JP4097662B2 - マーカーとしてのｎｓ５ａヌクレオシド配列変異 - Google Patents

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Description

本発明は、マーカーとしてのNS5Aヌクレオシド配列変異に関する。
C型肝炎ウイルス（HCV）感染は、世界的な重要な臨床問題である。米国のみでも、4百万人の個体が、HCVに慢性感染していると推定されている。非A型肝炎、非B型肝炎の主要な病原体であるHCVは、感染した血液及び血液製剤の輸血によって主に伝染する（非特許文献1参照）。米国において、1990年中頃に抗HCVスクリーニングが導入される以前には、輸血後肝炎症例の80〜90％がHCVによるものであった。血液及び血液製剤の曝露頻度が高い群である出血性障害又は慢性腎不全を有する個体にも、高いHCV感染率が見られる。
急性HCV感染は、症例のおよそ90％において、持続的なウイルス複製及び慢性肝炎への進行の原因となる。多くの患者で、慢性HCV感染は、進行性の肝障害及び肝硬変の発生の原因となる。10〜20年という期間がより一般的ではあるが、攻撃的感染している患者においては、2年という早さで肝硬変が発生する場合もある。慢性HCV患者の30〜50％において、肝障害は肝細胞癌の発生へと進行し得る。一般に、肝細胞癌は、遅発性（late occurrence）であり、発生までに30年を越える場合がある（非特許文献2参照）。疾患進行の決定におけるウイルス側又は宿主側の要因の相対的な寄与は、明らかとなっていない。
HCVは、およそ9.5kbの(+)センス一本鎖RNAゲノムを含有しているエンベロープを有するウイルスである。そのゲノムの構成及びビリオンの特性に基づき、HCVは、ペスチウイルス及びフラビウイルスも含む1つの科であるフラビウイルス科の別の属として分類されている（非特許文献3参照）。ウイルスゲノムは、非常に長い5'非翻訳領域（LTR）、およそ3011アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードする長いオープンリーディングフレーム、及び短い3'UTRからなる。ポリタンパク質前駆体は、宿主及びウイルス両方のプロテアーゼにより切断され、成熟型のウイルスの構造タンパク質及び非構造タンパク質を生じる。HCVは、2個のプロテイナーゼ、NS2-NS3領域によりコードされた亜鉛依存性メタロプロテイナーゼ、及びNS3/NS4領域にコードされたセリンプロテイナーゼをコードしている。これらのプロテイナーゼは、前駆ポリタンパク質の特定の領域の成熟ペプチドへの切断に必要とされる。非構造タンパク質5、NS5Bのカルボキシル側の半分は、RNA依存性RNAポリメラーゼを含有している。残りの非構造タンパク質NS4B及びNS5A（非構造タンパク質5のアミノ側の半分）の機能は、未だ不明である。
インターフェロンα（インターフェロン）は、食品医薬品局（Food and Drug Administration）により認可された慢性HCV感染の治療薬である。インターフェロンの効果は、二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ（double-stranded RNA-activated protein kinase）（PKR）を含む種々の細胞性の誘導可能なタンパク質により媒介される（非特許文献4参照）。HCV遺伝子型1を有する患者のうち8〜12％のみが、インターフェロン療法に対する持続的な臨床上のウイルス学的応答を有する（非特許文献5及び6参照）。最近、インターフェロン及びグアノシン類似体であるリバビリンによる組み合わせ療法が、持続的な生化学的及びウイルス学的な応答の生成においてインターフェロン単独療法よりも優れていることが示された（非特許文献7参照）。しかしながら、持続的な応答率の有意な改善にも関わらず、高力価HCV遺伝子型1感染患者の60％もが、組み合わせ療法に対して非応答性である。例えば、HCV-1bに感染した患者における応答率は40％未満である。原型米国遺伝子型HCV-1aに感染した患者についても、類似の低い応答率が報告されている（非特許文献8参照）。対照的に、HCV遺伝子型2に感染した患者の応答率はほぼ80％である（非特許文献9参照）。HCVポリタンパク質全体の発現は、ヒトU2-OS骨肉腫細胞において、インターフェロンにより誘導されるシグナル伝達を阻害することが示されている（非特許文献10参照）。いずれのHCVタンパク質がこの効果を担っているのかは報告されていない。
インターフェロンに対する応答と、HCVの非構造5A（NS5A）配列との関係には、議論の余地がある。インターフェロン療法に対する応答は、HCV亜型によって異なっており、HCV-1b亜型はインターフェロン治療に対して特に抵抗性である（非特許文献11参照）。HCV感染患者由来のインターフェロン抵抗性ウイルス及びインターフェロン感受性ウイルスからの全長HCV核酸配列の比較によって、NS5Aのカルボキシ末端に相当するミスセンス置換が明らかとなった（非特許文献12参照）。対応するNS5Aの40アミノ酸の領域（HCVポリタンパク質のアミノ酸2209〜2248）は、インターフェロン感受性決定領域又はISDRと名付けられている（非特許文献12参照）。ISDRは、PKRと結合しその機能を阻害することができるNS5Aタンパク質内の領域に囲まれている（非特許文献13参照）。エノモト（Enomoto）ら（非特許文献14参照）は、インターフェロン療法に応答する患者が、（インターフェロン抵抗性HCV1b-J原型配列と比較して）ISDR内の多重置換を有するウイルスに感染しており、インターフェロン療法が無効な患者はISDR内の置換がほとんどないウイルスに感染しているとのモデルを提唱した。
インターフェロン抵抗性ウイルス及びインターフェロン感受性ウイルス由来のISDR配列を発表した25件の研究のうち9件が、エノモトのモデルを支持し、5％の有意水準で、データが、インターフェロン応答とISDR内の置換とが依存的であることの充分な証拠を提供していると結論付けている（非特許文献12、非特許文献14、非特許文献15、非特許文献16、非特許文献17、非特許文献18、非特許文献19、非特許文献20、非特許文献21参照）。他の16件の研究は、相関があるとの結論を下すことができなかった（非特許文献22、非特許文献23、非特許文献24、非特許文献25、非特許文献26、非特許文献27、非特許文献28、非特許文献29、非特許文献30、非特許文献31、非特許文献32、非特許文献33、非特許文献34、非特許文献35、非特許文献36、非特許文献37参照）。興味深いことに、相関を支持している9件の研究のうち7件が、日本からのHCV単離物に基づいており、相関を支持していない16件の研究のうち15件が欧州からの単離物及び北米の単離物に基づいている。北米及び欧州の研究においてインターフェロン応答とISDR配列との統計的に有意な相関は概して見出されていないが、関係があるという証拠がある。個々の研究からのISDR配列の中間クラスと変異クラスとを合わせた場合、インターフェロンに対する応答率は、野生型クラスのISDR配列を有する患者における応答率よりも高い（非特許文献38参照）。
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本発明は、個体のインターフェロン治療に対する応答の予測において有用な、HCV-1a NS5A遺伝子の937位における塩基変異を決定するための方法及び試薬を提供することを課題とする。
本発明は、HCV-1a亜型に感染したヒト患者において、HCV NS5A遺伝子の937位における塩基配列置換と、感染個体のインターフェロン治療に対する応答との間に有意な関連があるという発見に基づいている。特に、NS5Aタンパク質の313位をバリンにするNS5A遺伝子の937位に「G」を含有しているウイルスに感染した個体は、インターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の増大した可能性を有すると思われる。反対に、NS5Aタンパク質の313位をイソロイシンにするNS5A遺伝子の937位に「A」を含有しているウイルスに感染した個体は、インターフェロン治療に対するウイルス学的無応答の増大した可能性を有すると思われる。本発明者らの知る限り、特定のヌクレオチド及びアミノ酸の変異が、インターフェロン治療に対する応答と関連付けられたのは、これが最初である。さらに、この特定の変異の位置は、ISDR内でもないし、又はNS5Aタンパク質のPKR結合領域内でもない。
従って、本発明は、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法を提供する。一つの態様において、その方法は、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、及び937位のヌクレオチドが「G」であるか否かを決定し、その際、937位における「G」の存在を、ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む。もう一つの態様において、その方法は、NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及び313位のアミノ酸がバリンであるか否かを決定し、その際、313位におけるバリンの存在を、ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む。
本発明は、HCVに感染したヒト患者を治療するための方法も提供する。一つの態様において、その方法は、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、937位のヌクレオチドが「G」であるか否かを決定すること、及び937位のヌクレオチドが「G」である場合、そのヒト患者をインターフェロンで治療することを含む。もう一つの態様において、その方法は、NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及び313位のアミノ酸がバリンであるか否かを決定すること、及び313位のアミノ酸がバリンである場合、そのヒト患者をインターフェロンで治療することを含む。
本発明は、新たな患者集団の治療用薬物の調製のためのインターフェロンの使用も提供する。一つの態様において、その使用は、HCV-1aポリヌクレオチドのNS5A遺伝子のヌクレオチド937位がGであるHCVに感染したヒト患者の治療用薬物の調製のためのインターフェロンの使用を含む。もう一つの態様において、その使用は、HCV-1aタンパク質のうちのNS5Aタンパク質のアミノ酸313位がバリンであるHCVに感染したヒト患者の治療用薬物の調製のためのインターフェロンの使用を含む。
上記の使用の好ましい態様において、インターフェロンは、ロフェロン（Roferon）（登録商標）-A、ペガシス（Pegasys）（登録商標）、イントロン（Intron）（登録商標）A、及びペグ−イントロン（Peg-Intron）（登録商標）からなる群より選択される。
本発明は、HCV-1aのNS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドも提供する。好ましい態様において、そのオリゴヌクレオチドは、14〜35ヌクレオチド長であり、かつNS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む領域においていずれかの鎖と本質的に相補的である。本発明は、さらに、HCV-1aに感染したヒト患者によるインターフェロンに対する応答を予測するのに有用なキットを提供する。特に、そのキットは、14〜35ヌクレオチド長であり、かつNS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む領域においていずれかの鎖と本質的に相補的である、HCV-1aのNS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドと、ポリメラーゼとを含む。
本発明（１）は、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、a）NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、及びb）937位のヌクレオチドがGであるか否かを決定し、その際、937位におけるGの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法である。
本発明（２）は、HCVに感染したヒト患者の治療用薬物の調製のためのインターフェロンの使用であって、HCVに感染したヒト患者において、HCV-1aポリヌクレオチドのNS5A遺伝子のヌクレオチド937位がGである、使用である。
本発明（３）は、NS5A遺伝子の937位のヌクレオチドの決定が、ヒト患者が感染しているHCV株の型又は亜型の決定をさらに含む、本発明(1)の方法である。
本発明（４）は、決定工程が、NS5A遺伝子の937位における一塩基置換を検出し得るアッセイ法を実施することを含む、本発明(1)又は(3)の方法である。
本発明（５）は、アッセイ法又は決定工程が、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を配列決定することを含む、本発明(1)、(3)、又は(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（６）は、アッセイ法又は決定工程が、配列特異的増幅又はプライマー伸長アッセイ法を含む、本発明(1)、(3)、又は(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（７）は、アッセイ法又は決定工程が、5'ヌクレアーゼ反応アッセイ法を含む、本発明(1)、(3)、又は(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（８）は、アッセイ法又は決定工程が、PCR後融解解析アッセイ法を含む、本発明(1)、(3)、又は(4)のいずれか一発明の方法である。
