CN107868848B - Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用 - Google Patents

Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107868848B
CN107868848B CN201711105552.9A CN201711105552A CN107868848B CN 107868848 B CN107868848 B CN 107868848B CN 201711105552 A CN201711105552 A CN 201711105552A CN 107868848 B CN107868848 B CN 107868848B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
hbv
pcr amplification
drug resistant
nucleoside analog
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711105552.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107868848A (zh
Inventor
郭晓磊
冯宇鹏
曾征宇
徐艳艳
张鹏博
柳盛伟
郝必喜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Heilongjiang Jinyu medical laboratory Co., Ltd
Original Assignee
Heilongjiang Jinyu Medical Laboratory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Heilongjiang Jinyu Medical Laboratory Ltd filed Critical Heilongjiang Jinyu Medical Laboratory Ltd
Priority to CN201711105552.9A priority Critical patent/CN107868848B/zh
Publication of CN107868848A publication Critical patent/CN107868848A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107868848B publication Critical patent/CN107868848B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和应用。该HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统包括第一PCR扩增引物对，所述第一PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。该HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和相关应用，可用于检测HBV基因型，尤其是核苷类似物耐药突变位点，从而有利于判断HBV预后及治疗效果，为慢性乙肝患者制定个体化的抗病毒治疗方案提供帮助，如辅助临床用药，使临床用药更加合理有效。上述PCR引物系统扩增有效性高，可达97％以上，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HBV核酸浓度的样品进行检测。

