ES2339240T3 - Metodo para detectar y cuantificar el virus de la hepatitis c. - Google Patents
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Abstract
Un cebador que consiste en la secuencia del SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos.
Description
Método para detectar y cuantificar el virus de
la hepatitis C.
La invención está dirigida a métodos y reactivos
para detectar y cuantificar el virus de la hepatitis C (HCV) en
muestras biológicas y a kits para llevar a cabo los métodos.
Las citas bibliográficas completas para los
documentos referidos se pueden encontrar en la sección Bibliografía,
inmediatamente antes de las reivindicaciones.
El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus con
ARN de cadena sencilla, que contiene un genoma de aproximadamente
9.400 nucleótidos. Véase Clark (1997). El HCV ha sido identificado
como el principal agente etiológico para la hepatitis no A, no B,
post-transfusión en todo el mundo. Rosen &
Gretch (1999). Aproximadamente el 85% de los individuos infectados
por HCV desarrollan hepatitis crónica, desarrollando aproximadamente
el 20% de los individuos infectados crónicamente cirrosis. Véase
Rosen & Gretch (1999). En pacientes con cirrosis, la incidencia
de carcinoma hepatocelular es de aproximadamente 1% a 4% por año.
Véase Consensus Statement (1999).
Se han desarrollado ensayos serológicos para la
detección de anticuerpos anti-HCV. Véase Clark
(1997). No obstante, la presencia de anti-HCV no es
un indicador directo de viremia por HCV, puesto que no se pueden
diferenciar las infecciones resueltas de las infecciones activas. Se
ha utilizado la actividad alanina aminotransferasa (ALT) en suero
como indicador sustituto de la infección activa por HCV, pero la
actividad ALT tampoco proporciona una medida directa de la viremia
por HCV. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm.
5.279.944.
Los ensayos de ácidos nucleicos para detectar y
cuantificar el ARN de HCV proporcionan una medida directa de la
viremia por HCV, y se han vuelto cada vez más importantes para
mejorar la seguridad de la sangre, y para controlar a los pacientes
en terapia. El ensayo cualitativo para HCV ha sido decisivo en la
reducción del número de casos de infección por HCV
post-transfusión. Es típico de estos ensayos
cualitativos el Análisis HCV-RT-PCR
de marca UltraQual producido por el National Genetics Institute (Los
Ángeles, California). Este ensayo ha sido aprobado por la
Administración de Alimentos y Fármacos de los EEUU para el ensayo
cualitativo de plasma reunido en busca de la presencia de HCV.
Véase también la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.527.669,
expedida el 18 de Junio de 1996.
De un modo similar, los ensayos cuantitativos
para el ARN de HCV han sido decisivos en la comprensión de la
eficacia de la respuesta anti-viral a tratamientos
tales como la monoterapia con interferón y la terapia combinada con
interferón/ribavirina. Véanse McHutchison et al. (1998) y
Davis et al. (1998). El ensayo de la carga viral de HCV
tiene implicaciones antes, durante, y después de la administración
de la terapia anti-viral. Los niveles bajos de
viremia en una medición en la linea base tomada antes del
tratamiento se corresponden significativamente con una mayor
respuesta a la terapia con interferón, conduciendo de ese modo al
uso de una carga viral de HCV para pronosticar la respuesta
individual del paciente a semejante terapia. Véanse Izopet et
al. (1998); Kakumu et al. (1997); y Toyoda et al.
(1996). La terapia de control con el ensayo de la carga viral de HCV
puede permitir a los médicos diferenciar entre los pacientes que
responden al tratamiento de aquellos que no, determinar la duración
del tratamiento, y ajustar la terapia a los pacientes individuales.
Véanse Izopet et al. (1998); Kakumu et al. (1997);
Yamakawa et al. (1998); y Tong et al. (1997). Tras la
terminación de la terapia, se han utilizado los niveles de ARN de
HCV para pronosticar la recaída y para identificar a los pacientes
que responden a largo plazo. Pawlotsky et al. (1996) y
Chemello et al. (1996).
La presente invención proporciona métodos,
reactivos, y kits mejorados para cuantificar el virus de la
hepatitis C (HCV) en muestras biológicas. El método utiliza
cualquier método adecuado de amplificación de ácido nucleico, y
utiliza preferiblemente la reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa (RT-PCR), junto con el
marcaje diferencial y la captura de los amplicones resultantes, para
medir cuantitativamente la cantidad de ARN de HCV en una muestra
biológica. El método utiliza un transcrito de ARN de HCV de control
interno que es co-amplificado junto con cualquier
ARN de HCV encontrado en la muestra. El control interno y cualquier
ARN de HCV presente en la muestra son
co-amplificados de una manera competitiva. De este
modo, comparando la cantidad de control interno que es amplificado
con la cantidad de ARN de HCV que es amplificado, se puede calcular
la cantidad de ARN de HCV presente en una muestra de ensayo
exactamente y precisamente. Asimismo, debido a que el método cuenta
con un control interno para la calibración, se puede
pre-fabricar una curva de calibración y enviar con
el kit de análisis, limitando de ese modo el número de experimentos
de calibración que el usuario debe realizar.
El método preferido continúa generalmente como
sigue: primero se extrae el ARN de un espécimen biológico mediante
cualquier medio conocido en la técnica o desarrollado en el futuro.
En la realización preferida, se extrae el ARN utilizando un kit
disponible en el mercado, el "Kit de Extracción de Ácido Nucleico
Viral de marca QI amp" (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Véase
"QI amp7Viral RNA Mini Kit Handbook", Enero de 1999. El virión
es lisado con un caotropo, tal como isotiocianato de guanidinio
(GuSCN), preferiblemente en presencia de proteinasa K, liberando de
ese modo simultáneamente el ARN viral y protegiéndolo de la
degradación por las ARNasas que pueden estar presentes en la
muestra.
En el mismo momento en el que se añade el
caotropo a la muestra, también se añade una cantidad conocida de un
transcrito de ARN de HCV de control interno a la muestra. El control
interno tiene una secuencia idéntica a la del ARN de HCV, con la
excepción de una región de unión a la sonda modificada que permite
una detección diferencial del control interno. Debido a que el
control interno es idéntico al ARN de HCV (con la excepción de la
única región de unión a la sonda), el control interno tiene los
mismos sitios de unión al cebador que el ARN de HCV de tipo
salvaje.
El ARN (esto es, tanto cualquier ARN de HCV
presente en la muestra como el control interno) se hace precipitar
después preferiblemente mediante un método adecuado conocido ahora o
desarrollado en el futuro (por ejemplo la adición de etanol).
Después el ARN es adherido a una membrana, tal como una membrana de
sílice. El ARN adherido se lava después para separar los
componentes distintos del ARN. De este modo, por ejemplo, el ARN
adherido a la membrana se puede lavar con una elevada concentración
de sal, seguido de un lavado con baja concentración de sal, para
separar los contaminantes distintos de ARN de la membrana. Después
se hace eluir el ARN de la membrana. Es digno de mención que en el
presente método, el ácido nucleico de control interno se extraiga
simultáneamente con el ácido nucleico de HCV presente en la muestra.
En resumen, el control interno se lleva a cabo a través del método
completo, y de este modo experimenta exactamente las mismas
manipulaciones que el ARN de HCV. Esto se suma a la precisión de
los resultados generados mediante el método.
El ARN aislado (ARN de HCV y control interno) se
amplifica después por medio de un protocolo de
RT-PCR convencional, preferiblemente utilizando los
cebadores novedosos descritos en la presente memoria. Además de los
reactivos de amplificación convencionales utilizados en la
RT-PCR, también se añaden a la reacción dos sondas
oligonucleotídicas marcadas distintas (no cebadores), una primera
sonda que es específica para los amplicones de HCV y una
segunda sonda que es específica para los amplicones del
patrón interno. La segunda sonda se une a los amplicones del patrón
interno por medio de la única región de unión a la sonda del control
interno. De este modo, el ARN se convierte primero en un
heterodúplex de ARN-ADN (esto es se genera una hebra
de ADNc) por medio de la acción de una transcriptasa inversa
(preferiblemente rTth). Después el ADNc es amplificado mediante PCR
convencional para producir amplicones de ADN de doble hebra. La
reacción de transcripción inversa que conduce al ADNc puede ser
catalizada utilizando una transcriptasa que sea distinta de la
polimerasa utilizada en la posterior reacción de amplificación. No
obstante, en la realización preferida, se utiliza la ADN polimerasa
termoestable, recombinante rTth (aislada de Thermus
thermophilus). Esta enzima es capaz de catalizar tanto la
reacción de transcripción inversa como la posterior reacción de
amplificación.
