスト活性について物質をアッセイするための方法にて有用性を有する。例
えば、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白を発現する無傷の細胞をＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋
白の細胞内活性に影響すると考えられる物質と接触させ、かかる物質のＨＣＶＮＳ５Ｂ活性についての影響を測定することで、アッセイを確立することができ
る。かかる物質のＨＣＶＮＳ５Ｂ活性に対する影響は多くの方法で測定することができる。例えば、ＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性に直接または間接的に依存するＲＮＡ合成を定量してもよい。一の方法において、ＮＳ５Ｂ活性に応じ
てトリクロロ酢酸で沈殿しうるＲＮＡに挿入した放射標識したＲＮＡの前駆体（
例えば、³Ｈ−ウリジン）の量を測定することができる。

【００４２】あるいは、そのような細胞システムは、リポーターシグナルの産生がＨＣＶＮＳ５ＢポリメラーゼによるＲＮＡ合成に依存するリポーターシステムを利用し
てもよい。１つの具体例において、ｍＲＮＡのアンチセンス鎖であるＨＣＶＮＳ５ＢポリメラーゼのＲＮＡ基質が提供される。そのセンス鎖（ｍＲＮＡ）は有
効に翻訳されて、検出できるまたは検出可能なシグナル（リポーター）を産生で
きるポリペプチドを産生する。例えば、ルシフェラーゼのコード配列に相補的な
配列（アンチセンス鎖）を含むＲＮＡ分子が提供される。このＲＮＡに対するＨ
ＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼの活性によって、ルシフェラーゼ遺伝子のセンス鎖が産生される。これは次いで細胞翻訳系によって翻訳され、ルシフェラーゼ蛋白
が産生される。次いで、このルシフェラーゼ蛋白を、ルシフェラーゼ蛋白に対す
る抗体によって、またはインタクトな細胞もしくは細胞抽出物中のルシフェラー
ゼ酵素活性のルミノメーターもしくはその他の同様なデバイスを使用する測定に
よって検出してもよい。限定するものではないが、β−ガラクトシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、緑色蛍光蛋白などを包含する多数の他のリポーターを同様
にこれに良好に適用し得る。さらに、本発明のこの方法に使用する細胞システム
は、細菌、真菌、昆虫、鳥、哺乳動物または植物起源であってもよい。

【００４３】さらに、本発明の核酸配列を、ＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸配列と相互作用できるかまたはＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸配列に影響を及ぼすことができる薬剤または材料を同定するためのアッセイに使用してもよい。例えば、本発明の核酸配列を提供し
、次いでこの配列と相互作用する可能性があると思われる薬剤または材料を接触
させるアッセイを確立してもよい。そのような相互作用アッセイにおいて同定さ
れた薬剤は、潜在的診断有用性および、例えば生物学的試料中のＨＣＶの検出に
おける用途を有する。そのような薬剤は、罹患した生体宿主（ヒトを含む）にお
けるＨＣＶ疾患の予防または処置を含む適用、ならびに生体宿主および細胞、組
織、器官培養物のようなインビトロ系におけるＨＣＶの複製または伝播の阻害ま
たは増強のための適用における潜在的有用性も有する。特定の薬剤の性質が明ら
かになれば、さらなる適用が意図され得る。

【００４４】本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白組成物も広い有用性を有する。診断適用においては、例えば、ＮＳ５Ｂ蛋白またはそのペプチドをその免疫応答の検出用のアッ
セイに使用してもよい。例えば、本発明の蛋白配列またはペプチドをその配列を
マトリックス上に固定化し、これを使用してその配列に対する抗体を捕獲するア
ッセイにおいて使用してもよい。さらに、本発明の蛋白配列またはペプチドを、
例えば免疫細胞増殖アッセイにおいて使用して、この蛋白に対する細胞媒介性免
疫応答を検出または測定してもよい。

【００４５】本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白組成物は、ワクチンにおけるような免疫応答の誘起における潜在的有用性も有する。例えば、本発明のＮＳ５Ｂ蛋白またはその
ペプチドを、機能している免疫系を有する生体生物に提供することによって、そ
の生物にＮＳ５Ｂ配列に対する免疫応答が付与される。ＮＳ５Ｂ配列を、当業者
に周知のいずれかの多数のアッセイにおいて生体生物に提示してもよく、限定す
るものではないが、遊離蛋白またはペプチドの提供、製剤化された蛋白またはペ
プチド、アジュバント化された蛋白またはペプチド、ＮＳ５Ｂ配列が存在するイ
ンタクトなまたは破壊された細胞に関連した蛋白またはペプチド、ならびにその
他のそのような様式を包含する。そのようにして誘起される免疫応答は、体液性
もしくは細胞性のいずれかまたはその両方の性質であってもよい。そのような免
疫応答は、生体宿主のＨＣＶ疾患からの防御において重要であり得、また、抗体
のような有用な免疫学的試薬（これはさらに治療もしくは診断有用性を有し得る
）の供給源を提供し得るかまたはそのような供給源として作用し得る。さらに、
本発明のＮＳ５Ｂ蛋白またはそのペプチド部分をＮＳＢ５に対する抗体を選択ま
たは精製するために使用してもよい。例えば、ＮＳ５Ｂ蛋白を固定化し、これを
使用してＮＳ５Ｂ蛋白に特異的な抗体を結合させ、そのような抗体を富化させて
もよい。さらに、本発明のＮＳ５Ｂ蛋白およびペプチドを、当該分野で公知の標
準的技術を使用してＮＳ５Ｂ蛋白に対するモノクローナル抗体を生成するために
使用してもよい。ＮＳ５Ｂ蛋白に対する抗体（ポリクローナルまたはモノクロー
ナルのいずれか）を、ＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性の酵素活性に影響を及ぼすその能力についてさらに評価してもよい。

【００４６】上記の適用に有用なＮＳ５Ｂ蛋白配列の部分のいくつかの例は、表２に挙げる
配列またはその部分を包含する。

【００４７】

【表１】

【００４８】本発明の蛋白組成物は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白と相互作用できるかまたはＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白に影響を及ぼすことができる薬剤の検出および同定用のアッセイにおける有用性を有する。本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂポリペプチド配列を提供し、次いでこの配列と相互作用するのではないかと思われる薬剤または材料を接
触させるアッセイを確立してもよい。例えば、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白またはそのフラグメントもしくは部分を提供し、接触された薬剤をこの蛋白に特異
的に結合するその能力について評価してもよい。そのような結合薬剤は、潜在的
診断有用性および、例えば生物学的試料中のＨＣＶの検出における用途を有する
。そのような結合薬剤はさらにＨＣＶ蛋白の機能的活性（ＨＣＶＮＳ５Ｂ機能の阻害または増強のいずれかのような）に影響を及ぼし得る。ＮＳ５Ｂ蛋白の機
能を阻害する薬剤は、罹患した生体宿主におけるＨＣＶ疾患の予防または処置を
含む適用、または生体宿主（ヒトを含む）、細胞、組織、器官培養物のようなイ
ンビトロ系または生物学的材料におけるＨＣＶの複製または伝播の阻害のための
適用における潜在的用途を有する。ＮＳ５Ｂ蛋白の機能を増強する薬剤は、生体
生物における（例えば、ＨＣＶ複製の動物モデル、細胞、組織および器官培養物
のようなインビトロ系における）ＨＣＶの複製、伝播または産生を含む適用にお
ける潜在的有用性を有する。

【００４９】別の具体例において、本発明の酵素的に活性なＮＳ５Ｂ蛋白によって供給され
るＨＣＶＮＳ５Ｂポリメラーゼ活性を直接的に測定するアッセイ法が提供される。この酵素的に活性なＮＳ５Ｂポリメラーゼと接触させられた薬剤を、この酵
素活性に特異的に影響を及ぼすその能力について評価してもよい。そのような酵
素的に活性なポリメラーゼは、ポリメラーゼが産生された細胞の抽出物または溶
解物中で、インビトロ無細胞発現系中で、または豊富化もしくは精製された形態
で提供され得る。