本発明（９）は、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、a）NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及びb）313位のアミノ酸がバリンであるか否かを決定し、その際、313位におけるバリンの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法である。
本発明（１０）は、HCVに感染したヒト患者の治療用薬剤の調製のためのインターフェロンの使用であって、HCVに感染したヒト患者において、HCV-1aタンパク質のうちのNS5Aタンパク質のアミノ酸313位がバリンである、使用である。
本発明（１１）は、インターフェロン治療が、ロフェロン（Roferon）（登録商標）-A、ペガシス（Pegasys）（登録商標）、イントロン（Intron）（登録商標）A、及びペグ−イントロン（Peg-Intron）（登録商標）からなる群より選択される、本発明(2)又は(10)の使用である。
本発明（１２）は、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、a）NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、及びb）937位のヌクレオチドがAであるか否かを決定し、その際、937位におけるAの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対するウイルス学的無応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法である。
本発明（１３）は、NS5A遺伝子の937位のヌクレオチドの決定が、ヒト患者が感染しているHCV株の型又は亜型の決定をさらに含む、本発明(12)の方法である。
本発明（１４）は、決定工程が、NS5A遺伝子の937位における一塩基置換を検出し得るアッセイ法を実施することを含む、本発明(12)の方法である。
本発明（１５）は、アッセイ法又は決定工程が、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を配列決定することを含む、本発明(12)〜(14)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１６）は、アッセイ法又は決定工程が、配列特異的増幅又はプライマー伸長アッセイ法を含む、本発明(12)〜(14)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１７）は、アッセイ法又は決定工程が、5'ヌクレアーゼ反応アッセイ法を含む、本発明(12)〜(14)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１８）は、アッセイ法又は決定工程が、PCR後融解解析アッセイ法を含む、本発明(12)〜(14)のいずれか一発明の方法である。
本発明（１９）は、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、a）NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及びb）313位のアミノ酸がイソロイシンであるか否かを決定し、その際、313位におけるイソロイシンの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対するウイルス学的無応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法である。
本発明（２０）は、HCV-1aのNS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用され得るオリゴヌクレオチドであって、14〜35ヌクレオチド長であり、かつNS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む領域においていずれかの鎖と本質的に相補的である、オリゴヌクレオチドである。
本発明（２１）は、領域の範囲が、配列番号：1のヌクレオチド908位からヌクレオチド957位までである、本発明(20)のオリゴヌクレオチドである。
本発明（２２）は、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：10、及び配列番号：11からなる群より選択される、本発明(20)のオリゴヌクレオチドである。
本発明（２３）は、本発明(20)〜(22)のいずれかのオリゴヌクレオチドとポリメラーゼとを含む、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するのに有用なキットである。
本発明により、個体のインターフェロン治療に対する応答の予測において有用な、HCV-1a NS5A遺伝子の937位における塩基変異を決定するための方法及び試薬が提供された。
本発明の上記及びその他の利点及び特質、並びにそれらが達成され得る様式は、例示的な態様を例示する添付の実施例と併せて以下の発明の詳細な説明を考慮することにより、より容易に明らかとなると思われる。
「NS5A遺伝子の937位のヌクレオチド」という語句は、アライメントのための参照配列として配列番号：1に示された配列を有するHCV-1a NS5のcDNA又はRNAのヌクレオチド937位の遺伝子座を意味する。なお、配列番号：1は、GenBankアクセッション番号M67463からのHCV-1aゲノム塩基配列のヌクレオチド6264位とヌクレオチド7601位との間の領域をコードするNS5Aを表している。
「NS5Aタンパク質の313位のアミノ酸」という語句は、アライメントのための参照配列として配列番号：2に示された配列を有するHCV-1a NS5Aタンパク質の313位のアミノ酸を意味する。なお、配列番号：2は、GenBankアクセッション番号P26662からのHCV-1aゲノムポリタンパク質のアミノ酸1975位からアミノ酸2420位までのNS5Aタンパク質のポリペプチド配列を表している。
「（1個又は複数個の）塩基置換」及び「（1個又は複数個の）塩基変異」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、特定の遺伝子の参照塩基配列におけるある位置における（1個又は複数個の）ヌクレオチドの変化をさす。
「アミノ酸変異」及び「アミノ酸置換」という用語は、参照タンパク質をコードする参照塩基配列におけるヌクレオチドの置換又は変異に起因する参照タンパク質配列におけるある位置におけるアミノ酸の変化をさすため、本明細書において交換可能に使用される。
「遺伝子型決定」という用語は、特定の遺伝子座の（1個又は複数個の）ヌクレオチドを決定することを意味する。
インターフェロンによる治療に対する「応答」という用語は、薬剤の投与に対する望ましい応答である。インターフェロンによる治療に対する「持続的なウイルス学的応答」及び「完全な応答」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、治療の終了時及び治療の終了後24週目の両方において、RT-PCRにより検出可能なHCV RNAが感染患者の試料中に存在しないことをさす。インターフェロンによる治療に対する「ウイルス学的無応答」及び「無応答」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、治療の間中及び治療の終了時、RT-PCRにより検出可能なHCV RNAが感染患者の試料中に存在することをさす。
「試料」又は「生物学的試料」という用語は、個体から単離された組織又は体液の試料をさし、以下に制限はされないが、例えば、組織生検材料、血漿、血清、全血、髄液、リンパ液、皮膚の外側切片、気道、腸管、尿生殖管、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官を含む。インビトロ細胞培養物の構成物（以下に制限はされないが、培地中の細胞の増殖に起因する条件培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、及び細胞成分を含む）の試料も、含まれる。
「インターフェロン」及び「インターフェロンα」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、ウイルス複製及び細胞増殖を阻害し、免疫応答を調整する高度に相同性の種特異的タンパク質のファミリーをさす。典型的な適当なインターフェロンには、以下に制限はされないが、シエーリング社（Schering Corporation, Kenilworth, N.J.）より入手可能なイントロン（Intron）（登録商標）Aインターフェロンのような組換えインターフェロンα-2b、ホフマン−ラ・ロシュ（Hoffmann-La Roch, Nutley, N.J.） より入手可能なロフェロン（Roferon）（登録商標）-Aインターフェロンのような組換えインターフェロンα-2a、ベーリンガー・インゲルハイム・ファーマシューティカル社（Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc., Ridgefield, Conn.）より入手可能なベロフォア（Berofor）（登録商標）α2インターフェロンのような組換えインターフェロンα-2C、住友（Sumitomo, Japan）より入手可能なスミフェロン（Sumiferon）（登録商標）もしくはグラクソ−ウェルカム社（Glaxo-Wellcome Ltd., London, Great Britain）より入手可能なウェルフェロン（Wellferon）（登録商標）インターフェロンα-n1（INS）のような精製された天然αインターフェロンの混和物、インターフェロンα-n1、又は米国特許第4,897,471号及び同第4,695,623号（特に、実施例7、8、もしくは9）に記載されたもの並びにアムジェン社（Amgen,Inc., Newbury Park, Calif.） より入手可能な特定生成物のようなコンセンサスα・インターフェロン、又はインターフェロン・サイエンシーズ（Interferon Sciences）製のパードゥ・フレデリック社（Purdue Frederick Co., Norwalk, Conn.）よりアルフェロン（Alferon）という商標の下で入手可能な天然型αインターフェロンの混合物、インターフェロンα-n3が含まれる。
「PEG化インターフェロンα」という用語は、本明細書において使用されるように、インターフェロンα、好ましくはインターフェロンα-2a及びインターフェロンα-2bのポリエチレングリコールで修飾された結合体を意味する。典型的な適当なPEG化インターフェロンαには、以下に制限はされないが、ペガシス（Pegasys）（登録商標）及びペグ−イントロン（Peg-Intron）（登録商標）が含まれる。
本明細書において使用されるように、「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オリゴマー対照、及び未標識ブロッキングオリゴマーをさし、ポリデオキシリボヌクレオチド（2-デオキシ-D-リボースを含有）、ポリリボヌクレオチド（D-リボースを含有）、及びプリン塩基もしくはピリミジン塩基又は修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他の任意の型のポリヌクレオチドの総称である。
核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合、又はホスホトリエステル結合、ホスホラミダイト結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホラミダイト結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、もしくはスルホン結合のような修飾された結合、及びそのような結合の組み合わせを含み得る。
核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、5個の生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）、並びに／又は5個の生物学的に存在する塩基以外の塩基を含み得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、以下に制限はされないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-Dマンノシルキュェオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、2,6-ジアミノプリン、及び5-プロピニルピリミジンを含む群より選択される修飾された塩基部分を少なくとも1個含有していてもよい。
さらに、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースのような修飾された糖部分を1個又は複数個含んでいてもよい。
本発明は、核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドの起源によって制限されないものとする。核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、ヒトもしくは非ヒト哺乳動物又はその他の任意の生物に由来するものであってもよいし、又は任意の組換え起源に由来しても、インビトロでもしくは化学合成によって合成されたものであってもよい。核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、cDNA、DNA-RNA、構造的にロックされた核酸（locked nucleotide acid）（LNA）、ペプチド核酸（PNA）、それらのハイブリッド又は任意の混合物であり得、二本鎖、一本鎖、又は部分的二本鎖の形態で存在し得る。本発明の核酸には、精製された又は未精製の形態の、核酸及びそれらの断片の両方が含まれ、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物、例えば、細菌、酵母、ウイルス、ウイロイド、カビ、真菌、植物、動物、及びヒト等のような生物学的材料のゲノムが含まれる。
