CN103275933B - 一种人肝癌细胞系hlcz01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人肝癌细胞系HLCZ01，该人肝癌细胞系HLCZ01为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201309的人肝癌细胞系。本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可作为支持肝炎病毒感染的细胞模型进行应用，可作为建立支持病毒感染的动物模型进行应用，还可用于制备、筛选或评价抗肝炎病毒药物、抗肿瘤药物，还可用于制备人造肝。

Description

一种人肝癌细胞系HLCZ01及其应用
技术领域
本发明涉及微生物动物细胞领域，尤其涉及一种人肝癌细胞系及其应用。
背景技术
肝脏具有多种重要的生理功能，主要包括：合成和分泌大量的血清蛋白，如白蛋白和脂蛋白；合成和转运与蛋白结合的脂质；解毒功能；合成分泌胆汁；合成糖来调节血糖；分解氨基酸合成尿素；激活维生素；合成和分解糖原；合成谷胱甘肽和金属硫蛋白等。
随着生物技术的进步，利用基因重组和细胞融合的方法可以生产很多有用的生物制品，但相比之下，动物细胞培养技术比以前显得更加重要。考虑到肝脏具有比其他器官更多的生理功能，包括其显著的合成和分泌胞浆蛋白的功能，且拥有更强的合成白蛋白、脂蛋白、运输脂质、尿素、糖原、谷胱甘肽的能力和更强的代谢能力，这使得使研究者更有兴趣利用肝脏细胞培养生产上述产品。基于此，为了研究肝脏功能并生产相关的生物制品，需要培养肝细胞。然而，目前的细胞培养技术并不能在肝细胞的培养时期生产出血浆蛋白等生物制品，正常肝细胞离体后活力极速下降，这导致相关产品的获得变得十分困难。
肝脏也是成人体内少数可以再生的器官，但是在培养皿中培养的肝细胞传代次数有限，不能反复培养。
已有的一些肝细胞系由于是非人源的或与人肝细胞相差较大而不能广泛应用。目前已有一些来源于实验动物的肝细胞系，比如来源于大鼠（Tsao et.al.,Exp.Cell Res.,1984,154:38-52；Enat et al.,Proc.Nat.Acad.Sci USA,1984,87:1411-1415），利用无血清培养基建立的来源于成年大鼠肝脏的大鼠上皮细胞（Chessebeuf and Padieu,In Vitro,1984,20:780-795;Enat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1984,81:1411-1415）。大鼠肝细胞中还可转入SV40DNA（Woodworth et al.,Cancer Res.,1987,46:4018-4026;Ledley et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1987,84:5335-5339），但是由于和人的肝细胞代谢不同，这种细胞不能用于研究人体内药物代谢和肝癌生成。
此外，人肝细胞无性繁殖也已有相关报道（Kaighn and Prince,Proc.Nat.Acad.Sci.,1971,68:2396-2400），长期培养的人胎肝也已经建立（Salas-Prato,M.et al.,In Vitro Cell Dev.Biol.,1988,24:230-238;Sells,M.A.et al.,In Vitro Cell Dev.Biol.,1985,21:216-220），但是由于胎肝和成年肝在代谢方面的差异，使得胎肝在肿瘤生成和毒理研究方面的应用受到局限，成年肝更易用于肿瘤生成和毒理研究。
为了寻找替代肝细胞的研究模型，研究者建立了来源于肝癌、且与正常肝细胞有相同功能（比如分泌白蛋白功能）的细胞系。目前已建立有多种肝癌细胞系（e.g.,Knowles et al.,U.S.Pat.No.4,393,133,issued Jul.12,1983;Knowles B.B.et al.,Science,1980,209:497-499;Monjardino J.and Crawford E.,Virology,1979,96:652-655;Park J.G.et al.,Int.J.Cancer,1995,62:276-282;Zhong et al.,PNAS,2005,102(26):9294-9299;Fuand Cheng,Antimicrobial Agentsand Chemotherapy,2000,44(12):3402-3407），比如肝癌细胞系HepG2（U.S.Pat.No.4393133）。进一步利用HepG2的研究也已有相关报道（Kelly et al.,In Vitro Cell.and Dev.Biol.,1989,25:217-222;U.S.Pat.No.5,290,684;and Darlington et al.,In Vitro Cell.and Dev.Biol.,1987,2-3:349-354）。另外，Nakabayashi建立了肝癌细胞系Huh7（Cancer Research,1982,42:3858-3863）。综观现有的出版文献，已有的肝癌细胞系包括但不限于：HLF(OkayamaUniversity,medical school:1975),HLE,c-1(Okayama University,medical school:1975),HuH-6clone5(Okayama University,medical school:1976),HuH-7(Okayama University,medical school:1979),C-HC-4(Hokkaido University,school of medicine:1979),HCC-M(Keio University,schoolof medicine:1980),JHH-1(The Tokyo Jikei University School of Medicine:1980),JHH-2(TheTokyo Jikei University School of Medicine:1982),JHH-4(The Tokyo Jikei University School