【００５０】抽出物中で、無細胞系で、または富化された形態で提供されたＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の酵素活性をそれによって評価し得る多数の手段が存在し、これらは当該
分野において周知である。代表的には、ＮＳ５Ｂ依存性ＲＮＡ合成は特定の反応
成分（少なくとも、緩衝化媒質、２価カチオン、ＲＮＡの前駆体（ヌクレオシド
３リン酸、ＮＴＰ）、ＲＮＡテンプレートおよびこのテンプレート上でのＲＮＡ
合成用のプライマーを包含する）を必要とする。さらなる成分は、１価カチオン
、還元剤、安定化剤、補因子およびＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性に無関係な活性の阻害剤（例えば、ＲＮａｓｅ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホトランスフェラ
ーゼおよび類似の活性の阻害剤）を包含し得る。

【００５１】ＮＳ５Ｂ依存性ＲＮＡ合成の測定を多数の方法で評価してもよい。一例では、
ＲＮＡポリマーへのＲＮＡ前駆体の取り込み、例えば、放射能標識ＮＴＰのトリ
クロロ酢酸沈殿可能ＲＮＡへの取り込み（これをシンチレーション分光法または
ホスホルイメージング（phosphorimaging）技術によって定量してもよい）を測定する。あるいは、そのような前駆体に他の部分でタグを付して、その容易な検
出を可能にしてもよい。例えば、アビジン試薬（アルカリホスファターゼなどの
ような種々のアビジン結合体を包含する）を用いる検出のためにビオチンで、ま
たは蛍光分極のような蛍光技術を使用する検出のために蛍光標識ＮＴＰでタグを
付してもよい。

【００５２】ＮＳ５Ｂ依存性ＲＮＡ合成を、テンプレートＲＮＡ分子上でのＲＮＡ合成を開
始するためにポリメラーゼによって使用される事前に標識したまたはタグを付し
たＲＮＡ合成のプライマー（例えば、放射能標識またはビオチンタグ付加オリゴ
ヌクレオチド）の伸長を測定することによって評価してもよい。プライマーの伸
長を、ヌクレオシド３リン酸のプラマ―への付加を定量することによって、プラ
イマー生成物の長さを測定することによって、または当該分野において公知のそ
の他の方法によって評価してもよい。

【００５３】あるいは、ＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性の生成物を、ハイブリダイゼーション技術を使用して生成物ＲＮＡを捕獲することによって検出および定量してもよい。例
えば、ＮＳ５ＢＲｄＲｐ反応生成物に相補的なオリゴヌクレオチドを反応の間または反応後に導入し、生成物にハイブリダイズさせてもよい。添加したオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度を混合物中に存在する生成物ＲＮ
Ａ量の尺度として用い、当該分野において公知の種々の手段によって評価しても
よい。

【００５４】ＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性の生成物を検出する他の手段はを、当業者は容易に知るかまたはそれに想到することができ、それらはここで完全に意図されている。

【００５５】本発明の核酸およびポリペプチド組成物を含むアッセイは、いずれかの多数の
構成の形式にしてもよい。高処理量スクリーニング形式は、多数の薬剤および材
料を評価するために特に有用である。従来、そのようなアッセイは代表的には９
６ウェルプレートにおける形式であった。しかし、３８４、８６４および１５３
６ウェルプレートをそのような高処理量アッセイシステムに使用してもよい。こ
れらのシステムはしばしば多数の試料の操作および処理を可能にするようにロボ
ット技術を使用して自動化される。

【００５６】潜在的なアンタゴニストまたはアゴニスト効果について本発明の種々のアッセ
イ法において評価し得る薬剤または材料は、限定するものではないが、低分子、
ポリマー、ペプチド、ポリペプチド、蛋白、免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ント、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ペプチド−核酸結合体、リボザ
イム、ポリヌクレオチドなどを包含する。本発明の組成物およびアッセイ法を使
用して同定される薬剤または材料の潜在的有用性は広く、ＨＣＶ核酸およびポリ
ペプチドの検出および単離のための、ＨＣＶの検出または診断のための、罹患し
た生体宿主（ヒトを含む）におけるＨＣＶ疾患の予防および処置のための、生体
宿主および細胞、組織、器官培養物のようなインビトロ系におけるＨＣＶの複製
または伝播の阻害または増強のための用途、ならびに薬剤の性質が明らかになれ
ば意図され得るその他用途を包含する。

【００５７】本発明の別の特徴は、本明細書中に開示する組成物および方法の使用を容易に
するためのキットを包含する。例示的なキットは、本発明のＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸およびポリペプチドおよび／またはその変種を単独でまたは適切なベクター中
で含む。特定の適用のための本発明の組成物の使用のためのプロトコルおよびそ
の適用を実施するために必要な試薬も含まれる。そのような試薬は、限定するも
のではないが、緩衝液、溶媒、媒質および溶液、基質および補因子、ベクターお
よび宿主細胞、ならびに検出またはリポーター試薬を包含し得る。付属的な品目
として、バイアル、容器、反応チャンバーおよび説明書を挙げてもよい。

【００５８】以下、本発明を実施するために現在意図される好ましい態様を記載する実施例
を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明を限定するものでは
ない。

【００５９】実施例１ＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子のクローニングおよび発現ＨＣＶ感染患者の血清から単離されたＲＮＡを用いて、ＲＴ−ネステッドＰＣ
Ｒ法によりＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子を増幅した。次の第１回プライマー：５’−
ＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＡＡＴＧＴＣ
Ｃ−３’および５’−ＧＧＧＡＴＧＧＣＣＴＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧ
ＡＧＴ−３’を用い、ＲＴ反応を５０℃で５０分間、つづいて９４℃変性を１
分間行ない、つづいて４０サイクルの第１回ＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５０℃
で３０秒間、６８℃で２分間の１５サイクル、および９４℃で３０秒間、５０℃
で３０秒間、６８℃で２分間の２５サイクル）を行なった。

【００６０】ついで第１回ＰＣＲ反応混合物の一部を、それぞれＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ
制限部位（下線）を含む次のネステッドプライマー：５’−ＡＡＣＡＧＡＴ
ＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＧＴＣ
ＣＴＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣ−３’および５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＧＧＧＧＡＧＣ
ＡＧＧＴＡＧ−３’を取り込む第２回ＰＣＲ反応に使用した。第２回ＰＣＲ
は、開始時の９４℃で１分間の変性、つづいて９４℃で４５秒間、５０℃で３０
秒間、６８℃で２分間の１０サイクル、および９４℃で３０秒間、５０℃で３０
秒間、６８℃で２分間の２０サイクルを含んだ。

【００６１】その結果得られたＰＣＲ生産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化し
、予めＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＦａｓｔＢａｃプラスミド（Ｇｉ
ｂｃｏ−ＢＲＬ社）に連結した。ライゲーション混合物をＤＨ５イー・コリ細胞
に形質導入した。Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）のト
ランスポジション法により、ＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子を含む細菌のコロニー由来
のプラスミドを用いて、組換えバキュロウイルスを生成させた。イー・コリＤＨ
１０Ｂａｃ細胞へのｐＦａｓｔＢａｃプラスミドＤＮＡを含むＨＣＶＮＳ５Ｂ
遺伝子の形質転換後、製造者によって与えられたプロトコールに従い、バクミド
（bacmid）ＤＮＡを含む数個のコロニーをＳｆ９昆虫細胞へ形質転換した。組換
えバキュロウイルス感染細胞におけるＮＳ５Ｂ蛋白発現を、ＨＣＶＮＳ５Ｂ配
列に特異的な抗血清を用いるウエスタン・イムノブロット分析により確認した。
一人の患者から得た単一のＲＮＡ調製物由来のＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子の６の別
々に単離したクローン（クローン４、１４、２１、１１、１６および２０）を配
列決定した。これらのクローンのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号：１、３
、４、５、６および７に示す。６のすべての配列は、遺伝子型１ｂウイルスに由
来し、互いに密接に関連するが、同一ではない。上記の各配列は独特の新規配列
であり、現在ＧｅｎＢａｎｋデータベースに載っていない。配列番号：１、３、
４、５、６および７で同定される核酸配列の推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番
号：２、８、９、１０、１１および１２に示す。図１に、これらのＮＳ５Ｂアミ
ノ酸配列をクローン４（配列番号：２）と比較して並べた。この並びから明らか
なように、クローン１４、２１、１１、１６および２０のＮＳ５Ｂ蛋白の配列は
、クローン４のものとは、それぞれ２、５、３、４および３個のアミノ酸によっ
て異なる。