Las concentraciones del control interno y los
cebadores se optimizan de manera que las dos secuencias diana (el
ARN de HCV presente en la muestra y el control interno) compitan por
los cebadores. Esta competición forma de este modo la base sobre la
cual se determina la cantidad de ARN de HCV en la muestra de ensayo.
A medida que aumenta la concentración de ARN de HCV en la muestra,
se utilizan más cebadores para generar los amplicones de ARN de
HCV. Simultáneamente, existe una caída correspondiente en el número
de amplicones generados a partir del control interno. De este modo,
la razón de amplicón derivado del paciente con respecto al amplicón
de control interno permite la determinación de la razón inicial del
HCV derivado del paciente con respecto al patrón interno. De este
modo, la presente invención proporciona, entre otras cosas, un
método para cuantificar la cantidad de ácido nucleico de HCV en una
muestra, tal como la derivada de un paciente.
Como se ha observado antes, además de los
reactivos de amplificación convencionales utilizados en la
RT-PCR, a la reacción de amplificación también se
le añaden dos sondas oligonucleotídicas: una primera sonda que es
específica para los amplicones de HCV y una segunda sonda que es
específica para los amplicones del control interno. Estas sondas se
marcan diferencialmente para permitir que sean detectadas y
distinguidas entre sí. La etapa de calentamiento y enfriamiento
final permite que estas sondas hibriden con sus respectivos
amplicones. Las sondas se detectan después (mediante cualquier
medio conocido ahora en la técnica o desarrollado en el futuro) y
se calcula la cantidad de amplicones de ARN de HCV y de amplicones
de control interno basándose en las señales generadas por las
respectivas marcas de las respectivas sondas. Como se describe con
detalle en la Descripción Detallada, en la realización preferida,
se detectan los dúplex sonda-amplicón utilizando un
formato de inmunoanálisis enzimático con micropartículas (MEIA)
empleando un analizador automatizado de marca "LCx" de Abbott
Laboratories.
En la realización preferida de la invención, uno
o ambos cebadores utilizados para amplificar tanto el ARN de HCV
como el control interno se modifican para que incluyan un radical de
captura, preferiblemente un hapteno derivado de carbazol. Véase la
Patente de los Estados Unidos Núm. 5.464.746, que describe algunos
haptenos de carbazol y dibenzofurano adecuados para su uso en la
presente invención. En la realización preferida, solamente el
cebador inverso es modificado para que incluya un radical de
captura.
La primera y la segunda sondas
oligonucleotídicas (esto es, las sondas que son diseñadas para
hibridar con los amplicones de ARN de HCV y los amplicones de
control interno, respectivamente) se marcan con distintas marcas
que permiten que sean distinguidas entre sí. En una realización
preferida, una de las sondas es marcada con adamantano, mientras la
otra sonda es marcada con dansilo. (Estas son solo marcas
ilustrativas. Para una lista más detallada de las marcas adecuadas
que se pueden utilizar en la invención, véase la sección de
"Abreviaturas y Definiciones").
Tras la RT-PCR y la etapa de
calentamiento y enfriamiento final para permitir que las sondas
primera y segunda hibriden con sus respectivos amplicones, se pone
en contacto una alícuota de los productos de amplificación con una
micropartícula revestida con un reactivo de captura (tal como un
anticuerpo) que reconoce el radical de captura presente en los
amplicones. Por ejemplo, cuando el radical de captura del cebador
inverso es un carbazol, la micropartícula se reviste con un
reactivo de captura anti-carbazol (preferiblemente
un anticuerpo anti-carbazol) que reconoce
específicamente y se une al radical carbazol del cebador. De esta
manera, las micropartículas reconocen y unen el radical de captura
encontrado en los productos de amplificación y el cebador inverso
libre. Esto sirve para inmovilizar los amplicones (así como los
cebadores que no han reaccionado) sobre la micropartícula, a la vez
que dejan las marcas (presentes solamente en los amplicones
hibridados con aquél que contiene la primera o la segunda sonda)
libres para reaccionar.
En la realización preferida, en la que se
utiliza el analizador de marca "LCx", las micropartículas se
adhieren después (preferiblemente de manera irreversible, aunque no
se requiere una unión irreversible) a una matriz de fibra de
vidrio. Las micropartículas unidas se incuban después con los
reactivos adecuados para detectar las diferentes marcas de la
primera y la segunda sonda. Esto se realiza preferiblemente por
medio de un inmunoanálisis de tipo sándwich. De este modo, por
ejemplo, cuando la sonda de ARN de HCV está marcada con adamantano y
la sonda de control interno está marcada con dansilo, los complejos
de micropartículas se incuban con una mezcla de reacción que
contiene (por ejemplo) producto conjugado de anticuerpo
anti-adamantano/fosfatasa alcalina y producto
conjugado de anticuerpo
anti-dansilo/\beta-galactosidasa.
El producto conjugado con fosfatasa alcalina se unirá
específicamente a las sondas marcadas con adamantano (en los
amplicones de ARN de HCV); el producto conjugado con
\beta-galactosidasa se unirá específicamente a las
sondas marcadas con dansilo (en el control interno). Añadiendo el
sustrato para la fostasa alcalina MUP a la mezcla de reacción se
producirá la escisión de MUP y la generación de una señal
fluorescente que es medida y almacenada. Después de medir la señal,
la matriz de fibra de vidrio se lava y se añade el sustrato de la
\beta-galactosidasa AUG. El producto conjugado
con \beta-galactosidasa escindirá el AUG,
generando de ese modo una segunda señal fluorescente, distinta de
la primera. Esta segunda señal también se mide y se almacena. La
cantidad de cada señal es proporcional a la respectiva cantidad de
amplicones generados competitivamente a partir del ARN de HCV y del
control interno durante el protocolo de RT-PCR. La
cantidad de ARN de HCV presente en la muestra se puede determinar
después comparando las señales generadas por la muestra de ensayo
con respecto a una curva de calibración. La curva de calibración se
genera analizando una serie de muestras de calibración empleando el
presente método y generando una curva que representa la
concentración de HCV como una función de la producción de señal
generada por las dos marcas. Cada muestra de calibración de la
serie contiene una cantidad fija y conocida de control interno. Se
puede utilizar cualquier cantidad adecuada de control interno. Por
ejemplo, se pueden utilizar tan pocas como 1000, 500, u
opcionalmente 50 copias por muestra de calibración en muchas
realizaciones. De un modo similar, se pueden utilizar tantas como
3.000, 10.000, u opcionalmente 30.000 copias de control interno por
muestra de calibración. Las muestras varían en cantidad de ARN de
HCV derivado del paciente o muestra contenida en cada ensayo. Se
someten a ensayo suficientes muestras para cubrir el intervalo de
detección dinámica completo del método. De este modo, el número de
copias de ARN viral se puede calcular, por ejemplo, tomando el
logaritmo de la proporción: {recuentos de velocidad festo es,
cuentas/segundo/segundo ("c/s/s")) para los amplicones de ARN
de HCV dividido por los recuentos de velocidad (c/s/s) para los
amplicones de control interno}, y comparando el valor experimental
con el correspondiente valor de la curva de calibración. De este
modo, la producción de señal a partir de la muestra de ensayo se
convierte en un valor para la concentración de HCV presente en la
muestra de ensayo.
