CN101696396A

CN101696396A - 乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用

Info

Publication number: CN101696396A
Application number: CN200910070982A
Authority: CN
Inventors: 金敏; 郭向飞; 李君文; 陈照立; 邱志刚; 谌志强; 王新为; 王景峰
Original assignee: Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Current assignee: Institute of Hygiene and Environmental Medicine Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA
Priority date: 2009-10-27
Filing date: 2009-10-27
Publication date: 2010-04-21
Also published as: CN101914489A; WO2011050672A1

Abstract

本发明涉及一种乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用，采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖；利用人胎肝干细胞用于体外感染模型的构建方法进行抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价。其优点是：人胎肝干细胞可感染乙型肝炎病毒并持续性的分泌乙型肝炎病毒；人胎肝干细胞可以传代培养；方法简便；重复性好。

Description

乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎病毒感染模型的构建，特别是涉及一种人胎肝干细胞用于抗HBV药物筛选的的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用。

背景技术

众所周知，乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝脏疾病的最主要原因之一，全球大约有3.5亿人是慢性HBV携带者，严重的可导致肝硬化、原发性肝癌。病毒性乙型肝炎流行面广，传染性强，是世界上最常见的感染性疾病之一，人一旦被乙肝病毒感染，肝脏就会发生炎性病变，肝细胞受损，对人体造成极大的危害，因此研究HBV的发病机制及其防治方法具有重要的意义。

研究HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及其防治方法的重要环节之一就是要建立方便有效的HBV体内外感染模型。现在用于研究HBV的动物感染体内模型，主要有灵长类、树鼩、鸭和应用最多的转基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模型的细胞包括成人肝细胞、胎肝细胞、HepRG细胞系及以HepG-2为基础的转基因细胞。动物模型虽然能模拟体内HBV感染过程，但是仍存在HBV复制表达水平不高，种间差异及免疫缺陷等问题。而建立的细胞感染体外模型，由于均存在不同程度的局限性，因而仍然没有合适理想的模型，如成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，因此限制其实际应用；胎肝细胞也终究因为不能传代培养而在应用中受到制约；HepRG细胞系模型不仅不能获得完整的HBV颗粒，而且难以去除添加物对HBV感染过程的可能影响；而在目前应用最广的以HepG-2为基础的HepG2.2.15转基因细胞中，由于HBV整合在宿主细胞染色体上且不能被清除，因而其复制方式与自然感染不同，细胞培养中不产生cccDNA(复制中间体)，病毒复制水平低，另外，HBV与转染肝癌细胞长期稳定的整合状态难以用于研究细胞的转化机制。

此外，人们还探讨了HBV感染的非肝源性细胞，并且，越来越多的研究表明，HBV不仅感染肝源性细胞，也可以感染其它如骨髓干细胞、内皮祖细胞、胎盘滋养层细胞等具干细胞特性的细胞，但是，由于HBV不能或很难在这些细胞中复制繁殖，且这些细胞为非肝脏源细胞，HBV感染机制可能不同，因此仍然不能用于建立理想的细胞感染模型。

胎肝干细胞(hepatic stem cell，HSC)是胎儿体内存在的一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的肝源性干细胞，既可以向胆管细胞分化，又可向肝细胞分化。它并非特指某一种类的细胞，而是由与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞组成，如肝脏在胚胎期出现的胎肝干细胞及成肝细胞(哺乳动物胚胎发育早期阶段肝内的干细胞，它同时表达肝细胞表型和胆管细胞表型，后两者又可进一步分化成为成熟肝细胞和胆管细胞)、成年肝脏内存在的兼性肝细胞及其子代细胞卵圆细胞等。肝干细胞作为治疗肝脏相关疾病的一种细胞来源，对肝的细胞移植，组织工程和基因治疗等有很重要的作用。