Description

HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和应用。
背景技术
HBV是一种经血液传播的嗜肝DNA病毒，根据HBV全基因核苷酸序列异源性≥8％或者S基因区核苷酸序列异源性≥4％，可将不同病毒株分为不同的基因型。迄今为止，HBV可以分为8个基因型，即A、B、C、D、E、F、G和H型。我国的HBV基因型主要有B型和C型，此外还有少数的A型、D型和C/D重组型。
HBV是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌的重要因素。抗病毒治疗是最常见的乙肝治疗方式。公认的HBV治疗用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷(酸)类药物两类。核苷(酸)类药物因口服方便、毒副作用少、病毒载量下降较快而受到广泛关注。但长期服用核苷(酸)类药物易产生耐药，如随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量将下降，而具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，得以不断复制、增加，使得肝炎复发。
HBV基因型与感染后临床表现、预后及治疗应答均有密切联系。HBV不同的基因型在针对慢性乙型肝炎患者的抗病毒治疗疗效上存在差异。HBV A型对干扰素治疗的应答率高于D型，B型高于C型，而A和D型又高于B和C型；HBV B型在用拉米夫定治疗停药后反跳较低，而HBV C型则反跳较高。
因此通过检测HBV基因型，尤其是HBV核苷类似物耐药突变位点的检测，有助于判断疾病预后、治疗效果、制定个体化抗病毒治疗方案，并有利于指导用药，使得临床用药更加合理有效。
发明内容
基于此，有必要提供一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下。
一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统，包括第一PCR扩增引物对，所述第一PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。
在其中一个实施例中，所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统还包括第二PCR扩增引物对，所述第二PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
上述HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统可应用在制备检测HBV核苷类似物耐药突变位点的试剂中。
一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒，含有上述任一实施例所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统。
在其中一个实施例中，所述HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒还含有阳性对照试剂和/或阴性对照试剂，所述阳性对照试剂呈HBV阳性，所述阴性对照试剂呈HBV阴性。
在其中一个实施例中，所述HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒还含有HBV核酸提取试剂、PCR扩增试剂以及测序试剂中的至少一种试剂。
一种HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法，包括如下步骤：
获取待测HBV核酸样品；
使用上述PCR引物系统中的第一PCR扩增引物对对所述HBV核酸样品进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行测序分析。
在其中一个实施例中，所述HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法还包括以下步骤：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对于未达到测序要求的PCR扩增产物以上述PCR引物系统中的第二PCR扩增引物对进行第二轮的PCR扩增，再对第二轮的PCR扩增产物进行测序分析。
在其中一个实施例中，PCR扩增的条件统一是：先95℃、30秒；再95℃、15秒，58℃、15秒，72℃、30秒共处理40个循环；最后72℃延伸5分钟。
在其中一个实施例中，所述测序是Sanger测序，测序使用的引物对与扩增得到的测序对象所使用的PCR扩增引物对相同。
上述HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和应用，可用于检测HBV基因型，尤其是核苷类似物耐药突变位点，从而有利于辅助判断HBV预后及治疗效果，为慢性乙肝患者制定个体化的抗病毒治疗方案提供帮助，如辅助临床用药，使临床用药更加合理有效。上述PCR引物系统扩增的有效性高，可达97％以上，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HBV核酸浓度的样品进行检测，灵敏度高。
附图说明
图1为71例HBV核酸样品及阴性对照样品的第一轮PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2为对47例HBV阳性样品在不同PCR仪进行重复扩增并进行电泳检测的结果；
图3a和3b分别为6例不同浓度的HBV阳性样品的第一轮PCR扩增和部分样品的第二轮PCR扩增的结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统，其包括第一PCR扩增引物对。该第一PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。进一步，在一个实施例中，该HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统还包括第二PCR扩增引物对，第二PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示。具体的，第一扩增引物对和第二扩增引物对的信息如下表1所示。
表1
其中Y表示C或T。
引物结合位点均以HBV参考株AB014381为准；PCR扩增反应时首先以HBV-F1/R1进行第一轮RT-PCR扩增，达到测序要求者以同样的扩增引物对进行测序，未达到要求者以HBV-F2/R2进行第二轮巢式PCR扩增，达到测序要求者以同样的扩增引物对进行测序。
上述HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统可应用在制备检测HBV核苷类似物耐药突变位点的试剂中，如一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒，含有上述任一实施例的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统。进一步，在一个实施例中，该HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒还含有阳性对照试剂和/或阴性对照试剂，其中，阳性对照试剂呈HBV阳性，阴性对照试剂呈HBV阴性。更进一步，在一个实施例中，该HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒还含有HBV核酸提取试剂、PCR扩增试剂以及测序试剂中的至少一种试剂。
本实施方式还提供了一种HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法，其包括如下步骤：
步骤一：获取待测HBV核酸样品。
HBV核酸样品可以提取自HBV阳性患者的血清或者血浆样本。
步骤二：使用上述PCR引物系统中的第一PCR扩增引物对对HBV核酸样品进行PCR扩增。
在一个实施例中，HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法还包括对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测的步骤，对于未达到测序要求的PCR扩增产物以上述PCR引物系统中的第二PCR扩增引物对进行第二轮的PCR扩增，再对第二轮的PCR扩增产物进行测序分析。电泳检测的结果标准为在871bp或735bp位置处有清晰且单一的条带为满足测序要求的样本。测序后的序列峰图质量满足生物信息分析要求。
在一个实施例中，PCR扩增的条件是：先95℃、30秒；再95℃、15秒，58℃、15秒，72℃、30秒共处理40个循环；最后72℃延伸5分钟。
步骤三：对PCR扩增产物进行测序分析。
在一个实施例中，测序是Sanger测序，测序使用的引物对与相应的PCR扩增引物对相同，即使用第一PCR扩增引物对进行PCR扩增得到的PCR扩增产物测序时，测序引物对使用第一PCR扩增引物对；使用第而PCR扩增引物对对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增得到的第二轮PCR扩增产物测序时，测序引物对使用第二PCR扩增引物对。
