CN106222306A - 一种hcv病毒ns5a蛋白编码序列突变检测试剂盒 - Google Patents

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冯宇鹏
郭晓磊
曾征宇
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明提供了一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，包含一组RT‑PCR引物组1和一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列互补编码的扩增引物组2，还包含一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列编码的扩增引物组3，所述扩增引物组3的编码序列包含在按照引物组2扩增的基因片段内。本发明利用多组引物组扩增出符合测序要求的高质量基因片段，极大的提高了检测的敏感性和特异性，降低了对HCV病毒核酸样品制备的要求，具备检测灵敏度高，结果可靠的优点。

Description

一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒
背景技术
HCV基因组可分为3个区域，即5’非编码区(5’UTR)、编码区(ORF)、3’非编码区(3’UTR)。5’UTR为高度保守区，是病毒翻译的起始位点，在HCV复制过程中有非常重要的作用。开放读码框架(ORF)包括结构蛋白区C、E1、E2和非结构蛋白区P7、NS2-NS5。包膜区(E1、E2)和核心区(C)编码病毒颗粒，非结构蛋白区在病毒复制和病毒蛋白合成中起重要作用。3’UTR为加尾结构。其中NS3/4A、NS5A和NS5B是直接抗病毒药物(DAAs)的作用靶点。在对HCV1b型基因序列的研究中,许多报道发现HCV NS5A蛋白多个区域的氨基酸(amino acid,aa)序列突变与IFN、IFN/RBV的疗效有关,但是NS5A蛋白在HCV病毒不同基因型中存在序列差异，且容易突变。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对HCV病毒NS5A蛋白易突变的问题，提供一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：提供一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，包含一组RT-PCR引物组1和一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列互补编码的扩增引物组2，还包含一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列编码的扩增引物组3，所述扩增引物组3的编码序列包含在按照引物组2扩增的基因片段内。利用多组引物组扩增出符合测序要求的高质量基因片段。
本发明具备的有益效果为：极大的提高了检测的敏感性和特异性，降低了对HCV病毒样品制备的要求，检测灵敏度高，结果可靠。
附图说明
图1 RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图1
图2 RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图2
图3 RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图3
图4二次PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳
具体实施方式
设计方案为：选取203例HCV1b型病毒样本，处理得到病毒的RNA核酸样品，利用引物组1一步法RT-PCR法扩增出NS5A区片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性及产物大致浓度，满足ABI3730测序仪测序要求时利用ABI3730测序仪进行测序；未满足测序要求的样本以第一轮扩增产物为模板利用引物组2进行进一步的PCR扩增，对不满足测序要求的样品进一步利用引物组3进行扩增。对满足测序要求的扩增产物测序完成后，使用序列分析软件Sequencher将测序图谱与HCV参考株序列进行比对，进而确定分析位点的氨基酸变异情况。本实施例所选用的设备仪器包括：Biorad S1000PCR仪、Biorad PAC300电泳仪、Biorad凝胶成像系统、ABI3730测序仪。本实施例使用的引物序列为：
PCR试剂为选取Vazyme产品(HiScript II One Step RT-PCR Kit)，包括：
名称 含量
RNase free ddH2O 2×1ml
2×One Step Mix 2×625μl
One Step Enzyme Mix 1×125μl
第一轮RT-PCR反应体系(30μl)为：
Rnase free ddH20 1.1μl
2×One Step Mix 15μl
One Step Enzyme Mix 1.5μl
NS5A-F(10μM) 1.2μl
NS5A-R(10μM) 1.2μl
模板RNA 10μl
RT-PCR扩增条件为：
第二或三轮PCR反应体系(30μl)为：
ddH20 10.6μl
2×Phanta Max Master Mix 15μl
NS5A2-F(10μM) 1.2μl
NS5A2-R(10μM) 1.2μl
第一轮扩增产物DNA 2μl
第二或三轮PCR扩增条件为：
第1轮RT-PCR结果如图1-3所示，第二轮PCR结果如图4所示。对凝聚电
泳的分析如下：
上述203例检测结果进行统计分析显示，第一轮RT-PCR检测成功率为92.10％(187/203)，对未达到测序要求的样本进行第二轮巢式PCR后成功率为81.25％(13/16)；两轮PCR扩增后总体成功率为98.52％(200/203)。本次验证过程中共有三例样本(T1012、T1015、T386)检测失败，对这三例样本重新进行了测序法分型检测，检测结果显示T1012为6n亚型，T1015、T386为6型，因此本次验证实验失败样本的原因为HCV基因型别判定错误造成。除去三例型别不符样本外，第一轮RT-PCR检测成功率为93.5％(187/200)，对未达到测序要求的样本进行第二轮PCR后成功率为100％(13/13)；两轮PCR扩增后总体成功率为100％。
随机选择了47例第一轮扩增成功的样本以及全部13例第二轮扩增成功样本，共计60例样本进行测序。
备注：1.突变型Cutoff：20％；2.*代表首次测序正反向序列93位点结果不一致。
从上述结果中可以看出，60例样本中31位氨基酸突变仅发生两例(3.33％)，93位氨基酸有5例样本发生突变(8.33％)；但还有7例样本出现93位点正反向测序结果不一致的情况，主要表现为正向测序为野生型，而反向测序时则出现了突变型与野生型共存。

Claims (5)

1.一种HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，其特征在于：包含一组RT-PCR引物组1和一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列互补编码的扩增引物组2。
2.根据权利要求1所述的HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，其特征在于：还包含一组设置于编码NS5A蛋白序列两端的，按照HCV基因序列编码的扩增引物组3，所述扩增引物组3的编码序列包含在按照引物组2扩增的基因片段内。
3.根据权利要求1或2所述的HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒在检测HCV病毒NS5A位点中的应用。
4.根据权利要求1所述的HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，其特征在于：使用该试剂盒在对含HCV病毒核酸样品进行RT-PCR的反应体系为：
5.根据权利要求1所述的HCV病毒NS5A蛋白编码序列突变检测试剂盒，其特征在于：RT-PCR扩增条件为：
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107699636A (zh) * 2017-11-10 2018-02-16 黑龙江金域医学检验所有限公司 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250885A (zh) * 2011-07-21 2011-11-23 中山大学附属第三医院 一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法
CN102341506A (zh) * 2009-01-21 2012-02-01 沃泰克斯药物股份有限公司 用于扩增丙型肝炎病毒核酸的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102341506A (zh) * 2009-01-21 2012-02-01 沃泰克斯药物股份有限公司 用于扩增丙型肝炎病毒核酸的方法
CN102250885A (zh) * 2011-07-21 2011-11-23 中山大学附属第三医院 一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAOLUCCI S.等: "Naturally occurring resistance mutations to inhibitors of HCV NS5A region and NS5B polymerase in DAA treatment-naive patients", 《VIROLOGY JOURNAL》 *
付慧等: "丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析", 《陕西医学杂志》 *
冷彦等: "克隆的丙型肝炎病毒NS2基因中发现数个N端终止突变序列", 《同济医科大学学报》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107699636A (zh) * 2017-11-10 2018-02-16 黑龙江金域医学检验所有限公司 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法

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