CN107674910B

CN107674910B - 一种检测和评价抗hbv药物活性的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN107674910B
Application number: CN201710863254.XA
Authority: CN
Inventors: 陈广磊; 刘明坤; 叶锋
Original assignee: Beijing Genomeprecision Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Genomeprecision Technology Co ltd
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2020-06-26
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: CN107674910A

Abstract

本发明涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。所述方法包括如下步骤：S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。所述试剂盒中含有上游引物、下游引物和荧光标记探针以及逆转录引物，其序列分别为序列表序列1—4序列。本发明具有检测灵敏度高、敏感，检测过程简便、周期短的优点。

Description

一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒。

背景技术

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是由乙型肝炎病毒HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒科，正嗜肝DNA病毒属，基因组长约3.2kb，是一种部分双链环状DNA。在HBV感染者的血液中，电镜下可以同时观察到三种不同的病毒颗粒：包括直径为42nm的大球形颗粒，为完整的病毒颗粒，具有传染性，也称为Dane颗粒；还可以见到直径22nm的小球形颗粒和管形颗粒。小球形颗粒和管形颗粒为乙型肝炎表面抗原，没有核酸，无传染性。

乙型肝炎病毒HBV外面有一层包膜，上面有乙肝表面抗原，包膜里面是病毒的核心颗粒，其内为乙肝的核酸和聚合酶。HBV的核酸为部分双链的DNA，又称为环状松弛DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，其基因组编码HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶和HBx蛋白。HBV含4个部分重叠的开放读码框(ORF)，即：前S/S区、前C/C区、P区和X区。HBV编码四种不同长度的mRNA，分别长3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb。

根据HBV全基因序列差异≥8％或S区基因序列差异≥4％，HBV可分为不同的基因型，各基因型又可分为不同亚型。目前，HBV至少有9个基因型(A～I)，我国以B型和C型为主。HBV基因型与疾病进展和干扰素治疗应答有关，与C基因型感染者相比，B基因型感染者较少进展为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HBeAg阳性患者对干扰素治疗的应答率，B基因型高于C基因型，A基因型高于D基因型。

当乙型肝炎病毒HBV进入人体后，有感染性的HBV病毒颗粒顺着人体的血液循环不停的前进。乙型肝炎病毒HBV属于嗜肝DNA病毒，对肝脏细胞具有特异性的感染力。因此，当HBV顺着血液循环到达肝脏时，HBV便会进入肝脏细胞。近来研究发现，肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸-协同转运蛋白(NTCP)是HBV感染所需的细胞受体。首先，HBV特异性的与肝脏细胞上的NTCP受体结合从而吸附到肝脏细胞上，脱掉最外面的包膜，HBV病毒的核心颗粒核衣壳或者称作衣壳体进入肝脏细胞的包浆之中。之后核心颗粒在包浆中释放出其内的HBVDNA，即rcDNA，rcDNA进入细胞核，形成共价闭合环状DNA(covalentlt closed circularDNA，cccDNA)，以cccDNA为模板，转录形成前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)和其它mRNA，pgRNA在逆转录酶的作用下形成rcDNA。一方面，rcDNA与相关mRNA表达的蛋白组装形成HBV病毒颗粒，覆盖包膜后释放进入血液中；另一方面，rcDNA会重新进入细胞核内，形成新的cccDNA。这就形成了一个“cccDNA池”，由于“cccDNA池”的存在就使得细胞一直处于被感染状态。

对于慢性乙型肝炎患者，现在公认的最基础的治疗是抗病毒治疗，包括干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NA)。干扰素包括普通干扰素和聚乙二醇干扰素，也可称为短效干扰素和长效干扰素；核苷(酸)类似物现在国内批准的药物有5种，分别是拉米夫定(简称M或LAM)、阿德福韦(ADV)、替比夫定(LdT)、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF)。M等核苷(酸)类似物的主要的作用位点为HBV的逆转录酶。