En general, el método más preferido de acuerdo
con la presente invención comprende añadir a una muestra de ensayo
que se sospecha que contiene un ácido nucleico genómico de HCV: (i)
una cantidad conocida de un control interno que comprende un
transcrito de ácido nucleico de HCV; (ii) una segunda sonda
específica marcada apara los amplicones del oligonucleótido de
control interno; y (iii) una primera sonda específica marcada para
los amplicones de ácido nucleico genómico de HCV. El transcrito del
control interno y cualquier ácido nucleico genómico de HCV presente
en la muestra de ensayo son co-amplificados
competitivamente utilizando un cebador directo y un cebador
inverso, creando de ese modo amplicones del transcrito del control
interno y amplicones de cualquiera de los ácidos nucleicos
genómicos de HCV presentes en la muestra de ensayo. La muestra de
ensayo se incuba después en condiciones que permiten que la primera
sonda hibride con los amplicones del oligonucleótido de control
interno y la segunda sonda marcada hibride con los amplicones del
ácido nucleico genómico de HCV, formando de ese modo híbridos. Los
híbridos formados entre la primera sonda marcada y los amplicones
del transcrito de control interno, y los híbridos formados entre la
segunda sonda marcada y los amplicones del ácido nucleico genómico
de HCV, son detectados después. Comparando estos resultados con una
curva de calibración se puede cuantificar la cantidad de ácido
nucleico genómico de HCV presente en la muestra de ensayo.
La presente invención tiene muchas ventajas
sobre los métodos actuales para medir las cargas de HCV. Por
ejemplo, los análisis de HCV disponibles actualmente en el mercado
adolecen de un intervalo dinámico y de una sensibilidad limitados.
En contraste, la presente invención incluye un método para detectar
y cuantificar el ARN de HCV que es independiente del genotipo y
capaz de medir precisamente los niveles de ARN de HCV a lo largo de
un intervalo dinámico que abarca de cinco a seis órdenes de
magnitud o más. El presente método es capaz de medir exactamente
los niveles de HCV inferiores a menos de 100 copias por ml.
Los beneficios observados antes son debidos en
gran medida a los cebadores de RT-PCR únicos
descritos en la presente memoria. Estos cebadores presentan un
incremento muy significativo en la especificidad y la afinidad para
el ARN de HCV en comparación con los cebadores de la técnica
anterior. Estos cebadores descritos en la presente memoria
cuantifican todos los genotipos de HCV de 1 a 6 más coherentemente y
sin preferencia hacia el genotipo.
El presente método también puede tolerar
elevadas concentraciones del control interno competitivo debido a
la fuerte afinidad y especificidad del cebador de
RT-PCR directo. De este modo, dependiendo del
volumen de la muestra, incluso cuando el método utiliza
aproximadamente 10.000 copias del control interno por reacción,
todavía detectará fiablemente las muestras que contienen
aproximadamente 200 copias/ml de ARN de HCV. Debido a que cada
reacción incluye una concentración relativamente elevada de
secuencias diana (esto es, incluso muestras desprovistas de ARN de
HCV, incluirán, en la realización preferida, aproximadamente 10.000
copias del control interno), la amplificación y la detección son
más coherentes y de este modo los resultados finales son bastante
más precisos que en otros formatos de detección de HCV.
Otra ventaja del presente método es que las
reacciones de transcripción inversa, amplificación, e hibridación
de oligonucleótidos tienen lugar en un único recipiente de reacción.
La detección se puede llevar a cabo automáticamente sin tener que
abrir manualmente el recipiente de reacción. Debido a que la
manipulación de las secuencias diana y producto ha sido reducida a
una adición de una etapa, se minimiza la posibilidad de
contaminación de la muestra de ensayo.
Asimismo, como se comenta más abajo, el presente
método puede ser calibrado de antemano, debido a la especificidad
del cebador y a la inclusión de una secuencia de control interno. De
este modo, las señales generadas a partir de cualquier ensayo
individual se pueden evaluar frente a la curva de calibración
pre-fabricada, y obtener un valor de carga de
HCV.
"Reactivos de amplificación" designa
colectivamente los diversos tampones, enzimas, cebadores,
desoxinucleósidos trifosfato, y oligonucleótidos utilizados para
realizar el procedimiento de amplificación mediante PCR o
RT-PCR seleccionado.
"Amplificar" o "Amplificación"
representa cualquier método adecuado de amplificación de un ácido
nucleico que emplea una sonda o cebador oligonucleotídico
específicos. Los mecanismos adecuados conocidos en la técnica
incluyen NASBA, Amplificación Mediada por Transcripción (TMA),
Análisis de Ligación de Oligonucleótidos (OLA), Reacción en Cadena
de la Ligasa (LCR), y otras. No obstante, estos términos hacen
referencia preferiblemente a cualquier incremento esencialmente
cuantitativo y logarítmico en una secuencia diana como resultado de
una PCR diseñada para amplificar la secuencia diana específica.
"Amplicón" representa un producto de
amplificación.
"Recocido" hace referencia a una
hibridación complementaria entre un oligonucleótido y una secuencia
diana y abarca los emparejamientos erróneos menores que pueden ser
acomodados reduciendo la restricción de la hibridación para lograr
el cebado deseado para la transcriptasa inversa o la ADN polimerasa
o para detectar una señal de hibridación.
"AUG" designa el sustrato
(2-hidroxietilamiduro) de ácido
7-\beta-galactopiranosiloxi-cumarin-4-acético.
Este sustrato es escindido por un producto conjugado con
\beta-galactosidasa para producir una señal
fluorescente.
"Reactivo de captura/radical de captura"
designa cualquier combinación de compuestos o radicales que se
reconocen y unen específicamente entre sí. Los tipos ilustrativos
de combinaciones de reactivo de captura/radical de captura que caen
dentro del alcance de la invención incluyen haptenos y anticuerpos
específicamente reactivos con el hapteno (tales como carbazol y un
anticuerpo anti-carbazol). También se incluyen
explícitamente las reacciones de captura bien conocidas entre, por
ejemplo, biotina y avidina y entre glutation y
glutation-S-transferasa, etc. Según
se utiliza en la presente memoria, el término "hapteno" hace
referencia a un antígeno parcial o un miembro de unión distinto de
una proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo, pero que no es
capaz de lograr la formación de anticuerpos a menos que se acople a
una proteína portadora. Los ejemplos de los haptenos incluyen
biotina, avidina, adamantano y carbazol.
"Marca" designa una molécula o un radical
que tiene una propiedad o característica que es susceptible de
detección. Una marca puede ser detectable directamente, como, por
ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas,
partículas coloidales, micropartículas fluorescentes y similares; o
una marca puede ser detectable indirectamente, como, por ejemplo,
miembros de unión específica. Los ejemplos anteriores se incluyen
explícitamente en la definición de "marca". Se entenderá que
las marcas detectables directamente pueden requerir componentes
adicionales tales como, por ejemplo, sustratos, reactivos
disparadores, luz, y similares para permitir la detección de la
marca. Cuando se utilizan marcas detectables indirectamente, éstas
se emplean típicamente combinadas con "un producto conjugado".
Un producto conjugado es típicamente un miembro de unión específica
que ha sido anclado o acoplado a una marca detectable directamente.
Las químicas de acoplamiento para sintetizar un producto conjugado
son bien conocidas en la técnica y pueden incluir, por ejemplo,
cualquier método químico y/o físico que no destruya la propiedad de
unión específica del miembro de unión específica o la propiedad
detectable de la marca. Según se utiliza en la presente memoria,
"miembro de unión específica" representa un miembro de un par
de unión, esto es, dos moléculas diferentes en las que una de las
moléculas, por ejemplo, a través de medios químicos o físicos se
une específicamente a la otra molécula. Además de los pares de unión
específica a antígenos y anticuerpos, otros pares de unión
específica incluyen, pero no están limitados a, avidina y biotina;
haptenos y anticuerpos específicos para los haptenos; secuencias de
nucleótidos complementarias; cofactores o sustratos de enzimas y
enzimas; y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
En la literatura se conocen muchos métodos de
adición de haptenos a sondas oligonucleotídicas. Una revisión de
semejante literatura de productos conjugados se encuentra en
Goodchild (1990). También se pueden añadir marcas, haptenos, y
similares, a oligonucleótidos como se describe en las Patentes de
los Estados Unidos Núms. 5.464.746; 5.424.414; y 4.948.882.