核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドという用語間に長さの区別は存在しないものとし、これらの用語は交換可能に使用される。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖のDNAが含まれ、二本鎖及び一本鎖のRNAも含まれる。
「対応する」とは、指定された配列と同一又は相補的であることを意味する。
モノヌクレオチドは、1個のモノヌクレオチドのペントース環の5'リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向に、隣の3'酸素に結合するよう反応して、オリゴヌクレオチドを作成し得るため、オリゴヌクレオチドの一端は、5'リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の3'酸素と結合していない場合には「5'末端」と呼ばれ、その3'酸素が次のモノヌクレオチドのペントース環の5'リン酸と結合していない場合には「3'末端」と呼ばれる。本明細書において使用されるように、核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドの内部にある場合ですら、5'末端及び3'末端を有すると言うことができる。
2個の異なる重複していないオリゴヌクレオチドが、同一の直鎖状の相補核酸配列の異なる領域にアニーリングし、一方のオリゴヌクレオチドの3'末端が他方のオリゴヌクレオチドの5'末端の方に向かっている場合、前者は「上流」オリゴヌクレオチド、後者は「下流」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。
「プライマー」という用語は、複数個のプライマー又はプライマーの混合物をさす場合もあり、かつ天然に存在するものであるか、精製された制限酵素消化物として存在するものであるか、又は合成的に作製されたものであるかに関わらず、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒されるような条件の下に置かれた場合に、相補鎖に沿ったポリヌクレオチド合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドをさす。そのような条件には、典型的には、適当な緩衝液（「緩衝液」は、補因子である成分、又はpH、イオン強度等に影響を与える成分を含む）中に、適当な温度における、4個の異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸及びDNAポリメラーゼ又は逆転写酵素のような重合誘導剤が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅効率を最大にするのため一本鎖である。
核酸配列の相補鎖とは、本明細書において使用されるように、一方の配列の5'末端が他方の3'末端と対合するようその核酸配列と整列化された場合に「逆平行に結合」するオリゴヌクレオチドをさす。天然の核酸には一般的には見出されないある種の塩基が本発明の核酸に含まれていてもよく、それらには、例えば、イノシン、7-デアザグアニン、及び前記のものが含まれる。相補性は完全である必要はなく、安定な二本鎖はミスマッチ塩基対又は非マッチ塩基を含有し得る。核酸技術に関する当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及び配列、イオン強度、並びにミスマッチ塩基対の出現率を含む多数の変数を経験的に考慮することにより、二本鎖の安定性を決定し得る。
本明細書において使用されるように、「プローブ」という用語は、プローブ内の少なくとも1個の配列が、ある核酸のある領域の配列と相補的であるために、その領域と二本鎖構造を形成することができ、かつ検出され得るオリゴヌクレオチドをさす。プローブは、好ましくは、5'ヌクレアーゼ反応におけるプライマーの（1個又は複数個の）配列と相補的な配列は含有しない。後述のように、プローブは標識されてもよいし又は未標識であってもよい。プローブの3'末端は、プローブがプライマー伸長産物へと取り込まれることを防止するために「ブロッキング」され得る。「ブロッキング」は、非相補的な塩基を使用することにより、又は、選択された部分に依っては、後の検出のための標識又は標識に結合した核酸の捕捉物としても作用することにより二重の目的を果たし得る、ビオチン基もしくはリン酸基のような化学的部分を、最後のヌクレオチドの3'ヒドロキシルに追加することにより達成され得る。ブロッキングは、3'-OHを除去すること、又はジデオキシヌクレオチドのような3'-OHを欠くヌクレオチドを使用することによっても達成され得る。
「標識」という用語は、本明細書において使用されるように、検出可能な（場合によっては定量可能な）シグナルを提供するために使用され得、かつ核酸又はタンパク質に結合させられ得る任意の原子又は分子をさす。標識は、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、X線回折又は吸収、磁性、酵素活性等によって検出可能なシグナルを提供し得る。本発明のための便利な標識には、オリゴヌクレオチド断片のサイズの検出を容易にするものが含まれる。
本発明のある種の態様において、「標識」は蛍光色素である。蛍光標識は、フルオレセインファミリーの色素のような負の電荷を有する色素、又はローダミンファミリーの色素のような中性の電荷を有する色素、又はシアニンファミリーの色素のような正の電荷を有する色素を含み得る。フルオレセインファミリーの色素には、例えば、FAM、HEX、TET、JOE、NAN、及びZOEが含まれる。ローダミンファミリーの色素には、テキサスレッド（Texas Red）、ROX、R110、R6G、及びTAMRAが含まれる。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、及びTAMRAは、パーキンエルマー（Perkin-Elmer）（Foster City, Calif.）より市販されており、テキサスレッドは、モレキュラープローブ社（Molecular Probes, Inc.）（Eugene, OR）より市販されている。シアニンファミリーの色素には、Cy2、Cy3、Cy5、及びCy7が含まれ、これらは、アマシャム（Amersham）（Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England）より市販されている。
「消光剤」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、消光剤及び蛍光色素の両方が共通のポリヌクレオチドに連結されている場合に、蛍光色素から放射されたエネルギーを吸収する化学的部分をさす。消光剤は、その消光剤に特徴的なシグナルとして蛍光色素から吸収されたエネルギーを再放出することができるので、消光剤も「標識」であり得る。この現象は、蛍光共鳴エネルギー転移又はFRETとして一般に知られている。又は、消光剤は、蛍光色素から吸収されたエネルギーを熱として放散させ得る。FRETにおいて一般的に使用される分子には、例えば、フルオレセイン、FAM、JOE、ローダミン、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、及びEDANSが含まれる。蛍光色素が標識であるか又は消光剤であるかは、その励起スペクトル及び放射スペクトル、並びに組み合わされた蛍光色素によって決められる。例えば、FAMは、488nmの波長を有する光によって最も効率的に励起され、500〜650nmのスペクトル及び525nmの放射極大を有する光を放射する。FAMは、例えば、励起極大514nmを有する消光剤としてのTAMRAと共に使用するための適当なドナー標識である。蛍光色素から吸収されたエネルギーを放散させる例示的な非蛍光性消光剤には、バイオサーチ・テクノロジーズ社（Biosearch Technologies,Inc.）（Novato, Calif.）より市販されているブラック・ホール・クエンチャーズ（Black Hole Quenchers）（商標）が含まれる。
本明細書において定義されるように、「5'→3'ヌクレアーゼ活性」とは、オリゴヌクレオチドの5'末端から連続的にヌクレオチドが除去されるような、従来よりいくつかのDNAポリメラーゼに関連している5'→3'エキソヌクレアーゼ活性（例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIはこの活性を有しているが、クレノウ断片は有していない）、もしくはは5'末端から複数個のホスホジエステル結合（ヌクレオチド）で切断が起こるような、5'→3'エンドヌクレアーゼ活性のいずれか、又はその両方の活性を含む、鋳型特異的核酸ポリメラーゼの活性をさす。いずれの特定の作用原理によっても拘束されるものではないが、プローブ−鋳型ハイブリダイゼーション複合体に対する5'→3'エンドヌクレアーゼ活性依存的切断のための好ましい基質は、Hollandら、1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-80（参照として完全に本明細書に組み入れられる）に記載されているような、置換された領域を鎖の塩基対形成部分と接続しているホスホジエステル結合において加水分解が起こる、置換された（displaced）一本鎖核酸であり、フォーク様（fork-like）構造をとる。
「近接する」という用語は、本明細書において使用されるように、鋳型核酸の相補鎖上のプローブに対するプライマーの位置付けをさす。プライマーとプローブとは、20ヌクレオチド超、1〜約20ヌクレオチド、より好ましくは約1〜10ヌクレオチド離れていてもよいし、又は、重合非依存的過程による検出にとって望ましい場合には、相互に直接隣接していてもよい。又は、本発明の方法が、本明細書において開示されたようなPCR増幅及び検出の方法において使用される場合のように、重合依存的過程における使用については、「近接」は、増幅すべき配列内の任意の場所、つまり、プローブの切断が起こるようプライマー伸長がポリメラーゼを位置づけるようにプライマーの下流の任意の場所であり得る。
本明細書において使用されるように、「熱安定性核酸ポリメラーゼ」という用語は、例えば、大腸菌からのヌクレオチドポリメラーゼと比較して、熱に対して比較的安定であり、かつヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素をさす。一般に、酵素は、標的配列にアニーリングしたプライマーの3'末端で合成を開始させ、5'→3'ヌクレアーゼ活性を保有している場合には、介在するアニーリングしたプローブを加水分解し、標識されたプローブ断片及び未標識のプローブ断片の両方を放出しながら、合成が終結するまで、又はプローブ断片が標的配列から融解除去されるまで、鋳型の5'末端に向かって新たな鎖の合成を継続すると思われる。サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Taq）より単離された代表的な熱安定性酵素は、米国特許第4,889,818号に記載されており、従来のPCRにおいてそれを使用するための方法は、Saikiら、1988, Science 239:487-91に記載されている。
Taq DNAポリメラーゼは、DNA合成依存性の鎖置換5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有している。Gelfand,「Taq DNA Polymerase」, PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich編、Stockton Press, N.Y.(1989), Chapter 2を参照のこと。溶液中で、プローブの分解は、たとえあったとしてもほとんどない。
核酸、プライマー、及びプローブの「5'ヌクレアーゼ反応」という用語は、以下に詳述されるような、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有している核酸ポリメラーゼによりプライマーが伸長する際の、核酸にハイブリダイズしたプローブの分解をさす。そのような反応は、米国特許第6,214,979号、同5,804,375号、同5,487,972号及び同第5,210,015号（参照として完全に本明細書に組み入れられる）に記載されているものに基づく。
「標的核酸」という用語は、5'ヌクレアーゼ反応においてプライマー及びプローブとハイブリダイズすることができ、かつ1個又は複数個の塩基変異部位を含有している核酸をさす。
