JPH04218377A

JPH04218377A - Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法

Info

Publication number: JPH04218377A
Application number: JP2936491A
Authority: JP
Inventors: Takenobu Kamata; 鎌田　武信; Norio Hayashi; 紀夫林; Eiji Mita; 英治三田; Keiji Ueda; 啓次上田
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1991-01-30
Publication date: 1992-08-07

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、配列番号：１に示され
るＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列を有するＤＮＡ配列
に関するものである。本発明のＤＮＡ配列は、Ｃ型肝炎
ウイルスのＲＮＡ診断に用い　るプロ−ブやプライマ−
の設定・合成に有用である。さらに、このＤＮＡ配列は
、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子工
学的製造に有用である。さらにまた、このＤＮＡ配列を
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。

【０００２】本発明はさらに、配列番号：２に示される
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した　１５塩基を含む
１５〜４０塩基からなるプライマ−および配列番号：３
に示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩
基を含む１５〜４０塩基からなるプ　ライマ−を用いる
ことを特徴とするＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウイルスの
検出方法を提供する。

【０００３】

【従来の技術】Ａ型肝炎は、直径２７ｎｍのＲＮＡウイ
ルスによる予後良好な急性伝染病で、ウイルスは肝実質
細胞および星細胞に存在し、糞便内に排泄されるため、
経口により伝播される。ウイルスが血中に出現する期間
は極めて短いため、血液を介しての伝染はない。他の肝
炎ウイルスによる急性肝炎に比べ、３８℃以上の発熱を
伴って発症することが多く、大多数は約４０日で肝機能
が正常化するが、稀に、劇症肝炎となることもある。

【０００４】Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルスの感染によ
るものであり、このウイルスはＤＮＡウ　イルスで二重
構造を有し、外被にＨＢｓ抗原、芯にＨＢｃ抗原、さら
にその内部にＨＢｅ　抗原が存在する。Ｂ型肝炎には一
過性感染と持続感染がある。一過性感染は、Ｂ型肝炎ウ
イルス感染後１〜６ケ月の潜伏期を経てから消化器系症
状を主とする肝炎症状と共に血清ＧＯＴ、ＧＰＴの上昇
と黄疸が現れる。ほとんどの例では発症後３ケ月以内に
肝機能は正常化するが、劇症肝炎となり速やかな経過で
死亡する例もある。持続感染には、Ｂ型肝炎ウイルスの
初感染から持続感染に移行する例と、無症　候性キャリ
アの急性発症例がある。この場合は定型的な急性肝炎を発症する例は少なく、大
部分が潜行性に発症して、慢性肝炎あるいは肝硬変で初
めて発見されることが多い。

【０００５】非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウイルスが原因と考え
られる輸血後肝炎、散発性の急性肝炎のうち、Ａ型なら
びにＢ型肝炎を除外した肝炎であり、未知のウイルスに
よる肝炎とされていた。日本では輸血後肝炎が１３〜２
０％の確率で発症しており、その９０％以上が非Ａ非Ｂ
型肝炎である。しかも慢性化する傾向はＢ型に比べて強
い。症状は、Ａ型ならびにＢ型肝炎に比べ無黄疸、自覚
症状を欠く例が多い（免疫学用語辞典第二版、最新医学
社）。