"MEIA" hace referencia a un inmunoanálisis
de enzimas con micropartículas. Véase, por ejemplo, Fiore et
al. (1988), Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.358.691
(describe la maquinaria automática para realizar los protocolos de
MEIA) y 5.507.410 (describe un alimentador de cartucho para la
maquinaria de MEIA automatizado). En el formato MEIA, las
micropartículas inertes (normalmente cuentas de látex) se acoplan
covalentemente con un anticuerpo de captura específico para un
analito dado (en este caso, los amplicones marcados con la sonda de
la reacción de RT-PCR). Después de ponerlas en
contacto con una muestra que se sospecha que contiene el analito
dado, las micropartículas se ponen en contacto, por ejemplo, con un
producto conjugado con fosfatasa
alcalina-anticuerpo o un producto conjugado con
\beta-galactosidasa-anticuerpo.
Los materiales no adsorbidos se separan en cada etapa mediante
acción capilar y lavados con tampón. Después de la separación del
producto conjugado no unido, se añaden los sustratos de la enzima
(tales como MUP y/o AUG) sucesivamente y se mide la velocidad de
incremento de la fluorescencia después de cada adición de sustrato.
En la presente invención, se prefiere el formato MEIA. Se prefiere
que el formato MEIA sea realizado utilizando maquinaria
automatizada, tal como el analizador marca "LCx" de Abbott
Laboratories (Abbott, Abbott Park, Illinois). El uso de maquinaria
automatizada limita la probabilidad de contaminación de la muestra
de ensayo debido al manejo manual. Las micropartículas de la fase
sólida pueden ser magnéticas o no magnéticas. Véanse, por ejemplo,
las solicitudes EPO publicadas Núms. EP 0 425 633 y EP 0 424
634.
"MUP" designa el sustrato fosfato de
4-metilumbeliferilo. Este sustrato es escindido por
un producto conjugado con fosfatasa alcalina para producir una
señal fluorescente.
"Ácido nucleico" hace referencia a un
polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma de hebra
sencilla o doble, y a menos que se limite de otro modo, incluye los
análogos conocidos de los nucleótidos naturales que pueden
funcionar de una manera idéntica o similar a los nucleótidos de
origen natural.
"Oligonucleótido" hace referencia a una
molécula formada por dos o más desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, tales como cebadores, sondas, fragmentos de ácido
nucleico a detectar, y controles de ácido nucleico. El tamaño
exacto de un oligonucleótido depende de muchos factores y de la
función final o el uso del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se
pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido
actualmente en la técnica o desarrollado en el futuro, incluyendo,
por ejemplo, el uso de la química de nucleótidos con fosforamidita
bien conocida y convencional y los aparatos asequibles de Applied
Biosystems, Inc, (Foster City, California); DuPont, (Wilmington,
Delaware); o Milligen, (Bedford, Massachusetts).
"PCR" designa la reacción en cadena de la
polimerasa.
"Cebador" hace referencia a un
oligonucleótido, ya sea natural o sintético, capaz de actuar como
punto de inicio de la síntesis de ADN en condiciones en las que se
induce la síntesis de un producto de prolongación del cebador
complementario a una hebra de ácido nucleico, esto es, en presencia
de los cuatro nucleósido trifosfato diferentes y un agente para la
polimerización (esto es, ADN polimerasa o transcriptasa inversa) en
un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. El cebador es
preferiblemente un oligodesoxirribonucleótido de cadena sencilla.
La longitud apropiada del cebador depende del uso pretendido del
cebador pero oscila generalmente entre 15 y 30 nucleótidos y puede
ser tan corto como 8 nucleótidos y tan largo como 50 o 100
nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas requieren generalmente
temperaturas más frías para formar complejos híbridos
suficientemente estables con el molde. No es necesario que un
cebador refleje la secuencia exacta del molde pero debe ser
suficientemente complementario para hibridar con el molde.
"Sonda" hace referencia a un
oligonucleótido, ya sea natural o sintético, capaz de hibridar en
condiciones restrictivas, específicas de la secuencia, con una
secuencia diana designada. No es necesario que una sonda refleje la
secuencia exacta del molde pero debe ser suficientemente
complementaria para hibridar con el molde. La longitud apropiada de
una sonda depende del uso pretendido de la sonda, y puede ser tan
corta como 8 nucleótidos y tan larga como 50 o 100 nucleótidos,
pero típicamente oscila entre 15 y 30 nucleótidos.
"RT-PCR" designa la
reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa.
"Transcriptasa inversa" hace referencia a
una enzima que cataliza la polimerización de los
desoxirribonucleósidos trifosfato para formar productos de
ampliación del cebador que son complementarios a un molde de ácido
ribonucleico. La enzima inicia la síntesis del extremo 3' del
cebador que es recocido con el molde de ARN y continúa hacia el
extremo 5' del molde de ARN hasta que termina la síntesis. Los
ejemplos de los agentes de polimerización adecuados que convierten
la secuencia diana de ARN en una secuencia de ADN complementario
(ADNc) son la transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis
aviar, la ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli), y
la ADN polimerasa de Thermus thermophilus (preferida), una
ADN polimerasa termoestable con actividad transcriptasa inversa. La
ADN polimerasa de Thermus thermophilus recombinante (rTth) es
asequible comercialmente de Applied Biosystems (núm. de catálogo
N808-0098, Foster City, California).
"Condiciones restrictivas" designa las
condiciones de hibridación y/o amplificación dependiente de la
secuencia y serán diferentes en las diferentes circunstancias.
Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que
sean aproximadamente 5ºC más baja que el punto de fusión térmico
(Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH
definidos. La Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH
definidos) a la cual 50% de las secuencias diana hibrida con una
sonda perfectamente emparejada. Típicamente, las condiciones
restrictivas para la amplificación son aquellas en las que el tampón
contiene KCl 50 mM, TrisCl 10 mM, y MgCl_{2} 1,5 mM. Semejante
tampón tiene un pH de aproximadamente 8,3 a la temperatura ambiente,
pero el pH cae a aproximadamente 7,2 a 72ºC. Véase, p. ej.,
Sambrook et al. (1989), Capítulo 14.
"Secuencia diana" o "región diana" son
términos sinónimos y designan una secuencia de ácido nucleico (de
hebra sencilla o doble) que es detectada y/o amplificada, o se
recocerá de otro modo en condiciones restrictivas con uno de los
cebadores o sondas proporcionados en la presente memoria. Las
secuencias diana pueden ser polimórficas.
"Muestra de ensayo" designa algo que se
sospecha que tiene una secuencia diana. La muestra de ensayo puede
derivar de cualquier fuente biológica sin limitación. Una muestra de
ensayo se puede utilizar (i) directamente como se obtiene de la
fuente; o (ii) siguiendo un pre-tratamiento para
modificar el carácter de la muestra de ensayo. De este modo, la
muestra de ensayo puede ser pre-tratada antes de su
uso, por ejemplo, desorganizando células y/o viriones, preparando
líquidos a partir de las muestras de ensayo sólidas, diluyendo
fluidos viscosos, filtrando líquidos, destilando líquidos,
concentrando líquidos, inactivando componentes intermedios,
añadiendo reactivos, purificando ácidos nucleicos, y similares.
"Polimerasa termoestable" hace referencia a
una enzima que es relativamente estable al calor y cataliza la
polimerización de nucleósidos trifosfato para formar productos de
prolongación del cebador que son complementarios a una de las
hebras de ácido nucleico de una secuencia diana. La enzima inicia la
síntesis en el extremo 3' del cebador que es hibridado con el molde
y continúa hacia el extremo 5' del molde hasta que termina la
síntesis. Se describe una enzima polimerasa termoestable purificada
con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Núms.
4.889.818 y 5.079.352. El término abarca las polimerasas que tienen
actividad transcriptasa inversa. Se encuentran disponibles
numerosas polimerasas termoestables de anfitriones de proveedores
comerciales, tales como Applied Biosystems y Promega Corporation,
Madison, Wisconsin.
"Transcrito" hace referencia a un producto
de ARN polimerasa, típicamente una ARN polimerasa dependiente de
ADN.
Como proposición general, se puede detectar ARN
genómico de HCV en muestras biológicas tales como (sin limitación)
sueros o plasma creando ADNc a partir del ARN genómico, amplificando
el ADNc con la reacción en cadena de la polimerasa, y sondeando
simultáneamente o con posterioridad la presencia de los amplicones
de ADNc de HCV con oligonucleótidos específicos de la
secuencia.