文献：一种检测和评价抗病毒感染活性的方法(CN103468826B)，利用沉降性病毒复合物技术，建立了一种检测和评估分子抗病毒能力的新方法。该方法是通过检测受试分子在血清中诱导产生沉降性病原体复合物的能力，检测分子的抗病毒和抗感染能力；所述的病原体是病毒。利用该方法可以快速检测抗体和其它抗感染药物清除病毒和控制病毒感染的能力。本方法操作过程简单，结果重复性好，是对现有抗病毒药物功能性检测和评估方法的补充，该方法的建立为目前还没有有效的细胞和动物感染模型病毒的药物研发，提供了一种新的选择。该发明还涉及抗病毒感染活性的检测试剂、检测过程中出现的沉降性病原体复合物和上述检测方法的应用。

文献：稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法(CN103266133B)公开了稳定表达拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒的细胞株的构建方法，通过细胞分子生物学技术使HBV全基因整合到人类肝癌细胞系Hep G2细胞基因组中，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。该发明所构建的细胞株能够支持HBV DNA的高水平复制及抗原的稳定表达，对拉米夫定具有高度耐药性，适用于HBV生物学特性、耐药机理及新型抗病毒药物的体外筛选研究。

现有技术筛选抗HBV药物相对比较复杂，检测手段有病历组织切片染色法、电镜法、免疫检测法、DNA检测法等，上述方法各有优点，在不同时间段以不同方式检测药物治疗乙肝的情况，同时也检测肝脏的变化，特别是HBV DNA的检测，从分子水平去监控疾病的治疗程度，但是其检测灵敏度不能完全满足临床需求，甚至不能更精准的检测是否可以停药以及判断治疗进展情况。因此，为了克服上述技术缺陷，提供一种检测和评价抗HBV病毒药物活性的方法是十分必要的。

现有的抗HBV药物，如M等，主要的作用机制是抑制HBV的逆转录酶，对肝细胞中的cccDNA作用微乎其微。逆转录的模板为HBV pgRNA，在HBV DNA病毒载量很低的情况下，HBVpgRNA会代偿性的升高，这是造成患者停药后很快复发的关键因素。因此，血清中pgRNA的含量可能是一个更好的评价患者病情的指标。国外有相关文献证明，在HBV DNA很低的情况下，确实存在pgRNA仍会处于比较高的状态的情况。我们通过HBV pgRNA定量的高低，来判断抗HBV药物的敏感性。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种非治疗非诊断目的的检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒，可以在不同药物作用下，检测HBV pgRNA变化，用来判断药物治疗HBV的效果，或者筛选出较好的抗HBV药物，突破目前HBV DNA检测结果不够准确全面的缺陷。本发明利用HBV pgRNA的特点，创造性地采用了一步法定量pgRNA并为寻找治疗乙肝病毒有效的药物提供更为敏感的筛选方法。该过程简便，周期短，很好地克服了现有技术的缺陷。

为达到以上目的，本发明提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：

S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗

HBV药物，进行培养，

S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，

S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。

本发明还提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的转HBV基因动物的离体血清进行HBV pgRNA浓度测定，根据离体血清中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。

本发明还提供了一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的乙肝患者的离体血清进行HBV pgRNA浓度测定，根据离体血清中HBVpgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果。

在上述任一所述检测和评价抗HBV药物活性的方法中，所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：

当培养上清液或离体血清中HBV pgRNA浓度在500copies/mL以下时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性较好，

当培养上清液或离体血清中HBV pgRNA浓度在1.0×10⁵copies/mL以上时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性较差，

当培养上清液或离体血清中HBV pgRNA浓度在500～1.0×10⁵copies/mL之间时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性中等。

在上述任一所述检测和评价抗HBV药物活性的方法中，所述HBV pgRNA浓度使用实时荧光定量PCR方法测定，

所述实时荧光定量PCR方法使用的上、下游引物和荧光标记探针的序列如下：

上游引物的序列为：序列表序列1序列；

下游引物的序列为：序列表序列2序列；

荧光标记探针的序列为：序列表序列3序列。

在上述任一所述检测和评价抗HBV药物活性的方法中，所述实时荧光定量PCR方法使用的逆转录引物的序列为：序列表序列4序列。

在上述任一所述检测和评价抗HBV药物活性的方法中，所述人肝癌细胞来自人类肝癌细胞系Hep G2，具体可为人类肝癌细胞系HepG2.2.15。

在上述任一所述方法中，所述抗HBV药物，可为抗病毒药物，所述抗病毒药物可为核苷类似物和/或干扰素；所述核苷类似物可为拉米夫定、和/或阿德福韦、和/或恩替卡韦、和/或替比夫定和/或替诺福韦，所述干扰素可为普通干扰素和/或长效干扰素。