【０００６】上記のとおり、非Ａ非Ｂ型肝炎は未知のウ
イルスによる肝炎とされていたが、最近Ｈｏｕｇｈｔｏ
ｎらは、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の感染組織および血清から
得られたｃＤＮＡライブラリ−由来の発現産物をスクリ
−ニングすることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスゲノ
ムの一部のｃＤＮＡの単離に成功し、Ｃ型肝炎ウイルス
（ＨＣＶ）と命名した（欧州　公開特許０　３１８　２
１６）。さらに、Ｋｏｂｏらは、上記ＨＣＶとは異なる
ＨＣＶゲノムの一部のｃＤＮＡの単離に成功した（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２４（
１９８９）　１０３６７−１０３７２）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＨＣＶ
は単一のウイルスではなく、数多くの亜型（ｓｕｂｔｙ
ｐｅ）が存在することが示唆されており、地域により異
なる亜型が存在することが示唆されている。従って、Ｃ
型肝炎の正確な診断、予防・治療およびその解明のため
には、　さらなる亜型ＨＣＶの単離が必要となる。また
、そのような亜型を検出可能な検出　方法が必要となる
。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、公知の
ＨＣＶとは異なる亜型ＨＣＶのｃＤＮＡを提供すること
にある。本発明のＤＮＡ配列は、配列番号：１に示され
るＨＣＶのｃＤＮＡ配列を含むものであり、詳細には、
配列番号：１に示されるＤＮＡ配列からなるものである
。本発明のＤＮＡ配列は、ＨＣＶのＲＮＡ診断に用いる
プロ−ブやプライマ−の設定・合成に有用であり、さら
に、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子
工学的製造に有用で　ある。さらにまた、このＤＮＡを
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。本発
明のＤＮＡ配列は、公　知のＨＣＶのｃＤＮＡとは異な
るため、公知のＨＣＶのｃＤＮＡを用いては検出され得
ないＣ型　肝炎の診断に特に有用である。さらには、本
発明のＤＮＡ配列と公知のｃＤＮＡを比較　することに
より、より共通性の高いプライマ−やプロ−ブを作成す
ればより広範なＣ型肝炎のＲＮＡ診断が可能になる。

【０００９】本発明のＨＣＶのｃＤＮＡは以下の方法に
従い単離される。（１）ＲＮＡ抽出ＨＣＶ抗体陽性患者の血清を超遠心したペレットや肝臓
組織をＧＩＴ緩衝液などの適当な緩衝液中でホモジナイ
ズした後超遠心し、得られたペレットをＴＥ緩衝液など
の適当な緩衝液に溶解し、フェノ−ル抽出／エタノ−ル
沈殿によりＲＮＡを抽出す　る。

【００１０】（２）逆転写（１）で得られたＲＮＡと、公知のＨＣＶのｃＤＮＡ配
列を基に合成されたアンチセンスプ　ライマ−とを、市
販の逆転写酵素と反応させ、逆転写を行なう。

【００１１】（３）ポリメラ−ゼ・チェイン・リアクシ
ョン（２）で得られた反応溶液に、公知のＨＣＶのｃＤＮＡ
配列を基に合成されたセンスプライマ−と、Ｔａｑ　Ｄ
ＮＡ　ポリメラ−ゼを加え、常法に従いポリメラ−ゼ・
チェイン・リアクション反応を行なう。

【００１２】（４）電気泳動ポリメラ−ゼ・チェイン・リアクション反応液をポリア
クリルアミドゲルなどを用いて電気泳動し、用いたプラ
イマ−から推定される鎖長を有するバンドを切り出し、
目的の鎖長を有するＤＮＡを得る。

【００１３】（５）クロ−ニング（４）で得られたＤＮＡは、適当な選択マ−カ−を有す
る市販のプラスミドに挿入し、得られたプラスミドを大
腸菌などの適切な宿主に導入する。形質転換体の有する
プラスミドの挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、目的の鎖長の挿
入ＤＮＡを有するクロ−ンを陽性とする。

【００１４】（６）シ−ケンシング陽性クロ−ンの挿入ＤＮＡの塩基配列は、通常のジデオ
キシ鎖終止法により決定　した。

【００１５】本発明のｃＤＮＡの塩基配列を配列表の配
列番号：１に示す。本発明のｃＤＮＡと、既に報告され
ているＨＣＶのｃＤＮＡ配列（Ｊ１：Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２４　（１９８９）　
１０３６７−１０３７２およびＰＴ：欧州公開特許第０
　３１８２１６号）を比較すると、本発明で得られたＭ
１６はこれらＪ１とＰＴにそれぞれ約９６％と約８１％
の相同性を示し、新規なＨＣＶのｃＤＮＡの一部である
と推定された。

【００１６】本発明はさらに、配列番号：２に示される
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した　１５塩基を含む
１５〜４０塩基からなるプライマ−および配列番号：３
に示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩
基を含む１５〜４０塩基からなるプ　ライマ−を用いる
ことを特徴とするＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウイルスの
検出方法を提供する。配列番号：２に示されるＤＮＡ配
列は、配列番号：１に示されるＤＮＡ配列の６０４〜６
２３に対応するアンチセンス配列であり、配列番号：３
に示されるＤＮＡ配列は、配列番号：１に示されるＤＮ
Ａ配列の１〜２０に対応するセンス配列である　。