Adicionalmente, utilizando un control interno, y
sometiendo el control interno exactamente a las mismas
manipulaciones en el laboratorio que el ARN de HCV derivado de la
muestra presente en la muestra (p. ej., purificación de ARN,
transcripción inversa, amplificación, inmovilización sobre un
soporte, etc.), el presente método produce resultados altamente
fiables. En resumen, tanto el control interno como cualquier ARN de
HCV presente en la muestra son co-analizados en el
mismo recipiente de reacción. De este modo, se puede realizar
fácilmente la compensación para las desviaciones pequeñas en la
eficacia de preparación de la muestra. Las etapas básicas de la
realización preferida del método se proporcionan en el Compendio de
la Invención. Lo que sigue es un estudio etapa por etapa de cada
etapa del método y los diferentes reactivos preferidos y
alternativos que se pueden utilizar en cada etapa.
El propósito de la preparación del espécimen es
volver no infeccioso el espécimen, eliminar del espécimen
cualquiera de los inhibidores potenciales de la amplificación, y
concentrar las moléculas de ARN diana y hacerlas accesibles a la
amplificación. En la presente invención se puede utilizar cualquiera
de los métodos que logra estos objetivos. Por ejemplo, los métodos
para preparar ácidos nucleicos para las reacciones de
RT-PCR son descritos por Sambrook et al.
(1989). Tales métodos para preparar ARN son bien conocidos en la
técnica y no se describirán con más detalle.
En un enfoque preferido, los objetivos indicados
antes se logran tratando el espécimen mediante digestión de
proteínas, y separando después los ácidos nucleicos de otros
componentes presentes en la muestra de ensayo utilizando una
columna disponible en el mercado diseñada específicamente para este
fin. El producto comercial preferido es el Kit de Extracción de
Ácido Nucleico Viral de la marca "QIamp", de Qiagen, GmbH. Para
un estudio completo del kit y de cómo se utiliza, véase "QI amp7
Viral RNA Mini Kit Handbook", con fecha Enero de 1999.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Brevemente, el kit de la marca "QI amp"
utiliza las propiedades de unión de una columna giratoria de marca
"QI amp" con una base de sílice para aislar el ARN y el ADN
virales de los productos lisados de la muestra en presencia de
reactivos desnaturalizantes. Las muestras de ensayo se someten a
lisis utilizando reactivos formulados especialmente para
desorganizar las partículas virales, los ácidos nucleicos libres, y
proteger el ARN y el ADN de la digestión con nucleasas. Los
productos de la lisis de la muestra de ensayo (productos lisados)
son transferidos a columnas giratorias de la marca "QI amp"
para la unión a ácido nucleico. Una vez unidos a la matriz de la
columna "QI amp", los ácidos nucleicos se purifican utilizando
tampones de lavado para separar los contaminantes que inhiben la
PCR. Se utiliza un sistema de vacío, tal como el sistema de vacío
de la marca "LCx" de Abbott Laboratories (Abbott Park,
Illinois) para el tratamiento de los productos lisados de la
muestra y los reactivos de lavado a través de las columnas.
Alternativamente, los diferentes reactivos de lavado se pueden
mover a través de las columnas utilizando la centrifugación. Se
prefiere el sistema de vacío de la marca "LCx" porque puede
tratar hasta 48 muestras simultáneamente. Los ácidos nucleicos
purificados se hacen eluir con agua centrifugando la columna "QI
amp". Los ácidos nucleicos virales se recuperan en el producto
eluido, libres de proteínas, nucleasas, y otros contaminantes.
Después de haber eluido de la columna "QI amp", los ácidos
nucleicos purificados de la muestra de ensayo (tanto el ARN de HCV
como el control interno) están listos para la amplificación sin una
purificación o una preparación adicionales.
Cuando se realiza la reacción de amplificación
mediante PCR, la reacción de PCR es dificultada preferiblemente
hasta después de la primera etapa de desnaturalización. Los métodos
adecuados para lograr esto incluyen, pero no están limitados a,
mantener los componentes de reacción fríos hasta que se calienta la
reacción en la primera etapa de desnaturalización, utilizar una
enzima que sólo es activada mediante la exposición a elevadas
temperaturas, y añadir la enzima a la reacción en presencia de un
anticuerpo (no estable al calor) que se une a la enzima e inhibe la
polimerización.
Como se ha observado antes, los cebadores que se
van a utilizar en el presente método tienen preferiblemente de 15 a
30 nucleótidos de longitud y deben cebar específicamente la
transcripción inversa y la amplificación solamente del ARN de HCV y
el control interno presente en la muestra de ensayo.
Los autores de la presente invención han
encontrado que los cebadores directos que contienen cualquiera de
las sub-secuencias (o sus complementos) citados en
la Tabla 1 son extraordinariamente específicos para el ARN genómico
de HCV:
donde N puede ser A, C, T, o
G.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Entre estas sub-secuencias, los
cebadores directos preferidos son aquellos que contienen una
sub-secuencia (o su complemento) como se muestra en
el SEQ. ID. NO: 1, SEQ. ID. NO: 22, SEQ. ID. NO: 30, y SEQ. ID.
NO:
35.
35.
La naturaleza del cebador inverso es menos
crítica para el funcionamiento de la invención sujeto que la del
cebador directo. De este modo, como proposición general, la
invención funcionará y producirá resultados aceptables con
cualquier cebador inverso que funcione junto con el cebador directo
para amplificar el ARN de HCV y el control interno específicamente.
Se prefiere, no obstante, que la combinación de cebadores directo e
inverso seleccionada proporcione un producto de amplificación que
tenga al menos 20 y preferiblemente menos de 250 nucleótidos
de
longitud.
longitud.
Los cebadores inversos preferidos para su uso en
las realizaciones basadas en la PCR de la presente invención
son:
SEQ. ID. NO: 44: CGAGACCTCC CGGGGCACTC GC, y
SEQ. ID. NO: 45: ATGTGCACGG TCTACGAGAC CTCC.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente el cebador directo no está
marcado con el cebador inverso modificado para que incluya un
reactivo de captura, tal como (sin limitación) carbazol, en su
extremo 5' o final.
\vskip1.000000\baselineskip
El control interno es un transcrito de ácido
nucleico genómico de HCV, tomado preferiblemente de la región no
traducida 5' (utr) del genoma de HCV. El control interno es
modificado para que incluya una única región de unión a la sonda
que tiene una secuencia complementaria a la sonda que es específica
para los amplicones del control interno. En todos los demás
aspectos, sin embargo, el control interno tiene una secuencia
idéntica a una porción del genoma de HCV. De este modo, el control
interno tiene los mismos sitios de unión al cebador que la
correspondiente localización del propio ácido nucleico genómico de
HCV.
La variabilidad adversa en la eficacia de las
reacciones de transcripción inversa y amplificación se puede
compensar en el presente método debido a que el control interno y el
ARN de HCV son sometidos a transcripción inversa simultáneamente y
amplificados simultáneamente. De este modo, el control interno
experimenta exactamente las mismas condiciones que el ARN de HCV
durante la transcripción inversa y la amplificación.
El presente método utiliza dos sondas
oligonucleotídicas distintas: una segunda sonda que hibrida
específicamente con los amplicones del control interno y una
primera sonda que hibrida específicamente con los amplicones del
ARN genómico de HCV. Ambas sondas son modificadas para que incluyan
una marca detectable (esto es, un hapteno), tal como adamantano o
dansilo. Las sondas deben estar marcadas con diferentes haptenos de
manera que puedan ser distinguidas entre sí en la fase de detección
del análisis.
La sonda preferida para el amplicón de ARN de
HCV es:
SEQ. ID. NO: 46: GCC TTG TGG TAC TGC CTG.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha apuntado antes, las dos sondas
utilizadas en la invención son marcadas diferencialmente para
permitir que sean detectadas y distinguidas entre sí. La detección
de la marca puede ser mediante métodos directos o indirectos. La
naturaleza exacta de la marca no es crítica para la funcionalidad
general de la invención, con tal que la marca no interfiera en la
hibridación de las sondas con sus respectivos amplicones y no sea
deletérea para ninguno de los otros componentes del análisis. Las
dos marcas detectables diferencialmente que son más preferidas para
su uso en la presente invención son las marcas derivadas de
adamantano (designadas colectivamente en la presente memoria
simplemente como "adamantinas") y dansilo. Las marcas de
adamantano preferidas se describen en la Patente de los Estados
Unidos Núm. 5.424.414.