【００６２】実施例２ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の精製当業者に既知の多くの方法（そのいくつかはCurrent Protcols in Molecular
Biology、Fredrick M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, 1995に例示されており、出典明示により本明細書に取り込む）により、組換え蛋白発現細胞システム
からＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白を精製形で得ることができる。

【００６３】本実施例の場合においては、バキュロウイルスクローン４−感染細胞をコン
プリート・プロテアーゼ・阻害剤・タブレット（Complete Protease Inhibitor
tablet）（Boehringer Mannheim社）を入れた溶菌緩衝液（５０％グリセロール、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭジチオスレイトール（
ＤＴＴ）、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２％トリトンＸ−１００
）中で破砕した。ついでＭｇＣｌ₂を最終濃度１０ｍＭまで添加し、つづいて１０単位のＤＮａｓｅＩ(RQ-1、Promega社）を添加した。氷上３０分後、溶解物を
３５，０００ｒｐｍ、３５分間、４℃で遠心分離した。

【００６４】清澄化した溶解物を溶出緩衝液（２０％グリセロール、２０ｍＭトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％トリト
ンＸ−１００）を用いて最終ＮａＣｌ濃度０．３Ｍまで希釈し、０．３ＭＮａ
Ｃｌを含む溶出緩衝液中で平衡化したＤＥＡＥセファロースとともに４℃でイン
キュベートした。ついで混合物をカラムに注ぎ、通過流出物質を回収した。通過
流出物質を溶出緩衝液を用いて最終ＮａＣｌ濃度０．２Ｍまで希釈し、０．２Ｍ
ＮａＣｌを含む溶出緩衝液中で平衡化したヘパリンセファロースカラムにかけ
た。ＮａＣｌの直線勾配（溶出緩衝液中、２００ｍＭ〜１ＭＮａＣｌ）を用い
て結合蛋白を溶出させ、その間、画分を回収した。

【００６５】ＮＳ５Ｂ−含有画分をプールし、０．４ＭＮａＣｌを含むシバクロンブルー
（Cibacron Blue）カラムにかけた。ＮａＣｌの直線勾配（溶出緩衝液中、４００ｍＭ〜４ＭＮａＣｌ）を用いて結合蛋白を溶出させ、その間、画分を回収し
た。ＮＳ５Ｂ−含有画分をプールし、５０％グリセロール、１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０１％
トリトンＸ−１００に対して透析し、−２０℃で保存した。図２に典型的な精製
結果を示す。

【００６６】実施例３精製ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の酵素活性この分野における通常の知識を有する者に周知のＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼ活性の測定のための多くの方法論がある。

【００６７】ＨＣＶＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性測定のための一つのアプローチは、インビト
ロＲｄＲｐアッセイにおいて精製組換えＮＳ５Ｂ蛋白を使用する。例えば、Behr
ensら［EMBO J. 15:12-22(1996)］は、ＨＣＶのＢＫ株由来のＨＣＶＮＳ５ＢＲｄＲｐのバキュロウイルス発現、精製および酵素活性を開示する。もう一つ
の例においては、PCT WO 97/12033［PCT/US96/15571］は、疾病管理センターから入手したＨＣＶ試料由来のＨＣＶＮＳ５ＢＲｄＲｐならびにこの配列のい
くつかの末端切断体および修飾体の細菌での発現、精製および酵素活性を開示す
る。もう一つの例は、Lohmannら［J Virol 71:8416-8428(1997)］のものであり、慢性的感染患者由来のＮＳ５Ｂ遺伝子を昆虫細胞内で組換えバキュロウイルス
を用いて発現させ、精製し、酵素的に評価するものである。さらにもう一つの例
は、Yuanら［Biochem Biophys Res Comm 232:231-235(1997)］のものであり、慢
性的散発性肝炎に罹患している患者由来のＨＣＶＮＳ５ＢＲｄＲｐの細菌で
の発現、精製および酵素活性を開示するものである。

【００６８】実施例２に従って調製した精製ＮＳ５Ｂ蛋白を、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．５、３ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトール、４００Ｕ／ｍＬＲＮａｓｉｎ（Gibco/BRL）、各０．５ｍＭのＵＴＰ、ＡＴＰおよびＣＴＰ、０．１μＭ［³²Ｐ］ＧＴＰおよび０．０３μｇｐＯＦ１２１３ＲＮＡからなる
１０μＬ標準反応混合物中で３０℃で６０分間インキュベートした。冷トリクロ
ロ酢酸（ＴＣＡ）およびピロリン酸ナトリウムの添加により、反応を停止させた
。ついで、ＴＣＡ沈殿性放射活性を定量し、ＲｄＲｐ活性の程度を決定した。本発明のクローン４、１４、２１、１１、１６および２０由来のＮＳ５Ｂ蛋白
に加え、Kolykhalovら（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 AF009606）により開示された遺伝子型１ａ共通配列感染クローン由来の配列のＮＳ５Ｂ遺伝子を、本発明の蛋
白と同様に発現させ、精製した。表３は本発明のＮＳ５Ｂ蛋白とKolykhalovの共
通配列の酵素活性の直接の比較を示す。

【００６９】

【表２】

【００７０】驚くべきことに、これらの別々のＮＳ５Ｂ蛋白の間で、かなりの範囲の酵素活
性が観察された。この比較において、クローン４由来のＮＳ５Ｂ蛋白が最大の活
性を有したが、クローン１４および２１の活性は中程度であり、クローン１１お
よび１６の活性は最小であり、クローン２０の活性は検出不能であった。Kolykh
alovの遺伝子型１ａ共通ＮＳ５Ｂ蛋白の活性は実質的に本発明のクローン４より
も小さかった。Lohmannらは、ヘテロポリマーＲＮＡ鋳型における彼らの遺伝子型１ｂＮＳ５Ｂ蛋白の特異的活性が、本明細書でKolykhalov酵素について報告し
た活性に近く、クローン４酵素のものよりも有意に低い、１．７ｐｍｏｌ／μｇ
／１２０分であることを報告した。

【００７１】本実施例は、高活性〜不活性の、クローン化され、発現したＮＳ５Ｂ配列の間
の機能的活性の範囲を示す。この本発明の６のＮＳ５Ｂ蛋白の分析において、わ
ずかに機能的か非機能的であるＮＳ５Ｂ蛋白の３つの例があり（クローン１１、
１６および２０）、機能的であるＮＳ５Ｂ蛋白の３つの例があった（クローン４
、１４および２１）。

【００７２】さらに、本明細書において、驚くべきことにごく僅かのアミノ酸配列の変化が
、ＮＳ５Ｂ蛋白の酵素活性の劇的な変化にとって十分であることを明らかにする
。酵素の既知または推定の活性部位または保存配列モチーフの配列変化が酵素の
活性に影響すると予期される場合、この比較の６個のＮＳ５Ｂ配列間のほとんど
のアミノ酸の変化は、Koonin［J. Gen. Virol. 72:2197-2206(1991)］およびPoc
hら［EMBO J. 8:3867-3874(1989)］によって同定されたＲｄＲｐ酵素の共通モチ
ーフの外側にある。このことについての２つの例外は以下の通りである。クロー
ン１６は、モチーフＩＩＩおよびＶＩ内での単一の残基変化を有し、クローン２
１はモチーフＶＩ内での単一の保存アミノ酸変化を有する（図１）。にもかかわ
らず、ＮＳ５ＢのＲｄＲｐ活性における、これらのアミノ酸変化の効果、および
この実施例のＮＳ５Ｂ配列間の他の効果は、驚くべきものであり、従来技術から
は予想できなかった。

【００７３】本実施例に示したデータはまた、クローン４由来のＮＳ５ＢＲｄＲｐ活性が
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 AF009606によって同定される感染クローンに由来するものよりも劇的に優れた活性を有することを示す。この結果は、ＮＳ５Ｂ蛋白の
共通配列の単なる生成が必然的に最適な作用性を有するＮＳ５Ｂ蛋白を与えるも
のではないことを示す。

