CN107699636B - 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法 - Google Patents

用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法。该用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物，包括第一扩增引物对，所述第一扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。该用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物可以用于分析研究HCV基因的突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。使用该扩增引物进行PCR扩增等检测分析时，有效性高，检测成功率可达100％，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HCV RNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。

Description

用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及 检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法。
背景技术
丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染所致，主要由血液/体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。我国健康人群抗HCV阳性率为0.7％～3.1％，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50％～80％的HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20％～30％将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％发展成为肝细胞癌症。直接抗病毒药物(Direct anti-HCV agents，DAAs)主要为HCV病毒非结构蛋白(NS3,NS5A,NS5B)抑制剂，而HCV基因的某些突变会显著降低这种抑制作用。
发明内容
基于此，有必要提供一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法，以分析研究HCV基因的突变情况，为耐药性临床研究提供参考。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物，包括第一扩增引物对，所述第一扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在其中一个实施例中，所述用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物还包括第二扩增引物对，所述第二扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示。
在其中一个实施例中，所述用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物还包括第三扩增引物对和/或第四扩增引物对，其中，所述第三扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示，所述第四扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2所示。
具体的，该第一扩增引物对及第二扩增引物对的信息见下表。
其中Y表示C或T。
引物结合位点均以参考株AB047639.1(JFH-1)为准。扩增反应时首先以2a5A-F1/R1进行第一轮RT-PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序，未达到要求者以2a5A-F2/R2进行第二轮巢式PCR扩增，达到测序要求者以同样的引物进行测序；对于两轮PCR均失败者可对两组引物重新组合扩增，例如使用2a5A-F1/R2或使用2a5A-F2/R1进行第一轮RT-PCR扩增，如果需要还可以使用2a5A-F2/R2进行第二轮巢式PCR扩增。
一种HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，包括如下步骤：
获取待测HCV RNA样品；
使用上述扩增引物中的第一扩增引物对，或使用上述扩增引物中的第三扩增引物对或第四引物对对所述HCV RNA样品进行逆转录扩增；
对所述逆转录扩增的产物进行测序分析。
在其中一个实施例中，所述HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法还包括如下步骤：
对所述逆转录扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对不满足测序要求的逆转录扩增的产物使用如权利要求2所述的扩增引物中的第二扩增引物对进行第二轮PCR扩增，再对该第二轮PCR扩增的产物进行测序分析。
电泳检测的结果标准为在871bp或735bp位置处有清晰且单一的条带为满足测序要求的样本。测序后的序列峰图质量满足生物信息分析要求。
在其中一个实施例中，所述逆转录扩增的条件为：先50℃、30分钟；再94℃、3分钟；再依次94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒进行40个循环；最后在72℃延伸7分钟。
在其中一个实施例中，所述第二轮PCR扩增的条件为：先95℃、30秒；再依次95℃、15秒，60℃、15秒，72℃、30秒进行35个循环；最后在72℃延伸5分钟。
在其中一个实施例中，所述测序是Sanger测序，测序使用的引物对与扩增得到的测序对象所使用的扩增引物对相同。
优选的，在其中一个实施例中，所述HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，是从血浆样本中提取HCV RNA模板，一步法RT-PCR扩增HCV NS5A区片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性及产物大致浓度，满足测序要求时进行测序；未满足测序要求的样本以第一轮扩增产物为模板进行第二轮巢式PCR扩增。测序完成后，使用序列分析软件Sequencher将测序图谱与HCV 2a亚型参考株序列进行比对，进而确定分析位点的氨基酸变异情况。
上述扩增引物可应用在制备用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的试剂中。如一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的试剂盒，其含有上述任一实施例所述的扩增引物。
上述用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物可以用于辅助分析研究HCV基因的突变情况，进而为耐药性临床研究提供参考。使用该扩增引物进行PCR扩增等检测分析时，有效性高，检测成功率可达100％，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HCV RNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。