本发明保护上述任一所述方法在生产或筛选抗HBV药物中的应用。

本发明还提供了一种实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中含有：上游引物、下游引物和荧光标记探针；

所述上游引物的序列为：序列表序列1序列；

所述下游引物的序列为：序列表序列2序列；

所述荧光标记探针的序列为：序列表序列3序列；

在上述试剂盒中，还含有：逆转录引物，其序列为：序列表序列4序列。

此试剂盒的最低检测限为500copies/mL，当血清中pgRNA的载量低于最低检测限时，一般认为此时药物作用较好，病毒得到抑制。当血清中pgRNA的载量大于1.0×10⁵copies/mL，此时pgRNA的载量较高，药物发挥的抗病毒作用较弱，病毒仍在复制。

所以，当pgRNA在500copies/mL以下时，药物敏感性较好；当pgRNA在1.0×10⁵copies/mL以上时，药物敏感性较差；当pgRNA在500copies/mL～1.0×10⁵copies/mL之间时，药物敏感性中等。

本发明的有益效果如下：

1、与现有技术相比，本发明提供的实时荧光定量PCR试剂盒中的引物设计更合理，删除了影响表达的非必需碱基，增加了有益引物碱基，获得基因表达水平更高，检测灵敏度增高，最低检测限为500copies/mL。

2、本发明利用HBV pgRNA的特点，创造性地采用了一步法定量pgRNA并为寻找治疗乙肝病毒有效的药物提供更为敏感的筛选方法。该过程简便，周期短，很好地克服了现有技术的缺陷。

附图说明

本发明有如下附图：

图1是实施例2中HBV pgRNA的实时荧光定量PCR检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的检测HBV pgRNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒为本发明实施例1的试剂盒。检测方法按照实施例2进行。

下述实施例3和4中所用的检测HBV DNA含量的实时荧光定量PCR试剂盒为“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒”，购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司。

实施例1、实时荧光定量PCR试剂盒

1、试剂盒组成

该试剂盒中含有：上游引物、下游引物、Taqman探针和逆转录引物；其中：

所述上游引物(F1)的序列为：

5’-CATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’(如序列表序列1所示)；

所述下游引物(R1)的序列为：

5’-GAACTGCCAATGATCGTACG-3’(如序列表序列2所示)；

所述Taqman探针(FP)的序列为：

5’-ATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCA-3’(如序列表序列3所示)；其5’端标记荧光，3’端标记荧光；

逆转录引物(RT)的序列为：

5’-GAACTGCCAATGATCGTACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(如序列表序列4所示)。

试剂盒内各试剂的组成及含量如下：

质控品：HBV pgRNA阴性质控品、HBV pgRNA临界阳性质控品、HBV pgRNA阳性质控品和HBV pgRNA定量标准品；

HBV pgRNA内标质控品、蛋白酶K、助沉剂；

病毒裂解液、磁珠；

洗液1、洗液2、洗脱液；

pgRNA PCR Buffer(含dNTP、dUTP、Mg²⁺)，pgRNA PCR酶(含UDG酶、逆转录酶和Taq酶)，pgRNA引物探针混合液(含有引物F1、R1、RT和探针FP)。

2、试剂盒灵敏度

HBV DNA病毒载量分别为1.0×10⁸IU/ml～1.0×10¹IU/ml，梯度稀释的8个浓度，按照实施例2中步骤2-4的方法进行实时荧光定量PCR。因为HBV DNA和HBV pgRNA扩增的序列相同，因此用上述引物探针组合同样可以扩增HBV DNA。

具体实验结果：HBV DNA病毒载量为1.0×10⁸IU/ml～1.0×10³IU/ml的样本扩增HBV pgRNA的结果均匀分布，HBV DNA病毒载量为1.0×10²IU/ml～1.0×10¹IU/ml的样本未扩出HBV pgRNA。此试剂盒的最低检测限为500copies/mL。