截至目前，尚未见利用人胎肝干细胞构建HBV体外感染模型的报道。

发明内容：

本发明的主要目的在于克服以上不足而提供一种全新的利用人胎肝干细胞用于抗HBV药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：它包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染细胞和验证乙肝病毒已感染细胞且病毒已繁殖，其特征在于：本发明是采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖：

I.分离培养人胎肝干细胞：

(1).胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏-剥离肝细胞悬液-过滤-充分散开细胞-离心细胞悬液-弃掉上清液-沉淀的细胞用培养基悬浮-将细胞放入离心管中-置于冰上沉淀-利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀-去除细胞悬液-离心沉淀细胞-细胞用PBS液悬浮-用PBS液将Percoll按体积分数配成90％、70％和50％3种浓度梯度-离心并吸取位于不同Percoll之间细胞层悬浮沉淀的细胞-接种于塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液-并在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜，新分离的细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力；

(2).胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/mlSCF(人干细胞生长因子)、10ng/ml HGF(人肝细胞生长因子)、20ng/ml EGF(表皮生长因子)、10ng/ml LIF(人白血病抑制因子)及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5天换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底。质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。

II.免疫组化鉴定人胎肝干细胞：采用SP免疫组化试剂盒检测AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面标志，以PBS代替各表面标志的一抗作为阴性对照，步骤如下：消化细胞后低速离心，PBS悬起细胞-接种于盖玻片上-通风晾干-PBS充分洗涤-抗原热修复-PBS洗涤多次后呈红棕色染色为阳性-苏木素复染；

III.乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞：将HBV(10⁷-10⁸Copies)血清接种到无血清培养液的六孔板细胞中；孵育后，吸取上清液，采用培养液培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV。

IV.采用以下三种方法验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞：

(1).荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度；

(2).ELISA检测不同时间细胞上清中病毒HBsAg分泌情况：采用乙肝病毒s抗原检测试剂盒对不同时间细胞上清进行HBsAg的检测；

(3).原位杂交检测细胞内病毒：将感染病毒的细胞，于病毒洗去后第三天和第七天进行生物素(POD)和荧光探针标记原位杂交。

实际操作时多同时采用上述三种方法反复验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞。

所述的采用人胎肝干细胞用于体外抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价是将稳定生长的肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的抗乙型肝炎病毒药物，另外，以不加抗乙型肝炎病毒药物组作为阳性对照，以不加病毒及抗乙型肝炎病毒药物组作为阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳检测乙肝病毒的繁殖抑制情况。

本发明还可以采用如下技术措施：

所述的人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞，如卵圆细胞或成肝细胞或兼性肝细胞或小肝细胞或肝侧群细胞或肝前体细胞；

所述的用于体外抗乙型肝炎病毒药物是化学药物或中草药或生物工程药或干扰素。

本发明具有的优点和积极效果是：人胎肝干细胞可感染乙型肝炎病毒并持续性的分泌乙型肝炎病毒，因而该模型可用于体外抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价且方法简便，重复性好；人胎肝干细胞可以传代培养，因而大大扩大其应用。