【００１７】本発明のＣ型肝炎ウイルスの検出方法に用
いるプライマ−は、配列番号：２および配列番号：３に
記載のＤＮＡ配列だけでなく、そのうち少なくとも連続
した１　５塩基を含む１５〜４０塩基からなるものを用
いることができる。１５〜４０塩基とは、ＰＣＲ法にお
けるプライマ−として用いられる通常の鎖長である。ま
た、配列番号：２および配列番号：３に記載のＤＮＡ配
列に相補的なプライマ−の組　合わせも可能である。こ
のようなプライマ−のデザインおよび調製は、配列番号
：１に記載のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により特異的に検出
し得るように、配列番号：　１に記載のＤＮＡ配列に基
づいて適宜行なうことができる。

【００１８】本発明で用いるＰＣＲ法は、Ｃ型肝炎ウイ
ルスがＲＮＡウイルスであるため、ＰＣＲを行なう前に
逆転写を行なう、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈ
ａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が好ましい。

【００１９】ＰＣＲ産物の検出は、ゲルを用いて電気泳
動したのち、エチジウムブロミドで染色して、紫外線下
で検出することができる。また、電気泳動後、配列番号
：１に対応するプロ−ブ、例えば配列番号：４に記載の
配列を有するプロ−ブをハイブリダイズさせて検出する
こともできる。この配列番号：４に記載の配列は、配列
番号：１の７３〜３６５番目の配列に対応する。

【００２０】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、この実施例は本発明を限定するものではな
い。

【００２１】

【実施例】（１）ＲＮＡ抽出ＨＣＶ抗体陽性患者血清約２ｍｌを１０名分（計約２０
ｍｌ）をＴＥＮ緩衝液（１０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ
７．５），　１ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．１Ｍ　ＮａＣｌ
）にて７倍に希釈し、ＨＩＴＡＣＨＩ　ＲＰＳ４０Ｔ２
ロ−タ−を用いて、３６０００ｒｐｍ、２時間、１５℃
で超遠心してペレットとした。これと、ＨＣＶ抗体陽性肝癌患者の切除肝の正常部約１
ｇとを、ＧＩＴ緩衝液（４．０Ｍ　グアニジウム・チオ
　シアネ−ト、０．１Ｍ　トリス−塩酸　（ｐＨ７．８
）、１％　β−メルカプトエタノ−ル、０．５％　Ｎ−
ラウロイルサルコシンナトリウム塩）４０ｍｌに、ブレ
ンダ−（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣ社製）を用　いて最高速で
約３０秒間ホモジナイズした。

【００２２】このホモジナイズした溶液２０ｍｌを、５
．７Ｍ　ＣｓＣｌ−０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８．
０）　２０ｍｌにゆ　っくりと重層し、ＨＩＴＡＣＨＩ
　ＳＲＰ−２８ＳＡロ−タ−を用いて、２４０００ｒｐ
ｍ、１５℃で２４時間超遠心した。得られたペレット約
８００μｇをジエチルピロカ−ボネ−ト処理ＴＥ緩衝液
（１０ｍＭ　トリス−塩酸　（ｐＨ７．８），　１ｍＭ
　ＥＤＴＡ）に溶解し、フェノ−ル／クロロホルム／イ
ソアミルアルコ−ル（２４：２４：１）で抽出した後、
エタノ−ル沈殿させた。得られた沈殿をジエチルピロカ
−ボネ−ト処理ＴＥ緩衝液に溶解し、核酸濃度を測定し
、ＲＮＡ濃度が１μｇ／μｌ　ＴＥ緩衝液となるよう調
製して、次の逆転写に用いた。

【００２３】（２）逆転写上記工程（１）で得られたＲＮＡ（１μｇ／μｌ　ＴＥ
緩衝液）１μｌを以下の組成の反応溶液　と混合した。１０　×　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ＊　　　　
　　　　　　　　　　　　　２μｌｄＮＴＰ　（それぞ
れ２．５ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８μｌ滅菌蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　６μｌアンチセンスプライマ
−（１０ｐｍｏｌ／μｌ）＊＊　　　　　２μｌ

【００
２４】＊：１０　×　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ
の組成５００ｍＭ　ＫＣｌ１００ｍＭ　トリス−塩酸　（ｐＨ８．３）　２５℃１
５ｍＭ　ＭｇＣｌ２０．１％（Ｗ／Ｖ）　ゼラチン

