JPH04262784A - Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法Info
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- JPH04262784A JPH04262784A JP4285591A JP4285591A JPH04262784A JP H04262784 A JPH04262784 A JP H04262784A JP 4285591 A JP4285591 A JP 4285591A JP 4285591 A JP4285591 A JP 4285591A JP H04262784 A JPH04262784 A JP H04262784A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、配列番号：１に示され
るＣ型肝炎ウィルスのｃＤＮＡ配列を有するＤＮＡ配列
に関するものである。本発明のＤＮＡ配列は、Ｃ型肝炎
ウィルスのＲＮＡ診断に用い るプローブやプライマー
の設定・合成に有用である。さらに、このＤＮＡ配列は
、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子工
学的製造に有用である。さらにまた、このＤＮＡ配列を
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。
るＣ型肝炎ウィルスのｃＤＮＡ配列を有するＤＮＡ配列
に関するものである。本発明のＤＮＡ配列は、Ｃ型肝炎
ウィルスのＲＮＡ診断に用い るプローブやプライマー
の設定・合成に有用である。さらに、このＤＮＡ配列は
、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子工
学的製造に有用である。さらにまた、このＤＮＡ配列を
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。
【０００２】本発明はさらに、配列番号：６に示される
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１
５〜４０塩基からなるプライマーおよび配列番号：７に
示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基
を含む１５〜４０塩基からなるプライマーを用いること
を特徴とするＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウィルスの検出
方法を提供する。
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１
５〜４０塩基からなるプライマーおよび配列番号：７に
示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基
を含む１５〜４０塩基からなるプライマーを用いること
を特徴とするＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウィルスの検出
方法を提供する。
【０００３】
【従来の技術】Ａ型肝炎は、直径２７ｎｍのＲＮＡウィ
ルスによる予後良好な急性伝染病で、ウィルスは肝実質
細胞および星細胞に存在し、糞便内に排泄されるため、
経口により伝播される。ウィルスが血中に出現する期間
は極めて短いため、血液を介しての伝染はない。他の肝
炎ウィルスによる急性肝炎に比べ、３８℃以上の発熱を
伴って発症することが多く、大多数は約４０日で肝機能
が正常化するが、稀に、劇症肝炎となることもある。
ルスによる予後良好な急性伝染病で、ウィルスは肝実質
細胞および星細胞に存在し、糞便内に排泄されるため、
経口により伝播される。ウィルスが血中に出現する期間
は極めて短いため、血液を介しての伝染はない。他の肝
炎ウィルスによる急性肝炎に比べ、３８℃以上の発熱を
伴って発症することが多く、大多数は約４０日で肝機能
が正常化するが、稀に、劇症肝炎となることもある。
【０００４】Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルスの感染によ
るものであり、このウィルスはＤＮＡウ ィルスで二重
構造を有し、外被にＨＢｓ抗原、芯にＨＢｃ抗原、さら
にその内部にＨＢｅ 抗原が存在する。Ｂ型肝炎には一
過性感染と持続感染がある。一過性感染は、Ｂ型肝炎ウ
ィルス感染後１〜６ケ月の潜伏期を経てから消化器系症
状を主とする肝炎症状と共に血清ＧＯＴ、ＧＰＴの上昇
と黄疸が現れる。ほとんどの例では発症後３ケ月以 内
に肝機能は正常化するが、劇症肝炎となり速やかな経過
で死亡する例もある。持続感染には、Ｂ型肝炎ウィルス
の初感染から持続感染に移行する例と、無症侯 性キャ
リアの急性発症例がある。この場合は定型的な急性肝炎
を発症する例は少なく、大部分が潜行性に発症して、慢
性肝炎あるいは肝硬変で初めて発見されることが多い。
るものであり、このウィルスはＤＮＡウ ィルスで二重
構造を有し、外被にＨＢｓ抗原、芯にＨＢｃ抗原、さら
にその内部にＨＢｅ 抗原が存在する。Ｂ型肝炎には一
過性感染と持続感染がある。一過性感染は、Ｂ型肝炎ウ
ィルス感染後１〜６ケ月の潜伏期を経てから消化器系症
状を主とする肝炎症状と共に血清ＧＯＴ、ＧＰＴの上昇
と黄疸が現れる。ほとんどの例では発症後３ケ月以 内
に肝機能は正常化するが、劇症肝炎となり速やかな経過
で死亡する例もある。持続感染には、Ｂ型肝炎ウィルス
の初感染から持続感染に移行する例と、無症侯 性キャ
リアの急性発症例がある。この場合は定型的な急性肝炎
を発症する例は少なく、大部分が潜行性に発症して、慢
性肝炎あるいは肝硬変で初めて発見されることが多い。
【０００５】非Ａ非Ｂ型肝炎は、ウィルスが原因と考え
られる輸血後肝炎、散発性の急性肝炎のうち、Ａ型なら
びにＢ型肝炎を除外した肝炎であり、未知のウィルスに
よる肝炎とされていた。日本では輸血後肝炎が１３〜２
０％の確率で発症しており、その９０％以上が非Ａ非Ｂ
型肝炎である。しかも慢性化する傾向はＢ型に比べて強
い。症状は、Ａ型ならびにＢ型肝炎に比べ無黄疸、自覚
症状を欠く例が多い（免疫学用語辞典第二版、最新医学
社）。
られる輸血後肝炎、散発性の急性肝炎のうち、Ａ型なら
びにＢ型肝炎を除外した肝炎であり、未知のウィルスに
よる肝炎とされていた。日本では輸血後肝炎が１３〜２
０％の確率で発症しており、その９０％以上が非Ａ非Ｂ
型肝炎である。しかも慢性化する傾向はＢ型に比べて強
い。症状は、Ａ型ならびにＢ型肝炎に比べ無黄疸、自覚
症状を欠く例が多い（免疫学用語辞典第二版、最新医学
社）。
【０００６】上記のとおり、非Ａ非Ｂ型肝炎は未知のウ
ィルスによる肝炎とされていたが、最近Ｈｏｕｇｈｔｏ
ｎらは、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の感染組織および血清から
得られたｃＤＮＡライブラリー由来の発現産物をスクリ
ーニングすることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスゲノ
ムの一部のｃＤＮＡの単離に成功し、Ｃ型肝炎ウィルス
（ＨＣＶ）と命名した（欧州 公開特許０ ３１８ ２
１６）。さらに、Ｋｕｂｏらは、上記ＨＣＶとは異なる
ＨＣＶゲノムの一部のｃＤＮＡの単離に成功した（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２４（
１９８９） １０３６７−１０３７２）。
ィルスによる肝炎とされていたが、最近Ｈｏｕｇｈｔｏ
ｎらは、非Ａ非Ｂ型肝炎患者の感染組織および血清から
得られたｃＤＮＡライブラリー由来の発現産物をスクリ
ーニングすることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスゲノ
ムの一部のｃＤＮＡの単離に成功し、Ｃ型肝炎ウィルス
（ＨＣＶ）と命名した（欧州 公開特許０ ３１８ ２
１６）。さらに、Ｋｕｂｏらは、上記ＨＣＶとは異なる
ＨＣＶゲノムの一部のｃＤＮＡの単離に成功した（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２４（
１９８９） １０３６７−１０３７２）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、ＨＣＶ
は単一のウィルスではなく、数多くの亜型（ｓｕｂｔｙ
ｐｅ）が存在することが示唆されており、地域により異
なる亜型が存在することが示唆されている。従って、Ｃ
型肝炎の正確な診断、予防・治療およびその解明のため
には、 さらなる亜型のＨＣＶの単離が必要となる。ま
た、そのような亜型を検出可能な検 出方法が必要とな
る。
は単一のウィルスではなく、数多くの亜型（ｓｕｂｔｙ
ｐｅ）が存在することが示唆されており、地域により異
なる亜型が存在することが示唆されている。従って、Ｃ
型肝炎の正確な診断、予防・治療およびその解明のため
には、 さらなる亜型のＨＣＶの単離が必要となる。ま
た、そのような亜型を検出可能な検 出方法が必要とな
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、公知の
ＨＣＶとは異なる亜型ＨＣＶのｃＤＮＡを提供すること
にある。本発明のＤＮＡ配列は、配列番号：１に示され
るＨＣＶのｃＤＮＡ配列を含むものであり、詳細には、
配列番号：１に示されるＤＮＡ配列からなるものである
。本発明のＤＮＡ配列は、ＨＣＶのＲＮＡ診断に用いる
プローブやプライマーの設定・合成に有用であり、さら
に、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子
工学的製造に有用で ある。さらにまた、このＤＮＡを
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。本発
明のＤＮＡ配列は、公 知のＨＣＶのｃＤＮＡとは異な
るため、公知のＨＣＶのｃＤＮＡを用いては検出され得