「ストリンジェント」又は「ストリンジェント条件」という用語は、本明細書において使用されるように、当技術分野において周知であるような、低いイオン強度及び高い温度のハイブリダイゼーション条件をさす。例えば、Sambrookら、2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、J.Wiley&Sons Inc., New York, 1988）；Tijssen, 1993,「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」, Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology:Hybridization with nucleic acid probes(Elsevier)（各々参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。一般に、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列の融点（Tm）より約5〜30℃低くなるよう選択される。又は、ストリンジェント条件は、所定のイオン強度及びpHにおける特定の配列のTmより約5〜15℃低くなるよう選択される。Tmとは、平衡時に標的と相補的なプローブの50％が標的配列にハイブリダイズするような（所定のイオン強度、pH、及び核酸濃度下での）温度である（標的配列は過剰に存在するため、Tmでは、平衡時にプローブの50％が占拠される）。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約pH7.0〜約pH8.3において塩濃度が約1.0M未満のナトリウム（又はその他の塩の）イオン濃度であり、典型的には約0.01〜約1M未満のナトリウムイオン濃度であり、かつ温度が短いプローブ（例えば、10〜50ヌクレオチド）の場合には少なくとも約25℃、かつ長いプローブ（例えば、50ヌクレオチド超）の場合には少なくとも約55℃である条件である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのようなハイブリダイゼーション不安定化剤の添加によっても改変され得る。長いプローブ（例えば、50ヌクレオチド超）のための例示的な非ストリンジェント又は低ストリンジェントの条件は、20mMトリス、pH8.5、50mM KCl、及び2mM MgCl2の緩衝液、並びに25℃の反応温度を含む。
本発明の実施は、特記しない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、及び組み換えDNA技術の従来の技術を用いる。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Sambrookら、2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames及びS.J.Higgins編、1984）；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal, 1984)；及びMethods in Enzymologyシリーズ（Academic Press,Inc.）を参照のこと。
HCV-1aの全ゲノム塩基配列は、アクセッション番号M67463の下でGenBankより入手可能であり、ヌクレオチド6264位〜7601位のNS5Aコード領域は配列番号：1として提供されている。新たに発見された一塩基置換は、937位において起こる。G937A置換は、コードされたアミノ酸におけるバリンからイソロイシンへの変化に対応する。
ヌクレオチド又はアミノ酸の変異を検出するための多数の技術が当技術分野において既知であり、それらは全て本発明の方法を実施するために使用され得る。配列変異を同定するために使用される特定の方法は、本発明の重大な面ではない。性能、コスト、及び利便性を考慮し、特定の方法が他より望ましいものになると思われるが、配列番号：1の937位のヌクレオチド又は配列番号：2の313位のアミノ酸を同定し得る任意の方法が、本発明を実施するために必要とされる情報を提供するということは明白であると思われる。その技術はポリヌクレオチドに基づくもの又はタンパク質に基づくものであってもよい。いずれの場合にも、使用される技術は、単一のヌクレオチド又はアミノ酸の変異を正確に検出するために十分な感度を有していなければならない。
ポリヌクレオチドに基づく検出法において、遺伝子型決定は、置換部位、配列番号：1のヌクレオチド937位に存在するヌクレオチドを同定することにより達成される。HCV-1aポリヌクレオチドを含有しているHCV-1a感染個体に由来する任意の種類の生物学的試料を、遺伝子型の決定のため使用してもよい。遺伝子型決定は、当技術分野において周知の標準的なRNA抽出法を用いてHCV RNAを単離することにより実施され得る。RNAの増幅は、まず、例えばウイルス逆転写酵素を使用して、標的RNAを逆転写し、次いで得られたcDNAを増幅することにより、又は米国特許第5,310,652号；同第5,322,770号；同第5,561,058号；同第5,641,864号；及び同第5,693,517号（各々参照として本明細書に組み入れられる）（Myers及びSigua, 1995, PCR Strategies, 前記, chapter 5も参照のこと）に記載されたような組み合わせられた高温逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使用することにより、実施され得る。単一のヌクレオチドの位置に存在するヌクレオチドを同定するための方法は、多数、当技術分野において既知である。
937位のヌクレオチドは、当技術分野において周知の連鎖停止（chain termination）法（Sangerら、1977, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463-5467（参照として本明細書に組み入れられる））のようなDNA配列決定法によって同定され得る。一つの態様において、置換部位を包含している遺伝子の部分配列（subsequence）が増幅され、適当なプラスミドへとクローニングされてから、配列決定されるか、又は直接配列決定される。PCRに基づく配列決定は、米国特許第5,075,216号；Brow, PCR Protocols, 1990, (Innisら編、Academic Press, San Diego), chapter 24;及びGyllensten, PCR Technology, 1989(Erlich編、Stockton Press, New York), chapter 5（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。一般的には、配列決定は、例えば、PEバイオシステムズ（PE Biosystems）(Foster City, Calif.)、ファルマシア（Pharmacia）(Piscataway, N.J.)、ジェノミクス社（Genomyx Corp.）(Foster City, Calif.)、LI-CORバイオテク（LI-COR Biotech）(Lincloln, Nebr.)、ジェネシス・テクノロジーズ（GeneSys technologies）(Sauk City, Wis.)、及びビザブル・ジェネティクス社（Visable Genetics,Inc.）(Toronto, Canada)より商業的に入手可能な自動DNAシーケンサーのうちの一つを使用して実施される。
937位のヌクレオチドは、増幅に基づく遺伝子型決定法によって同定され得る。標的核酸内の一塩基変化を検出し得るアッセイ法において使用され得る多数の核酸増幅法が記載されている。好ましい方法は、今や当技術分野において周知であり、米国特許第4,683,195号；同第4,683,202号；及び同第4,965,188号（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。PCRの方法及び使用を記載している公開された多数の文献の例は、PCR Applications, 1995, (Innisら編、Academic Press, San Diego)、PCR Strategies, 1995, (Innisら編、Academic Press, San Diego)；PCR Protocols, 1990, (Innisら編、Academic Press, San Diego)；及びPCR Technology, 1989(Erlich編、Stockton Press, New York)（各々参照として本明細書に組み入れられる）に見出される。PEバイオシステムズ（PE Biosystems）(Foster City, Calif.)のような商業的な製造業者が、PCR試薬を市販し、PCRプロトコルを公開している。
その他の適当な増幅法には、リガーゼ連鎖反応（Wu及びWallace 1988, Genomics 4:560-569）；鎖置換アッセイ法（Walkerら、1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396、Walkerら、1992, Nucleic Acids Res.20:1691-1696、及び米国特許第5,455,166号）；並びに米国特許第5,437,990号；第5,409,818号；及び第5,399,491号に記載された方法を含む、いくつかの転写に基づく増幅系；転写増幅系（TAS）（Kwohら、1989, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177）；並びに自己持続型配列複製（self-sustained sequence replication）（3SR）（Guatelliら、1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878及びWO92/08800）（各々参照として本明細書に組み入れられる）が含まれる。又は、Qβ-レプリカーゼ増幅（Kramer及びLizardi, 1989, Nature 339:401-402及びLomeliら、1989, Clin.Chem.35:1826-1831（いずれも、参照として本明細書に組み入れられる））のようなプローブを検出可能なレベルにまで増幅する方法が使用され得る。既知の増幅法の概説は、Abramson及びMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47（参照として本明細書に組み入れられる）に提供されている。
937位のヌクレオチドは、プライマーを伸長させるDNAポリメラーゼの能力に対する末端プライマーのミスマッチの阻害効果に基づく、配列特異的増幅法又はプライマー伸長法を使用して同定され得る。配列特異的増幅又は伸長に基づく方法を使用して配列を検出するには、3'末端ヌクレオチドが置換位置にハイブリダイズするよう、NS5A遺伝子に相補的なプライマーが選択される。同定すべき特異的バリアントの存在下では、プライマーが3'末端で標的配列にマッチし、プライマーが伸長する。特異的バリアントの非存在下では、プライマーが標的配列に対して3'ミスマッチを有しており、プライマー伸長が排除されるか又は有意に抑制される。対立遺伝子特異的増幅又は伸長に基づく方法は、例えば、米国特許第5,137,806号；同第5,595,890号；同第5,639,611号；米国特許第4,851,331号（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。配列特異的増幅に基づく遺伝子型決定を使用する場合、置換の同定は、増幅された標的配列の有無の検出のみを必要とする。増幅された標的配列の検出のための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ゲル電気泳動（例えば、前記のSambrookら、1989を参照のこと）及び前記のプローブハイブリダイゼーションアッセイ法が、核酸の存在を検出するために広く用いられている。
反応混合物中の二本鎖DNAの全量の増加をモニターすることにより、増幅された核酸の生成が検出される、本明細書においてキネティック（kinetic）-PCR法と呼ばれる別のプローブを用いない方法は、Higuchiら、1992,Bio/Technology 10:413-417; Higuchiら、1993,Bio/Technology 11:1026-1030;Higuchi及びWatson, PCR Application, 前記, Chapter 16;米国特許第5,994,056号；並びに欧州特許公開第487,218号及び同第512,334号（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。二本鎖標的DNAの検出は、二本鎖DNAと結合した際に臭化エチジウム（EtBr)及びその他のDNA結合色素が示す蛍光の増加に頼っている。標的配列の合成に起因する二本鎖DNAの増加は、二本鎖DNAと結合した色素の量の増加及び同時の蛍光の検出可能な増加をもたらす。キネティック-PCR法を使用して遺伝子型決定するには、各増幅が、特定の対立遺伝子の存在を示し得るよう、対立遺伝子のうちの一方に特異的なプライマー対を使用して増幅反応が実施される。一つは937位のGに特異的なプライマーを使用して、もう一つは937位のAに特異的なプライマーを使用して、二つの増幅を実施することにより、試料の遺伝子型は決定され得る。
937位のヌクレオチドは、プローブと、相補性の程度が異なるヌクレオチドバリアントとの間に形成されるハイブリダイゼーション二本鎖の安定性の差に頼っている、プローブに基づく方法を使用して同定され得る。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下では、プローブと、厳密にマッチする標的配列との間にのみ、安定な二本鎖は形成される。安定なハイブリダイゼーション二本鎖の存在は、多数の周知の方法のうちの任意のものによって検出され得る。一般に、検出を容易にするため、ハイブリダイゼーションの前に核酸を増幅することが好ましい。しかしながら、これは、十分な核酸を増幅なしに入手できる場合には、必要ない。