【００７４】実施例４ＨＣＶＮＳ５Ｂ配列の並び本発明のＮＳ５Ｂ配列は、予め機能的であると特徴付けられたＮＳ５Ｂ配列と
は異なる。このことは、図３、４および５に表す配列の並びによって示される。

【００７５】 Kolykhalovら（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 AF009606）によって開示された配列は遺伝子型１ａＨＣＶ由来の既知のＮＳ５Ｂ配列の共通配列を表す。これらの
２配列間には７１アミノ酸の違いがある（クローン４の開始メチオニン残基を除
く）このことは、本発明のクローン４ＮＳ５Ｂ配列が遺伝子型１ａ共通配列と
は異なることを示す。この遺伝子型１ａ共通配列と全ての本発明の他の配列とは
、同様に本発明の配列の異なる性質を示す。PCT WO 97/12033に開示されている遺伝子型１ａ配列、ＲｄＲｐ活性を有することが示されたＮＳ５Ｂもまた図３の
並びに含まれる。この並びの調査は、配列間の７２のアミノ酸の違いが明らかに
し、本発明の配列の独特の性質を示す。

【００７６】本発明の配列はまた遺伝子型１ｂ共通配列とも異なる。GenBankデータベースに見出された２９の遺伝子型１ｂ共通配列の並びに基づき、遺伝子型１ｂ共通配
列を生じさせた。この共通配列と、本発明のクローン４（配列番号：２）のもの
との比較は、これらの配列が異なることを示す（図４）。開始メチオニン（−１
位）以後、クローン４配列はこの遺伝子型１ｂ共通配列とは１３のアミノ酸によ
って異なる。この遺伝子型１ｂ共通配列と全ての本発明の他の配列との並びは、
同様に本発明の配列の異なる性質を示す。Behrensらによって開示された遺伝子型１ｂ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 M58335）およびLohmannらによって開示さ
れた遺伝子型１ｂ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 Z97730）もまた図４の並びに含まれる。これらの配列によってコードされるＮＳ５Ｂ蛋白がＲｄＲｐ活性を有
することは既に示されている。またクローン４はM58335に対して１７のアミノ酸
の変化を有することにおいて異なり、Z97730に対して１２の変化を有することに
より異なる。

【００７７】本発明の配列はさらに、感染クローン［Yanagiら、Virology 244:161-172(198
8);ＧｅｎＢａｎｋ受託番号 AF054247］由来の遺伝子型１ｂ共通配列と異なる。
図５の並びに示すように、クローン４配列（配列番号：２）は、クローン４のＤ
１位のメチオニン残基を除く２５のアミノ酸残基により、異なる。

【００７８】これらの並びは、これらの遺伝子型１ｂ配列と比較しての本発明の配列の独特
の性質を明らかにする。したがって、遺伝子型１ａおよび１ｂ共通配列の両方との比較に基づき、本発
明のＮＳ５Ｂ配列は、共通配列を表さない。したがって、機能的に配列を推論す
る共通配列法に基づき、機能的なＲｄＲｐまたは機能的に優れたＲｄＲｐである
ことは明らかでない。さらに、既に示したＮＳ５Ｂ配列との比較に基づき、本発
明の他の配列のクローン４の配列および本発明の他の配列は、これらのＲｄＲｐ
配列と異なり、さらに、演繹的にＲｄＲｐ活性を有すると仮定されるものではな
く、またさらに優れたＲｄＲｐ活性を有することが予期されるものではない。

【００７９】実施例５改良された活性を有するＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白本発明のＮＳ５Ｂ配列間での配列比較に基づいて、特定のアミノ酸を変化させ
た多くの修飾ＮＳ５Ｂ配列を構築した。これらの修飾配列は、標準的な部位特異
的突然変異誘発法［Picard et al., Nucleic Acid Res. 22:2587-2591 (1994)］
により得た。修飾遺伝子を、実施例１に記載したバキュロウイルス発現系にて遺
伝子工学処理し、実施例２に従って精製し、実施例４に従ってＲｄＲｐ活性につ
いて評価した。

【００８０】クローン２０の配列は、３個のアミノ酸残基でクローン４の配列と異なる。イ
ニシエーター・メチオニン（Ｍ）に代わりクローン２０ＮＳ５Ｂ蛋白の位置− １にバリン（Ｖ）残基が存在することは、クローン２０から産生されるＮＳ５Ｂ
蛋白が位置２のメチオニンで開始されること、さらにまた、このメチオニン残基
から産生された蛋白が不活性であることを示唆している。クローン２０における
Ｖ変化は、分子クローニング方法の人工産物（オリゴヌクレオチドプライマーに
おける誤った配列）であると考えられる。クローン２０における位置−１のＶ残
基をＭに変えて、１個のアミノ酸（残基−１）によりクローン２０の配列と異な
り、２個のアミノ酸（残基１７７および５４３）によりクローン４と異なる、配
列番号１３により同定されるクローン２０（Ｖ−１Ｍ）を得た。クローン２０（
Ｖ−１Ｍ）から誘導された精製ＮＳ５Ｂ蛋白のＲｄＲｐ活性は、クローン２０の
ＲｄＲｐ活性よりも劇的に増大し、クローン４のＲｄＲｐ活性よりも有意に改良
されていた（表４）。

【００８１】本発明のＮＳ５Ｂ配列間のさらなる残基変化により、有用かつ機能的な蛋白を
得ることができる。例えば、クローン４中の位置７５のアラニン（Ａ）残基が、
クローン１４においてこの位置に見られる残基であるバリン（Ｖ）に変わると、
得られたクローンであるクローン（Ａ７５Ｖ）は、相当なＲｄＲｐ活性を示す（
表４）。別の例において、クローン４中の位置１７７のアスパラギン（Ｎ）残基
を、本発明の他の全てのクローンにおいてこの位置で見られる残基であるアスパ
ラギン酸（Ｄ）に変えてクローン４（Ｎ１７７Ｄ）を得た。このクローンは、非
常に良好なＲｄＲｐ活性を示した（表４）。第３の例において、クローン４中の
位置５４３のセリン（Ｓ）がクローン２０において見られるプロリン（Ｐ）に変
わると、クローン４（Ｓ５４３Ｐ）が得られ、機能的なＲｄＲｐが得られる（表
４）。

【００８２】

【表３】

【００８３】この実施例は、アミノ酸残基の変化がＮＳ５Ｂ蛋白の配列において行われても
よいこと、および、かかる変化が、得られた蛋白の機能的活性を保持できること
を示している。さらにまた、該アミノ酸置換は、事実上、保存的であっても非保
存的であってもよい。種々の組み合わせで本発明のＮＳ５Ｂ配列間のアミノ酸残基の付加的な変化は
、本発明の範囲内であると考えられる。

【００８４】実施例６改良された活性を有する新規ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白機能的ＮＳ５Ｂ配列を研究するための別のストラテジーは、アミノ酸残基が既
知のＮＳ５Ｂ配列において保存的である位置でのユニークなアミノ酸置換の導入
を含む。例えば、全ての既知のＮＳ５Ｂ配列は、アミノ末端アミノ酸（位置１）
としてセリン残基を有する。このセリンがアラニン［クローン４（Ｓ１Ａ）］、
グリシン［クローン４（Ｓ１Ｇ）］またはスレオニン［クローン４（Ｓ１Ｔ）］
で置換されたクローン４のいくつかの修飾バージョンを構築した。意外にも、こ
れらの新規配列から誘導されたＮＳ５Ｂ蛋白の全ては、実質的なＲｄＲｐ活性を
示した。しかしながら、この位置でのチロシン（Ｙ）［クローン４（Ｓ１Ｙ）］
との置換は、不活性ＮＳ５Ｂ蛋白を生じる（表５）。

【００８５】同様に、全ての既知のＮＳ５Ｂ配列は、位置２にメチオニン残基を有する。こ
のメチオニンがアラニン［クローン４（Ｍ２Ａ）］、ロイシン［クローン４（Ｍ
２Ｌ）］またはスレオニン［クローン４（Ｍ２Ｔ）］で置換されたクローン４の
修飾バージョンを構築した。意外にも、これらの新規ＮＳ５Ｂ蛋白の全ては、実
質的なＲｄＲｐ活性を示した。