与现有技术相比，该试剂盒中的引物设计更合理，删除了影响表达的非必需碱基，增加了有益引物碱基，获得基因表达水平更高，检测灵敏度增高。

实施例2、样本中HBV pgRNA含量的实时荧光定量PCR检测

1、样本提取

将-20℃保存的HBV pgRNA内标质控品、蛋白酶K、助沉剂和七个质控品取出，室温融化，振荡15秒，瞬时离心。

将送检血清振荡15s，彻底混匀。将七个质控品(pgRNA阴性质控品、pgRNA临界阳性质控品、pgRNA阳性质控品和pgRNA定量标准品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ))和送检血清各取200μL至1.5mL离心管中，向离心管内加入300μL病毒裂解液、5μL HBV pgRNA内标质控品、10μL蛋白酶K、4μL助沉剂和20μL磁珠(每次吸取前需颠倒混匀)，于室温轻柔颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。

将离心管放在磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。

加入500μL洗液1，漩涡振荡5～10s使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。

加入500μL洗液2，漩涡振荡5～10s使磁珠重新悬浮，然后置于磁力架上，反复颠倒磁力架将离心管盖上的磁珠冲洗下来，静置1min后弃去上清液。

重复上述步骤。

尽量吸弃管底残余的液体，晾干5min。

加入50μL洗脱液，用移液枪缓慢吹打管壁上的磁珠使之浸于洗脱液R中，55℃温育5min，期间轻轻晃动溶液两次使核酸充分洗脱。

将离心管置于磁力架上静置1min，磁分离后及时将上清液转移至新的无核酸酶离心管中，得到核酸提取液。

2、一步法实时荧光定量PCR反应液配置

将-20℃保存的pgRNA PCR Buffer、pgRNA PCR酶和pgRNA引物探针混合液(含有引物F1、R1、RT和探针FP)取出(本实验采取绝对定量检测，故不需要内参基因)，室温融化，使用前振荡15秒，瞬时离心。

确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(7)+1(损耗)。各组分用量：pgRNA PCRBuffer，25μL；pgRNA PCR酶3μL；pgRNA引物探针混合液2μL。

取合适体积的无菌离心管配置反应体系，试剂全部加入后振荡混匀15s，瞬时离心。

将上述混合液按30μL/孔分装至PCR反应管中备用。

将七个质控品和待检血清的核酸提取液，按照20μL/孔加入至相应的孔中，盖紧管盖，瞬时离心将管壁上的液体全部甩至管底，如有气泡，轻弹、离心直至气泡去除，然后进行PCR反应。

3、一步法实时荧光PCR扩增程序设置：

不同厂家以及不同型号的荧光定量PCR仪参考相应仪器的说明书。

荧光通道选择“FAM”(目标通道)及“VIC”或“HEX”(内标通道)双通道，样本类型选择相应的待测样本、标准品、阴性对照、阳性对照等选项，反应体系为50μl。标准品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ浓度分别设置为1×10⁴copies/mL，1×10⁵copies/mL，1×10⁶copies/mL，1×10⁷copies/mL。

设置反应条件：25℃10min；50℃60min；95℃5min；94℃15s，60℃35s，45个循环。设置完毕进行一步法实时荧光定量PCR反应。

4、结果分析：

反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值。基线(baseline)的起始点(Start)一般设定在1～3之间，终止点(Stop)一般设定在8～12之间，阈值线(threshold)通常设定在1000～5000之间(视具体情况而定)。通过“标准曲线法”对HBV pgRNA进行定量分析。从结果窗口中可以得到各样本的Ct值和相应的初始浓度。

如图1中A、B、C、D所示，其样本来自四位接受抗病毒治疗一段时间，达到停药指标的慢性乙型肝炎患者，其HBV DNA定量均为阴性(测定值<1000copies/ml，则表现为阴性，测定值>1000copies/ml时，直接以数值直接显示报数，定量为阳性)，但是其中两位的HBVpgRNA定量为阳性。患者A的pgRNA定量为107000copies/ml，患者B的HBV pgRNA定量为223copies/ml，患者C的HBV pgRNA定量为0copies/ml，患者D的HBV pgRNA定量为0copies/ml。该结果说明，在乙肝患者达到停药指标，即HBV DNA检测阴性的情况下，HBV pgRNA仍有可能是阳性，且载量较高。因此，HBV pgRNA定量可以补足现有指标的不足。