附图说明

图1是本发明实施例1的方法流程示意图；

图2是人胎肝干细胞不同培养时间细胞形态示意图；其中

A为刚分离胎肝干细胞(40×)示意图；

B为刚分离胎肝干细胞(100×)示意图；

C为台盼蓝染色(40×)示意图；

D为HE染色(200×)示意图；

E为培养1周后胎肝干细胞(100×)示意图；

F为培养1周后胎肝干细胞(200×)示意图；

G为分离培养2周后胎肝干细胞(100×)示意图；

H为分离培养4周后胎肝干细胞(100×)示意图；

I为传代培养5天细胞(100×)示意图；

J为传代2周后细胞(100×)示意图；

图3是人胎肝干细胞不同表面标志物的免疫细胞化学染色(×200)示意图。其中

A为AFP；B为OV-6；C为CD34；D为CK18；E为CK19；

F为阴性对照。

图4是检测细胞内HBV DNA的原位杂交(200×)示意图。其中

A、E为感染3d后的细胞；C、D为感染7d后细胞；

E、F为阴性对照； A、C、E为生物素标记；

B、D、F为荧光标记。

图5是不同浓度干扰素(IFN)作用HBV后HBV DNA的PCR产物电泳示意图。其中，

1.200IU IFN； 2.500IU IFN； 3.1000IU IFN；

4.2000IU IFN； 5.感染组对照组；6.阴性对照；

M.DL2000Marker。

图6是本发明实施例2的方法流程示意图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容特点及功效兹举例以下实施例，并配合附图详细说明如下，请参阅图1-图6

本发明采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖：

实施例1如图1-图4所示

I.分离培养人胎肝干细胞：

(1).胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏，待肝脏呈灰白色时停止灌注，小刮刀小心剥离肝细胞悬液，经100目筛网过滤，吸管吹打使细胞充分散开。细胞悬液经D-Hank’s液2000r/min，4℃离心5min。弃掉上清液，沉淀的细胞用2ml DMEM培养基悬浮，加入50ml含0.1％Pronase E和0.005％DNase I的DMEM培养基，37℃、5％CO2培养30min。然后将细胞转移至离心管中，置于冰上沉淀20min，利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀。去除细胞悬液，沉淀细胞经4℃、2000r/min离心10min。细胞用PBS液悬浮。用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度，经4℃、10000r/min离心30min，吸取位于50％与70％Percoll之间细胞层。2ml DMEM/F12悬浮沉淀的细胞，接种于0.25％明胶处理塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，并在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜。细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF、10ng/ml HGF、20ng/ml EGF、10ng/mlLIFf及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5天换液1次。

新分离的干细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力。显微镜下可见细胞大小均匀，光亮而透明，细胞核质比大，细胞直径为10-15μm，核为圆形或卵圆形，呈鹅卵石形态(如图2A，B所示)。Trypanblue染色细胞平均活性率为90％(如图2C所示)，常规HE染色核较大(如图2D所示)，胞浆少，细胞形态均一。继续培养发现该细胞生长相对缓慢，接种培养瓶24h后半贴壁状态，培养3-10d后细胞体积才有所增大(如图2E，F所示)，细胞增殖明显活跃，原代连续培养两周后细胞呈集落样生长，排列成葡萄状(如图2G所示)。培养一个月后，细胞的克隆增大，克隆数逐渐增多(如图2H所示)。胰酶消化1∶2传代，传代后细胞成克隆生长(如图2I，J所示)。随着传代，细胞逐渐脱落，但仍然可见小克隆。

(2).胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF(人干细胞生长因子)、10ng/ml HGF(人肝细胞生长因子)、20ng/ml EGF(表皮生长因子)、10ng/ml LIF(人白血病抑制因子)及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5d换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底。质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。

II.免疫组化鉴定人胎肝干细胞：采用SP免疫组化试剂盒检测AFP、OV-6、CK19、CD34、CK18表面标志，以PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤如下：

(1).消化细胞后低速离心，PBS悬起细胞，取100μl接种于盖玻片上，通风晾干，95％酒精室温固定15min；

(2).PBS充分洗涤后，以30ml/L过氧化氢溶液浸泡10min灭活内源性过氧化物酶；

(3).抗原热修复后，PBS洗三次，5min/次，以正常山羊血清室温封闭30min；

(4).甩干，加第一抗体(AFP、CK19、CD34、OV-6)PBS 1∶100稀释4℃过夜；

(5).PBS洗三次，5min/次，加生物素标记的第二抗体37℃45min；

(6).PBS洗三次，5min/次，加结合过氧化物酶链霉亲和素37℃45min；

(7).PBS洗三次，5min/次，加新鲜配制的DAB，显微镜下观察5-10min红棕色染色为阳性；

(8).苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

显色结果表明，新分离的人胎肝干细胞AFP、CK19、CK18、OV-6、CD34均为阳性染色，其中胎肝细胞标志AFP和肝卵圆细胞标志OV-6、CK18表达较强，阳性细胞胞浆呈棕红色，CD34也有表达，胞浆红棕色染色相对较少，CK19阳性细胞染色较弱(如图3A-F所示)。