【００８６】最後の例において、アラニン残基がセリン残基の前に挿入されるクローン４（
ＭＡＳ）におけるように、成熟ＮＳ５Ｂ蛋白の最初の残基（１位のセリン）の前
にアミノ酸残基を付加して、実質的に機能的なＮＳ５ＢＲｄＲｐが得られる（表５）。

【００８７】アミノ酸置換が天然のバリエーションがない残基で行われ、機能的なおよび劇
的に改良された機能的なＮＳ５Ｂ蛋白を生じさせるというこれらの知見は、全く
予想されなかった。

【００８８】さらにまた、これらのデータは、ＮＳ５Ｂの機能的変種を生じさせることがで
きるアミノ酸残基変化の性質が保存的未の酸置換に限定されないことを示してい
る。例えば、位置１でセリンのスレオニンへの置換は、保存的アミノ酸置換と考
えることができるが、一方、グリシンとの置換は、アミノ酸側鎖の化学的性質に
おいて劇的な変化を示す。同様に、位置２のメチオニン残基のロイシンとの置換
は、保存的な変化を示す。しかしながら、明らかな非保存的変化であるスレオニ
ンとの置換は、機能的なおよび機能的に改良されたＮＳ５Ｂ蛋白を生じる。した
がって、これらの知見に基づいて、様々な残基位置で、様々な組合せで、事実上
、保存的および非保存的の両方である本発明のＮＳ５Ｂ配列間のアミノ酸残基の
付加的な変化は、有用なＮＳ５Ｂ組成物を生じ、したがって、本発明の範囲内で
ある。

【００８９】

【表４】

【００９０】実施例５および６は、配列番号２のアミノ酸配列における様々な変化が有利に
なることを示しているが、ここに例示した残基変化は、また、本発明の配列（例
えば、配列番号８、９、１０、１１および１３、表４および表５に記載のもの）
を包含する他のＮＳ５Ｂ配列、これらのＮＳ５Ｂ配列および他のＮＳ５Ｂ配列の
自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体において、単一または種々の組合せで
、同様の有用性を有することが十分に考えられる。すなわち、実施例５および６
に記載の変化は、いずれのＮＳ５Ｂ配列に導入されても、機能的なまたは機能的
に改良されたＮＳ５Ｂを提供すると考えられ、本発明の範囲内であることが十分
に考えられる。本発明の実施に有用な変種ＮＳ５Ｂ蛋白配列をコードする核酸配列のいくつか
の例は、表６に挙げられる配列からなる。

【００９１】

【表５】

【００９２】表６の例は、配列番号１の核酸配列における種々の有益な変化を示している。
これらの結果を考慮して、配列番号１において例示された変化は、また、本発明
の配列（例えば、配列番号３、４、５、６および７）を包含する他のＮＳ５Ｂ配
列、これらのＮＳ５Ｂ配列および他のＮＳ５Ｂ配列の自然対立遺伝子変種、変異
体および誘導体において、単一または様々な組合せで、同様の有用性を有すると
考えられる。すなわち、この表６に記載した変化は、いずれのＮＳ５Ｂ配列に導
入されても、機能的なまたは機能的に改良されたＮＳ５Ｂを提供すると考えられ
、かくして、本発明の範囲に包含される。

【００９３】実施例７抗ウイルス組成物の発見のためのＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の利用性ウイルス性ポリメラーゼおよび関連蛋白の新規阻害薬の発見には、しばしば、
多数の化合物または化合物の混合物のスクリーニングを必要とする。かくして、
高容量スクリーニングが可能なポリメラーゼ活性のアッセイ、すなわち、高処理
量アッセイが望まれている。多数の試料を十分にスクリーニングする当業者によ
く知られている種々のアッセイ法があり［例えば、Cole, JL, in Meth. Enzymol
ogy 275:310-328 (1996) を参照のこと］、放射測定法、比色測定法、蛍光法または化学発光法を包含するがこれらに限定されないかなり多数の活性検出および
測定技法を利用してもよく、これらのうちいずれか１つがＨＣＶＮＳ５ＢＲｄ
Ｒｐ活性のケースに適当である。

【００９４】一のアプローチにおいて、本発明の機能的ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白のＲｄＲｐ活性の高処理量アッセイは、該酵素に対する活性について多数の化合物または他の
可能性のある阻害剤のスクリーニングを可能にする。該アッセイは、９６ウェル
・マイクロプレート中でフォーマットされ、放射性標識ＮＴＰのトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）−沈殿性ＲＮＡ産生物への取込みによりＲＮＡ鋳型−プライマー上で
のポリメラーゼ活性を測定する。放射能は、直接シンチレーション分光分析法ま
たは燐光イメージング（phosphorimaging）技法のいずれかにより定量化できる。１つのスクリーニングプレートについての実施例４のＮＳ５Ｂ蛋白［クローン
４］を用いて得られたアッセイ結果の燐光イメージ（phosphorimage）を図６に示す。該プレートの最初のカラム（１）および最後のカラム（１２）は、活性お
よびバックグラウンド対照および参照阻害化合物のタイトレーションを含む。か
くして、ウェルＡ１、Ｂ１、Ａ１２およびＢ１２は、試験化合物の不在下では酵
素の活性（予想活性の１００％）を示す。ウェルＣからＦまでのカラム１および
１２において、本発明の方法の使用によりＨＣＶＲｄＲｐ活性を阻害するという知見が得られた化合物は、低濃度で含まれる。ウェルＨ１およびＨ１２は、Ｈ
ＣＶ酵素を欠いており、該アッセイにおいてバックグラウンド（ＲｄＲｐ活性０
％）を例示する。この実施例において、残り８０個のウェルは、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白のＲｄＲｐ活性に作用する能力について試験された小さい有機化合物の集
まりを含む。かくして、ウェルＧ２、Ｄ１０およびＦ１０における物質がＨＣＶ
ＲｄＲｐ活性の有効な阻害剤であることが理解できる。この実施例は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白がＨＣＶＲｄＲｐおよびＨＣＶ複製に作
用する薬剤または物質を同定し評価するのに有利に用いることができることを示
している。

【００９５】まとめると、本発明の記載は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ配列の簡単な知識では、かかる配列が機能的配列であるかまたは機能的有用性を有することを推断させるのに
または予想させるのにでさえ不十分であることを示している。さらに、ＨＣＶＮＳ５Ｂコンセンサス配列は、唯一ではなく、必ずしも最適ではない機能的ＮＳ
５Ｂ蛋白コード化配列である。本発明は、予想外の機能性を有する新規ＮＳ５Ｂ
配列を提供する。さらに、本発明は、ＨＣＶＮＳ５Ｂにおける特定の配列変化により予想外の有意に改良された機能性を得ることができることを示している。
上記に鑑みて、本発明のＮＳ５Ｂ配列は、従来技術に優る、立証された機能性お
よび有用性ならびに固有の改良を有する新規配列である。最後に、本発明のＨＣ
ＶＮＳ５Ｂ配列は、研究用途、診断用途、治療用途および医薬用途において幅広い有用性を有する。

【００９６】本発明のある種の具体例を上記に記載および／または例示したが、種々の他の
具体例は、上記記載から当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、記載
および／または例示した特定の具体例に限定されず、特許請求の範囲の範囲から
逸脱することなく相当な変更が可能である。

【００９７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の数個のＮＳ５Ｂ蛋白のアミノ酸配列の並びを示
す。Koonin [J Gen Virol. (1991) 72:2197-206] (Roman numerals)およびPoch ら [EMBO J. (1989) 8:3867-74] (letters)により同定された、ＲｄＲｐ酵素中に存在する保存配列モチーフのおおよその位置は、クローン４配列の上に示す。

【図２】図２は、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の精製を示す。組換えバキュロウイルスに感染した、ＨＣＶＮＳ５Ｂ遺伝子を発現しているＳｆ９細胞を収集し、溶解した。不要物を除去した溶解物を一連の蛋白精製工程に供した。精製工程
の各段階に関して標本をＳＤＳ-含有ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いで銀染色した。レーン１:不要物を除去した細胞溶解物;レーン２:ＤＥＡＥカラムからの流通物質;レーン３:ヘパリンカラムからの物質;レーン４:シブラクロン(Cibracron)ブルーカラムからの物質。Ｍ＝分子量基準;キロダルトン数。