优选的，一本实施方式的检测方法是：通过从血清或血浆样本中提取HBVDNA模板，从中PCR扩增出HBV逆转录酶区片段，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性及产物大致浓度，满足测序要求时进行测序；未满足测序要求的样本以第一轮扩增产物为模板进行第二轮的巢式PCR扩增，然后进入测序流程。测序完成后，可使用序列分析软件Sequencher将测序图谱与HBV参考株序列进行比对，进而确定待分析位点的氨基酸变异情况，同时还可以使用遗传分析软件MEGA构建进化树，确定HBV核苷类似物耐药突变位点。
本实施方式的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和相关应用，可用于检测HBV基因型，尤其是核苷类似物耐药突变位点，从而有利于判断HBV预后及治疗效果，为慢性乙肝患者制定个体化的抗病毒治疗方案提供帮助，如在用药过程中进行检测可以判断病毒的耐药性，从而选择最合适的药物进行治疗，辅助临床用药，使临床用药更加合理有效。上述PCR引物系统扩增的有效性高，可达97％以上，并且再现重复性好，尤其是最低检出限低，有利于对低HBV核酸浓度的样品进行检测，灵敏度高。
以下为具体实施例部分。
1.样本来源
慢性乙肝患者的血清或血浆样本。
2.主要试剂
提取试剂：QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen)；
PCR试剂：2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)；
测序试剂：Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit(AppliedBiosystems)。
3.主要仪器，见下表2。
表2
序号 仪器名称 用途 品牌
1 Biorad S1000PCR仪 PCR扩增 BioRad
3 Biorad PAC300电泳仪 琼脂糖凝胶电泳 BioRad
4 Biorad凝胶成像系统 凝胶成像 BioRad
5 ABI3730xl测序仪 Sanger测序 ABI
3.检测流程
从血清或血浆样本中提取HBV DNA模板，PCR扩增HBV逆转录酶区片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段的正确性及产物大致浓度，满足测序要求时利用ABI3730xl测序仪进行测序；未满足测序要求的样本以第一轮扩增产物为模板进行第二轮的巢式PCR扩增，然后进入测序流程。测序完成后，使用序列分析软件Sequencher将测序图谱与HBV参考株序列进行比对，进而确定待分析位点的氨基酸变异情况，同时使用遗传分析软件MEGA构建进化树，确定HBV核苷类似物耐药突变位点。
其中HBV DNA提取以及PCR扩增程序具体如下：
3.1HBV DNA提取
提取试剂为Qiagen产品(QIAamp MinElute Virus Spin Kit)其包括QIAGENProtease、Protease Resuspension Buffer、Buffer AL、Buffer AW1、Buffer AW2、Carrier RNA、Buffer AVE以及无水乙醇。
3.1.1试剂准备
所有离心步骤在室温下进行(15-25℃)，平衡样本温度到室温(15-25℃)。
Buffer AW1和AW2准备：19ml AW1加25ml无水乙醇，13ml AW2加入30ml无水乙醇，颠倒混匀；准备好的AW1和AW2用前需摇动混匀。
如果Buffer AL有结晶，将其于56℃溶解。
QIAGEN Protease准备：溶解前离心，将QIAGEN Protease溶解于1.4mlProteaseResuspension Buffer，溶解后充分振荡混匀，储存于2-8℃。
Carrier RNA准备：溶解前离心，吸取310μl Buffer AVE于310ug Carrier RNA管中，溶解后充分振荡混匀，制成Carrier RNA-AVE溶液，储存于2-8℃。
3.1.2核酸提取步骤：
吸取25μl QIAGEN Protease溶液加到1.5ml离心管的底部。
吸取200μl血清或血浆样本到离心管中，加200μl缓冲液Buffer AL到样本中，勿振荡。
吸取5.64μl Carrier RNA-AVE溶液到上一步骤的离心管中，然后旋转振荡15s混匀。
56℃孵育15min，短时离心1.5ml离心管，去除管盖内壁的液滴。
向离心管中加入250μl无水乙醇，振荡器振荡15s；室温静置5分钟；短时离心以去除离心管内壁液滴。
小心转移上一步混匀后的液体到吸附柱(置于2ml收集管中)，盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min；离心完成后将吸附柱置于新的2ml收集管中，并将含过滤液的收集管丢弃。
小心打开管盖，加入500μl AW1；盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min；离心完成后将吸附柱置于新的2ml收集管中，并将含过滤液的收集管丢弃。
小心打开管盖，加入500μl AW2；盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min；离心完成后将吸附柱置于新的2ml收集管中，并将含过滤液的收集管丢弃。
小心打开管盖，加入500μl无水乙醇；盖上管盖，6000×g(8000rpm)离心1min；离心完成后将含过滤液的收集管丢弃。
将吸附柱置于新的2ml收集管中，20000×g(14000rpm)离心3min。可打开管盖，置于56℃3min，使残留的乙醇挥发干净。
将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，将含过滤液的收集管丢弃。
小心打开吸附柱管盖，加入50μl Buffer AVE；盖上管盖，室温孵育1min，最大转速离心1min，将吸附柱丢弃，盖上离心管盖，即得到HBV核酸样品。
3.2PCR扩增
3.2.1引物序列，如上表1所示。
3.2.2反应体系
第一轮PCR扩增反应体系(30μl)，见下表3。
表3
ddH<sub>2</sub>0 3.8μl
2×Phanta Max Master Mix 15μl
HBV-F1(20μM) 0.6μl
HBV-R1(20μM) 0.6μl
模板DNA 10μl
第二轮巢式PCR扩增反应体系(30μl)，见下表4。
表4
ddH<sub>2</sub>0 11.8μl
2×Phanta Max Master Mix 15μl
HBV-F2(20μM) 0.6μl
HBV-R2(20μM) 0.6μl
第一轮扩增产物DNA 2μl
3.2.3扩增条件，两轮PCR扩增条件统一，见下表5。
表5
3.3质控品
阴性对照(Negative Control)：采用HBV阴性样本为阴性对照，与实验样本平行操作，每批次1个；
阳性对照(Postive Control)：采用HBV阳性样本为阳性对照，与实验样本平行操作，每批次1个。
3.4电泳检测分析标准
电泳检测结果标准为：在871bp/735bp处有清晰单一条带；测序后的序列峰图质量满足生物信息分析要求。
4实验结果
4.1有效性实验
有效性在本次验证实验中是指该反应体系对HBV阳性样本的检测成功率。
请参图1，本次验证共对71例HBV阳性样本进行检测，对结果进行统计分析显示，经过第一轮PCR扩增，共有72例样本达到测序要求，整体扩增成功率为97.3％(72/74)。经过分析，两例失败的样本可能是由于靶序列的引物结合区突变导致。
4.2再现重复性实验
再现重复性是指对相同样本在不同时间、不同人员或不同仪器条件下进行重复检测时得到相同结果的能力。在本次验证过程中主要研究不同PCR仪(Biorad S1000型号的不同仪器，如金域自编JY100和JY101)对实验的影响。
请参图2，对47例HBV阳性样本在不同PCR仪进行检测，通过对电泳图及测序结果分析可以看出，该检测的再现重复性为100％(47/47)。
测序结果见下表6。
表6
从上表6中可以看出，不同PCR仪扩增的测序结果没有影响，该项目的再现重复性为100％(47/47)。
4.3最低检出限实验
最低检出限是指该项目可以成功检测的样本的最低病毒载量。
请参图3a、图3b和下表7，本次验证实验共对6例样本进行梯度稀释后进行检测，结果显示病毒载量在1.00E+02IU/ml以上的样本，通过一轮/两轮扩增即可满足测序要求，但1.00E+02IU/ml以下的样本只有部分能够在第二轮扩增后达到测序要求，因此，该项目的最低检出限至少可确定为1.00E+02IU/ml。
表7
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 黑龙江金域医学检验所有限公司
<120> HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统、方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggacccctgc tcgtgttac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcaggat ahccacattg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcgtggtg gacttctctc a 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actttccaat caataggyc 19