实施例3、小鼠体内抗HBV药物活性检测实验

1.实验材料

(1)主要试剂：治疗乙肝药物M，FQ-PCR试剂盒(实时荧光定量PCR试剂盒)，HBs Ag(乙肝表面抗原)ELISA试剂盒。

(2)主要仪器：全自动酶标仪，FQ实时荧光定量PCR仪

(3)动物：雌性HBV转基因小鼠，由北京大学实验动物中心提供。该雌性HBV转基因小鼠是由Balb/c小鼠胚胎显微注射1.5copy的HBV DNA研制而成。在该雌性HBV转基因小鼠的血清中能够检测到高水平的HBsAg及HBV DNA。本实验采用10周龄的成年小鼠。

2.实验方法

转基因小鼠随机分为3组，分别为阳性组、药物低剂量组和药物高剂量组，另设空白对照组(即雌性非转基因Balb/c小鼠)，每组5只。

药物M用0.5％的羧甲基纤维素钠溶液混悬至浓度为1％给药。

给药量：空白对照组和阳性组分别按照每公斤小鼠体重给予10ml的0.5％的羧甲基纤维素钠溶液，药物低剂量组按照每公斤小鼠体重给予300mg的药物M，药物高剂量组按照每公斤小鼠体重给予600mg的药物M。每组通过灌胃方式连续给药49d，每天一次。

采样与检测：在给药第7d、第14d、第21d、第28d、第35d、第42d、第49d后5h后断尾取血0.2ml分离血清，在最后一次49天给药5h后将小鼠摘眼球取血，分离所得的血清用于检测HBs Ag、HBV DNA、HBV pgRNA。HBsAg使用ELISA试剂盒并按其说明书进行检测，HBV DNA使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒并按其说明书进行检测，HBV pgRNA按照实施例1试剂盒及方法进行检测。

小鼠处死后，尽快分离肝脏，并将肝脏的左下叶用福尔马林固定(4％甲醛溶液)，其余肝脏放入冻存管置于液氮中速冻。福尔马林固定的小鼠肝脏用石蜡包埋并常规HE染色，并通过免疫组化检测肝脏中的HBs Ag表达水平。

3.统计学分析

实验数据用SPSS20.0软件处理，结果以表示，多个样本均数的比较采用单因素方差(One-way ANOVA)分析，P<0.05为统计学差异显著。

4.实验结果

(1)小鼠给药期间体重变化

小鼠给药过程中每周称取体重，不同组别的小鼠在给药期间没有伤亡，并且体重没有明显变化，说明药物没有造成严重的不良反应。

(2)小鼠肝脏的HE染色及免疫反应

小鼠处死后将肝脏迅速分离，并剪取左下叶用4％甲醛固定24h后，浸蜡1小时，用石蜡固定后切片做常规HE染色。结果如表1所示。由于外源基因在鼠胚胎发育期即开始复制表达，引起小鼠免疫系统对其产区的耐受，导致了HBV转基因小鼠没有免疫反应。故在小鼠肝脏切片的HE染色中并无发现严重的病理变化。

表1.小鼠肝脏HE染色变化情况

注：免疫反应阳性用+表示，免疫反应阴性用-表示，空白表示无相应的结果。

(3)小鼠血清中HBV DNA水平变化

小鼠灌胃给药不同时间后，采集血液并分离血清，血清中的HBV拷贝水平用荧光定量PCR检测，在给药第7d、第14d、第21d、第28d、第35d、第42d、第49d后给药5h后分别采用荧光定量PCR技术检测HBV DNA的量，以便观测药物在不同时间作用的效果，与阳性组相比，低剂量组和高剂量组中药物M均能对血清中HBV DNA产生明显的抑制作用(*P<0.05)。在第28d时，高剂量组和低剂量组中的药物M均能够对血清中HBV DNA产生明显的抑制作用(*P<0.05)(表2)。

表2.小鼠血清中HBV DNA水平变化情况

(4)小鼠血清HBs Ag水平变化

小鼠灌胃给药不同时间后，采集血液并分离血清，血清中的HBs Ag水平用ELISA定量试剂盒检测，在给药第7d后、第14d后、第21d后、第28d后给药5h后分别采用ELISA定量试剂盒检测，以便观测药物在不同时间作用的效果，由结果(表3)可以看出，在给药21d及28d后，高剂量组中药物M对血清中HBs Ag均有比较明显的抑制作用(P<0.05)。