いくつかの態様において、937位に存在するヌクレオチドは、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下での、NS5A遺伝子の937位を含む領域と厳密に相補的なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって同定される。プローブがハイブリダイズする配列及び配列特異的ハイブリダイゼーション条件は、置換部位における単一のミスマッチが、効率的に形成されないよう十分にハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化するよう選択される。従って、配列特異的ハイブリダイゼーション条件下で、安定な二本鎖は、プローブと、厳密に相補的な配列との間にのみ形成される。従って、NS5A遺伝子の937位を含む領域と厳密に相補的な14〜60ヌクレオチド長、好ましくは14〜35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが、本発明の範囲内に含まれる。
その他の態様において、937位に存在するヌクレオチドは、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下での、NS5A遺伝子の937位を含む領域と本質的に相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって同定される。この態様において、ハイブリダイゼーション条件は、非標的配列との安定な二本鎖の形成を除外するのに十分なストリンジェンシーを維持しつつ、標的配列との安定な二本鎖の形成を可能にするのに十分に緩和される。従って、NS5A遺伝子の937位を含む領域と本質的に相補的な14〜60ヌクレオチド長、好ましくは14〜35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが、本発明の範囲内に含まれる。
厳密にではなく本質的に相補的なオリゴヌクレオチドの使用は、ハイブリダイゼーション条件の最適化が制限されるアッセイフォーマットにおいて望ましいかもしれない。例えば、典型的な多標的固定化プローブアッセイフォーマットにおいて、各標的に対するプローブは単一の固体支持体上に固定化される。ハイブリダイゼーションは、固体支持体を、標的DNAを含有している溶液と接触させることにより同時に実施される。全てのハイブリダイゼーションが同一条件下で実施されるため、ハイブリダイゼーション条件は、各プローブのため別々には最適化され得ない。プローブへのミスマッチの組み込みは、アッセイフォーマットがハイブリダイゼーション条件の調整を除外する場合、二本鎖の安定性を調整するために使用され得る。特定の導入されたミスマッチの二本鎖の安定性に対する効果は周知であり、二本鎖の安定性は、前記のように、日常的に推定され経験的に決定され得る。
配列番号：1の標的配列（937位を含む）又は配列番号：1の相補鎖に本質的に相補的又は厳密に相補的なハイブリダイズする領域を含有している、本発明のプローブに基づく方法において使用するのに適しているオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供され当技術分野において周知の指針を使用して選択され得る。同様に、プローブの正確なサイズ及び配列に依る適当なハイブリダイゼーション条件は、本明細書に提供され当技術分野において周知の指針を使用して経験的に選択され得る。配列内の一塩基対の差違を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブの使用は、例えば、Connerら、1983, Proc,Natl.Acad.Sci.USA 80:278-282、並びに米国特許第5,468,613号及び同第5,604,099号（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
完全にマッチするハイブリダイゼーション二本鎖と一塩基ミスマッチハイブリダイゼーション二本鎖との間の安定性の比例的な変化は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの長さに依る。より短いプローブ配列と共に形成された二本鎖は、ミスマッチの存在により比例的により大きく不安定化される。実際、14〜35ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドは、配列特異的検出のため好ましい。さらに、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの末端は、熱エネルギーによる継続的なランダムな解離及び再アニーリングを起こしているため、いずれかの末におけるミスマッチは、内部に存在するミスマッチより少なくハイブリダイゼーション二本鎖を不安定化する。好ましくは、標的配列内の一塩基対変化の識別のため、塩基置換部位がプローブの内部領域に存在するよう標的配列とハイブリダイズするプローブ配列が選択される。
配列番号：1とハイブリダイズするプローブ配列を選択するための上記の基準は、プローブのハイブリダイズする領域、即ち、標的配列とのハイブリダイゼーションに関与しているプローブの部分にも適用される。プローブは、プローブのハイブリダイゼーション特性を有意に改変することなく、プローブを固定化するために使用されたポリTテールのような付加的な核酸配列と結合させられ得る。当業者は、本発明において使用するため、標的配列と相補的ではなく、そのためハイブリダイゼーションには関与しない付加的な核酸配列と結合したプローブが、未結合のプローブと本質的に等価であることを認識すると思われる。NS5A遺伝子型を決定するためのプローブに基づく方法の好ましい態様において、置換部位を包含しているNS5A遺伝子からの核酸配列が、増幅され、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でプローブとハイブリダイズさせられる。塩基配列は、増幅された標的配列とのプローブの結合のパターンから推量される。この態様においては、プローブハイブリダイゼーションによる解析のための十分な核酸を提供するため、増幅が実施される。従って、プライマーは、いずれのヌクレオチドが試料中に存在しているかに関わらず、NS5A遺伝子の置換部位を包含している領域が増幅されるよう設計される。配列非依存的な増幅は、NS5A遺伝子の保存された領域にハイブリダイズするプライマーを使用して達成される。
プローブと試料中の標的核酸配列との間で形成されたハイブリッドを検出するための適当なアッセイフォーマットは、当技術分野において既知であり、固定化標的フォーマット及び固定化プローブアッセイフォーマットを含む。これらのアッセイフォーマットは、米国特許第5,310,893号；第5,451,512号；第5,468,613号；及び第5,604,099号（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。さらに、マイクロチップ技術又はマイクロアレイ技術も、本発明のプローブに基づく検出法に適用可能である。本質的に、マイクロチップにおいては、多数の異なるオリゴヌクレオチドプローブが、基質又は担体、例えば、シリコンチップ又はガラススライドの上にアレイとして固定化される。解析すべき標的核酸配列は、マイクロチップ上の固定化されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させられ得る（Lipshutzら、1995, Biotechniques, 19:442-445）。又は、研究すべき複数の標的核酸配列が基質に固定され、プローブのアレイが、固定化された標的配列と接触させられる（Drmanacら、1998, Nature Biotechnology, 16:54-58）。一塩基変異を検出するための前記の技術のうちの一つ又は複数を取り込んだ多数のマイクロチップ技術が開発されている。コンピュータ化された解析ツールと組み合わせられたマイクロチップ技術は、大規模な迅速なスクリーニングを可能にする。マイクロチップ技術の本発明への適用は、本開示を参照した当業者には明らかであると思われる（Wilgenbusら、1999, J.Mol.Med., 77:761-786）。
本発明における塩基置換を検出するための好ましいプローブに基づく遺伝子型決定技術は、「5'ヌクレアーゼ反応」であり、その態様は、米国特許第5,210,015号；同第5,487,972号；及び同第5,804,375号；並びにHollandら、1988, Proc,Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280（各々参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）からのCOBAS TAQMAN（商標）システムのような5'ヌクレアーゼ反応を実施するために使用される試薬及び装置は、当業者に周知である。
簡単に説明すると、5'ヌクレアーゼ反応においては、プライマー及びプローブが核酸の鎖にハイブリダイズする条件の下で、核酸がプライマー及びプローブと接触させられる。核酸、プライマー、及びプローブは、5'→3'ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼとも接触させられる。5'→3'ヌクレアーゼ活性を保有している核酸ポリメラーゼは、プライマーの下流の核酸とハイブリダイズしたプローブを切断し得る。プライマーの3'末端は、核酸ポリメラーゼのための最初の結合部位を提供する。結合したポリメラーゼがプローブの5'末端と遭遇するや否や、ポリメラーゼはプローブから断片を切断し得る。
プライマー及びプローブは、核酸ポリメラーゼがプライマーの3'末端と結合することによって、自動的に、それがプローブの5'末端と接触するよう、核酸上の近位でアニーリングするよう設計され得る。この過程において、切断を達成するための位置に核酸ポリメラーゼを持っていくために、重合は必要とされない。「重合非依存的な切断」という用語は、この過程をさす。
又は、プライマー及びプローブが、核酸のより遠く離れた領域にアニーリングする場合には、核酸ポリメラーゼがプローブの5'末端と遭遇する前に、重合が起こらなければならない。重合が継続しながら、ポリメラーゼは進行的にプローブの5'末端から断片を切断する。この切断は、プローブの残りが、鋳型分子から解離する程度に不安定化されるまで、継続される。「重合依存的な切断」という用語は、この過程をさす。
重合非依存的な切断の一つの利点は、核酸増幅の必要がない。プライマー伸長の非存在下で、核酸の鎖は実質的に一本鎖である。プライマー及びプローブが近接して核酸と結合した場合には、オリゴヌクレオチドのアニーリング及び断片の切断が連続的に繰り返され得る。従って、重合の非存在下で検出を可能にする十分な量の断片が生成し得る。
いずれの過程においても、核酸を含有している試料が準備される。試料中に含有されている核酸は、まず、必要であればcDNAへと逆転写され、次いで、当業者に既知の物理的、化学的、又は酵素的な手段を含む任意の適当な変性法を使用して変性させられる。鎖分離のための好ましい物理的手段には、完全に（＞99％）変性するまで核酸を加熱することが含まれる。典型的な熱変性は、約1〜10分の範囲の時間の、約80℃〜約105℃の範囲の温度を含む。変性の代わりに、核酸は、例えば、一本鎖のRNAウイルス又はDNAウイルスのような一本鎖の形態で試料中に存在してもよい。
次いで、変性した核酸鎖が、プライマー及びプローブが核酸鎖と結合することを可能にするハイブリダイゼーション条件の下で、プライマー及びプローブと共にインキュベートされる。いくつかの態様において、2個のプライマーが核酸を増幅するために使用され得る。当技術分野において既知であるように、2個のプライマーは、核酸上のそれらの相対的な位置が、一方のプライマーから合成された伸長産物が鋳型（相補鎖）から分離した際に、伸長産物が他方のプライマーの伸長のための鋳型としてはたらき、一定の長さの複製鎖を生じるような位置となるよう、選択される。
相補鎖は、典型的にはプローブ又はプライマーのいずれかより長いため、鎖はより多くの接触点を有し、従って、所定の時間で相互を見出すより大きな確率を有する。高モル濃度過剰のプローブに加えプライマーは、鋳型の再アニーリングではなくプライマー及びプローブのアニーリングへと平衡が傾くのを助ける。
プライマーは、重合のための薬剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さ及び組成は、アニーリング反応の温度、プライマーの起源及び組成、プローブアニーリング部位とプライマーアニーリング部位との近接度、並びにプライマー：プローブ濃度比を含む多くの要因に依ると思われる。例えば、配列の複雑度に依って、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、約15〜30ヌクレオチドを含有するが、それより多い又は少ないヌクレオチドを含有してもよい。プライマーは、それぞれの鎖と選択的にアニーリングし、安定な二本鎖を形成するため十分に相補的でなければならない。
各プライマーは、核酸の鎖と「実質的に」相補的であるよう選択され得る。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、それぞれの鎖と選択的にハイブリダイズするため十分に相補的でなければならない。プライマーが、安定な二本鎖を形成するために十分な鋳型鎖との相補性を保持していることを条件として、非相補的な塩基又はより長い配列が、プライマー内に点在しているか又はプライマーの末端に位置していてもよい。プライマーの非相補的な塩基配列には、制限酵素部位が含まれ得る。
重合非依存的過程において、プライマー伸長重合がこの二本鎖領域に到達する前、又はポリメラーゼが上流オリゴヌクレオチドに付着する前に、プローブが相補的な核酸とアニーリングする可能性を高くするためには、多様な技術が使用され得る。短いプライマー分子は、一般に、核酸と十分安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。従って、プローブは、プローブがプライマーのアニーリングと比べてより高い温度で核酸と優先的にアニーリングするよう、プライマーより長くなるように設計され得る。