Claims (8)

1.一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统，其特征在于，包括第一PCR扩增引物对，所述第一PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
还包括第二PCR扩增引物对，所述第二PCR扩增引物对中上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统在制备检测HBV核苷类似物耐药突变位点的试剂中的应用。
3.一种HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的PCR引物系统。
4.如权利要求3所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒，其特征在于，还含有阳性对照试剂和/或阴性对照试剂，所述阳性对照试剂呈HBV阳性，所述阴性对照试剂呈HBV阴性。
5.如权利要求3所述的HBV核苷类似物耐药突变位点检测用的试剂盒，其特征在于，还含有HBV核酸提取试剂、PCR扩增试剂以及测序试剂中的至少一种试剂。
6.一种HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测HBV核酸样品；
使用如权利要求1所述的PCR引物系统中的第一PCR扩增引物对对所述HBV核酸样品进行PCR扩增；
对PCR扩增产物进行测序分析；
此外，还包括以下步骤：对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对于未达到测序要求的PCR扩增产物以权利要求1所述的PCR引物系统中的第二PCR扩增引物对进行第二轮的PCR扩增，再对第二轮的PCR扩增产物进行测序分析。
7.如权利要求6所述的HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件统一是：先95℃、30秒；再95℃、15秒，58℃、15秒，72℃、30秒共处理40个循环；最后72℃延伸5分钟。
8.如权利要求6所述的HBV核苷类似物耐药突变位点的检测方法，其特征在于，所述测序是Sanger测序，测序使用的引物对与扩增得到的测序对象所使用的PCR扩增引物对相同。
CN201711105552.9A 2017-11-10 2017-11-10 Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用 Active CN107868848B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711105552.9A CN107868848B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711105552.9A CN107868848B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107868848A CN107868848A (zh) 2018-04-03
CN107868848B true CN107868848B (zh) 2019-03-01