III.HBV高拷贝阳性血清感染人胎肝干细胞：将HBV(10⁷-10⁸Copies)血清100ul接种到1ml DMEM/F12培养液(无血清)的六孔板细胞中；37℃孵育24h后，吸取上清液，采用DMEM/F12培养液(10％FBS)培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV，可连续取样5次。

利用本发明的HBV体外感染模型，HBV高拷贝血清可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒至上清中达10d，其中，HBV DNA检测值均在10²-10⁵copies之间，ELISA方法检测细胞分泌的HBsAg均呈阳性。

IV.验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞：

采用荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度法

(1).DNA提取：采用乙肝病毒核酸定量检测试剂盒提取DNA并保存于-20℃，阴阳性质控样品经同样处理后备用。

(2)荧光定量PCR扩增：利用PCR-荧光探针法，采用乙肝病毒核酸定量检测试剂盒进行荧光定量PCR扩增(杭州博日公司)，具体使用方法参见产品说明书。

PCR反应体系：PCR反应液37.7μl；Taq酶0.3μl；UDG酶0.1μl；标本液或对照品或标准品2μl。

PCR反应条件：37℃5min；93℃2min；以下40个循环：95℃5s；60℃40s。

结果表明：各取样时间点的PBS洗后液中未检测到病毒；HBV高拷贝血清可感染人胎肝干细胞并能在细胞内繁殖，且细胞可持续分泌病毒DNA至上清达10天，且HBV DNA含量在10²-10⁵copies之间，第二天最高能达8.9×10⁴copies。

还可采用ELISA检测不同时间细胞上清中病毒HBsAg分泌情况和原位杂交检测细胞内病毒分布。采用乙肝病毒s抗原检测试剂盒(英科新创科技有限公司)进行ELISA检测(按照试剂盒说明书操作)的结果表明，在细胞上清液中能持续检测到HBsAg；采用人HBVDNA生物素标记(POD)和荧光原位杂交双染色试剂盒(天津灏洋生物技术公司)于病毒洗去后第三天和第七天进行原位杂交检测(按照试剂盒说明书操作)的结果表明，在感染病毒的细胞孔中显示棕红色颗粒或绿色荧光信号，未接病毒的细胞孔均为阴性结果，说明乙肝病毒细胞内存在病毒颗粒(如图4A-F所示)。

采用上述三种方法反复验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞。

其优点是：人胎肝干细胞可感染乙型肝炎病毒并持续性的分泌乙型肝炎病毒；人胎肝干细胞可以传代培养；方法简便；重复性好。

实施例2与实施例1的不同点如下：

如图6所示：

I.分离培养人胎肝干细胞中胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏，待肝脏呈灰白色时停止灌注，小刮刀小心剥离肝细胞悬液，经100目筛网过滤，吸管吹打使细胞充分散开。细胞悬液经D-Hank’s液2000r/min，4℃离心5min。弃掉上清液，沉淀的细胞用2ml DMEM培养基悬浮，加入50ml含0.1％Pronase E和0.005％DNase I的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养30min。然后将细胞转移至离心管中，置于冰上沉淀20min，利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀。去除细胞悬液，沉淀细胞经4℃、2000r/min离心10min。细胞用PBS液悬浮。用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度，经4℃、10000r/min离心30min，吸取位于70％与90％Percoll之间细胞层。2ml DMEM/F12悬浮沉淀的细胞，接种于0.25％明胶处理塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液，并在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜。细胞接种18h后首次更换含10％FBS、10ng/ml SCF、10ng/ml HGF、20ng/ml EGF、10ng/ml LIFf及1μg/ml胰岛素的DMEM/F12培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3-5天换液1次，而分离出干细胞。