ないＣ型 肝炎の診断に特に有用である。さらには、本
発明のＤＮＡ配列と公知のｃＤＮＡとを比 較すること
により、より共通性の高いプライマーやプローブを作成
すればより広範なＣ型肝炎のＲＮＡ診断が可能になる。
ＨＣＶとは異なる亜型ＨＣＶのｃＤＮＡを提供すること
にある。本発明のＤＮＡ配列は、配列番号：１に示され
るＨＣＶのｃＤＮＡ配列を含むものであり、詳細には、
配列番号：１に示されるＤＮＡ配列からなるものである
。本発明のＤＮＡ配列は、ＨＣＶのＲＮＡ診断に用いる
プローブやプライマーの設定・合成に有用であり、さら
に、Ｃ型肝炎の免疫診断に用いられるペプチドの遺伝子
工学的製造に有用で ある。さらにまた、このＤＮＡを
用いて遺伝子工学的に製造されたペプチドは、Ｃ型肝炎
の免疫診断に用いられる抗体の製造に有用である。本発
明のＤＮＡ配列は、公 知のＨＣＶのｃＤＮＡとは異な
るため、公知のＨＣＶのｃＤＮＡを用いては検出され得
ないＣ型 肝炎の診断に特に有用である。さらには、本
発明のＤＮＡ配列と公知のｃＤＮＡとを比 較すること
により、より共通性の高いプライマーやプローブを作成
すればより広範なＣ型肝炎のＲＮＡ診断が可能になる。
【０００９】本発明のＨＣＶのｃＤＮＡは以下の方法に
従い単離される。 （１）ＲＮＡ抽出 肝癌患者の切除肝の正常組織をＧＩＴ緩衝液などの適当
な緩衝液中でホモジナイ ズした後超遠心し、得られた
ペレットをＴＥ緩衝液などの適当な緩衝液に溶解し、フ
ェノール抽出／エタノール沈殿によりＲＮＡを抽出する
。
従い単離される。 （１）ＲＮＡ抽出 肝癌患者の切除肝の正常組織をＧＩＴ緩衝液などの適当
な緩衝液中でホモジナイ ズした後超遠心し、得られた
ペレットをＴＥ緩衝液などの適当な緩衝液に溶解し、フ
ェノール抽出／エタノール沈殿によりＲＮＡを抽出する
。
【００１０】（２）逆転写
（１）で得られたＲＮＡと、公知のＨＣＶのｃＤＮＡ配
列を基に合成されたアンチセンスプ ライマーとを、市
販の逆転写酵素と反応させ、逆転写を行なう。
列を基に合成されたアンチセンスプ ライマーとを、市
販の逆転写酵素と反応させ、逆転写を行なう。
【００１１】（３）ポリメラーゼ・チェイン・リアクシ
ョン（ＰＣＲ） （２）で得られた反応溶液に、公知のＨＣＶのｃＤＮＡ
配列を基に合成されたセンスプライマーと、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼを加え、常法に従いポリメラーゼ・
チェイン・リアクション反応を行なう。
ョン（ＰＣＲ） （２）で得られた反応溶液に、公知のＨＣＶのｃＤＮＡ
配列を基に合成されたセンスプライマーと、Ｔａｑ Ｄ
ＮＡ ポリメラーゼを加え、常法に従いポリメラーゼ・
チェイン・リアクション反応を行なう。
【００１２】（４）Ｓｅｃｏｎｄ ＰＣＲ（３）で用い
たプライマーとは別のセンス・アンチセンスプライマー
を用いて、（３）で得られたＰＣＲ産物をさらに２度目
のＰＣＲにかける。
たプライマーとは別のセンス・アンチセンスプライマー
を用いて、（３）で得られたＰＣＲ産物をさらに２度目
のＰＣＲにかける。
【００１３】（５）電気泳動
２度目のＰＣＲ反応液をポリアクリルアミドゲルなどを
用いて電気泳動し、もちいたプライマーから推定される
鎖長を有するバンドを切りだし、目的の鎖長を有するＤ
ＮＡを得る。
用いて電気泳動し、もちいたプライマーから推定される
鎖長を有するバンドを切りだし、目的の鎖長を有するＤ
ＮＡを得る。
【００１４】（６）クローニング
（５）で得られたＤＮＡは、好ましくは５’末端をリン
酸化した後、適当な選択マー カーを有する市販のプラ
スミドに挿入し、得られたプラスミドを大腸菌などの適
切な宿主に導入する。形質転換体の有するプラスミドの
挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、 目的の鎖長の挿入ＤＮＡを
有するクローンを陽性とする。
酸化した後、適当な選択マー カーを有する市販のプラ
スミドに挿入し、得られたプラスミドを大腸菌などの適
切な宿主に導入する。形質転換体の有するプラスミドの
挿入ＤＮＡの鎖長を調べ、 目的の鎖長の挿入ＤＮＡを
有するクローンを陽性とする。
【００１５】（７） シーケンシング
陽性クローンの挿入ＤＮＡの塩基配列は、通常のジデオ
キシ鎖終止法により決定 する。本発明のｃＤＮＡ塩基
配列を配列表の配列番号：１に示す。
キシ鎖終止法により決定 する。本発明のｃＤＮＡ塩基
配列を配列表の配列番号：１に示す。
【００１６】本発明はさらに、配列番号：６に示される
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１
５〜４０塩基からなるプライマーおよび配列番号：７に
示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５〜４
０塩基からなるプライマーを用いることを特徴とするＰ
ＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウィルスの検出方法を提供する
。配列番号：６に示されるＤＮＡ配列は、配列番号：１
に示されるＤＮＡ配列の３０９〜３２８に対応するアン
チセンス配列であり、配列番号：７に示されるＤＮＡ配
列は、配列番号：１に示され るＤＮＡ配列の９〜２８
に対応するセンス配列である。
ＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１
５〜４０塩基からなるプライマーおよび配列番号：７に
示されるＤＮＡ配列のうち少なくとも連続した１５〜４
０塩基からなるプライマーを用いることを特徴とするＰ
ＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウィルスの検出方法を提供する
。配列番号：６に示されるＤＮＡ配列は、配列番号：１
に示されるＤＮＡ配列の３０９〜３２８に対応するアン
チセンス配列であり、配列番号：７に示されるＤＮＡ配
列は、配列番号：１に示され るＤＮＡ配列の９〜２８
に対応するセンス配列である。
【００１７】本発明のＣ型肝炎ウィルスの検出方法に用
いるプライマーは、配列番号：６お よび配列番号：７
に記載のＤＮＡ配列だけでなく、そのうち少なくとも連
続した１５ 塩基を含む１５〜４０塩基からなるものを
用いることができる。１５〜４０塩基とは、ＰＣＲ法に
おけるプライマーとして用いられる通常の鎖長である。 また、配列番号： ６および配列番号：７に記載のＤＮ
Ａ配列に相補的なプライマーの組合わせも可能 である
。このようなプライマーのデザインおよび調製は、配列
番号：１に記載のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により特異的に
検出し得るように、配列番号：１に記載のＤＮＡ配 列
に基づいて適宜行なうことができる。
いるプライマーは、配列番号：６お よび配列番号：７
に記載のＤＮＡ配列だけでなく、そのうち少なくとも連
続した１５ 塩基を含む１５〜４０塩基からなるものを
用いることができる。１５〜４０塩基とは、ＰＣＲ法に
おけるプライマーとして用いられる通常の鎖長である。 また、配列番号： ６および配列番号：７に記載のＤＮ
Ａ配列に相補的なプライマーの組合わせも可能 である
。このようなプライマーのデザインおよび調製は、配列
番号：１に記載のＤＮＡ配列をＰＣＲ法により特異的に
検出し得るように、配列番号：１に記載のＤＮＡ配 列
に基づいて適宜行なうことができる。
【００１８】本発明で用いるＰＣＲ法は、Ｃ型肝炎ウィ
ルスがＲＮＡウィルスであるため、ＰＣＲを行なう前に
逆転写を行なう、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈ
ａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が好ましい。
ルスがＲＮＡウィルスであるため、ＰＣＲを行なう前に
逆転写を行なう、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈ
ａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が好ましい。
【００１９】ＰＣＲ産物の検出は、ゲルを用いて電気泳
動した後、配列番号：１に対応するプ ローブ、例えば
配列番号：８に記載の配列を有するプローブを用いてサ
ザンブロットハイブリダイゼーションすることにより検
出することができる。配列番号：８に示されるＤＮＡ配
列は、配列番号：１に示されるＤＮＡ配列の８３〜１０
６に対応する 配列である。また、サザンブロットハイ
ブリダイゼーションの代わりに、ＰＣＲ産 物をさらに
２度目のＰＣＲにかける２重ＰＣＲ法を行ない、その産
物をエチジウムブロミドを含むゲルを用いて電気泳動し
、紫外線下で検出してもよい。
動した後、配列番号：１に対応するプ ローブ、例えば
配列番号：８に記載の配列を有するプローブを用いてサ
ザンブロットハイブリダイゼーションすることにより検
出することができる。配列番号：８に示されるＤＮＡ配
列は、配列番号：１に示されるＤＮＡ配列の８３〜１０
６に対応する 配列である。また、サザンブロットハイ
ブリダイゼーションの代わりに、ＰＣＲ産 物をさらに
２度目のＰＣＲにかける２重ＰＣＲ法を行ない、その産
物をエチジウムブロミドを含むゲルを用いて電気泳動し
、紫外線下で検出してもよい。
【００２０】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明するが、この実施例は本発明を限定するものではな
い。
説明するが、この実施例は本発明を限定するものではな
い。
【００２１】
【実施例】１．Ｃ型肝炎ウィルスのｃＤＮＡ配列の決定
（１）ＲＮＡ抽出 単一患者（肝癌患者）の切除肝の正常組織１ｇをＧＩＴ
緩衝液（４．０Ｍ グアニジウム ・チオシアネート、
０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、１％ β−