【００２５】＊＊：アンチセンスプライマ−の配列（配
列番号：２）５’−ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ−３
’（バイオサ−チ社製サイクロンにより合成）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２４　（１９
８９）１０３６７−１０３７２参照

【００２６】上記反
応溶液を６５℃で５分間予備加熱してＲＮＡの２次構造
を解除した後、室温で５分間放置してプライマ−をアニ
−ルさせた。これに、２００単位／μｌのＭ−ＭＬＶ逆
転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１μｌを加え、３７℃で６０分
間逆転写反応を行なった。

【００２７】（３）ポリメラ−ゼ・チェイン・リアクシ
ョン（ＰＣＲ）上記工程（２）の反応溶液２０μｌに以下の溶液を加え
た。１０　×　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　　　　　
　　　　　　　　８μｌ滅菌蒸留水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６９μｌセンスプラ
イマ−（１０ｐｍｏｌ／μｌ）＊　　　　　　　２μｌ
Ｔａｑ　ＤＮＡ　ポリメラ−ゼ（４単位／μｌ）＊＊　
　　１μｌ

【００２８】＊：センスプライマ−の配列（
配列番号：３）５’−ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＴＡ−３
’（バイオサ−チ社製サイクロンにより合成）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２４　（１９
８９）１０３６７−１０３７２参照＊＊：「Ｇｅｎｅ　
ＡｍｐＴＭ」キット（宝酒造）

【００２９】ＰＣＲ反応
は、９４℃３０秒→５５℃１分→７２℃１分に温度設定
し、３０サイクル行なった　後、７２℃１５分を追加し
た。

【００３０】（４）電気泳動ＰＣＲ反応液１００μｌをフェノ−ル／クロロホルム／
イソアミルアルコ−ル（２４：２４：１）１００μｌで
抽出した後、エタノ−ル沈殿させた。この沈殿物約５０
０ｎｇを１０μｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、ブロモフェノ
−ルブル−／キシレンシアノ−ル／シュクロ−ス（４μ
ｌ）を加えてサンプルとした。

【００３１】２．８ｍｌの３０％アクリルアミド溶液（
２９％アクリルアミド、１％　Ｎ、Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミド）、２．４ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液（
８９０ｍＭ　トリス−ホウ酸、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（
ｐＨ８．０））、１８．８ｍｌの滅菌蒸留水を混合した
後、少量の過硫酸アンモニウム、２０μｌのＮ、Ｎ、Ｎ
’、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを加え、３．
５％ポリアクリルアミドゲルを　作製した。

【００３２】このゲルを用いて上記サンプルを電気泳動
した後、エチジウムブロミドで染色し、二本鎖ＤＮＡを
紫外線下で確認した。同時に、サイズマ−カ−として、
ＡｌｕＩ消　化ｐＢＲ３２２（９０８、６５９、６５６
、５２１ｂｐ断片を含む）を電気泳動した。使用したプ
ライマ−から推定される目的の６２３ｂｐ付近のバンド
（シングルバンド）を切り出し、２０μｌのＴＥ緩衝液
に溶解した。

【００３３】（５）クロ−ニング２μｇ／μｌのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）１μｌを、１００ｍＭ　トリ
ス−塩酸、７０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ　ＫＣｌ
、７０ｍＭ　２−メルカプトエタノ−ルおよび１ｍｇ／
ｍｌ　牛血清アルブミンを含む反応液２μｌ、滅菌蒸留
水１６μｌおよび１μｌのＳｍａＩ（１４単位／μｌ、
東洋紡製）と混合し、３０℃で１時間インキュベ−トし
てＳｍａＩ消化した後、フェノ−ル抽出、エタノ−ル沈
殿を行ない、ＴＥ緩衝液に懸濁した（最終濃度　０．１
μｇ／μｌ）。

【００３４】このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋の
ＳｍａＩ消化溶液１μｌと上記工程（４）で得たＤＮＡ
溶液６μｌ、５　×　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ
　（２５０ｍＭ　トリス−塩酸　（ｐＨ７．８）、５０
ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ジチオトレイト−ル、２
．５ｍＭ　ＡＴＰ、５００μｇ／ｍｌ　牛血清アルブミ
ン）２μｌおよびＴ４ＤＮＡリガ−ゼ（５単位／μｌ）
１μｌとを混合し、１６℃で２０時間インキュベ−トし
た。