其它各步骤的内容和优点均与实施例1相同。

实施例3以干扰素IFN药物为准进行试验，如图5所示：

乙型肝炎病毒体外感染模型的应用，所述的采用人胎肝干细胞用于体外抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价是将稳定生长的人胎肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的干扰素IFN(还可以是化学药物或中草药或生物工程药)，另外，以不加抗乙型肝炎病毒药物组作为阳性对照，以不加病毒及抗乙型肝炎病毒药物组作为阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳检测乙肝病毒的繁殖抑制情况。

以干扰素IFN药物进行试验，其试验结果表明(如图5中1-6，M所示)，干扰素可以抑制病毒颗粒在细胞内的复制，且不同浓度的干扰素作用显示不同的抑制效果。这说明成功构建了HBV体外感染模型并可用于抗HBV药物筛选和效果评价。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定。在不脱离本发明设计原则的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案作出的各变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范畴。

Claims

1.一种乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，它包括人胎肝干细胞的分离培养、鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞和验证乙肝病毒已感染细胞且病毒已繁殖，其特征在于：本发明采用人胎肝干细胞用于抗乙型肝炎病毒药物筛选的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法的步骤为分离培养人胎肝干细胞、免疫组化鉴定人胎肝干细胞、乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞、验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且病毒已繁殖：

I.分离培养人胎肝干细胞：

(1).人胎肝干细胞的分离培养：将胶原酶原位灌注肝脏-剥离肝细胞悬液-过滤-充分散开细胞-离心细胞悬液-弃掉上清液-沉淀的细胞用培养基悬浮-将细胞放入离心管中-置于冰上沉淀-利用肝干细胞黏附作用使细胞沉淀-去除细胞悬液-离心沉淀细胞-细胞用PBS液悬浮-用PBS液将Percoll按体积分数配成30％-90％的浓度梯度-离心并吸取位于不同Percoll之间细胞层悬浮沉淀的细胞-接种于塑料培养瓶中，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液-并在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜，新分离的细胞用0.25％台盼蓝染色观察细胞活力；

(2).人胎肝干细胞的培养与传代：细胞接种18h后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3-5天换液1次。两周后细胞数量成对数生长，形成小细胞克隆，四周后，小克隆逐渐增多，铺满瓶底。质量分数0.25％胰蛋白酶消化细胞，按1∶2比例传代。

III.乙肝病毒血清感染人胎肝干细胞：将HBV(10⁷-10⁸Copies)血清接种到无血清培养液的六孔板胎肝干细胞中；孵育后，吸取上清液，采用培养液培养细胞，每隔48h取上清即可获得HBV。

IV.采用以下三种方法验证乙肝病毒已感染人胎肝干细胞且繁殖：

(1).荧光定量PCR检测不同时间细胞上清的病毒滴度；

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，其特征在于：所述的人胎肝干细胞是与肝脏胚胎发育及再生有关的各类具有干细胞特性的细胞，是卵圆细胞或成肝细胞或兼性肝细胞或小肝细胞或肝侧群细胞或肝前体细胞。

3.一种乙型肝炎病毒体外感染模型的应用，其特征在于：所述的采用人胎肝干细胞用于体外抗乙型肝炎病毒药物的筛选与效果评价，即将稳定生长的人胎肝干细胞接种六孔板中24h后，将其与病毒血清孵育24h，吸去病毒液，PBS洗6遍，留洗后液待检；分别加入200IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml的抗乙型肝炎病毒药物，另外，以不加抗乙型肝炎病毒药物组作为阳性对照，以不加病毒及抗乙型肝炎病毒药物组作为阴性对照，每组重复三孔，37℃孵育，3天后取上清，荧光定量PCR和电泳检测乙肝病毒的繁殖抑制情况。

4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒体外感染模型的应用，其特征在于：所述的用于体外抗乙型肝炎病毒药物是化学药物或中草药或生物工程药或干扰素。