差次的な熱安定性を有するプライマー及びプローブを使用することも可能である。例えば、プローブのヌクレオチド組成は、プライマーより高いG/C含有量を有し、従って、より大きな熱安定性を有するよう選択され得る。又は、例えば、従来のものではないDNA塩基が、従来のDNA塩基のみを有するプライマー又はプローブと比較して大きい又は小さい熱安定性をもたらすために、プライマー又はプローブに組み込まれてもよい。プローブ及びプライマーのディファレンシャルな熱安定性を活用するため、サーモサイクリングパラメータも変動させられ得る。例えば、サーモサイクリングにおける変性工程の後、プローブ結合には許容しうるがプライマー結合には許容しえない中間の温度が導入され得、次いで、プライマーのアニーリング及び伸長を許容するため温度がさらに下げられる。
プライマーの前のプローブの結合が優先的に有利となるよう、プライマー濃度に対して高モル濃度過剰のプローブが使用されてもよい。そのようなプローブ濃度は、典型的には、一般に0.5〜5×10-7Mであるそれぞれのプライマー濃度の約2〜20倍の範囲にある。
プライマー及びプローブは、任意の適当な方法によって調製され得る。特異的な配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当技術分野において既知であり、例えば、適切な配列のクローニング及び制限、並びに直接化学合成を含む。化学合成法には、例えば、Narangら、1979, Methods in Enzymology 68:90により記載されたホスホトリエステル法、Brownら、1979, Methods in Enzymology 68:109により記載されたホスホジエステル法、Beaucageら、1981, Tetrahedron Letters 22:1859に開示されたジエチルホスホラミダイト法、及び米国特許第4,458,066号に開示された固相法が含まれてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドに対する酵素の挙動に影響を与えるため、オリゴヌクレオチドに修飾が組み込まれてもよい。例えば、修飾されたホスホジエステル結合（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホアミデート（phosphoamidate）、もしくはボラノホスフェート（boranophosphate））、又はリン酸誘導体以外の結合のプローブへの組み込みが、選択部位における切断を防止するため使用され得；又は、例えば、2'-アミノ修飾糖の内含は、オリゴヌクレオチドの消化より置換にとって有利である可能性が高いと思われる。
（1個又は複数個の）オリゴヌクレオチドプライマーの鋳型依存的伸長は、適切な塩、金属カチオン、及びpH緩衝系から構成された反応媒体の中で、適正量の4個のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dGTP、dCTP、及びdTTP）又は前記のような類似体の存在下で、重合剤によって触媒される。適当な重合剤は、プライマー及び鋳型に対して依存的なDNA合成を触媒し、かつ5'→3'ヌクレアーゼ活性を保有していることが既知の酵素である。既知のDNAポリメラーゼには、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、Tth DNAポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus littoralis）DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、及びZ05 DNAポリメラーゼが含まれる。これらのDNAポリメラーゼによりDNA合成を触媒するための反応条件は、当技術分野において周知である。本発明において有用であるためには、重合剤は、シグナルが直接的又は間接的に生成するよう、効率的にオリゴヌクレオチドを切断し、標識された断片を放出しなければならない。
合成産物は、鋳型鎖とプライマー伸長鎖とからなる二本鎖分子である。この合成の副産物は、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、及びそれより大きいヌクレオチド断片の混合物からなり得るプローブ断片である。変性、プローブ及びプライマーのアニーリング、並びにプライマー伸長及びプローブの切断のサイクルの反復は、プライマーによって決められた領域の指数関数的な蓄積及び標識された断片の指数関数的な生成をもたらす。一般にはバックグラウンドシグナルより数桁大きい、プローブ断片の検出可能量に達するため、十分なサイクルが実行される。
好ましい方法において、PCR反応は、熱安定性酵素を用いた自動化された過程として実施される。この過程においては、切断及び置換がプライマー依存的鋳型伸長と同時に起こるよう、反応混合物は、変性工程、プローブ及びプライマーのアニーリングの工程、並びに合成工程のサイクルに供される。熱安定性酵素と共に使用するために特別に設計された、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）より商業的に入手可能な機器のような、サーマルサイクラーが使用され得る。
二本鎖伸長産物を変性させる好ましい手段は、PCRサイクル中にそれらを高温（約95℃）に曝すことによるであるため、この自動化された過程においては、温度安定性ポリメラーゼが好ましい。例えば、米国特許第4,889,818号は、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）より単離された代表的な熱安定性酵素を開示している。付加的な代表的な温度安定性ポリメラーゼには、例えば、熱安定細菌サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・ルバー（Thermus ruber）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（列挙された他のものより幾分低い至適温度を有する）、サーマス・ラクテウス（Thermus lacteus）、サーマス・ルベンス（Thermus rubens）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus littoralis）、及びメタノサーマス・ファービダス（Methanothermus fervidus）より抽出されたポリメラーゼが含まれる。
5'ヌクレアーゼ反応におけるプローブは、標的核酸の遺伝子型を同定するために使用され得る任意のオリゴヌクレオチドである。典型的には、プローブは、標的核酸内のある領域に対応する塩基配列を含む。本発明の方法を実施するためには、領域は、NS5A遺伝子の937位を含むべきである。
プローブの塩基配列は、ヌクレアーゼ反応において断片を生成させるのに十分な任意の長さを有し得る。ある種の態様において、プローブの塩基配列は、少なくとも6ヌクレオチド、一般的には140ヌクレオチド未満から構成され得る。一つの態様において、プローブは、14〜60ヌクレオチド長である。好ましい態様において、プローブは、14〜35ヌクレオチド長である。プローブの長さは、PCRのアニーリング工程の温度においてプローブのその標的とのハイブリダイゼーションを確実にするのに十分な熱力学的安定性を与えるよう選択される。例えば、従来のものではないDNA塩基を有するプローブは、従来のDNA塩基を有するものより長くても、又は短くてもよい。もう一つの例において、A/Tリッチ配列を有するプローブは、G/Cリッチ配列を有するものより長い。塩基変異の部位は、プローブの塩基配列内の任意の位置にあり得る。好ましい態様において、塩基変異の部位は、プローブの塩基配列の5'末端ではない。
典型的には、プローブの塩基配列は、標的領域と同一又は相補的である。しかしながら、プローブの塩基配列は、100％未満の標的ヌクレオチド領域との同一性又は相補性を有していてもよい。本発明のある種の態様において、プローブの塩基配列は、99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、又は80％の標的ヌクレオチド領域との相補性又は同一性を有し得る。本発明のある種の態様において、プローブの塩基配列は、ストリンジェント条件下で標的ヌクレオチド領域とハイブリダイズする。本発明の他の態様において、プローブの塩基配列は、低ストリンジェンシー条件下で標的ヌクレオチド領域とハイブリダイズする。
プローブの塩基配列に加え、プローブは、本発明の方法に干渉しない付加的な塩基配列又はその他の部分を含んでいてもよい。本発明の都合のよい態様において、プローブは、本発明の方法を容易にする付加的な塩基配列又はその他の部分を含み得る。例えば、不要な増幅プライミングを防止するため、プローブは、3'末端でブロッキングされ得る。また、プローブ又はプローブ断片の標的塩基配列とのハイブリダイゼーションを不安定化する部分が、プローブ内に存在してもよい。
本発明のある種の態様において、プローブは標識を含み得る。便利な態様において、標識は、ヌクレアーゼ反応により生成した標的プローブの断片のサイズ決定を容易にする標識であり得る。
プローブは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段によって検出可能な部分を組み込むことにより標識され得る。標識をオリゴヌクレオチドプローブと連結又は結合させる方法は、当然、使用される（1個又は複数個の）標識の型及びプローブ上の標識の位置に依る。
アッセイ法において使用するのに適切と思われる多様な標識、及びプローブにそれらを含める方法は、当技術分野において既知であり、以下に制限はされないが、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼ）及び酵素基質、放射性原子、蛍光色素、発色団、化学発光標識、オリジン（Origin）（商標）（Igen）のような電気化学発光標識、特異的結合パートナーを有するリガンド、又はシグナルを増強するか、改変するか、もしくは消滅させるため相互作用し得るその他の任意の標識を含む。当然、ヌクレアーゼ反応は、サーモサイクラー（Thermo Cycler）装置を使用して実施されるべきであり、標識は、この自動化された過程において必要とされる温度サイクリングに耐え得るものであるべきである。
放射性原子のうち、32Pが好ましい。32Pを核酸へ導入するための方法は、当技術分野において既知であり、例えば、キナーゼによる5'標識又はニックトランスレーションによるランダム挿入を含む。酵素は、典型的には、それらの活性によって検出され得る。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子と結合することができるタンパク質をさす。その他の特異的結合パートナーには、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジン、IgGとプロテインA、及び当技術分野において既知の多数の受容体−リガンド対が含まれる。同一の標識がいくつかの異なる機序で機能する場合もあるため、上記の記載は、様々な標識を別個のクラスへ分類するためのものではないことを理解されたい。例えば、125Iは、放射性標識としても、又は高電子密度試薬としても機能し得る。HRPは、酵素としても、又はモノクローナル抗体のための抗原としても機能し得る。さらに、所望の効果のため様々な標識を組み合わせることも可能である。例えば、プローブをビオチンで標識し、その存在を、125Iで標識されたアビジンにより、又はHRPで標識された抗ビオチンモノクローナル抗体により検出することが可能である。その他の入れ替え及び可能性は、当業者には容易に明らかであり、本発明の範囲内の等価物と見なされる。
標識は、多様な技術により直接的又は間接的にオリゴヌクレオチドに結合させられ得る。使用される標識の正確な型に依って、標識は、プローブの5'末端もしくは3'末端に位置していてもよいし、プローブの塩基配列の内部に位置していてもよいし、又はシグナル相互作用を促進するため様々なサイズ及び組成のスペーサーアームに結合させられてもよい。商業的に入手可能なホスホロアミダイト試薬を使用して、適切に保護されたホスホロアミダイトを介していずれかの末端に官能基（例えば、チオール又は第一級アミン）を含有しているオリゴマーを生成させ、それらを、例えば、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applicatoins, Innisら編, Academic Press,Inc., 1990に記載されたプロトコルを使用して標識することが可能である。
オリゴヌクレオチドプローブ配列に、典型的には5'末端に、1個又は複数個のスルフヒドリル部分、アミノ部分、又はヒドロキシル部分を導入するため、オリゴヌクレオチド官能化試薬を導入するための方法は、米国特許第4,914,210号に記載されている。5'リン酸基は、レポーター基を提供するため、ポリヌクレオチドキナーゼ及び［γ-32P］ATPを使用することにより放射性同位体として導入され得る。ビオチンは、合成中に導入されたアミノチミジン残基又はアルキルアミノリンカーを、ビオチンのN-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、5'末端に付加され得る。
3'末端における標識は、例えば、コルジセピン35S-ATP及びビオチン化dUTPのような所望の部分を追加するため、ポリヌクレオチド末端転移酵素を使用し得る。
オリゴヌクレオチド誘導体も、使用可能な標識である。例えば、エテノ−dA及びエテノ-Aは、オリゴヌクレオチドプローブへ組み込まれ得る既知の蛍光性アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ-dCは、プローブ合成において使用され得るもう一つの類似体である。そのようなヌクレオチド誘導体を含有しているプローブは、PCR中DNAポリメラーゼがプライマーを伸長させるにつれ、ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって、はるかに強く蛍光性のモノヌクレオチドを放出するよう加水分解され得る。