【図３】図３は、感染クローン由来の遺伝子型１ａコンセンサスＮＳ５Ｂ
配列(GenBank 受託番号 AF009606)および、ＲｄＲｐ活性を有することがすでに示されている遺伝子型１ａＮＳ５Ｂ配列(PCT WO 97/12033)と共に、本発明のク
ローン４ＮＳ５Ｂ配列の並びである。破線はアミノ酸残基の同一性を示す。

【図４】図４は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られたＨＣＶＮＳ５Ｂ配列の配列から誘導された遺伝子型１ｂ「コンセンサス」アミノ酸配列およ
び、機能的であることがすでに示されている遺伝子型１ｂＮＳ５Ｂ配列(GenBan
k 受託番号 M58335および Z97730)と共に、本発明のクローン４ＮＳ５Ｂ配列の
並びを示す。破線はアミノ酸残基の同一性を示す。

【図５】図５は、Yanagiらにより報告されたＨＣＶ遺伝子型１ｂＮＳ５Ｂ遺伝子[Virology(1998) 244:161-172; GenBank 受託番号AF 054247]および、本発明のクローン４の蛋白配列の並びを示す。破線はアミノ酸残基の同一性を示
す。

【図６】図６はＨＣＶＮＳ５ＢのＲｄＲｐ活性に関する高処理アッセイの結果を示す。

【図７】図７は配列番号１の配列を示す。

【図８】図８は配列番号３の配列を示す。

【図９】図９は配列番号４の配列を示す。

【図１０】図１０は配列番号５の配列を示す。

【図１１】図１１は配列番号６の配列を示す。

【図１２】図１２は配列番号７の配列を示す。

【図１３】図１３は、クローン２０(Ｖ-１Ｍ)、配列番号１３のアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 7/00 5/10 9/12 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/12 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/70 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/576 Ｚ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/576 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項２】配列番号：２の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子。
【請求項３】配列番号：３の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項４】配列番号：８の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子。
【請求項５】配列番号：４の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項６】配列番号：９の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子。
【請求項７】配列番号：５の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項８】配列番号：１０の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコー
ドする核酸分子。
【請求項９】配列番号：６の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項１０】配列番号：１１の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコ
ードする核酸分子。
【請求項１１】配列番号：７の配列を含む、Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコー
ドする核酸分子、その自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体。
【請求項１２】配列番号：１２の配列を有するＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコ
ードする核酸分子。
【請求項１３】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６、配列番号：７からなる群より選択される核酸配列を有する、
Ｃ型肝炎ウイルス蛋白をコードする核酸分子およびその自然対立遺伝子変種、変
異体および誘導体。
【請求項１４】分子が表６に示すように修飾された請求項１３記載の核酸
。
【請求項１５】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選
択されるアミノ酸配列を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸
分子。
【請求項１６】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選
択される配列を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項１７】表４および５に示すように修飾されている請求項１６記載
のＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項１８】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選
択されるアミノ酸配列を必須として含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白をコード
する核酸配列を含むベクター。
【請求項１９】アミノ酸配列が表４および５に示すように変化しているＣ
型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸を含む請求項１８記載のベクター
。
【請求項２０】配列番号：２の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白
。
【請求項２１】配列番号：８の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白
。
【請求項２２】配列番号：９の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白
。
【請求項２３】配列番号：１０の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋
白。
【請求項２４】配列番号：１１の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋
白。
【請求項２５】配列番号：１２の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋
白。
【請求項２６】配列番号：１３の配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋
白。
【請求項２７】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２、および配列番号：１３からなる群より
選択されるアミノ酸配列を有し、位置＋１および＋２のアミノ酸残基がいずれの
アミノ酸であってもよい、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項２８】アミノ酸配列が表４および５に示すように変化している請
求項２７記載のＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項２９】成熟ポリペプチドの位置１７７のアミノ酸がアスパラギン
である、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸分子。
【請求項３０】成熟ポリペプチドの位置１７７のアミノ酸がアスパラギン
である、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項３１】位置７５のアミノ酸をコードするコドンがアラニンからバ
リンに変化している、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３２】位置７５のアミノ酸がアラニンからバリンに変化している
、請求項２０記載のＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項３３】位置１７７のアミノ酸をコードするコドンがアスパラギン
からアスパラギン酸に変化している、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３４】位置１７７のアミノ酸がアスパラギンからアスパラギン酸
に変化している、請求項２０記載のＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項３５】位置５３４のアミノ酸をコードするコドンがセリンからプ
ロリンに変化している、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３６】位置５３４のアミノ酸がセリンからプロリンに変化してい
る、請求項２０記載のＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項３７】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６、および配列番号：７からなる群より選択される配列を有し、
位置−１、−２、および−３のアミノ酸をコードするコドンがいずれのアミノ酸
をコードしていてもよい、ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸分子。
【請求項３８】さらにタグ配列を含む請求項１３記載の核酸分子。
【請求項３９】該タグ配列がホモポリマー核酸配列、ポリヒスチジン、フ
ラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグル
チニン蛋白の膜貫通エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カル
モジュリン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ、またはビオチンからなる群より選択されるものである
請求項３８記載の核酸分子。
【請求項４０】さらにタグ配列を含む請求項１４記載の核酸分子。
【請求項４１】該タグ配列がホモポリマー核酸配列、ポリヒスチジン、フ
ラッグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグル
チニン蛋白の膜貫通エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カル
モジュリン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチオン
Ｓ−トランスフェラーゼ、またはビオチンからなる群より選択されるものである
請求項４０記載の核酸分子。
【請求項４２】さらにホモポリマー核酸配列、ポリヒスチジン、フラッグ
エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン
蛋白の膜貫通エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カルモジュ
リン結合蛋白、マルトース結合蛋白、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ、またはビオチンからなる群より選択される蛋白タグ配列を含
む、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：
１１、配列番号：１２および配列番号：１３ならびに表４および５に示すような
修飾ＮＳ５Ｂ蛋白からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白。
【請求項４３】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号：１、配列番号：３、
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７の自然対立遺伝
子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように修飾された核酸からな
る群より選択される核酸配列を有し、アラニンに対するアミノ酸コドンが成熟Ｎ
Ｓ５Ｂ蛋白の最初のアミノ酸コドンの前にある、Ｃ型肝炎ウイルス蛋白をコード
する核酸分子。
【請求項４４】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３ならびに表４およ