表3.小鼠血清HBs Ag水平变化情况(HBs Ag>0.05IU/mL为阳性)

(5)小鼠血清中HBV pgRNA水平变化

小鼠灌胃给药不同时间后，采集血液并分离血清，血清中的HBV拷贝水平用荧光定量PCR检测(表4)，在给药第7d后、第14d后、第21d后、第28d后、第35d、第42d、第49d后给药5h后分别采用荧光定量PCR技术检测HBV pgRNA的量，以便观测药物在不同时间作用的效果，与阳性组相比均能产生明显的抑制作用(*P<0.05)。在第28d时，高剂量组和低剂量组均能够产生明显的抑制作用(*P<0.05)。

表4.小鼠血清中HBV pgRNA水平变化情况

实施例4、检测药物M对HepG2.2.15细胞上清HBV DNA、HBV pgRNA、HBsAg的影响

1.主要实验材料

(1)主要试剂：抗乙肝药物M、FQ-PCR试剂盒；

(2)主要仪器：FQ实时荧光定量PCR仪；

(3)细胞株：HepG2.2.15细胞为首都医科大学北京地坛医院惠赠。

2.实验方法

(1)药物处理：细胞接种于24孔板中培养24h后，分成空白对照组、阳性组、低剂量组、高剂量组共计4组，每组6个重复。空白对照组使用DMEM培养基培养，阳性组使用不含有药物M的DMEM培养基培养，低剂量组使用添加药物M的终浓度为50mg/ml的DMEM培养基培养，高剂量组使用添加药物M的终浓度为100mg/ml的DMEM培养基培养，隔天换含有相应药物浓度的DMEM培养基，连续培养7-49d后，取上清进行检测。

(2)HBV DNA提取及荧光定量PCR检测

使用DNA提取试剂盒，按说明提取各组上清中的DNA，使用“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒”定量上清中的HBV DNA。

(3)HBV pgRNA提取及荧光定量PCR检测

按照实施例2步骤1—3的方法进行。

3.结果

如表5所示。

表5药物对HepG2.2.15细胞中HBV DNA和HBV pgRNA的检测浓度情况

数据分析：

本实验组经过大量的前期数据研究，发现当现行公认的检测HBV DNA浓度在1000copies/mL时，此时检测HBV pgRNA浓度在500copies/mL，按照现行停药标准进行停药，发现，经过1-3个月停药，HBV DNA浓度回升，HBV pgRNA浓度指数增加；当按照检测HBVpgRNA浓度在500copies/mL以下停药，经过1-3个月的停药，无论是HBV DNA浓度还是HBVpgRNA浓度均未出现明显增加，因此得出如下结论：

根据HBV pgRNA的浓度，当HBV pgRNA在500copies/mL以下时，药物敏感性最好(高度敏感)；当HBV pgRNA在1.0×10⁵copies/mL以上时，药物敏感性较差(不敏感)；当HBVpgRNA在500copies/mL～1.0×10⁵copies/mL之间时，药物敏感性较好(中度敏感)。

根据各实施例中的HBV DNA和HBV pgRNA的变化情况，可以判断治疗乙肝药物M对乙型肝炎病毒的药物敏感性，如表6所示：

表6.治疗抗乙肝药物M低剂量对乙型肝炎病毒的药物敏感性情况

单位：(copies/mL)

由表6我们可以分析得出，药物M在低剂量浓度对HBV DNA敏感，药物M在低剂量浓度对HBV pgRNA并不敏感。7d以后的同期HBV DNA测量数据明显低于同期HBV pgRNA数据值，同期的数据值越低表示对药物越敏感。

依据本发明的判断标准，药物M在21d以前对HBV pgRNA并不敏感，药物M在21-49d对HBV pgRNA中度敏感。经过检测发现，即使HBV DNA检测数值很低的情况下，HBV pgRNA的浓度依然很高，从停药的角度来看，依据HBV DNA的检测数值低于现行标准1000copies/ml即可减量或者停药，但是从检测到的HBV pgRNA的检测浓度来看，需要低于本发明标准的500copies/ml才可以停药，否则继续服用。