La fijación de tales marcas a los
oligonucleótidos es conocida en la técnica. Para las metodologías de
marcaje adecuadas, véanse, p. ej., las Patentes de los Estados
Unidos Núms. 5.464.746; 5.424.414; y 4.948.882.
Algunos reactivos de captura preferidos se
describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.464.746.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación RT-PCR,
preferiblemente utilizando los cebadores marcados enumerados antes,
prosigue de la manera convencional.
La secuencia diana para la amplificación dentro
del control interno y el ARN de HCV genómico presente in la muestra
está dentro de la región 5' utr del genoma de HCV. Esta
región es específica de HCV y está muy conservada en todos los
genotipos de HCV conocidos. Los cebadores preferidos se designan de
manera que hibriden con la región diana dentro de 5' utr con
los menores emparejamientos erróneos posibles entre los diferentes
genotipos de HCV. Esto minimiza la desviación del genotipo,
posibilitando que el presente método detecte y cuantifique
exactamente todos los genotipos de HCV conocidos. Como se comenta en
la presente memoria, el cebador inverso está marcado
preferiblemente con un radical, mientras que la sonda específica de
HCV está marcada con una primera marca, y la sonda específica del
control interno está marcada con una segunda marca.
La reacción de transcripción inversa se puede
realizar separadamente a partir de la reacción de amplificación. No
obstante, se prefiere que las dos reacciones se realicen como un
protocolo sencillo utilizando una polimerasa que incluya actividad
transcriptasa inversa, tal como rTth termoestable.
Por lo tanto, en la realización preferida, la
polimerasa termoestable tiene una función enzimática dual: sirve
tanto de transcriptasa inversa como de ADN polimerasa dependiente de
ADN. Durante un período de incubación prolongado, la actividad
transcriptasa inversa genera un producto de prolongación de ADNc a
partir del cebador inverso que se ha hibridado con la diana de ARN
(el ARN de HCV y el control interno). Este producto de ADNc actúa
después directamente como molde durante la amplificación PCR. El
segundo cebador es complementario a una región del producto de ADNc
y actúa como cebador para la prolongación mediante PCR a partir del
producto de ADNc.
Durante el ciclo térmico, la temperatura de la
reacción aumenta por encima del punto de fusión del producto
hibridado, haciendo que las hebras se disocien. La disminución de la
temperatura permite que los cebadores en exceso se recuezan con las
hebras disociadas y generen nuevos productos. La amplificación
exponencial de los productos se logra a través de la ciclación
repetida entre alta y bajas temperaturas. Son suficientes 45 ciclos
térmicos para generar una amplificación de mil millones de veces o
más de las secuencias diana. La amplificación de ambas dianas (HCV
si estuviera presente, y el control interno) tiene lugar
simultáneamente en la misma reacción.
Un ciclo adicional con una desnaturalización a
alta temperatura e incubación a baja temperatura permite que la
sonda específica de HCV y la sonda de detección específica del
control interno se recuezan con sus respectivos amplicones.
Una mezcla adecuada de reactivos de
amplificación incluye los siguientes ingredientes a las
concentraciones especificadas: bicina 50 mM, K^{+} 115 mM, dNTP
150 \muM, cebador inverso modificado para el radical de captura
125 nM, cebador directo 50 nM, control interno (\sim10.000 copias
por RT-PCR), sonda específica de ácido nucleico de
HCV marcada 50 nM, sonda específica de ácido nucleico de control
interno marcada 50 nM, 2,5 unidades de polimerasa rTth, BSA
acetilada de 0,01 mg/ml, azida de sodio al 0,02%, glicerol al 8%,
MnCl_{2} 0,5 mM, azida de sodio al 0,225%, y colorante naranja de
xilenol al 0,005%, pH 8,25, y opcionalmente Tween-20
al 0,3125%.
Un conjunto típico de condiciones de
termociclación para efectuar la transcripción inversa y la reacción
de es el siguiente:
Síntesis de ADNc: 94ºC, 1 min; 62ºC, 30 min;
94ºC, 2 min; 1 ciclo.
Amplificación: 94ºC, 1 min; 62ºC, 1 min; 45
ciclos.
Hibridación de la sonda: 97ºC, 5 min; 15ºC, 5
min; 1 ciclo.
Cuando el equipo de termociclación utilizado es
más completamente programable, se prefieren las siguientes
condiciones:
Síntesis de ADNc: 94ºC, 1 min; 62ºC, 30 min;
94ºC, 2 min; 1 ciclo.
Amplificación: 94ºC, 15 seg; 58ºC, 20 seg; con
prolongación de 1 seg. por ciclo; 5 ciclos; seguido de 94ºC, 15
seg; 62ºC, 25 seg; con prolongación de 1 seg. por ciclo; 40
ciclos.
Hibridación de la sonda: 97ºC, 5 min; 15ºC, 5
min; 1 ciclo.
Los amplicones se pueden empapar en la mezcla
del reactivo de amplificación a 15ºC durante hasta 96 horas antes
del análisis adicional.
Los cebadores y el control interno se optimizan
de manera que las dos dianas (el ARN genómico de HCV y el control
interno) compitan por los cebadores. Así, el protocolo de
amplificación se designa por ser competitivo. Cuando la
concentración de ARN genómico de HCV aumenta en comparación con la
cantidad de control interno, hay una caída correspondiente en el
número de amplicones generados a partir del control interno. La
razón de la cantidad de amplicón generada a partir del control
interno frente a la cantidad de amplicón generada a partir del ARN
genómico de HCV se utiliza después para cuantificar la cantidad de
ARN genómico de HCV que estaba presente en la muestra de
ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de completar la reacción de
amplificación y de completar la hibridación de las sondas de ARN de
HCV y de control interno, la muestra está lista para la detección.
En la última etapa del protocolo de amplificación, la sonda de HCV
y la soda de control interno hibridan con sus productos de
amplificación respectivos durante el ciclo final cuando la reacción
se enfría por debajo de la temperatura de fusión de las sondas de
detección. Puesto que las sondas de detección son complementarias a
las secuencias internas de las hebras diana, éstas añaden
especificidad al análisis eliminando falsos productos de
amplificación (tales como dímeros de cebadores) de la detección. El
diseño del formato de dos sondas permite la detección dual de los
amplicones de HCV y de control interno.
De este modo, en la realización preferida, la
sonda de HCV y la sonda de control interno se marcan
diferencialmente y uno o ambos cebadores (preferiblemente sólo el
cebador inverso) se modifican para incluir un radical de captura.
En la etapa de detección, los amplicones y los cebadores que no han
reaccionado se inmovilizan en un soporte inerte revestido con un
reactivo de captura para facilitar el análisis adicional de los
amplicones. Así, por ejemplo, cuando el cebador inverso de modifica
para que incluya un radical de captura de carbazol, el soporte
inerte, preferiblemente una micropartícula se reviste con un
anticuerpo anti-carbazol (conejo). Obsérvese que
ambos amplicones y los cebadores que no han reaccionado que incluyen
el radical de captura están inmovilizados sobre la micropartícula.
No obstante, puesto que los cebadores que no han reaccionado no se
detectarán en la etapa de detección subsiguiente (los cebadores no
están marcados), esto no afecta al resultado del análisis.
Una alícuota del producto de amplificación se
transfiere a un pocillo de reacción que contiene las micropartículas
revestidas. Las micropartículas revestidas reconocen y se unen al
radical de captura encontrado sobre el producto de amplificación y
los cebadores inversos libres que no han reaccionado. En la
realización preferida, utilizando el analizador de la marca
"LCx", la mezcla de reacción se transfiere después
automáticamente a una matriz de fibra de vidrio a la que se unen
irreversiblemente los complejos de micropartículas. Después de
lavar, los complejos de micropartícula unidos se incuban con
reactivos que permiten detectar y cuantificar la cantidad de
amplicones de HCV y de amplicones de control interno. Esto se
realiza detectando las marcas diferenciales presentes sobre las
sondas de HCV y las sondas de control interno.