附图说明
图1为有效性实验时，对95例HCV分型结果为2a亚型的样本进行第一轮逆转录扩增后的电泳结果图；
图2为对图1中22例不满足测序要求的样本进行第二轮PCR扩增后的电泳结果图；
图3为图2中扩增失败的样本重新进行第一轮逆转录扩增后的电泳结果图；
图4为对图3中不满足测序要求的样本进行第二轮PCR扩增后的电泳结果图；
图5为重复性实验时，对47例HCV 2a亚型样本在不同PCR仪进行重复扩增后的电泳结果图；
图6为对图5中不满足测序要求的样本进行第二轮PCR扩增后的电泳结果图；
图7和8分别为13例不同浓度的HBV阳性样品的第一轮逆转录扩增和部分样品的第二轮PCR扩增的电泳结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一、样本及材料
1、样本
检测结果为HCV 2a亚型的血浆样本。
2、主要试剂
RNA提取试剂：MagPure Viral Nucleic Acid KF Kit(Magen)；
一步法反转录PCR试剂：HiScript II One Step RT-PCR Kit(Vazyme)；
巢式PCR试剂：2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)；
测序试剂：Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)。
3、主要仪器
4、对照试剂
阴性对照(Negative Control)：采用HCV阴性血清为阴性对照，与实验样本平行操作，每批次1个；
阳性对照(Postive Control)：采用HCV 2a亚型阳性样本为阳性对照，与实验样本平行操作，每批次1个。
二、检测流程
从血浆样本中提取HCV RNA模板，一步法RT-PCR扩增HCV NS5A区片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性及产物大致浓度，满足测序要求时利用ABI3730测序仪进行测序；未满足测序要求的样本以第一轮扩增产物为模板进行巢式PCR扩增。测序完成后，使用序列分析软件Sequencher将测序图谱与HCV 2a亚型参考株序列进行比对，进而确定分析位点的氨基酸变异情况。提取HCV RNA模板以及PCR扩增的具体步骤如下。
1.HCV RNA模板提取
1.1提取试剂
提取试剂为Magen产品(MagPure Viral Nucleic Acid KF Kit)：
1.2提取步骤
a.准备洗板和洗脱板：
按下表把相应的洗涤液(Buffer MW1和Buffer MW2)和洗脱液(Nuclease FreeWater)加到96孔板中，并标记好名称。把磁力外套放到洗板1中。
b.准备样品板：
样品板为深孔板，往深孔板中加入20μl Proteinase K、20μl MagBind Particles和2μl Carrier RNA；然后加入400μl Buffer MLB；最后加入200μl血清、血浆或其它液体样品。
c.上机运行：
打开Thermo KingFisher Flex，导入MagPure Viral-5412-KF程序。
启动程序，按仪器提示，把装好样品和试剂的96孔板放到仪器中。
约30min后程序结束。
取出洗脱板贴上封口膜，非立即检测时把提取的产物保存于-20℃。
2.PCR扩增
2.1一步法反转录PCR扩增试剂为Vazyme产品(HiScript II One Step RT-PCRKit)：
RNase free ddH2O 2×1ml；
2×One Step Mix 2×625μl；
One Step Enzyme Mix 1×125μl。
2.2巢式PCR试剂为Vazyme产品(2×Phanta Max Master Mix)：2×Phanta MaxMaster Mix(1×1ml)。
2.3引物序列
2.4反应体系
2.4.1第一轮RT-PCR扩增反应体系(30μl)
Rnase free ddH<sub>2</sub>0 2.3μl
2×One Step Mix 15μl
One Step Enzyme Mix 1.5μl
2a5A-F1(20μM) 0.6μl
2a5A-R1(20μM) 10.6μl
模板RNA 10μl
2.4.2第二轮巢式PCR扩增反应体系(30μl)
ddH<sub>2</sub>0 11.8μl
2×Phanta Max Master Mix 15μl
2a5A2-F2(20μM) 0.6μl
2a5A2-R2(20μM) 0.6μl
第一轮RT-PCR扩增的产物DNA 2μl
2.5扩增条件：
2.5.1第一轮RT-PCR扩增：
2.5.2第二轮巢式PCR扩增：
3.琼脂糖凝胶电泳检测
电泳检测结果标准为：在722bp/456bp处有清晰且单一的条带。
4.测序分析
测序结果分析标准为：cut off值设置为20％，仅判断大于占比20％碱基信息。
三、检测结果
1.有效性
有效性在本次验证实验中是指该反应体系对阳性样本的检测成功率。
请参图1至图4，本次验证共对95例HCV分型结果为2a亚型的样本进行检测，对结果进行统计分析显示，经过第一轮RT-PCR扩增，共有73例样本达到测序要求，对其余22例样本进行第二轮巢式PCR扩增后，有19例样本达到要求。对剩余的3例样本怀疑是引物结合区突变导致引物无法结合，但重新提取核酸并调整引物组合，经过2轮扩增后也均达到测序要求，因此，整体扩增成功率为100％(95/95)。
测序验证结果见下表：
注：数据以AB047639.1(JFH-1)基因序列为参考序列进行分析
2.再现重复性
再现重复性是指对相同样本在不同时间、不同人员或不同仪器条件下进行重复检测时得到相同结果的能力。在本次验证过程中主要研究不同PCR仪对实验的影响。
结果见图5和图6，对47例HCV 2a亚型样本在不同PCR仪(Biorad S1000型号的不同仪器，如金域自编JY100和JY101)进行重复扩增并进行电泳检测，通过对电泳图分析可以看出，该检测的重复性为100％(47/47)。
3.最低检测下限
最低检测下限是指该项目可以成功检测的样本的最低病毒载量。
请参见图7和图8以及下表的琼脂糖凝胶电泳结果分析，本次验证实验共对13例样本进行梯度稀释后进行检测，结果显示病毒载量在1.00E+04IU/ml以上的样本，通过一次/两次扩增即可满足测序要求，但1.00E+04IU/ml以下的样本只有部分能够在第二轮扩增后达到测序要求，因此，该项目的最低检测下限可认为至少是1.00E+04IU/ml。
琼脂糖凝胶电泳结果分析
由上述检测结果可知，使用该扩增引物进行PCR扩增等检测分析时，有效性高，检测成功率可达100％，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HCV RNA浓度的样品进行检测，灵敏度高。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 黑龙江金域医学检验所有限公司
<120> 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggtccaat ggatgaayag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaagcccaa cgcwraacga 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagaagactc cacaaytgga t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgtcagtgg tcagtcctgt t 21