メルカプトエタノー ル）４０ｍｌに加え、ブレンダー
（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣ社製）を用いて最高速で約３０秒
間ホモジナイズした。このホモジネート液に１０％ Ｎ
−ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液を最終濃度が
０．５％になるように加えた。
（１）ＲＮＡ抽出 単一患者（肝癌患者）の切除肝の正常組織１ｇをＧＩＴ
緩衝液（４．０Ｍ グアニジウム ・チオシアネート、
０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、１％ β−
メルカプトエタノー ル）４０ｍｌに加え、ブレンダー
（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣ社製）を用いて最高速で約３０秒
間ホモジナイズした。このホモジネート液に１０％ Ｎ
−ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液を最終濃度が
０．５％になるように加えた。
【００２２】この０．５％ホモジネート溶液２０ｍｌを
、５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）２０ｍｌにゆっくりと重層し、ＨＩＴＡＣＨＩ
ＳＲＰ−２８ＳＡローターを用いて、２４０００ｒｐ
ｍ、１５℃で２４時間超遠心した。得られたペレットを
ジエチルピロカーボネート処理ＴＥ緩衝液（１００ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ ７．８），１ｍＭ ＥＤＴＡ）
に溶解し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：２４：１）で抽出した後、エタノール沈
殿させた。
、５．７Ｍ ＣｓＣｌ−０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）２０ｍｌにゆっくりと重層し、ＨＩＴＡＣＨＩ
ＳＲＰ−２８ＳＡローターを用いて、２４０００ｒｐ
ｍ、１５℃で２４時間超遠心した。得られたペレットを
ジエチルピロカーボネート処理ＴＥ緩衝液（１００ｍＭ
トリス−塩酸（ｐＨ ７．８），１ｍＭ ＥＤＴＡ）
に溶解し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：２４：１）で抽出した後、エタノール沈
殿させた。
【００２３】得られた沈殿をジエチルピロカーボネート
処理ＴＥ緩衝液３００μｌに溶解し、核酸濃度を測定し
たところ、ＲＮＡ濃度は２．８μｇ／μｌ ＴＥ緩衝液
となっていた。
処理ＴＥ緩衝液３００μｌに溶解し、核酸濃度を測定し
たところ、ＲＮＡ濃度は２．８μｇ／μｌ ＴＥ緩衝液
となっていた。
【００２４】（２）逆転写
上記工程（１）で得られた全ＲＮＡ（２．８μｇ／μｌ
）１μｌを以下の組成の反応溶液と 混合した。
）１μｌを以下の組成の反応溶液と 混合した。
【００２５】
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ＊
２μｌ滅菌蒸留水
１２μｌアンチセンスプライマー （１０
ｐｍｏｌ／μｌ）＊＊ ２μｌ＊：１０×ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成５００ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ８．３）２５℃１５
ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．１％（Ｗ／Ｖ） ゼラチン ＊＊：アンチセンスプライマーの配列 ５’−ＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣ−３
’ （配列番号：２）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参
照
２μｌ滅菌蒸留水
１２μｌアンチセンスプライマー （１０
ｐｍｏｌ／μｌ）＊＊ ２μｌ＊：１０×ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成５００ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ８．３）２５℃１５
ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．１％（Ｗ／Ｖ） ゼラチン ＊＊：アンチセンスプライマーの配列 ５’−ＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣ−３
’ （配列番号：２）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参
照
【００２６】上記反応溶液を６５℃で５分間予備加熱
してＲＮＡの２次構造を解除した後、室温で２分間放置
してプライマーをアニールさせた。これに、以下の溶液
を加えて、４２℃で６０分間逆転写反応を行なった。 ｄＮＴＰ （それぞれ１０ｍＭ）
２ μｌＲＮａｓｅ阻害剤（４０
単位／μｌ）＊ ０．５μ
ｌＭＭｕＬＶ逆転写酵素（２００単位／μｌ）＊＊
０．５μｌ＊：Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＊＊：Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ
してＲＮＡの２次構造を解除した後、室温で２分間放置
してプライマーをアニールさせた。これに、以下の溶液
を加えて、４２℃で６０分間逆転写反応を行なった。 ｄＮＴＰ （それぞれ１０ｍＭ）
２ μｌＲＮａｓｅ阻害剤（４０
単位／μｌ）＊ ０．５μ
ｌＭＭｕＬＶ逆転写酵素（２００単位／μｌ）＊＊
０．５μｌ＊：Ｐｒｏｍｅｇａ社 ＊＊：Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ
【００２７】（３） ポリメラーゼ・
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）上記工程（２）の反
応溶液２０μｌに以下の溶液を加えた。
チェイン・リアクション（ＰＣＲ）上記工程（２）の反
応溶液２０μｌに以下の溶液を加えた。
【００２８】
１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
８ μｌセンスプライマ
ー（１０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊ ２μ
ｌ滅菌蒸留水
６９．５μｌＴａｑ ＤＮＡ ポリ
メラーゼ（５単位／μｌ）＊＊ ０．５μｌ＊：
センスプライマーの配列 ５’−ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ−３
’ （配列番号：３）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参
照＊＊：「Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ」キット（宝酒造）
８ μｌセンスプライマ
ー（１０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊ ２μ
ｌ滅菌蒸留水
６９．５μｌＴａｑ ＤＮＡ ポリ
メラーゼ（５単位／μｌ）＊＊ ０．５μｌ＊：
センスプライマーの配列 ５’−ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ−３
’ （配列番号：３）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参
照＊＊：「Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ」キット（宝酒造）
【
００２９】ＰＣＲ反応は、 デナチュレーション工程 ： ９４℃ ３０秒アニー
リング工程 ： ５５℃ １分エクステ
ンション工程 ： ７２℃ １分を１サイクルと
して、３０サイクル行なった後、７２℃ １５分間の反
応を追加した 。
００２９】ＰＣＲ反応は、 デナチュレーション工程 ： ９４℃ ３０秒アニー
リング工程 ： ５５℃ １分エクステ
ンション工程 ： ７２℃ １分を１サイクルと
して、３０サイクル行なった後、７２℃ １５分間の反
応を追加した 。
【００３０】（４）Ｓｅｃｏｎｄ ＰＣＲ上記工程（３
）のＰＣＲ反応産物５μｌに以下の溶液を加えた。 １０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
１０ μｌｄＮＴＰ（それぞれ１０
ｍＭ） ２
μｌセンスプライマー（１０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊
２μｌアンチセンスプライマー（１
０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊＊ ２ μｌ滅菌蒸留水
７８．５μｌＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ＊＊＊
０．５μｌ
）のＰＣＲ反応産物５μｌに以下の溶液を加えた。 １０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ
１０ μｌｄＮＴＰ（それぞれ１０
ｍＭ） ２
μｌセンスプライマー（１０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊
２μｌアンチセンスプライマー（１
０ ｐｍｏｌ／μｌ）＊＊ ２ μｌ滅菌蒸留水
７８．５μｌＴａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ＊＊＊
０．５μｌ
【００３１
】＊：センスプライマーの配列５’−ＧＧＣＧＡＣＡＣ
ＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ−３’（配列番号：４）Ｊａ
ｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ６０， （１９
９０） １６７−１７７参照＊＊：アンチセンスプライ
マーの配列 ５’−ＣＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ−３
’（配列番号：５）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍ
ｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参照＊
＊＊：工程（２）で用いたものと同じ
】＊：センスプライマーの配列５’−ＧＧＣＧＡＣＡＣ
ＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ−３’（配列番号：４）Ｊａ
ｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ６０， （１９
９０） １６７−１７７参照＊＊：アンチセンスプライ
マーの配列 ５’−ＣＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ−３
’（配列番号：５）Ｊａｐａｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍ
ｅｄ． ６０， （１９９０） １６７−１７７参照＊
＊＊：工程（２）で用いたものと同じ
【００３２】ＰＣ
Ｒ反応は、 デナチュレーション工程 ： ９４℃ ３０秒ア
ニーリング工程 ： ５５℃ １分
エクステンション工程 ： ７２℃ １分を
１サイクルとして、３０サイクル行なった後、７２℃
１５分間の反応を追加した。
Ｒ反応は、 デナチュレーション工程 ： ９４℃ ３０秒ア
ニーリング工程 ： ５５℃ １分
エクステンション工程 ： ７２℃ １分を
１サイクルとして、３０サイクル行なった後、７２℃
１５分間の反応を追加した。
【００３３】（５）電気泳動
上記工程（４）のＰＣＲ反応産物６０μｌにブロモフェ
ノールブルー／キシレンシア ノール／シュクロース
２０μｌを加え、低融点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌ
ａｑｕｅ， ＦＭＣ社）を用いて電気泳動した後、エチ
ジウムブロマイド染色し、二本鎖ＤＮＡを紫外線下で確
認した。同時に、サイズマーカーとして、Ａｌｕ消化Ｐ
ＢＲ３２２（９０８， ６５９， ６５６， ５２１ｂ
ｐ断片を含む）を電気泳動し、それを参考にして目的の
長さに出た単一バンド を切りだし、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（ＣＳＨＬ） Ｐｒｅｓｓ）に従い、ＤＮＡを回
収した。
ノールブルー／キシレンシア ノール／シュクロース
２０μｌを加え、低融点アガロースゲル（Ｓｅａ Ｐｌ
ａｑｕｅ， ＦＭＣ社）を用いて電気泳動した後、エチ
ジウムブロマイド染色し、二本鎖ＤＮＡを紫外線下で確
認した。同時に、サイズマーカーとして、Ａｌｕ消化Ｐ
ＢＲ３２２（９０８， ６５９， ６５６， ５２１ｂ
ｐ断片を含む）を電気泳動し、それを参考にして目的の
長さに出た単一バンド を切りだし、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ（ＣＳＨＬ） Ｐｒｅｓｓ）に従い、ＤＮＡを回
収した。
【００３４】（６）クローニング
カイネーション（Ｋｉｎａｔｉｏｎ）反応上記工程（５
）で回収したＤＮＡをＴＥ緩衝液で０．２μｇ／μｌに
調製し、その１０μｌ を以下の溶液と混合した。
）で回収したＤＮＡをＴＥ緩衝液で０．２μｇ／μｌに
調製し、その１０μｌ を以下の溶液と混合した。
【００３５】
５×Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ＊
４μｌＡＴＰ（５０
ｐｍｏｌ／μｌ）
２μｌ滅菌蒸留水
２μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位／μｌ）＊＊
２μｌ＊：５×Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成
２５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ９．５）５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ ２５ｍＭ ＤＴＴ ２５％ グリセリン ＊＊：Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社
４μｌＡＴＰ（５０
ｐｍｏｌ／μｌ）
２μｌ滅菌蒸留水
２μｌ
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位／μｌ）＊＊
２μｌ＊：５×Ｋｉｎａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成
２５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ ９．５）５０ｍＭ
ＭｇＣｌ２ ２５ｍＭ ＤＴＴ ２５％ グリセリン ＊＊：Ｂｉｏ Ｌａｂｓ社
【００３６】上記混合溶液を３７℃で３０分間反応させ
た後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを２μｌ追加し、
更に３７℃で３０分間反応を行ないＤＮＡの５’末端を
リン酸化した。 反応液をフェノール処理した後、エタノール沈殿させた
。
た後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを２μｌ追加し、
更に３７℃で３０分間反応を行ないＤＮＡの５’末端を
リン酸化した。 反応液をフェノール処理した後、エタノール沈殿させた
。
【００３７】
ベクターへのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応
エタノール沈殿で得られたＤＮＡ沈殿物をＴＥ緩衝液で
０．０５μｇ／μｌに調製し、その１μｌを以下の溶液
と混合した。
エタノール沈殿で得られたＤＮＡ沈殿物をＴＥ緩衝液で
０．０５μｇ／μｌに調製し、その１μｌを以下の溶液
と混合した。
【００３８】
５×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ＊
２μｌＣＩＡＰ処理したＳｍａＩ消化ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）＊＊ １μｌ
滅菌蒸留水
５μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位
／μｌ） １μｌ＊：５×ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成２５０ｍＭ トリス−
塩酸（ｐＨ ７．８）５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ ジチオトレイトール ２．５ｍＭ ＡＴＰ ５００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン
２μｌＣＩＡＰ処理したＳｍａＩ消化ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）＊＊ １μｌ
滅菌蒸留水
５μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（５単位
／μｌ） １μｌ＊：５×ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒの組成２５０ｍＭ トリス−
塩酸（ｐＨ ７．８）５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ｍＭ ジチオトレイトール ２．５ｍＭ ＡＴＰ ５００μｇ／ｍｌ 牛血清アルブミン
【００３９】＊＊：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）をＳｍａＩで完全消
化した後、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）の方法に従
って、ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉ
ｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにてｄｅｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｉｏｎしたものをＴＥ緩衝液にて０．１μｇ
／μｌに調製した。この混合液を１６℃で２４時間反応
させた。
ｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）をＳｍａＩで完全消
化した後、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ， ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）の方法に従
って、ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉ
ｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅにてｄｅｐｈｏｓｐｈｏ
ｒｙｌａｔｉｏｎしたものをＴＥ緩衝液にて０．１μｇ
／μｌに調製した。この混合液を１６℃で２４時間反応
させた。
【００４０】形質転換
Ｃａ＋＋処理した大腸菌ＸＬ−１−Ｂ（１００μｌ）と
上記ｌｉｇａｔｉｏｎ反応液（１μｌ）を混合し、氷中