【００３５】Ｃａ＋＋処理した大腸菌ＸＬ−１−Ｂ（１
００μｌ）と上記反応液（１μｌ）を混合し、氷中０℃
で３０分間静置した後、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ、
４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含有するＬ培地上で形質転換した。

【００３６】形質転換された白色のコロニ−をＬ培地５
ｍｌ中で一夜培養した。このうち１．５ｍｌ　を７００
０ｒｐｍで４０秒間遠心した。得られたペレットを１０
０μｌのＳＴＥＴ緩衝液（８％シュクロ−ス、５％トラ
イトンＸ−１００、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ト
リス−塩酸　（ｐＨ８．０））に懸濁し　た。これに１
０μｇ／μｌのライソザイムを１０μｌ加えた後４０秒
間煮沸した。これを等量のフェノ−ル／クロロホルム／
イソアミルアルコ−ル（２４：２４：１）で抽出した後
、　得られた上清に等量のイソプロパノ−ルを加え−２
０℃で３０分間静置した。これを　遠心（１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１０分間）後、得られたペレットを１００
μｌのＴＥ緩衝液に懸濁　した。この懸濁液１６μｌに
、２μｌの１０×Ｈｉｇｈ　ｂｕｆｆｅｒ　（５００ｍ
Ｍ　トリス−塩酸　（ｐＨ７．５）、１０００ｍＭ　Ｎ
ａＣｌ、１００ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ジチオト
レイト−ル）、１μｌのＢａｍＨＩ（１２単位／μｌ）
、１μｌのＥｃｏＲＩ（１２単位／μｌ）を加え、３７
℃で３０分間インキュベ−トしてＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで二重消化した。この反応液２０μｌにブロモフェノ
−ルブル−／キシレンシアノ−ル／シュクロ−ス（５μ
ｌ）を加え、１．２％アガロ−スゲルを用いて電気泳動
　した。サイズマ−カ−としてＡｌｕＩ消化ｐＢＲ３２
２を用いた。エチジウムブロミド染色後、紫外線下で、
目的の６２３ｂｐ付近にバンドのみえる陽性クロ−ン２
個を得た。

【００３７】（６）シ−ケンシング前記工程（５）で得られた陽性クロ−ンの１つであるＭ
１６のＤＮＡインサ−トの塩基　配列を、ジデオキシ鎖
終止法により決定した。決定された塩基配列を配列表に
示す。本発明のＤＮＡ配列と、既に報告されているＨＣ
ＶのｃＤＮＡ配列（Ｊ１：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　２４　（１９８９）　１０３６７
−１０３７２およびＰＴ：欧州公開特許第０　３１８　
２１６号）を比較　すると、本発明で得られたＭ１６は
これらＪ１とＰＴにそれぞれ約９６％と約８１％の相同
性　を示し、新規なＨＣＶのｃＤＮＡの一部であると推
定された。

【００３８】（７）ＲＴ−ＰＣＲＣ−１００抗体陽性であるＣ型慢性肝炎患者（２０例）
の血清１００〜５００μｌからＲＮＡを抽出し、エタノ
−ル沈殿した後、配列番号：２に示す配列からなるアン
チセンスプライマ−を用いて逆転写を行ないｃＤＮＡと
した。さらに、配列番号：３に示す配列からなるセンス
プライマ−を加え、４０サイクルのＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物は２％アガロ−スゲル上で電気泳動し、膜に
ブロットした後、配列番号：４に示す配列からなるＤＮ
Ａを３２Ｐで標識したプロ−ブによりハイブリダイゼイ
ションを行ない解析した。Ｃ−１００抗体はＯｒｔｈｏ
社のＥＬＩＳＡキットにて測定した。その結果、２０例
中１８例が、ＨＣＶ−ＲＮＡ陽性を示した。