En la realización preferida, la sonda de HCV se
marca con adamantano y la sonda de control interno se marca con
dansilo. Para detectar estar sondas, los anticuerpos que son
específicos para las marcas se conjugan con enzimas que se pueden
detectar directamente. Los productos conjugados se ponen después en
contacto con las micropartículas, con lo que los productos
conjugados se unirán a sus respectivas marcas. La adición de
sustrato enzimático proporcionará después señales distintas para
los amplicones de HCV y señales distintas para los amplicones de
control interno. Estos dos valores se comparan después para producir
una razón mediante la cual se determina la cantidad de ácido
nucleico de HCV en la muestra de ensayo original.
Por ejemplo, para detectar una sonda de HCV
(que, en esta ilustración, está marcada con adamantano), un
anticuerpo anti-adamantano se conjuga con (por
ejemplo) una enzima fosfatasa alcalina. El producto conjugado
anti-adamantano/fosfatasa alcalina se unirá sólo a
la sonda específica de HCV. Las micropartículas se incuban con el
producto conjugado anti-adamantano/fosfatasa
alcalina en condiciones y durante un tiempo suficiente para que la
porción de anticuerpo del producto conjugado se una a la sonda de
adamantano. Después, el sustrato de la fosfatasa alcalina MUP se
añade a la reacción de incubación. Esto ocasiona una reacción en la
que el sustrato MUP es escindido por la porción fosfatasa alcalina
del producto conjugado y se forma un producto fluorescente. El
producto fluorescente se detecta por medios ópticos bien conocidos
para detectar la fluorescencia, tales como un fotómetro. La magnitud
de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de amplicón
de HCV unido.
De la misma manera, para detectar la sonda de
control interno (que, en esta ilustración, está marcada con
dansilo), un anticuerpo anti-dansilo se conjuga con
(por ejemplo) una enzima \beta-galactosidasa. El
producto conjugado
anti-dansilo/\beta-galactosidasa
se unirá sólo a la sonda específica de control interno. Las
micropartículas se incuban con el producto conjugado
anti-dansilo/\beta-galactosidasa
en condiciones y durante un tiempo suficiente para que la porción
de anticuerpo del producto conjugado se una a la sonda de dansilo.
Después, el sustrato de la \beta-galactosidasa
AUG se añade a la reacción de incubación. Esto ocasiona una reacción
en la que el sustrato AUG es escindido por la porción
\beta-galactosidasa del producto conjugado y se
forma un producto fluorescente. El producto fluorescente se detecta
por medios ópticos bien conocidos para detectar la fluorescencia,
tales como un fotómetro. La magnitud de esta segunda señal
fluorescente es proporcional a la cantidad de amplicón de control
interno unido.
El orden de detección de la sonda no es crítico.
La naturaleza de las marcas específicas sobre las sondas tampoco es
crítica para el funcionamiento de la invención, con tres
salvedades:
- 1.
- Las marcas preferiblemente no interfieren las reacciones de transcripción inversa o amplificación.
- 2.
- Cualquiera de las dos marcas que se elijan (una para la sonda de HCV, una para la sonda de control interno), deben ser diferentes entre sí y detectables diferencialmente de manera que las dos señales se puedan distinguir entre sí.
- 3.
- La química requerida para detectar las dos diferentes sondas preferiblemente no interfieren entre sí.
\vskip1.000000\baselineskip
Satisfaciendo estas tres salvedades, la presente
invención se puede poner en práctica con dos marcas detectables
diferencialmente cualesquiera, incluyendo marcas radiactivas,
fluorofóricas, cromofóricas, y enzimáticas.
La conjugación del anticuerpo producido de este
modo con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, se logra por
medios bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, la fosfatasa
alcalina se puede conjugar con un anticuerpo de acuerdo con el
siguiente esquema:
- 1.
- Someter a diálisis la solución de anticuerpo de 5 mg/ml frente a 2L de PBS 0,1 M (pH 6,8) a 4ºC.
- 2.
- Retirar la solución de anticuerpo de la membrana de diálisis y ajustar a 3 mg/ml con PBS.
- 3.
- Añadir 100 \mul solución de anticuerpo dializada a 90 \mul de fosfatasa alcalina en un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- 4.
- Añadir 5 ml de glutaraldehído y mezclar suavemente. Dejar estar a temperatura ambiente.
- 5.
- Retirar muestras de 25 \mul a tiempo 0, 5, 10, 15, 30, 60, y 120 min y colocarlas en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 ml. Añadir 125 \mul de PBS a cada muestra, y después añadir 1,1 ml de solución de Tris/ovoalbúmina. Almacenar cada muestra sobre hielo hasta que se completa el transcurso del tiempo.
- 6.
- Someter a diálisis las muestras frente a PBS como se ha descrito en la etapa 1. Someter a ensayo cada muestra en busca de actividad fosfatasa alcalina para determinar qué tiempo de conjugación proporciona el producto conjugado enzimático más activo.
- 7.
- Repetir las etapas 1 a 4, pero en la etapa 4 permitir que prosiga la reacción durante el tiempo de conjugación óptimo, como se ha determinado en la etapa 6.
- 8.
- Añadir azida de sodio al 0,1% y almacenar el producto conjugado protegido de la luz a 4ºC. Debe permanecer activo durante hasta un año. Alternativamente, añadir un volumen igual de glicerol y almacenar el producto conjugado congelado a -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las ventajas evidentes de la presente
invención es que puesto que el control interno se lleva a cabo a lo
largo de todo el procedimiento, desde la RT-PCR,
hasta el aislamiento y el análisis de los amplicones, el método se
puede calibrar a priori utilizando un conjunto de patrones de
calibración. Así, se minimiza el número de rondas de calibración
que deben ser realizadas por el usuario final. En resumen, todo lo
que el usuario necesita hacer es realizar el análisis, calcular el
logaritmo de la razón: {recuentos de velocidad (es decir, c/s/s)
para los amplicones de ARN de HCV) por recuentos de velocidad
(c/s/s) para los amplicones de control interno}, y comparar el
valor obtenido con una curva de calibración prefabricada
correspondiente para llegar a la concentración de HCV en la muestra
de
ensayo.
ensayo.
Las muestras de calibración utilizadas para
compilar una curva de calibración adecuada contienen cada una una
concentración fija y conocida del control interno (p. ej.,
10.000 copias por RT-PCR). Las muestras de
calibración también contienen niveles variados sistemáticamente de
transcrito de HCV que abarcan el rango dinámico completo del
método. Así, una serie ilustrativa de muestras de calibración
incluiría las siguientes muestras (2.000 o 10.000 copias de control
interno por muestra):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensamblaron varios grupos de muestras de
calibración diferentes y se sometieron a ensayo utilizando el
método preferido. Los transcritos de HCV utilizados para fabricar
las muestras calibración se emparejaron con sustancias de
referencia candidato de la Organización Mundial de la Salud
obtenidas de la Sanquin Blood Supply Foundación, Plesmanlaan 125,
1066CX Amsterdam, Holanda (antes conocida como CLB).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
De este modo, por ejemplo, en ensayos reiterados
(n > 100) del presente método frente a una batería de muestras
de calibración donde cada muestra contenía 10.000 copias del control
interno y 0, log 2,50, log 3,02, log 3,59, log 4,09, log 6,15 y log
7,19 copias/ml de transcrito de HCV, se obtuvieron las siguientes
desviaciones típicas:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Obsérvese que una ventana de tres desviaciones
típicas que están rodeando la muestra de calibración 0 y la muestra
calibración log 2,5 no se solapan. De este modo, las muestras
negativas son distinguidas fácilmente de las muestras "poco
positivas", es decir, aquellas muestras que contienen
aproximadamente log 2,50 copias de HCV por ml.
En un estudio utilizando plasma de suero tomado
de 10 pacientes negativos para HCV conocidos, cada paciente
proporcionó tres muestras (una muestra de suero, una muestra de
plasma con EDTA, y una muestra de plasma con ACD). Cada muestra se
reforzó con log 3,00 copias de HCV/ml y después se sometió a ensayo
de acuerdo con la realización preferida del presente método. La
desviación típica para estas 30 muestras fue de 0,116, un valor que
concuerda mucho con la desviación típica de 0,133 observada en la
muestra del calibrador de log 3,02 copias/ml de la Tabla 3.