０℃で３０分間静置した後、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇｅ
ｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有するＬ培地上で形質転換した。
上記ｌｉｇａｔｉｏｎ反応液（１μｌ）を混合し、氷中
０℃で３０分間静置した後、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇｅ
ｌ、４０μｇ／ｍｌのＩＰＴＧおよび５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含有するＬ培地上で形質転換した。
【００４１】形質転換された白色のコロニーをＬ培地５
ｍｌ中で一夜培養した。このうち１．５ｍｌを７０００
ｒｐｍで４０秒間遠心した。得られたペレットを１００
μｌのＳＴＥＴ緩衝液（８％シュクロース、５％トライ
トンＸ−１００、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ ８．０）） に 懸濁した。これに１
０μｇ／μｌのライソザイムを１０μｌ加えた後４０秒
間煮沸した。これを等量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２４：２４：１）で抽出 した
後、得られた上清に等量のイソプロパノールを加え、−
２０℃で３０分間静置した。これを遠心（１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１０分間）後、得られたペレットを１００
μｌのＴＥ緩 衝液に懸濁した。この懸濁液１６μｌに
、２μｌの１０×Ｈｉｇｈ ｂｕｆｆｅｒ （５００ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、１０００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオト
レイトール）、１μｌのＢａｍＨＩ（１２単位／μｌ）
、１μｌのＥｃｏＲＩ（１２単位／μｌ）を加え、３７
℃で１時間インキュベ ートしてＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで二重消化した。
ｍｌ中で一夜培養した。このうち１．５ｍｌを７０００
ｒｐｍで４０秒間遠心した。得られたペレットを１００
μｌのＳＴＥＴ緩衝液（８％シュクロース、５％トライ
トンＸ−１００、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリ
ス−塩酸（ｐＨ ８．０）） に 懸濁した。これに１
０μｇ／μｌのライソザイムを１０μｌ加えた後４０秒
間煮沸した。これを等量のフェノール／クロロホルム／
イソアミルアルコール（２４：２４：１）で抽出 した
後、得られた上清に等量のイソプロパノールを加え、−
２０℃で３０分間静置した。これを遠心（１５０００ｒ
ｐｍ、４℃、１０分間）後、得られたペレットを１００
μｌのＴＥ緩 衝液に懸濁した。この懸濁液１６μｌに
、２μｌの１０×Ｈｉｇｈ ｂｕｆｆｅｒ （５００ｍ
Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ ７．５）、１０００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオト
レイトール）、１μｌのＢａｍＨＩ（１２単位／μｌ）
、１μｌのＥｃｏＲＩ（１２単位／μｌ）を加え、３７
℃で１時間インキュベ ートしてＢａｍＨＩとＥｃｏＲ
Ｉで二重消化した。
【００４２】この反応液２０μｌにブロモフェノールブ
ルー／キシレンシアノール／シュ クロース（５μｌ）
を加え、１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動した
。サイズマーカーとしてＡｌｕＩ消化ｐＢＲ３２２を用
いた。エチジウムブロミド染色後、紫外線下で、目的の
長さ付近にバンドのみえる陽性クローンを得た。
ルー／キシレンシアノール／シュ クロース（５μｌ）
を加え、１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動した
。サイズマーカーとしてＡｌｕＩ消化ｐＢＲ３２２を用
いた。エチジウムブロミド染色後、紫外線下で、目的の
長さ付近にバンドのみえる陽性クローンを得た。
【００４３】（７）シーケンシング
前記工程（６）で得られた陽性クローンの１つであるＭ
６４２のＤＮＡインサートの塩基配列を、ジデオキシ鎖
終止法により決定した。決定された塩基配列を配列番号
１に示す。
６４２のＤＮＡインサートの塩基配列を、ジデオキシ鎖
終止法により決定した。決定された塩基配列を配列番号
１に示す。
【００４４】
２．ＲＴ−ＰＣＲ法を用いたＣ型肝炎ウィルスの検出臨
床的に非Ａ非Ｂ型慢性肝疾患と診断された１１５例およ
びＢ型慢性肝疾患１０例を対象とし、以下の工程で実験
を行なった。
床的に非Ａ非Ｂ型慢性肝疾患と診断された１１５例およ
びＢ型慢性肝疾患１０例を対象とし、以下の工程で実験
を行なった。
【００４５】（１）ＲＮＡ抽出
上記疾患患者の血清２００μｌに対し、２１％ ＰＥＧ
６０００−１．５Ｍ ＮａＣｌを１００μｌ加え た
。ボルテックスをかけ、簡単に遠心した後、氷中で１〜
２時間静置した。次いで、１５０００ｒｐｍ、４℃で２
０分間遠心した後（トミー，アングルローター）、上清
を除去 し、沈殿にＧＴＣ緩衝液（４Ｍグアニジニウム
チオシアネイト、０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５
）、１％ β−メルカプトエタノール、０．５％サルコ
シル）を４００μｌ加え、ピペッティングにより沈殿を
溶解して簡単に遠心した。次に、フェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：２４：１）を４０
０μｌ加え、ボルテックスをかけ、１２０００ｒｐｍ、
室温で２０分間遠心し（トミー、スウィングローター）
、上清（水層）を採取し た。
６０００−１．５Ｍ ＮａＣｌを１００μｌ加え た
。ボルテックスをかけ、簡単に遠心した後、氷中で１〜
２時間静置した。次いで、１５０００ｒｐｍ、４℃で２
０分間遠心した後（トミー，アングルローター）、上清
を除去 し、沈殿にＧＴＣ緩衝液（４Ｍグアニジニウム
チオシアネイト、０．１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ７．５
）、１％ β−メルカプトエタノール、０．５％サルコ
シル）を４００μｌ加え、ピペッティングにより沈殿を
溶解して簡単に遠心した。次に、フェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール（２４：２４：１）を４０
０μｌ加え、ボルテックスをかけ、１２０００ｒｐｍ、
室温で２０分間遠心し（トミー、スウィングローター）
、上清（水層）を採取し た。
【００４６】もう一度フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール（２４：２４：１）を 上清の等量加
え、ボルテックスをかけて、１２０００ｒｐｍ、室温で
２０分間遠心し（トミ ー，スウィングローター）、上
清（水層）を３００μｌ採取した。そこにｔＲＮＡ（１
０μｇ／μｌ）を１μｌ加え、さらに１／１０容量（３
０μｌ）の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５容量（７５０
μｌ）の冷エタノールを加えて−８０℃で１時間以上静
置した。１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し（ト
ミー、アングルローター）沈殿を得た。得られた沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え、簡単にボルテック
スをかけてから１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心
し（ト ミー，アングルローター）沈殿を得た。 得られた沈殿をデシケーター内で真空吸 引乾燥した後
、ＲＴ溶液Ｉ＊で溶解し、６５℃で１０分間加熱し、氷
中で急冷した。
アミルアルコール（２４：２４：１）を 上清の等量加
え、ボルテックスをかけて、１２０００ｒｐｍ、室温で
２０分間遠心し（トミ ー，スウィングローター）、上
清（水層）を３００μｌ採取した。そこにｔＲＮＡ（１
０μｇ／μｌ）を１μｌ加え、さらに１／１０容量（３
０μｌ）の３Ｍ 酢酸ナトリウムと２．５容量（７５０
μｌ）の冷エタノールを加えて−８０℃で１時間以上静
置した。１５０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心し（ト
ミー、アングルローター）沈殿を得た。得られた沈殿に
７０％エタノール２００μｌを加え、簡単にボルテック
スをかけてから１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心
し（ト ミー，アングルローター）沈殿を得た。 得られた沈殿をデシケーター内で真空吸 引乾燥した後
、ＲＴ溶液Ｉ＊で溶解し、６５℃で１０分間加熱し、氷
中で急冷した。
【００４７】
＊：ＲＴ溶液Ｉの組成
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ
）＊＊ ２μｌ 滅菌
蒸留水
９μｌ
合計
１１μｌ ＊＊：アンチセンスプライマーの配列 ５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧ−３
’ （配列番号：６）
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ
）＊＊ ２μｌ 滅菌
蒸留水
９μｌ
合計
１１μｌ ＊＊：アンチセンスプライマーの配列 ５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧ−３