【配列表】

【００３９】配列番号：１配列の長さ：６２３配列の型：核酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸　　ウイルスＲＮＡに対するｃＤ
ＮＡアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：Ｃ型肝炎ウイルス配列ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧ　ＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ　ＣＴＣ
ＧＧＴＧＡＴＣ　ＧＡＣＴＧＴＡＡＣＡ　ＣＡＴＧＴＧ
ＴＣＡＣ　ＴＣＡＧＡＣＧＧＴＣ　　　　　６０ＧＡＴ
ＴＴＣＡＧＣＴ　ＴＧＧＡＴＣＣＣＡＣ　ＣＴＴＣＡＣ
ＣＡＴＴ　ＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡ　ＣＣＧＴＧＣＣＣＣ
Ａ　ＡＧＡＴＧＣＧＧＴＧ　　　　１２０ＴＣＧＣＧＣ
ＡＣＡＣ　ＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧ　ＴＡＧＧＡＣＴＧＧ
Ｃ　ＡＧＡＧＧＴＡＧＧＡ　ＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡ　Ｃ
ＡＧＧＴＴＴＧＴＧ　　　　１８０ＡＣＴＣＣＡＧＧＧ
Ｇ　ＡＡＣＧＧＣＣＣＴＣ　ＧＧＧＣＡＴＧＴＴＣ　Ｇ
ＡＴＴＣＣＴＣＧＧ　ＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡ　ＧＴＧＴ
ＴＡＴＧＡＣ　　　　２４０ＧＣＧＧＧＣＴＧＣＧ　Ｃ
ＴＴＧＧＴＡＴＧＡ　ＧＣＴＴＡＣＧＣＣＣ　ＧＣＴＧ
ＡＧＡＣＣＴ　ＣＧＧＴＴＡＧＧＴＴ　ＧＣＧＧＧＣＴ
ＴＡＣ　　　　３００ＣＴＡＡＡＴＡＣＡＣ　ＣＡＧＧ
ＧＴＴＧＣＣ　ＣＧＴＣＴＧＣＣＡＧ　ＧＡＣＣＡＴＣ
ＴＧＧ　ＡＧＴＴＣＴＧＧＧＡ　ＧＡＧＣＧＴＣＴＴＣ
　　　　３６０ＡＣＡＧＧＣＣＴＣＡ　ＣＣＣＡＣＡＴ
ＡＧＡ　ＴＧＣＣＣＡＴＴＴＣ　ＴＴＧＴＣＣＣＡＧＡ
　ＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣ　ＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣ　　　
　４２０ＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣ　ＴＧＧＴＡＧＣＡＴＡ
　ＴＣＡＡＧＣＣＡＣＡ　ＧＴＧＴＧＣＧＣＣＡ　ＧＧ
ＧＣＴＣＡＧＧＣ　ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡ　　　　４８
０ＴＣＧＴＧＧＧＡＣＣ　ＡＡＡＴＧＴＧＧＡＡ　ＧＴ
ＡＴＣＴＣＡＣＡ　ＣＧＧＣＴＡＡＡＡＣ　ＣＴＡＣＧ
ＣＴＧＣＡ　ＣＧＧＧＣＣＡＡＣＧ　　　　５４０ＣＣ
ＣＣＴＧＣＴＧＴ　ＡＴＡＧＧＣＴＡＧＧ　ＡＧＣＣＧ
ＴＣＣＡＡ　ＡＡＴＧＡＡＧＴＣＡ　ＴＣＣＴＣＡＣＡ
ＣＡ　ＣＣＣＣＡＴＡＡＣＣ　　　　６００ＡＡＡＴＡ
ＣＡＴＣＡ　ＴＧＡＣＡＴＧＣＡＴ　ＧＴＣ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　６２３

【００４０】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡアンチセンス：Ｙｅｓ配列ＧＡＣＡＴＧＣＡＴＧ　ＴＣＡＴＧＡＴＧＴＡ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０

【００４１】配列番号：３配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡアンチセンス：Ｎｏ配列ＧＧＣＴＡＴＡＣＣＧ　ＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０

【００４２】配列番号：４配列の長さ：２９３配列の型：核酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸　　合成ＤＮＡ配列

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　配列番号：１に示されるＤＮＡ配列を
有するＤＮＡ配列。
【請求項２】　　配列番号：１に示されるＤＮＡ配列で
ある請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】　　配列番号：２に示されるＤＮＡ配列の
うち少なくとも連続した　１５塩基を含む１５〜４０塩
基からなるプライマ−および配列番号：３に示されるＤ
ＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１５
〜４０塩基からなるプ　ライマ−を用いることを特徴と
するＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウイルスの検出方法。