Claims (8)

1.一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物，其特征在于，包括第一扩增引物对，所述第一扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示；
还包括第二扩增引物对，所述第二扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
还包括第三扩增引物对和/或第四扩增引物对，其中，所述第三扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4所示，所述第四扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2所示。
2.一种非疾病诊断和治疗目的的HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测HCV RNA样品；
使用如权利要求1所述的扩增引物中的第一扩增引物对，或第三扩增引物对或第四引物对对所述HCV RNA样品进行逆转录扩增；
对所述逆转录扩增的产物进行测序分析。
3.如权利要求2所述的非疾病诊断和治疗目的的HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，其特征在于，还包括如下步骤：
对所述逆转录扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对不满足测序要求的逆转录扩增的产物使用如权利要求1所述的扩增引物中的第二扩增引物对进行第二轮PCR扩增，再对该第二轮PCR扩增的产物进行测序分析。
4.如权利要求3所述的非疾病诊断和治疗目的的HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，其特征在于，所述逆转录扩增的条件为：先50℃、30分钟；再94℃、3分钟；再依次94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒进行40个循环；最后在72℃延伸7分钟。
5.如权利要求3所述的非疾病诊断和治疗目的的HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，其特征在于，所述第二轮PCR扩增的条件为：先95℃、30秒；再依次95℃、15秒，60℃、15秒，72℃、30秒进行35个循环；最后在72℃延伸5分钟。
6.如权利要求2～5中任一项所述的非疾病诊断和治疗目的的HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的检测方法，其特征在于，所述测序是Sanger测序，测序使用的引物对与扩增得到的测序对象所使用的扩增引物对相同。
7.如权利要求1所述的扩增引物在制备用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的试剂中的应用。
8.一种用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的扩增引物。
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