当给药49d后小鼠的HBV DNA的检测数值为950copies/ml，HBV pgRNA的检测为526copies/ml，按照检测HBV DNA的标准，数值低于1000copies/ml可以停药，但是，此时HBVpgRNA的检测为526copies/ml，按照本发明的标准，仍需要治疗，说明检测HBV pgRNA要比检测HBV DNA的指标更具有判断药物的准确指标。

表7.治疗抗乙肝药物M高剂量对乙型肝炎病毒的药物敏感性情况

单位：(copies/mL)

由表7我们可以分析得出，药物M在高剂量浓度对HBV DNA敏感，药物M在高剂量浓度对HBV pgRNA没有对HBV DNA敏感，依据是表7中7d以后的同期HBV DNA测量数据明显低于同期HBV pgRNA数据值，同期的数据值越低表示对药物越敏感。

依据本发明的判断标准，药物M在21d以前对HBV pgRNA并不敏感，药物M在21-49d对HBV pgRNA中度敏感，但没有达到药物敏感性较好的程度。经过检测发现即使HBV DNA检测数值很低的情况下，HBV pgRNA的浓度依然很高，从停药的角度来看，依据HBV DNA的检测数值有可能减量或者停药，但是从检测到的HBV pgRNA的检测浓度来看，需要继续服用。

依据HBV DNA的检测数值低于现行标准1000copies/ml即可减量或者停药，但是从检测到的HBV pgRNA的检测浓度来看，需要低于本标准的500copies/ml才可以停药，否则继续服用。

当给药42d后小鼠的HBV DNA的检测数值为1000copies/ml，HBV pgRNA的检测为898copies/ml，按照检测HBV DNA的标准，数值低于1000copies/ml可以停药，但是，此时HBVpgRNA的检测为898copies/ml，按照本发明的标准，仍需要治疗，说明检测HBV pgRNA要比检测HBV DNA的指标更具有判断药物的准确指标。同理，在细胞水平上也是一样得出检测HBVpgRNA要比检测HBV DNA的指标更具有判断药物的准确指标。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

序列表

<110> 北京旌准医疗科技有限公司

<120> 一种检测和评价抗HBV药物活性的方法及试剂盒

<141> 2017-09-18

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

catgcaactt tttcacctct gc 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaactgccaa tgatcgtacg 20

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atctcatgtt catgtcctac tgttca 26

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gaactgccaa tgatcgtacg tttttttttt tttttttttt tttttvn 47

Claims

1.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：

S1、向动物肝癌细胞或人肝癌细胞的培养体系中加入待测抗HBV药物，进行培养，

S2、检测培养上清液中HBV pgRNA浓度，

S3、根据培养上清液中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果；

所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：

当培养上清液或离体血清中HBV pgRNA浓度在500～1.0×10⁵copies/mL之间时，所述待测抗HBV药物的活性或敏感性中等；

所述HBV pgRNA浓度使用实时荧光定量PCR方法测定，所述实时荧光定量PCR方法使用的上、下游引物和荧光标记探针的序列如下：

上游引物的序列为：序列表序列1；

下游引物的序列为：序列表序列2；

荧光标记探针的序列为：序列表序列3。

2.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的转HBV基因动物的离体血清进行HBV pgRNA浓度测定，根据离体血清中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果；

所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：

上游引物的序列为：序列表序列1；

下游引物的序列为：序列表序列2；

荧光标记探针的序列为：序列表序列3。

3.一种检测和评价抗HBV药物活性的方法，包括如下步骤：对经待测抗HBV药物治疗过的乙肝患者的离体血清进行HBV pgRNA浓度测定，根据离体血清中HBV pgRNA浓度判断待测抗HBV药物活性结果；

所述判断待测抗HBV药物活性结果的标准为：

上游引物的序列为：序列表序列1；

下游引物的序列为：序列表序列2；

荧光标记探针的序列为：序列表序列3。

4.如权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR方法使用的逆转录引物的序列为：序列表序列4。

5.如权利要求1所述的方法，特征在于：所述人肝癌细胞来自人类肝癌细胞系HepG2 .2.15。

6.权利要求1—5中任一所述方法在生产或筛选抗HBV药物中的应用。

7.一种实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有：上游引物、下游引物和荧光标记探针；

所述上游引物的序列为：序列表序列1；

所述下游引物的序列为：序列表序列2；

所述荧光标记探针的序列为：序列表序列3。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有：逆转录引物，其序列为：序列表序列4。