’ （配列番号：６）
【００４８】（２）逆転写（ｃＤ
ＮＡの合成）上記（１）で得られた溶液に、簡単にボル
テックスをかけ、ＲＴ溶液ＩＩ＊を加えて、３７℃で３
０分間、さらに４２℃で３０分間反応させた後、簡単に
遠心した。 ＊：ＲＴ溶液ＩＩの組成
５×Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＲ
Ｌ）＊＊ ４ μ
ｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ）
２ μｌ １０ｍＭ
ｄＮＴＰｓ
２ μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ，４０単位／
μｌ） ０．５μｌ
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ，２００単位／
μｌ） ０．５μｌ
合計
９ μｌ ＊＊：５×Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＲＬ）
の組成２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ ８．３，
２５℃）３７５ｍＭ ＫＣｌ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＮＡの合成）上記（１）で得られた溶液に、簡単にボル
テックスをかけ、ＲＴ溶液ＩＩ＊を加えて、３７℃で３
０分間、さらに４２℃で３０分間反応させた後、簡単に
遠心した。 ＊：ＲＴ溶液ＩＩの組成
５×Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＲ
Ｌ）＊＊ ４ μ
ｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ（ＢＲＬ）
２ μｌ １０ｍＭ
ｄＮＴＰｓ
２ μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ，４０単位／
μｌ） ０．５μｌ
Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（ＢＲＬ，２００単位／
μｌ） ０．５μｌ
合計
９ μｌ ＊＊：５×Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＲＬ）
の組成２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ ８．３，
２５℃）３７５ｍＭ ＫＣｌ １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２
【００４９】（３）ＰＣＲ
０．５ｍｌエッペンドルフチューブにＰＣＲ溶液＊を加
え、上記（２）で合成したｃＤＮＡ液（９５℃で５分間
加熱し、氷中で急冷したもの）の２０μｌをそこに加え
た。 ＊：ＰＣＲ溶液の組成
１×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＊＊
７７．５μ
ｌ センスプライマー（１０ｐｍ
ｏｌ／μｌ）＊＊＊ ２ μ
ｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（ＣＥ
ＴＵＳ， ５単位／μｌ） ０．５μｌ
合計
８０．０μｌ ＊＊：１×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒの組成４５．１６ｍＭ
ＫＣｌ １．１６ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％ ゼラチン ＊＊＊：センスプライマーの配列 ５’−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３
’ （配列番号：７）
え、上記（２）で合成したｃＤＮＡ液（９５℃で５分間
加熱し、氷中で急冷したもの）の２０μｌをそこに加え
た。 ＊：ＰＣＲ溶液の組成
１×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ＊＊
７７．５μ
ｌ センスプライマー（１０ｐｍ
ｏｌ／μｌ）＊＊＊ ２ μ
ｌ Ｔａｑ ポリメラーゼ（ＣＥ
ＴＵＳ， ５単位／μｌ） ０．５μｌ
合計
８０．０μｌ ＊＊：１×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒの組成４５．１６ｍＭ
ＫＣｌ １．１６ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０１％ ゼラチン ＊＊＊：センスプライマーの配列 ５’−ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ−３
’ （配列番号：７）
【００５０】この溶液を用いて
ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、ＣＥＴＵＳ社の
ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用し、デナ
チュレーション工程：９４℃ ３０秒アニーリング工程
：５５℃ １分エクステンション工程
：７２℃ １分を１サイクルとして、４０サイクル行な
い、その後さらに７２℃で１０分間エクステン ション
反応を行なった。
ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応は、ＣＥＴＵＳ社の
ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用し、デナ
チュレーション工程：９４℃ ３０秒アニーリング工程
：５５℃ １分エクステンション工程
：７２℃ １分を１サイクルとして、４０サイクル行な
い、その後さらに７２℃で１０分間エクステン ション
反応を行なった。
【００５１】（４）サザンブロッティング上記（３）の
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（エチジウムブロミド
は含まず）を用いて電気泳動した後、０．５Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液 ２００ｍｌに浸し、ゆっ
くりと３０分間 振盪した。次に、ゲル内ＤＮＡをメン
ブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に一
晩アルカリブロッティングし（アルカリトランスバッフ
ァー：０．４Ｎ ＮａＯＨ）、メンブレンを２×ＳＳＣ
で、ゆっくり振盪しながら１５分間ずつ室温で２回洗浄
、さらに５０℃で３０分間洗浄して室温で乾燥させ、そ
の後、−２０℃で保存した。
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（エチジウムブロミド
は含まず）を用いて電気泳動した後、０．５Ｎ ＮａＯ
Ｈ−１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液 ２００ｍｌに浸し、ゆっ
くりと３０分間 振盪した。次に、ゲル内ＤＮＡをメン
ブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋）に一
晩アルカリブロッティングし（アルカリトランスバッフ
ァー：０．４Ｎ ＮａＯＨ）、メンブレンを２×ＳＳＣ
で、ゆっくり振盪しながら１５分間ずつ室温で２回洗浄
、さらに５０℃で３０分間洗浄して室温で乾燥させ、そ
の後、−２０℃で保存した。
【００５２】（５）３２Ｐ標識ＨＣＶ−ｃＤＮＡを用い
たハイブリダイゼーション 上記（４）でサザンブロッティングしたメンブレンをプ
レハイブリダイゼーシ ョン溶液（５×ＳＳＰＥ，５×
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，０．５％ ＳＤＳ，１００μｇ
／ｍｌ ｓｓＤＮＡ）に浸し、５５℃で２〜４時間処理
した。次いで、３２Ｐ標識ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブ＊
をハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼー
ション溶液に同じ）に加え、５５℃で一晩インキュベー
トした後、メンブレンを約１００ｍｌの０．１×ＳＳＣ
／０．１％ ＳＤＳ溶液で、ゆっくり振盪しながら室温
で３０分間洗浄した。さらに約１００ｍｌの０．１×Ｓ
ＳＣ／０．１％ ＳＤＳ溶液で、ゆっくり振盪しながら
５０℃で３０分間洗浄し、その後、−８０℃でオートラ
ジオグラフィーを行ないＨＣＶ−ＲＮＡを検出した。 ＊：３２Ｐ標識ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブの配列５’−
ＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣ−
３’（配列番号：８）
たハイブリダイゼーション 上記（４）でサザンブロッティングしたメンブレンをプ
レハイブリダイゼーシ ョン溶液（５×ＳＳＰＥ，５×
Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，０．５％ ＳＤＳ，１００μｇ
／ｍｌ ｓｓＤＮＡ）に浸し、５５℃で２〜４時間処理
した。次いで、３２Ｐ標識ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブ＊
をハイブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼー
ション溶液に同じ）に加え、５５℃で一晩インキュベー
トした後、メンブレンを約１００ｍｌの０．１×ＳＳＣ
／０．１％ ＳＤＳ溶液で、ゆっくり振盪しながら室温
で３０分間洗浄した。さらに約１００ｍｌの０．１×Ｓ
ＳＣ／０．１％ ＳＤＳ溶液で、ゆっくり振盪しながら