び５に示すような修飾ＮＳ５Ｂ蛋白からなる群より選択される配列を有し、アラ
ニン残基が成熟ＮＳ５Ｂ蛋白の最初のアミノ酸の前にあるＣ型肝炎ウイルスＮＳ
５Ｂ蛋白。
【請求項４５】Ｃ型肝炎ウイルスに対するモジュレーション活性に関して
試験化合物をアッセイするための方法であって、ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、および配列番号：１３からなる群より選択される配列を含む、酵素的に
活性のあるＣ型肝炎ウイルスＮＡ５Ｂ蛋白を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性をモジュレーションする可能性のある試
験化合物に上記蛋白を接触させ；次いでｉｉｉ）該試験化合物による該Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性のモジュレーシ
ョンを測定することを含む方法。
【請求項４６】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白配列が表４および５に示すように修飾されている請求項４５記載の方法。
【請求項４７】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白がさらにタグ配列を含むものである請求項４５記載の方法。
【請求項５０】Ｃ型肝炎ウイルスに対するアンタゴニスト活性に関して化
合物をアッセイするための方法であって、ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、および配列番号：１３からなる群より選択される配列を含む、酵素的に
活性のあるＣ型肝炎ウイルスＮＡ５Ｂ蛋白を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性にアンタゴナイズする可能性のある試験
化合物に上記蛋白を接触させ；次いでｉｉｉ）該試験化合物による該Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対するアンタ
ゴニスト作用を測定することを含む方法。
【請求項５１】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白配列が表４および５に示すように修飾されている請求項５０記載の方法。
【請求項５２】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白がさらにタグ配列を含むものである請求項５０記載の方法。
【請求項５４】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項５０記載の方法。
【請求項５５】Ｃ型肝炎ウイルスに対するアゴニスト活性に関して試験化
合物をアッセイするための方法であって、ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、および配列番号：１３からなる群より選択される配列を含む、酵素的に
活性のあるＣ型肝炎ウイルスＮＡ５Ｂ蛋白を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性をアゴナイズする可能性のある試験化合
物に上記蛋白を接触させ；次いでｉｉｉ）該試験化合物による該Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対するアゴニ
スト作用を測定することを含む方法。
【請求項５６】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白配列が表４および５に示すように修飾されている請求項５５記載の方法。
【請求項５７】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白がさらにタグ配列を含むものである請求項５５記載の方法。
【請求項６０】Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白配列との相互作用に関して
試験化合物をアッセイするための方法であって、ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選択される配列を
必須として含むＣ型肝炎ウイルスＮＡ５Ｂポリペプチドを用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白またはペプチドと相互作用する可能性の
ある試験化合物に該蛋白またはペプチドを接触させ；次いでｉｉｉ）該試験化合物または材料と該Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂポリペプチド
との相互作用を測定することを含む方法。
【請求項６１】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白配列が表４および５に示すように修飾されている請求項６０記載の方法。
【請求項６２】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白がさらにタグ配列を含むものである請求項６０記載の方法。
【請求項６５】Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ核酸配列との相互作用に関して
試験化合物をアッセイする方法であって、ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：
６、および配列番号：７からなる群より選択される配列を必須として含むＣ型肝
炎ウイルスＮＳ５Ｂ核酸を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ核酸と相互作用する可能性のある試験化合物
に該ＮＳ５Ｂ核酸を接触させ；次いでｉｉｉ）該試験化合物と該Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ核酸との相互作用を測定
することを含む方法。
【請求項６６】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ核酸配列が表６に示すように修飾されている請求項６５記載の方法。
【請求項６７】該ウイルス由来の選択されたヌクレオチド配列を効果的に
増幅する核酸増幅ならびに該選択された配列の検出を含む、生物学的試料中のＨ
ＣＶの存在を検出する方法であって、該核酸が配列番号：１、配列番号：３、配
列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、および配列番号：７からなる群より
選択される配列を有するものである方法。
【請求項６８】該核酸配列が表６に示すように変化している請求項６７記
載の方法。
【請求項６９】核酸増幅方法が一連のネステッドプライマーを用いて行わ
れる請求項６７記載の方法。
【請求項７０】表１に示す配列を含むオリゴヌクレオチドを用いて該配列
が検出される請求項６７記載の方法。
【請求項７１】ウイルスポリペプチドと生物学的試料中のＣ型肝炎ウイル
スに指向された抗体との免疫学的相互作用を検出する方法であって、からなる群より選択されるＮＳ５Ｂアミノ酸配列を用いて該抗体を単離すること
を含む方法。
【請求項７２】該ＨＣＶＮＳ５Ｂアミノ酸配列が表４および５に示すように修飾されている請求項７１記載の方法。
【請求項７３】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項７１記載の方法。
【請求項７４】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項７１記載の方法。
【請求項７５】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２、および配列番号：１３からなる群より
選択される配列を有するＣ型肝炎ポリペプチドに対してアフィニティーを有する
抗体。
【請求項７６】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白配列が表４および５に示すように修飾されている請求項７５記載の抗体。
【請求項７７】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項７５記載の方法。
【請求項７８】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項７５記載の方法。
【請求項７９】表２に示す配列を含むポリペプチドに対してアフィニティ
ーを有する抗体。
【請求項８０】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号：１、配列番号：３、
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７の自然対立遺伝
子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように修飾された核酸からな
る群より選択される核酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス蛋白をコードする核酸分
子であって、ウイルス抗原をコードしている核酸分子。
【請求項８１】請求項８０記載の核酸を宿主中に導入する方法であって、
形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、トランスジェネティッ
クス（transgenetics）、外科的方法、および核酸で被覆した粒子を用いる物理的爆撃からなる群より選択される方法により該核酸が該宿主にデリバリーされる
方法。
【請求項８２】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：
１０、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３、ならびに表４お
よび５に示すような修飾ＮＳ５Ｂ蛋白からなる群より選択されるアミノ酸配列を
含むウイルス抗原。
【請求項８３】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項８２記載のウイルス抗原。
【請求項８４】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項８２記載のウイルス抗原。
【請求項８５】さらに蛋白タグ配列を含む請求項８２記載のウイルス抗原
。
【請求項８６】請求項８０の核酸によりコードされるウイルス抗原を哺乳
動物対象に投与することを含む、哺乳動物対象において免疫応答を起こさせる方
法。
【請求項８７】請求項８２記載のウイルス抗原を哺乳動物対象に投与する
ことを含む、哺乳動物対象において免疫応答を起こさせる方法。
【請求項８８】表１に示すオリゴヌクレオチド配列から選択される配列を
含むプライマーを用いる、Ｃ型肝炎ウイルス核酸の増幅方法。
【請求項８９】請求項１３のＣ型肝炎ウイルス核酸を含む宿主細胞。
【請求項９０】表６に示すように変化しているＣ型肝炎ウイルス核酸を含
む宿主細胞。
【請求項９１】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号：１、配列番号：３、
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７の自然対立遺伝
子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように修飾された核酸からな
る群より選択されるＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸を含む宿主細胞であ
って、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および植物細胞からなる
群より選択される宿主細胞。
【請求項９２】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：
５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号：１、配列番号：３、
配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７の自然対立遺伝
子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように修飾された核酸からな
る群より選択されるＣ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸を含む細胞系であっ
て、肝細胞系、Chang肝細胞、HeLa細胞、Ｕ９３７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＭＴ −４細胞および上記細胞系から生じるクローン細胞からなる群より選択される細
胞系。
【請求項９３】機能的ＮＳ５Ｂ蛋白を発現する請求項９２記載の細胞系。