Las muestras de suero negativas y las muestras
de suero "poco positivas" (log 3,5 copias de HCV/ml) también
se reforzaron con los compuestos que interfieren potencialmente para
observar si estos compuestos interrumpirían la medición exacta de
HCV en la muestra. La adición de proteína (90 mg/ml total - 55 mg/ml
albúmina y 35 mg/ml gammaglobulina), hemoglobina (10 mg/ml),
bilirrubina (0,4 mg/ml), lípidos (30 mg/ml y liposina II al 20%), o
fármacos anti-virales para HCV (273 UI/ml de
interferón \alpha-2b o una combinación de 273
UI/ml de interferón \alpha-2b y 0,05 de \mug/ml
ribavirina) a las muestras no tuvo un efecto significativo sobre los
resultados generados a partir de las muestras reforzadas en
comparación con los controles.
\newpage
También se describen kits que incluyen todos o
un subgrupo de cebadores, sondas, marcas, reactivos, etc.,
requeridos para poner en práctica el método sujeto. Así, la
realización preferida del kit comprendería uno o más recipientes
conteniendo los cebadores directo e inverso, el control interno, la
sonda específica de HCV, y la sonda específica del control interno.
Estos componentes serían liberados disueltos en tampones adecuados
o liofilizados. El kit puede incluir opcionalmente instrucciones
para poner en práctica el método de detección de HCV. Los kits
pueden incluir opcionalmente una curva de calibración
prefabricada.
Otras realizaciones de los kits incluirían una
colección mucho más extensa de reactivos, tales como tampones,
dNTP, enzima rTth, reactivos de parada, mezclas de reactivos
conjugados, etc. Estos ingredientes se dispondrían en una
pluralidad de recipientes para hacer la práctica del método sujeto
más conveniente al usuario final. Así, tal kit ilustrativo descrito
en la presente memoria puede incluir las siguientes mezclas, cada
una dispuesta en su propio recipiente:
- 1.
- 2x Mezcla de Reactivo de Amplificación: bicina 100 mM, K+ 230 mM, dNTPs 300 \muM, cebador inverso 250 nM, cebador directo 100 nM que tiene una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 22, sonda específica de ácido nucleico de HCV marcada 100 nM, sonda específica de ácido nucleico de control interno marcada 100 nM, 5 unidades de polimerasa rTth, BSA acetilada de 0,02 mg/ml, azida de sodio al 0,04%, glicerol 16%, control interno (10.000 copias por RT-PCR) (pH 8,25). Esto se diluye al 100% para producir 1x mezcla del reactivo de amplificación.
- 2.
- Mezcla del Reactivo de Activación: MnCl_{2} 10 mM, azida de sodio al 0,45%, colorante naranja de xilenol 0,010%. La adición de la mezcla del reactivo de activación a 1x mezcla del reactivo de amplificación inicia la reacción RT-PCR. De este modo, esta mezcla no se añade hasta que las muestra están listas para la amplificación.
- 3.
- Mezcla del Reactivo de Ácido Nucleico de Control Interno: Alternativamente, el transcrito de ARN de control interno (10.000 copias por RT-PCR) (enumerado antes en la Mezcla del Reactivo de Amplificación) se puede incluir como un componente separado. El control interno sería el proporcionado en una solución de HEPES 10 mM, EDTA 0,2 mM, BSA acetilada de 100 \mug/ml, DTT 10 mM, ARNasas de 0,5 U/\mul, poli-A de 8725 \mug/ml, azida de sodio al 0,045%.
- 4.
- Micropartículas Anti-carbazol: partículas con un diámetro de 0,400 \mum recubiertas con anticuerpos anti-carbazol de conejo en una solución de tris (hidroximetil)aminometano al 0,265%.
- 5.
- Mezcla de Reactivo Conjugado: producto conjugado anti-dansilo/galactosidasa y producto conjugado anti-adamantano/fosfatasa alcalina; cada uno \sim 1 \mug/ml con respecto al anticuerpo.
- 6.
- MUP (1,2 mM en tampón) y AUG (3,0 mM en tampón), sustratos enzimáticos para la fosfatasa alcalina y la \beta-galactosidasa, respectivamente.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA DETECTAR Y CUANTIFICAR
VIRUS DE LA HEPATITIS C
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 6874.WO.O1
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Aún No Asignado
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-07-25
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccg
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccnc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc nccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgnc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgngcc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcntgcc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggncgtgcc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgcaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgcaa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgca
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)...(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgnaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccncaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)...(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc nccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgnc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcggcnc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)...(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcntgcc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggncgtgcc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgcaa g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gccccc
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccgnaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)...(17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gcccccncaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)...(14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gccnccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgt gnccccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)...(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcgn gcccccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)...(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttgggcnt gcccccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)...(7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N = a o g o c o t/u, desconocida, u
otra en la posición 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttggncgt gcccccgcaa ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgggcgtg cccccgcaag a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgggcgtgc ccccgcaaga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggcgtgcc cccgcaaga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgtgccc ccgcaaga
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgtgcccc cgcaaga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtgccccc gcaaga
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgcccccg caaga
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador Inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcgagacctcc cggggcactc gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtgcacgg tctacgagac ctcc
\hfill24
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<210> 46
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador Directo
\newpage
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<400> 46
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttgtggt actgcctg
\hfill18
Claims (5)
1. Un cebador que consiste en la secuencia del
SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos.
2. El cebador de la Reivindicación 1, donde el
cebador está marcado.
3. El cebador de la Reivindicación 1, donde el
cebador está marcado con un hapteno.
4. Un método para cuantificar una cantidad de
ácido nucleico genómico del virus de la hepatitis C (HCV) en una
muestra de ensayo, comprendiendo el método:
- (a)
- añadir a una muestra de ensayo que se sospecha que contiene ácido nucleico genómico de HCV: (i) una cantidad conocida de un oligonucleótido de control interno que comprende una secuencia de ácido nucleico de HCV; (ii) una primera sonda marcada específica para amplicones del oligonucleótido de control interno; y (iii) una segunda sonda marcada específica para amplicones de ácido nucleico genómico de HCV; después
- (b)
- co-amplificar competitivamente el oligonucleótido de control interno y cualquier ácido nucleico genómico de HCV presente en la muestra de ensayo de la etapa (a) utilizando un cebador directo que tiene una secuencia de ácido nucleico que consiste en el SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos y un cebador inverso, creando de ese modo amplicones del oligonucleótido de control interno y amplicones de cualquier ácido nucleico genómico de HCV presente en la muestra de ensayo; después
- (c)
- incubar la muestra de ensayo de la etapa (b) en condiciones de posibiliten que la primera sonda marcada hibride con los amplicones del oligonucleótido de control interno y la segunda sonda marcada hibride con los amplicones del ácido nucleico genómico de HCV, formando de ese modo híbridos; y después
- (d)
- detectar los híbridos formados entre la primera sonda marcada y los amplicones del oligonucleótido de control interno y los híbridos formados entre la segunda sonda marcada y los amplicones del ácido nucleico genómico de HCV, con lo que se cuantifica la cantidad de ácido nucleico genómico de HCV presente en la muestra de ensayo.
5. Un kit para cuantificar una cantidad de ácido
nucleico genómico del virus de la hepatitis C (HCV) en una muestra
de ensayo, comprendiendo el kit combinados:
- un par de cebadores capaz de amplificar específicamente ácido nucleico genómico de HCV, teniendo el primer cebador la secuencia que consiste en el SEQ ID NO: 22 o uno de sus complementos y un segundo cebador que genera con el primer cebador un transcrito de al menos 20 nucleótidos y menos de 250 nucleótidos en una reacción en cadena de la polimerasa;
- un oligonucleótido de HCV de control interno, comprendiendo el oligonucleótido de HCV de control interno un transcrito de ácido nucleico de la región no traducida 5' del genoma de HCV y teniendo secuencias que son complementarias a dicho par de cebadores; y
- una primera sonda específica para amplicones de ARN genómico de HCV, y una segunda sonda específica para amplicones del oligonucleótido de HCV de control interno.
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