５０℃で３０分間洗浄し、その後、−８０℃でオートラ
ジオグラフィーを行ないＨＣＶ−ＲＮＡを検出した。 ＊：３２Ｐ標識ＨＣＶ−ｃＤＮＡプローブの配列５’−
ＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣ−
３’（配列番号：８）
【００５３】（６）Ｃ−１００抗
体の検出上記実験とは別に、同じ検体を用いてＣ−１０
０抗体の検出を行なった。測定に は、Ｏｒｔｈｏ社の
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを使用した。
体の検出上記実験とは別に、同じ検体を用いてＣ−１０
０抗体の検出を行なった。測定に は、Ｏｒｔｈｏ社の
ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを使用した。
【００５４】（７）成績
非Ａ非Ｂ型慢性肝疾患においてＣ−１００抗体は１１５
例中９３例（８１％）で陽性であった 。ＨＣＶ−ＲＮ
Ａは、Ｃ−１００抗体陽性例では９２％（８６／９３）
、Ｃ−１００抗体陰性例では５０％（１１／２２）に検
出されたが、Ｂ型慢性肝疾患例では検出されなかった。 また別に、Ｃ−１００抗体陽性であるＣ型慢性肝炎患者
（２０例）についても同様の実験を行なったところ、２
０例中２０例（１００％）ともＨＣＶ−ＲＮＡ陽性を示
した。
例中９３例（８１％）で陽性であった 。ＨＣＶ−ＲＮ
Ａは、Ｃ−１００抗体陽性例では９２％（８６／９３）
、Ｃ−１００抗体陰性例では５０％（１１／２２）に検
出されたが、Ｂ型慢性肝疾患例では検出されなかった。 また別に、Ｃ−１００抗体陽性であるＣ型慢性肝炎患者
（２０例）についても同様の実験を行なったところ、２
０例中２０例（１００％）ともＨＣＶ−ＲＮＡ陽性を示
した。
【００５５】配列番号：１
配列の長さ：８０７
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 ウィルスＲＮＡ由来のｃＤＮ
Ａアンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Ｃ型肝炎ウィルス 配列 ＣＣＧＧＣＧＡＣＡＣ ＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧ ＡＴＣ
ＡＣＴＣＣＣＣ ＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣ ＴＡＣＴＧＴ
ＣＴＴＣ ＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧ ６０ＣＧＴ
ＣＴＡＧＣＣＡ ＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴ ＡＴＧＡＧＴ
ＧＴＣＧ ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ ＡＧＧＴＣＣＣＣＣ
Ｃ ＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡ １２０ＧＣＣＡＴＡ
ＧＡＧＧ ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣ ＣＧＧＴＧＡＧＴＡ
Ｃ ＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧ ＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣ Ｃ
ＧＧＧＴＣＣＴＴＴ １８０ＣＴＴＧＧＡＴＣＡ
Ａ ＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴ ＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴ Ｔ
ＴＧＧＧＣＧＴＧＣ ＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＴＧＣ
ＴＡＧＣＣＧ ２４０ＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧ Ｇ
ＧＴＣＧＣＧＡＡＡ ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧ ＴＡＣＴ
ＧＣＣＴＧＡ ＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴ ＧＣＧＡＧＴＧ
ＣＣＣ ３００ＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴ ＣＧＴＡ
ＧＡＣＣＧＴ ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧ ＣＡＣＡＡＡＴ
ＣＣＴ ＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡ ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
３６０ＡＣＧＴＡＡＣＡＣＣ ＡＡＣＣＧＣＣ
ＧＣＣ ＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴ ＣＡＡＧＴＴＣＣＣＧ
ＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣ ＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧ
４２０ＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣ ＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣ
ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣ ＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴ ＧＴ
ＧＣＧＣＧＣＧＡ ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣ ４８
０ＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧ ＴＣＧＣＡＡＣＣＴＣ ＧＴ
ＧＧＡＡＧＧＣＧ ＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣ ＣＣＣＡＡ
ＧＧＣＴＣ ＧＣＣＧＧＣＣＣＧＡ ５４０ＧＧ
ＧＣＡＧＧＧＣＣ ＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣ ＣＣＧＧＧ
ＴＡＣＣＣ ＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣ ＴＡＴＧＧＣＡＡ
ＴＧ ＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧ ６００ＧＴＧＧＧ
ＣＡＧＧＡ ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴ ＣＡＣＣＣＣＧＡ
ＧＧ ＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴ ＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣ
ＣＣＡＣＴＧＡＣＣＣ ６６０ＣＣＧＧＣＧＴＡ
ＧＧ ＴＣＧＣＧＴＡＡＴＴ ＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣ ＣＴＣＡＣＡＴＧＣＧ ＧＣＴ
ＴＣＧＣＣＧＡ ７２０ＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧ
ＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣ ＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣ ＣＣＣ
ＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡ ＧＧＧＣＣＣ
ＴＧＧＣ ７８０ＧＣＡＴＧＧＣＧＴＣ ＣＧＧ
ＧＴＴＣＴＧＧ ＡＡＣＡＣＧＧ
８０７
Ａアンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：Ｃ型肝炎ウィルス 配列 ＣＣＧＧＣＧＡＣＡＣ ＴＣＣＡＣＣＡＴＡＧ ＡＴＣ
ＡＣＴＣＣＣＣ ＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣ ＴＡＣＴＧＴ
ＣＴＴＣ ＡＣＧＣＡＧＡＡＡＧ ６０ＣＧＴ
ＣＴＡＧＣＣＡ ＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴ ＡＴＧＡＧＴ
ＧＴＣＧ ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣ ＡＧＧＴＣＣＣＣＣ
Ｃ ＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡ １２０ＧＣＣＡＴＡ
ＧＡＧＧ ＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣ ＣＧＧＴＧＡＧＴＡ
Ｃ ＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧ ＣＣＡＧＧＡＣＧＡＣ Ｃ
ＧＧＧＴＣＣＴＴＴ １８０ＣＴＴＧＧＡＴＣＡ
Ａ ＣＣＣＧＣＴＣＡＡＴ ＧＣＣＴＧＧＡＧＡＴ Ｔ
ＴＧＧＧＣＧＴＧＣ ＣＣＣＣＧＣＧＡＧＡ ＣＴＧＣ
ＴＡＧＣＣＧ ２４０ＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧ Ｇ
ＧＴＣＧＣＧＡＡＡ ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧ ＴＡＣＴ