【請求項９４】発せられるリポートシグナルが細胞中の機能的ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白のポリメラーゼ活性に依存したものであるリポーターシステムをさら
に含む請求項９３記載の細胞系。
【請求項９５】該リポーターシステムが機能的リポーター分子をコードす
るＲＮＡ分子のアンチセンス鎖を含む核酸を含むものであり、該ＮＳ５Ｂポリメ
ラーゼが該アンチセンス分子に作用して該宿主細胞中に翻訳可能なｍＲＮＡ配列
を生じさせるものであり、該翻訳されたリポーター分子の配列がシグナルを増大
させることができるものであり、該シグナルが機能的ＮＳ５Ｂポリメラーゼの存
在を示すものである、請求項９４記載の細胞系。
【請求項９６】該機能的ｍＲＮＡ分子がルシフェラーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたは緑色蛍光蛋白からなる群より選択され
るリポーター分子をコードするものであり、宿主細胞が肝細胞である請求項９５
記載の細胞系。
【請求項９７】Ｃ型肝炎ＮＳ５Ｂ蛋白の機能性をアッセイする方法であっ
て、下記工程：ｉ）請求項９２記載の細胞系を用意し；ｉｉ）アンチセンス分子をコードする核酸で該細胞系を形質転換し、アンチセ
ンス分子をコードする核酸の相補物は機能的リポーター分子をコードしており、
該ＮＳ５Ｂポリメラーゼは該アンチセンス分子に作用して該宿主細胞中に翻訳可
能なｍＲＮＡ配列を生じさせるものであり；次いでｉｉｉ）該翻訳されたリポーター分子の配列により生じるシグナルの増大に関
して該細胞を評価し、該増大が機能的なＮＳ５Ｂ蛋白の存在を示すものであるを含む方法。
【請求項９８】該機能的リポーター分子がルシフェラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたは緑色蛍光蛋白からなる群より選択さ
れる請求項９７記載の方法。
【請求項９９】肝細胞である請求項８９記載の宿主細胞。
【請求項１００】Ｃ型肝炎ウイルスに対するアンタゴニストを求めて試験
化合物をアッセイする方法であって、ｉ）請求項９３記載の細胞系を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対するアンタゴニスト作用を有する可
能性のある試験化合物に該細胞系を接触させ；次いでｉｉｉ）存在する場合には、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対する該試験化
合物のアンタゴニスト効果を測定することを含む方法。
【請求項１０１】Ｃ型肝炎ウイルスに対するアゴニスト活性を求めて試験
化合物をアッセイする方法であって、ｉ）請求項９３記載の細胞系を用意し；ｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対するアゴニスト作用を有する可能性
のある試験化合物に該細胞系を接触させ；次いでｉｉｉ）存在する場合には、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ活性に対する該試験化
合物のアゴニスト効果を測定することを含む方法。
【請求項１０２】配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号
：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、および配列番号：１３からなる群よ
り選択される配列を含むＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白の製造方法であって、ｉ）生物学的システム中で該蛋白を発現させ；ｉｉ）該蛋白を可溶化させ；ｉｉｉ）該蛋白を抽出し；次いでｉｖ）該ＮＳ５Ｂ蛋白を豊富化させることを含む方法。
【請求項１０３】該Ｃ型肝炎ウイルス蛋白が表４および５に示すように変
化している請求項１０２記載の方法。
【請求項１０４】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項１０２記載の方法。
【請求項１０５】該ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白中の位置−１、−２および−３のアミノ酸がいずれのアミノ酸であってもよい請求項１０２記載の方法。
【請求項１０６】さらに該ＨＣＶＮＳ５Ｂが請求項４０記載の蛋白タグを含むものである請求項１０２記載の方法。
【請求項１０７】細胞破裂、細胞分画、分配、逆ミセル分配、水性二相抽
出、沈殿法、クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、キレートク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティーク
ロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、遠心分離、膜濾過、ゲル濾過、免疫沈降、電気泳動、等電点電気泳動、
および等速電気泳動からなる群より選択される方法により該ＮＳ５Ｂ蛋白が豊富
化される、請求項１０２記載の方法。
【請求項１０８】該生物学的システムが細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、
哺乳動物細胞、および植物細胞からなる群より選択される請求項１０２記載の方
法。
【請求項１０９】該生物学的システムが無細胞系である請求項１０２記載
の方法。
【請求項１１０】ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白の単離方法であって、ｉ）ＮＳ５Ｂ蛋白を含有する生物学的システムの抽出物を、官能基としてジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）部分を有する含塩バッファー溶液中の固体マトリ
ックスに接触させ；ｉｉ）該ＮＳ５Ｂ蛋白を該固体マトリックスから除去し、さらに、官能基とし
てヘパリンを含む固体マトリックスに該蛋白を接触させ；ｉｉｉ）結合したＮＳ５Ｂ蛋白を含有する該ヘパリンマトリックスを、塩レベ
ルを連続的に増加させるバッファー溶液に曝露し；ｉｖ）ＮＳ５Ｂ蛋白含有フラクションを集め、官能基としてシバクロン・ぶる
ー（Cibacron Blue）を含有する固体マトリックスに該集めたフラクションを接触させ；ｖ）結合したＮＳ５Ｂ蛋白を含有するCibacron Blueマトリックスを、塩レベルを連続的に増加させるバッファー溶液に曝露し；次いでｖｉ）該豊富化されたＮＳ５Ｂ含有フラクションを集めることを含む方法。
【請求項１１１】感染性ウイルスベクターを得る方法であって、配列番号
：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番
号：７からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ核酸をウイルスベク
ター中に組み込むことを含む方法。
【請求項１１２】該核酸配列が表６に示すように変化している請求項１１
１記載の方法。
【請求項１１３】感染性ウイルスベクターを得る方法であって、ウイルス
ベクター中において、いずれかのＨＣＶ配列に由来するＨＣＶＮＳ５Ｂ相同遺伝子配列を、配列番号：、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番
号：６、および配列番号：７からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＮＳ５
Ｂ核酸で置換することを含む方法。
【請求項１１４】該核酸配列が表６に示すように変化している請求項１１
３記載の方法。
【請求項１１５】配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号
：５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号：１、配列番号：３
、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７の自然対立遺
伝子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように修飾された核酸から
なる群より選択される核酸配列を含む宿主動物。
【請求項１１６】ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白に対する抗体を単離する方法であって、配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号
：１１、配列番号：１２および配列番号：１３、ならびに表４および５に示す修
飾ＮＳ５Ｂ蛋白からなる群より選択される配列を有するＮＳ５Ｂ蛋白に対する反
応性に関してヒトまたはネズミの抗体ライブラリーをスクリーニングし、反応性
抗体を発現するクローンを該ライブラリーから選択し、次いで、該クローンを単
離することを含む方法。
【請求項１１７】インビトロ系においてＨＣＶを増殖させる方法であって
、機能的ＨＣＶＮＳ５Ｂ配列が提供された細胞系をＨＣＶの複製を容易ならしめる条件下で培養することを含み、該配列が配列番号：１、配列番号：３、配列
番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：７、ならびに配列番号
：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番
号：７の自然対立遺伝子変種、変異体および誘導体、ならびに表６に示すように
修飾された核酸からなる群より選択されるものである方法。
【請求項１１８】細胞培養物をＣ型肝炎ウイルスに感染させる方法であっ
て、請求項１１１の記載に従って得られたウイルスベクターを投与することを含
む方法。
【請求項１１９】動物をＣ型肝炎ウイルスに感染させる方法であって、請
求項１１１の記載に従って得られたウイルスベクターを投与することを含む方法
。
【請求項１２０】インビトロにおいてＣ型肝炎ウイルスを増殖させる方法
であって、ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番
号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選択される配列
を必須として含む機能的ＨＣＶＮＳ５Ｂ蛋白に細胞系を接触させ；次いでｉｉ）該細胞系をさらにＨＣＶ核酸に接触させることを含む方法。
【請求項１２１】該ＮＳ５Ｂ蛋白が表６に示すように修飾されている請求
項１２０記載の方法。
【請求項１２２】該ＮＳ５Ｂ蛋白中の位置＋１および＋２のアミノ酸残基
がいずれのアミノ酸であってもよい請求項１２０記載の方法。
【請求項１２３】該ＮＳ５Ｂ核酸がＣ型肝炎ウイルスのレプリコン中に提
供される請求項１２０記載の方法。
【請求項１２４】生きた宿主においてＣ型肝炎ウイルスを増殖させる方法
であって、下記工程：ｉ）配列番号：２、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番
号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群より選択される配列
を有するＣ型肝炎ウイルスＮＳ５Ｂ蛋白をコードする核酸を生きた宿主にデリバ
リーし、該核酸は機能的なＮＳ５Ｂ蛋白をコードしていて、発現オペロンに作動
可能に連結されており；次いでｉｉ）ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ核酸およびＨＣＶレプリコンからなる群より選択さ
れるＨＣＶ分子に該生きた宿主を接触させるを含む方法。
【請求項１２５】該ＮＳ５Ｂをコードする核酸が表６に示すように変化し
ている請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】形質転換、トランスフェクション、トランスダクション
、トランスジェネティックス（transgenetics）、外科的方法または核酸を被覆した粒子を用いる物理的爆撃からなる群より選択される方法により該核酸が該宿
主にデリバリーされる、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２７】工程ｉ）の該ＮＳ５Ｂをコードする核酸がレプリコン中
に提供される請求項１２４記載の方法。
【請求項１２８】生物学的試料中のＨＣＶ核酸の存在を検出するためのキ
ットであって、ｉ）該ＨＣＶをコードする核酸にハイブリダイゼーションしうる、表１に示す
配列を含むオリゴヌクレオチド；ｉｉ）反応バッファー；およびｉｉｉ）説明書を含むキット。
【請求項１２９】該オリゴヌクレオチドがタグを含むものである請求項１
２８記載のキット。
【請求項１３０】生物学的試料中のＨＣＶの存在を検出するためのキット
であって、ｉ）ＨＣＶ蛋白に対して免疫学的に特異的な抗体；ｉｉ）陽性対照としての、固定化ＨＣＶ抗原を伴う固体支持体；およびｉｉｉ）説明書を含むキット。
【請求項１３１】該抗体がタグを含むものである請求項１３０記載のキッ
ト。