本発明を実施するための好ましい態様において、標識は、オリゴヌクレオチド断片の検出を容易にするため、蛍光性である。標識には、以下に制限はされないが、フルオレセイン、ポリハロフルオレセイン、好ましくはヘキサクロロフルオレセイン、クマリン、ローダミン、シアニン、オキサジン、チアジン、及びスクアレンが含まれる。さらなる好ましい態様において、単一のプローブが蛍光色素（すなわち、標識）及び消光剤により二重標識される。プローブが完全であるとき、標識の蛍光は、消光剤によって消光される。標識と消光剤との間でプローブが切断されると、標識によって放射された蛍光の消光が減少する。本発明のこの面を実施するための例示的な組み合わせは、蛍光色素ローダミン590及び消光剤クリスタルバイオレットである。
NS5A遺伝子の937位のヌクレオチドの同一性は、単一の5'ヌクレアーゼ反応を用いて試料中のHCVの型又は亜型の決定（即ち、HCV遺伝子型決定アッセイ法）と共に、同一のアッセイ法において決定され得る。そのような態様において、NS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用されるプローブは、単一の5'ヌクレアーゼ反応内で、HCV遺伝子型決定アッセイ法のため使用される1個又は複数個のプローブ（例えば、高い配列多様性が存在するHCVゲノムの5'UTR領域内にハイブリダイズするプローブ）と混合される。好ましい態様において、個々の各プローブは、単一の5'ヌクレアーゼ反応内でそのシグナルと他のプローブから生成した（1個又は複数個）のシグナルを区別するため、自己の特有の標識（例えば、特有の蛍光色素）を含むと思われる。
937位のヌクレオチドは、PCR後融解／アニーリング解析と呼ばれる5'ヌクレアーゼ反応の誘導物を使用して同定され得る。5'ヌクレアーゼ反応における二重標識されたプローブ（即ち、消光剤と共に蛍光色素を含むプローブ）が、典型的には、増殖曲線（これより、Ctが計算され、定量的又は定性的なアルゴリズムにおいて結果を求めるために使用される）の形態でリアルタイムPCR又はキネティックPCRの際の蛍光シグナルを生成させるため使用される。この過程においては、プローブが、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断され、多様なDNA断片（それらのうちのいくつかは蛍光レポーターにより依然として標識されている）を生成させる。これらの断片が生成すると、それらは、もはやシグナル生成に関与し得ない。しかしながら、いくつかの状況においては、全長の完全な二重標識されたプローブが、PCRが完了した後に残存し得る。十分なプローブが残存している場合、それは、プローブが標識核酸から融解除去され、得られた蛍光の変化がその特定の標的核酸に対するプローブの融解温度（Tm）（配列のマッチ及びミスマッチ（即ち、遺伝子型決定）と相関し得る）を決定するために使用される、融解工程を実施することにより、増幅された標的核酸に関するさらなる情報を提供するために使用され得る。蛍光の変化は、プローブが、ランダムコイル構造と、標的核酸と塩基対形成したアニーリング構造との間を移行する際の、蛍光性レポーターと消光剤との間の距離のシフトによる。プローブが結合する鎖を生成させるプライマーの濃度が過剰である非対照PCRを実施することにより、PCR中に切断されるプローブの量が減少し、PCR後融解解析を実施するために十分なプローブが残存することを確実にすると思われる。
937位のヌクレオチドは、米国特許第6,031,098号（参照として完全に本明細書に組み入れられる）に記載されたような障害干渉（hindered intercalating）化合物又は障害干渉剤の使用によって決定され得る。簡単に説明すると、検出可能標識を保持し得るか又は光分解を触媒し得るこれらの化合物は、塩基ミスマッチのあるヌクレオチド塩基間のみにインターカレートするよう十分な障害を有しており、一塩基変異を検出するのに有用である。
937位のヌクレオチドの検出において有用なもう一つの技術は、質量分析（MS）である。核酸遺伝子型決定の分野において最も一般的に使用されているMS法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI-MS）であるが、エレクトロスプレー／イオンスプレー連結液体クロマトグラフィ（LC-ESI/MS）も重要なツールとなりつつある。典型的には、MSによる核酸配列の決定は、デオキシリボヌクレオチド及びジデオキシリボヌクレオチドの規定の混合物と共にプライマーを使用した連鎖停止法のような従来のDNA配列決定法、並びに得られた「ラダー」のMALDIによる測定によって実施される。米国特許第6,258,538号（参照として完全に本明細書に組み入れられる）に記載されたもう一つの方法において、標的核酸は固体支持体に固定化される。次いで、プライマーが、解析すべきヌクレオチド位置に隣接した部位において標的核酸にアニーリングする。デオキシリボヌクレオチド及びジデオキシリボヌクレオチドの選択された混合物の存在下で、プライマー伸長が実施される。次いで、得られた伸長したプライマー及び伸長していないプライマーの混合物が、問題となっている位置におけるヌクレオチドの同一性を決定するため、質量分析によって分析される。
タンパク質に基づく検出技術も、特に、本発明のHCV-1aのNS5A遺伝子の313位のアミノ酸の同一性の決定において有用である場合がある。アミノ酸変異を検出するため、タンパク質配列決定技術が使用され得る。例えば、NS5Aタンパク質又はその断片が、試験すべき個体から単離されたNS5Aヌクレオチド断片を使用して組み換え発現によって合成され得る。好ましくは、ヌクレオチド937位を包含しているわずか100〜150塩基対のNS5A cDNA断片が使用される。次いで、ペプチドのアミノ酸配列が、従来のタンパク質配列決定法によって決定され得る。最近開発された液体クロマトグラフ-顕微鏡質量分析（HPLC-microscopy tandem mass spectrometry）技術も、アミノ酸配列変異を決定するために使用され得る。この技術においては、タンパク質分解による消化がタンパク質に対して実施され、得られたペプチド混合物が逆相クロマトグラフィ分離によって分離される。次いで、タンデム型質量分析が実施され、そこから収集されたデータが分析される。例えば、Gatlinら、Anal.Chem., 72:757-763(2000)を参照のこと。
その他の有用なタンパク質に基づく検出技術には、イディオタイプ特異的抗体、即ち、本発明に係るアミノ酸置換を含むタンパク質に対して特異的な抗体に基づくイムノアフィニティアッセイ法が含まれる。抗体は、溶液試料から特定のタンパク質を免疫沈降させるため、又は例えばポリアクリルアミドゲルにより解析されたタンパク質をイムノブロットするため、使用され得る。免疫細胞化学的方法も、組織又は細胞における特異的なタンパク質多型の検出において使用され得る。例えば、モノクローナル又はポリクローナルの抗体を使用した、酵素連結免疫吸着アッセイ法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、免疫放射線アッセイ法（IRMA）、及びサンドイッチアッセイ法を含む免疫酵素アッセイ法（IEMA）を含む、その他の周知の抗体に基づく技術も、使用され得る。例えば、米国特許第4,376,110号及び同第4,486,530号（いずれも、参照として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。
本発明は、本発明を実施するために有用な成分を含むキット、容器ユニットにも関する。有用なキットは、NS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用されるオリゴヌクレオチドを含有し得る。いくつかの場合、検出プローブは、適当な支持膜に固定され得る。置換部位を包含しているNS5A遺伝子座の領域を増幅するための増幅プライマーは、本発明の好ましい態様において有用であるため、キットは、そのようなプライマーも含有し得る。又は、有用なキットは、NS5A遺伝子の特異的増幅のための配列特異的プライマーを含むプライマーのセットを含有し得る。キットのその他のオプション成分には、本明細書に記載されたような遺伝子型決定法において使用される付加的な試薬が含まれる。例えば、キットは、さらに、プライマー伸長産物の合成を触媒するための薬剤、基質ヌクレオシド三リン酸、核酸を標識しかつ／又は検出するための手段（例えば、標識がビオチンである場合には、アビジン−酵素結合体及び酵素基質及び色素原）、増幅反応又はハイブリダイゼーション反応のための適切な緩衝液、並びに本発明を実施するための説明書を含有し得る。
以下に提示される本発明の実施例は、例示のためだけに提供され、本発明の範囲を制限するものではない。添付の特許請求の範囲に含まれる多数の本発明の態様が、以上の本文及び以下の実施例を参照することにより、当業者には明らかであると思われる。
実施例
ロフェロン臨床研究の概説
ロフェロン（登録商標）-A（IFN-α-2A）治検N-139203/NV14524Bは、1997年7月に完了した無作為化多施設第三期臨床研究であった。目標は、慢性HCV患者の治療における24週間及び48週間のロフェロン（登録商標）-A（6MIU〜3MIUの投与計画）の効力及び安全性を比較することであった（表1参照）。
患者におけるHCV遺伝子型の分布は、表2に示される。SASにおいてロジスティック回帰分析を使用して調べられた確率応答（probability response）に基づき、研究前測定において矛盾は存在しなかった（ウイルス血症、HCV遺伝子型、ウイルス応答、年齢、性別、ジェンダー、人種、体表面積、病期、組織学的活性指数、及びALT）。
データ解析のための生化学的測定（肝酵素テスト又はALT）及びウイルス学的（PCRによるウイルス量）測定を収集するために使用された時間ウィンドウ（time windows）は、0週目（活動的治検治療の初日）、12週目、20週目、24週目、48週目、及び72週目である。表、リスト、及びグラフを含む全ての解析が、SAS PROG GLM法を使用して実施された。応答率は、24週の群で15％、48週で19％であり、それらは統計的に同等であった。
（表１）群の分類
Figure 0004097662
（表２）遺伝子型分布
Figure 0004097662
配列解析の概説
様々な時点における生化学的応答（ALT）及びウイルス学的応答（PCR）をプロットし、治療成績を査定するために使用した（治療成績分類のルールについては表3を参照のこと）。ロフェロン臨床治検（NV14524）からの保存された患者血清を使用して、ウイルスサブゲノムNS5A領域における無応答（NR）又は完全応答（CR）の患者からの治療前及び治療中の配列を、プロフェッショナル・ジェネティクス・ラボラトリーズ（Professional Genetics Laboratories）（PGL、Uppsala, Sweden）より入手した。全HCV-1b患者110人からの28個の試料（18NR、10CR）及び全HCV-1a患者182人からの24個の試料（13NR、11CR）を解析に含めた。ディシジョントリー（dicision trees）を構築し、治療成績に基づき個体を分類するために、シリコン・グラフィックス（Silicon Graphics）のマインセット（MineSet）を使用した。
（表３）IFN治療成績のカテゴリ
Figure 0004097662
NS5Aの領域におけるアミノ酸変化を、二進法フォーマット（binary format）へと変換した。又は、真のアミノ酸配列をスコア化するため、存在しない残基を示すために「0」、存在する残基を示すために「1」を使用して、タンパク質の各残基位置について全ての可能なアミノ酸の表を作成することにより、配列データを表した。IFN治療に対する完全応答又は無応答のいずれかと関連していた変異を、ソフトウェアによって同定した。トリーより、各ブランチ（branch）の「リーフ（leaves）」に到達するためにとられたパス（path）を記載するルールを構築した。例えば、73位にバリンを保有しているが、195位にアラニンを保有していないHCV-1b配列8個のうち全てが、無応答者であった。同様に、他のルールをトリーの全ての「リーフ」について記載した。ディシジョントリー（Decision Tree）構築のための通常の解析戦略は、データを、二つの部分（一つはトリーの構築のため、一つはトリーの検証のため）に分割することである。NS5A配列データが入手された患者は少数であったため、全てのデータをトリーを構築するために使用した。ルールをデータに逆適用したところ、誤分類率はHCV-1bが14％、HCV-1aが4％であった。HCV-1aについての詳細な結果は、表4に与えられる。
（表４）NS5A-1a予測からの査定
Figure 0004097662
これらの結果によると、無応答者（インターフェロン治療に対して抵抗性）である可能性が5.5倍高かったHCV-1a患者において、アミノ酸残基313I（イソロイシン）とNRとの関連は統計的に有意（フィッシャーの直接法、p＜0.001）であった。HCV-1b患者における配列パターン（残基73Vと195A）の観察は、統計的に有意でなかった（カイ二乗検定、自由度2のχ2＝1.49）。
配列特異的増幅／プライマー伸長
プライマーのうちの一つの3'末端の塩基を変化させることにより、一塩基変異の他より優先的な増幅が達成され得た。「A」バリアントを優先的に増幅するための最良の選択は、G-TミスマッチよりA-Cミスマッチをより不安定化するため、GではなくAで終わる上流プライマーをセンス鎖のおいて設計することである。プライマーの長さは、ノースウェスタン大学（Northwestern University）からのオリゴヌクレオチドプロパティーズカルキュレーター（Oligonucleotide Properties Calculator）（http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html）を使用して、各プライマーについて全Tmがおよそ65゜となるよう決定される。塩調整（Salt Adjusted）測定が、全ての場合に使用される。上流プライマーの一例は、以下の通りである。