ＧＣＣＴＧＡ ＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴ ＧＣＧＡＧＴＧ
ＣＣＣ ３００ＣＧＧＧＡＧＧＴＣＴ ＣＧＴＡ
ＧＡＣＣＧＴ ＧＣＡＣＣＡＴＧＡＧ ＣＡＣＡＡＡＴ
ＣＣＴ ＡＡＡＣＣＴＣＡＡＡ ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＡ
３６０ＡＣＧＴＡＡＣＡＣＣ ＡＡＣＣＧＣＣ
ＧＣＣ ＣＡＣＡＧＧＡＣＧＴ ＣＡＡＧＴＴＣＣＣＧ
ＧＧＣＧＧＴＧＧＴＣ ＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧ
４２０ＴＧＧＡＧＴＴＴＡＣ ＣＴＧＴＴＧＣＣＧＣ
ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＣ ＣＡＧＧＴＴＧＧＧＴ ＧＴ
ＧＣＧＣＧＣＧＡ ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣ ４８
０ＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧ ＴＣＧＣＡＡＣＣＴＣ ＧＴ
ＧＧＡＡＧＧＣＧ ＡＣＡＡＣＣＴＡＴＣ ＣＣＣＡＡ
ＧＧＣＴＣ ＧＣＣＧＧＣＣＣＧＡ ５４０ＧＧ
ＧＣＡＧＧＧＣＣ ＴＧＧＧＣＴＣＡＧＣ ＣＣＧＧＧ
ＴＡＣＣＣ ＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣ ＴＡＴＧＧＣＡＡ
ＴＧ ＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧ ６００ＧＴＧＧＧ
ＣＡＧＧＡ ＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴ ＣＡＣＣＣＣＧＡ
ＧＧ ＣＴＣＴＣＧＧＣＣＴ ＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣ
ＣＣＡＣＴＧＡＣＣＣ ６６０ＣＣＧＧＣＧＴＡ
ＧＧ ＴＣＧＣＧＴＡＡＴＴ ＴＧＧＧＴＡＡＧＧＴ
ＣＡＴＣＧＡＴＡＣＣ ＣＴＣＡＣＡＴＧＣＧ ＧＣＴ
ＴＣＧＣＣＧＡ ７２０ＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧ
ＴＡＣＡＴＴＣＣＧＣ ＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣ ＣＣＣ
ＣＣＴＧＧＧＡ ＧＧＣＧＣＴＧＣＣＡ ＧＧＧＣＣＣ
ＴＧＧＣ ７８０ＧＣＡＴＧＧＣＧＴＣ ＣＧＧ
ＧＴＴＣＴＧＧ ＡＡＣＡＣＧＧ
８０７
【００５６】配列番号：２
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｙｅｓ
配列
ＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡ ＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣ
２０
２０
【００５７】配列番号：３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣ ＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ
２０
２０
【００５８】配列番号：４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
ＧＧＣＧＡＣＡＣＴＣ ＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴ
２０
２０
【００５９】配列番号：５
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｙｅｓ
配列
ＣＣＧＴＧＴＴＣＣＡ ＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣ
２０
２０
【００６０】配列番号：６
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｙｅｓ
配列
ＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣ ＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧ
２０
２０
【００６１】配列番号：７
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｎｏ
配列
ＡＣＴＣＣＡＣＣＡＴ ＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣ
２０
２０
【００６２】配列番号：８
配列の長さ：２４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の配列 合成ＤＮＡ
配列
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号：１に示されるＤＮＡ配列を
有するＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 配列番号：１に示されるＤＮＡ配列で
ある請求項１記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 配列番号：６に示されるＤＮＡ配列の
うち少なくとも連続した１５塩基を含む１５〜４０塩基
からなるプライマーおよび配列番号：７に示されるＤＮ
Ａ配列のうち少なくとも連続した１５塩基を含む１５〜
４０塩基からなるプライマーを用いることを特徴とする
ＰＣＲ法に基づくＣ型肝炎ウィルスの検出方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4285591A JPH04262784A (ja) | 1991-02-14 | 1991-02-14 | Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法 |
| AT91111413T ATE150086T1 (de) | 1990-07-11 | 1991-07-09 | Cdns-sequenz und detektion des hepatitis c-virus |
| ES91111413T ES2100185T3 (es) | 1990-07-11 | 1991-07-09 | Secuencia de adnc y deteccion del virus de la hepatitis c. |
| DK91111413.0T DK0469348T3 (da) | 1990-07-11 | 1991-07-09 | cDNA-sekvens og detektering af hepatitis C-virus |
| DE69125066T DE69125066T2 (de) | 1990-07-11 | 1991-07-09 | cDNS-Sequenz und Detektion des Hepatitis C-Virus |
| EP91111413A EP0469348B1 (en) | 1990-07-11 | 1991-07-09 | cDNA sequence and detection of hepatits C virus |
| KR1019910011819A KR920002784A (ko) | 1990-07-11 | 1991-07-11 | C형 간염 비루스의 cDNA 서열 및 검출 |
| GR970400916T GR3023251T3 (en) | 1990-07-11 | 1997-04-22 | cDNA sequence and detection of hepatits C virus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4285591A JPH04262784A (ja) | 1991-02-14 | 1991-02-14 | Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04262784A true JPH04262784A (ja) | 1992-09-18 |
Family
ID=12647638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4285591A Pending JPH04262784A (ja) | 1990-07-11 | 1991-02-14 | Ｃ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ配列および検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04262784A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11103899A (ja) * | 1997-09-30 | 1999-04-20 | Tokyoto Rinshou Igaku Sogo Kenkyusho | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
-
1991
- 1991-02-14 JP JP4285591A patent/JPH04262784A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11103899A (ja) * | 1997-09-30 | 1999-04-20 | Tokyoto Rinshou Igaku Sogo Kenkyusho | リアルタイム検出ｐｃｒ法によるｈｃｖ遺伝子の測定方法並びにそれに用いられるプライマー及びプローブ |
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