Family

ID=61753760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711105552.9A Active CN107868848B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107868848B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113549707A (zh) * 2020-04-24 2021-10-26 利多(香港)有限公司 用于hbv基因型检测的方法、寡核苷酸和试剂盒
CN116732243A (zh) * 2023-04-04 2023-09-12 赛立安生物技术(广州)有限公司 一种用于检测hbv前s/s区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒
CN116479182B (zh) * 2023-05-05 2024-01-30 赛立安生物技术(广州)有限公司 一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒
CN117965814B (zh) * 2024-04-02 2024-06-25 广东凯普生物科技股份有限公司 一种乙肝病毒基因耐药突变位点的单管巢氏pcr扩增引物及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101565756B (zh) * 2008-04-25 2013-07-10 中山大学达安基因股份有限公司 一种乙型肝炎病毒核苷类似物耐药相关突变检测试剂盒
CN101545013B (zh) * 2009-03-10 2012-05-09 上海翼和应用生物技术有限公司 一种乙型肝炎病毒多耐药基因位点分型检测试剂盒
CN106367528A (zh) * 2016-08-26 2017-02-01 厦门大学 一种乙型肝炎病毒耐药突变的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107868848A (zh) 2018-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107868848B (zh) Hbv核苷类似物耐药突变位点检测用的pcr引物系统、方法和应用
Wang et al. Hepatitis C virus transmission bottlenecks analyzed by deep sequencing
Josefsson et al. Hematopoietic precursor cells isolated from patients on long-term suppressive HIV therapy did not contain HIV-1 DNA
Rotbart et al. Factors affecting the detection of enteroviruses in cerebrospinal fluid with coxsackievirus B3 and poliovirus 1 cDNA probes
Li et al. From orphan virus to pathogen: the path to the clinical lab
CN105907891A (zh) 检测乙型肝炎患者血液中HBV PgRNA 的方法、试剂盒及其应用
Pasquier et al. Molecular evidence for mother-to-child transmission of multiple variants by analysis of RNA and DNA sequences of human immunodeficiency virus type 1
Nelson et al. Patterns of changes in human immunodeficiency virus type 1 V3 sequence populations late in infection
CN109182600B (zh) 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒
CN109517927A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
Wilson et al. Dynamics of SEN virus infection among injection drug users
CN107699636B (zh) 用于检测HCV 2a亚型NS5A耐药突变基因的扩增引物、应用及检测方法
Gan et al. The relationship between serum exosome HBV-miR-3 and current virological markers and its dynamics in chronic hepatitis B patients on antiviral treatment
Zhang et al. Early infant human immunodeficiency virus type 1 detection suitable for resource-limited settings with multiple circulating subtypes by use of nested three-monoplex DNA PCR and dried blood spots
CN109439800B (zh) 检测hiv-1基因pr区和rt区基因突变的试剂盒及方法
Coller et al. Chronic human Pegivirus 2 without Hepatitis C virus co-infection
del Pino et al. Molecular epidemiology and putative origin of hepatitis C virus in random volunteers from Argentina
Junqueira et al. New genomes from the Congo Basin expand history of CRF01_AE origin and dissemination
Knapp et al. In vitro selection of clinically relevant bevirimat resistance mutations revealed by “deep” sequencing of serially passaged, quasispecies-containing recombinant HIV-1
CN107674910B (zh) 一种检测和评价抗hbv药物活性的方法及试剂盒
Qi et al. Molecular evolutionary characteristics of OBI virus S gene among the adolescent population in rural and pastoral areas of Xinjiang Province
Kim et al. Efficacy of antiviral therapy and host–virus interactions visualised using serial liver sampling with fine-needle aspirates
Mane et al. Phylogenetic analysis of spread of hepatitis C virus identified during HIV outbreak investigation, Unnao, India
CN106929609A (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的pcr检测试剂盒及其专用引物
Olusola et al. Profiles of mutations in hepatitis B virus surface and polymerase genes isolated from treatment-naïve Nigerians infected with genotype E

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 150000 Heilongjiang city of Harbin province science and technology innovation accelerator innovation city square enterprises in Harbin high tech Industrial Development Zone No. 10 Ju Bao Road No. 508 3 unit 1-4

Patentee after: Heilongjiang Jinyu medical laboratory Co., Ltd

Address before: 150000 Heilongjiang city of Harbin province science and technology innovation accelerator innovation city square enterprises in Harbin high tech Industrial Development Zone No. 10 Ju Bao Road No. 508 3 unit 1-4

Patentee before: HEILONGJIANG KINGMED MEDICAL LABORATORY Co.,Ltd.