センス鎖：
Figure 0004097662
（アステリスクはヌクレオチド937位をさす）
マッチング下流プライマーは、オリゴプライマーアナリシスソフトウェア（Oligo Primer Analysis Software）バージョン6.32（Molecular Biology Insights,Inc.）を使用して設計され得る。そのようなプライマーの一例を以下に示す。
アンチセンス鎖：
Figure 0004097662
「G」バリアントを優先的に増幅するための一つの選択は、C-Aミスマッチをより不安定化するため、TではなくCで終わる下流プライマーを、標的DNAのアンチセンス鎖において設計することである。ミスマッチの末端塩基をさらに不安定化するためには、ミスマッチ鋳型より完全マッチ鋳型の伸長において立体障害が大きくなるよう、かさ高い（bulky）基を付加するt-ブチル-ベンジル-dA又はt-ブチル-ベンジル-dCが、それぞれ、最後の塩基のため使用され得る。下流プライマーの一例は、以下の通りである。
アンチセンス鎖：
Figure 0004097662
（アステリスクはヌクレオチド937位をさす）
またオリゴ（Oligo）6.32を使用したマッチしている上流プライマーの一例を以下に示す。
センス鎖：
Figure 0004097662
増幅条件は、あるバリアントの増幅が他より有利となるよう可能な限りストリンジェントであるべきである。これは、一塩基対3'ミスマッチより完全3'マッチの増幅にとって有利となることを確実するための、サーマルサイクリング条件、特に、アニーリング／伸長温度の注意深い選択により達成され得る。プライマーTmは65℃付近に設計され、従って、58〜65℃のアニーリング温度が、目的のヌクレオチドバリアントにとって有利となる最良の温度を決定するため試験される。
COBAS TaqMan96装置において使用されるような典型的なサーマルサイクリング条件は、95℃20秒、その後、58〜65℃でのアニーリング／伸長40秒、計35サイクルの増幅である。増幅後、PCR産物は2.5％アガロースゲルでのゲル電気泳動によって可視化され得る。さらに、ABI PRISM 7700のような色素シグナルの増加を読み取ることができるサーマルサイクラーを使用したリアルタイムPCR検出のため、インターカレーティング色素サイバーグリーン（Sybr Green）が増幅中に0.2×の濃度で添加され得る。
典型的なPCRマスターミックスは、反応液100μl中の最終濃度で示された以下の成分からなる。
ZO5 ポリメラーゼ 20単位
トリシン、pH8.0 100mM
KOAc、pH7.5 125mM
グリセロール 9.0%
dATP 200μM
dUTP 200μM
dGTP 200μM
dCTP 200μM
プライマー1 25pmol
プライマー2 25pmol
UNG 1単位
5'ヌクレアーゼ反応
一塩基対ミスマッチは、5'ヌクレアーゼプローブ化学、及びミスマッチ鋳型より完全マッチ鋳型の切断にとって有利となるようなアニーリング／伸長温度の注意深い最適化を使用して、区別され得る。レポーター色素（例えば、FAM）及び消光色素（例えば、CY5）を含有している5'ヌクレアーゼプローブは、通常、プライマー伸長前のプローブの標的配列へのアニーリング及びその後のプローブの切断にとって有利となるよう、プライマーのTmよりおよそ10度高いTmを有するよう設計される。この切断によって、消光色素からレポーター色素が分離され、測定すべきレポーター色素からの色素放射が可能となる。PCRの繰り返しにおいて、これらの色素放射は、生成するアンプリコンの数が増加するにつれ増加し、サイクル数に対して蛍光の増加を示した増殖曲線としてグラフ化することができる。プローブと鋳型配列との間のミスマッチは、プローブの結合及びその後の切断を不安定化し得る。
「G」バリアントと「A」バリアントとを区別するための5'ヌクレアーゼプローブの一例を以下に示す。
アンチセンス鎖：
Figure 0004097662
5'ヌクレアーゼプローブは、10pmolの最終濃度で、前実施例に記載されたようにしてPCR反応ミックスへ添加される。このプローブは、およそ65℃のTmを有するよう設計されたプローブより先に結合するよう、およそ72℃のTmを有するよう設計される。このプローブ領域のための比較可能なプライマーはまた、オリゴ6.32ソフトウェアを使用して設計され、その例は以下に示される。
センス鎖プライマー：
Figure 0004097662
アンチセンス鎖プライマー：
Figure 0004097662
前実施例において記されたような類似のサーマルサイクリング条件が使用され得る。COBAS TaqMan96又はABI PRISM 7700のような、レポーター色素を励起し、その後の蛍光放射を測定し得るサーマルサイクラーが、使用され得る。
PCR後融解解析
一塩基対変異を区別するためのもう一つの方法は、変異部位の周辺の区域を増幅するPCRプライマーを設計し、PCR反応の後、目的の領域にアニーリングするよう設計された蛍光標識プローブを使用して融解曲線生成を実施することである。典型的には、融解曲線は、蛍光標識プローブの存在下での最終増幅サイクルの後、PCR増幅産物を95℃に加熱することにより変性させることにより生成させられる。次いで、相同アンプリコン領域へのプローブの迅速な再アニーリングにとって有利となるよう、温度が急速に40℃に冷却される。次いで、各温度工程において頻繁に蛍光を読み取みとりながら、温度が徐々に80℃まで上昇させられる。温度が、プローブがアンプリコンから解離する点に達した時点で、標識プローブの蛍光のシフトが起こり、この蛍光の変化が測定され得る。プローブのアンプリコンとの一塩基対ミスマッチによって、完全マッチの場合より早い温度で、プローブが解離するか又は「融解」除去され、それぞれの融解温度による二種類の差別化が可能となると思われる。5'ヌクレアーゼの例におけるPCRプライマー及びプローブアッセイ法が、融解曲線を生成させるために使用され得る。
さらに、ハイブリダイゼーションプローブ化学を利用したもう一つの型のPCRアッセイ法が、ディファレンシャルな融解曲線を生成させるために使用され得るが、この場合には、1個ではなく2個のプローブが使用される。「アンカー」プローブとして既知の第一のプローブは、第二の「センサー」プローブより高い温度のTmを有するよう設計される。アンカープローブは、FAMのような3'末端ドナー色素を含んで合成される。センサープローブは、LC640のようなアクセプター色素で5'末端標識される。PCRアニーリング中、2個のプローブは、ドナープローブの3'末端とアクセプタープローブの5'末端との間隔が1〜5ヌクレオチドとなるよう、目的の領域と結合するよう設計される。この工程において、蛍光エネルギーがFAM色素からLC640アクセプター色素へと転移し、LC640色素の放射が測定される。PCRの次の工程のため、温度は、PCR産物の伸長、並びにさらなるPCRの繰り返し及びその後の融解曲線の生成のためのプローブを保存するオリゴ−プローブ対の解離にとって有利となるよう増加させられる。三段階のPCR温度プロファイルが、この場合に使用され得る。
95℃での変性工程20秒
58℃でのアニーリング工程20秒
72℃での伸長工程40秒
計45サイクル
このPCRは、ライトサイクラー（LightCycler）2.0のような、FAM色素を励起しLC640色素の放射を測定し得る装置で実行されなければならない。
5'ヌクレアーゼの例に記載されたプライマーを使用して2個の異なるNS5Aバリアントを差別化するためのアンカー及びセンサーとして使用され得る2個のハイブリダイゼーションプローブの予言的（prophetic）な例は、以下の通りである。
アンカープローブ
Figure 0004097662
センサープローブ
Figure 0004097662
アンカープローブは62℃のTmを有するよう設計され、センサーは、アンプリコンに対する完全マッチセンサープローブのため、53℃のTmを有するよう設計された。一塩基対ミスマッチは、完全マッチより少なくとも4℃低いTmを与える可能性が最も高いと思われる。この例におけるアンカープローブは、センサープローブとの間隔が一塩基対である。
PCR配列決定
5'ヌクレアーゼの例に記載されたプライマー（配列番号：8及び配列番号：9）が、前記のPCR条件を使用して、PCR配列決定のため使用され得る。

Claims (19)

  1. HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、
    a）NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、及び
    b）937位のヌクレオチドがGであるか否かを決定し、その際、937位におけるGの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法。
  2. NS5A遺伝子の937位のヌクレオチドの決定が、ヒト患者が感染しているHCV株の型又は亜型の決定をさらに含む、請求項1記載の方法。
  3. 決定工程が、NS5A遺伝子の937位における一塩基置換を検出できるアッセイ法を実施することを含む、請求項1又は２記載の方法。
  4. アッセイ法又は決定工程が、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を配列決定することを含む、請求項1〜３のいずれか一項記載の方法。
  5. アッセイ法又は決定工程が、配列特異的増幅又はプライマー伸長アッセイ法を含む、請求項1〜３のいずれか一項記載の方法。
  6. アッセイ法又は決定工程が、5'ヌクレアーゼ反応アッセイ法を含む、請求項1〜３のいずれか一項記載の方法。
  7. アッセイ法又は決定工程が、PCR後融解解析アッセイ法を含む、請求項1〜３のいずれか一項記載の方法。
  8. HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、
    a）NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及び
    b）313位のアミノ酸がバリンであるか否かを決定し、その際、313位におけるバリンの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対する持続的なウイルス学的応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法。
  9. HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、
    a）NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリヌクレオチドを準備すること、及び
    b）937位のヌクレオチドがAであるか否かを決定し、その際、937位におけるAの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対するウイルス学的無応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法。
  10. NS5A遺伝子の937位のヌクレオチドの決定が、ヒト患者が感染しているHCV株の型又は亜型の決定をさらに含む、請求項９記載の方法。
  11. 決定工程が、NS5A遺伝子の937位における一塩基置換を検出できるアッセイ法を実施することを含む、請求項９記載の方法。
  12. アッセイ法又は決定工程が、NS5A遺伝子のヌクレオチド937位を含む部分を配列決定することを含む、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
  13. アッセイ法又は決定工程が、配列特異的増幅又はプライマー伸長アッセイ法を含む、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
  14. アッセイ法又は決定工程が、5'ヌクレアーゼ反応アッセイ法を含む、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
  15. アッセイ法又は決定工程が、PCR後融解解析アッセイ法を含む、請求項９〜１１のいずれか一項記載の方法。
  16. HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するための方法であって、
    a）NS5Aタンパク質のアミノ酸313位を含む部分を含むヒト患者由来のHCV-1aポリペプチドを準備すること、及び
    b）313位のアミノ酸がイソロイシンであるか否かを決定し、その際、313位におけるイソロイシンの存在を、該ヒト患者によるインターフェロン治療に対するウイルス学的無応答の可能性の増大の指標とすることを含む、方法。
  17. HCV-1aのNS5A遺伝子の937位における塩基置換を検出するために使用できるオリゴヌクレオチドを含むプローブであって、該オリゴヌクレオチドが14〜35ヌクレオチド長であり、かつ配列番号：１のヌクレオチド９０８位からヌクレオチド９５７位までの領域において連続した鎖と完全に相補的である、前記プローブ。
  18. 配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、配列番号：10、及び配列番号：11からなる群より選択される、請求項１７記載のプローブ。
  19. 請求項１７又は１８記載のプローブとポリメラーゼとを含む、HCV-1aに感染したヒト患者のインターフェロン治療に対する応答を予測するのに有用なキット。
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