ofMedicine:1983),KIM-1(Kurume University,school of medicine:1983),JHH-5(The Tokyo JikeiUniversity School of Medicine:1984),JHH-6(The Tokyo Jikei University School ofMedicine:1984),OHR(Showa University,school of medicine:1985),KMCH-1(KurumeUniversity,school of medicine:1985),KMG-A(Kurume University,school of medicine:1985),JHH-7(The Tokyo Jikei University School of Medicine:1986),JHC-1(The Tokyo JikeiUniversitySchool of Medicine:1986),KYN-1(Kurume University,school of medicine:1986),KYN-2(Kurume University,school of medicine:1987),HCC-T(Keio University,school of medicine:1986),HPT-NT/D3(Kyushu University,faculty of medicine:1986),Hep-tabata(Mie University,Faculty of Medicine:1986),HuCC-T1(Toyama Medicine and Pharmaceutical University,facultyof medicine:1987),HuH-28(Okayama University,medical school:1987).上述相关数据可参见人类细胞Vol.1,No.1,p.106-126,1988。
已有大量的研究利用生物反应器培养肝细胞来制造人工肝。人工技术已在肾脏、心脏和肺移植方面取得进展。利用人造肝和其他技术长期保留肝功能已有报道（例如,Anand A.C.,Indian J.Gastroenterol.,2003,22Suppl2:S69-74;Ueda et al.,ASAIO J,2003,49(4):401-6;Tilleset al.,J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.,2002,9(6):686-96;Metab.Brain Dis.,2005,20(4):327-35;and Park and Lee,J.Biosci Bioeng.,2005,99(4):311-9）。肝辅助设备也有过相关报道（例如,Lu etal.,Tissue Eng.,2005,11(11-12):1667-77;Pless and Sauer,Transplant Proc.,2005,37(9):3893-5;Millis and Losanoff,Nat.Clin.Pract.Gastroenterol Hepatol.,2005,2(9):398-405;and George J.,J.Assoc.Physicians India,2004,52:719-22）。这些肝辅助设备在移植手术中经常用到。例如，人造肝和肝辅助设备能让爆发性肝衰竭病人在手术前保持清醒和镇定；能让病人在移植手术后稳定，特别是在对再灌注没有反应的情况下，也可在某些情况下代替肝移植。为了更好地利用生物人造肝和肝辅助器，需要发明轻便小巧的生物反应器。因此要求所培养细胞在反应器内产生急需和足够的肝特异蛋白。人正常肝细胞的缺乏使肝癌细胞在此应用上具有很大潜力。研究者已经成功地利用HepG2细胞在这种装置中生产抗凋亡蛋白Bcl-2（Terada S.,J.Biosci.Bioeng.,2003,95(2):146-51）。
肝癌是一种常见的肿瘤，多数肝癌是由肝炎病毒引起的，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV)；目前尚无有效的疗法。HCV感染是一种主要的人类感染疾病，尚无有效疫苗进行防治。已有部分证据证明了细胞免疫清除肝炎病毒的重要性，但是病人体内抗体介导的抗病毒反应机制尚不明确。多数病人体内的抗体可以中和病毒抗原，但是血清中中和抗体的含量和强度未知，缺乏支持病毒感染的细胞或动物模型限制了对中和抗体的研究。
尽管已有一些来源于人肝癌的细胞系，但这些已有的细胞系多数是低分化的且肝细胞功能不健全。据我们所了解的情况，目前尚无一株可以支持HBV和HCV感染的细胞系，这也限制了抗病毒药物的研发和应用。尽管有部分的研究小组利用人原代肝细胞检测到了少量HCV复制，但是还没有能支持野生型HCV大量复制的细胞系（Tagawa M.et al.,J.GastroenterolHepatol,1995,10:523-527;Ito T.et al.,J.Gen.Virol.,1996,77(Pt.5):1043-1054;Ito T.et al.,Hepatology,2001,34:566-572）。2005年，几个研究小组成功地在细胞系中呈现了2a型HCVJFH1的生理周期（Heller T.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2005,102:2579-2583;Wakita T.etal.,Nat.Med.,2005,11(7):791-796;Zhong J.et al.,PNAs,2005,102(26):9294-9;Lindenbach B.D.et al.,Science2005,309(5734):623-6）。
目前，唯一能支持HCV感染的动物模型是黑猩猩（Lanford R.E.et al.,Virology,2002,293:1-9）。这种动物模型的优点是呈现了病毒的真实生理周期，尽管与感染人的病理表现不同（Alter M.J.et al.,N.Eng.J.Med.,1999,341:556-562;Bassett S.E.et al.,J.Virol.,1998,72:2589-2599），但这种模型针对病毒感染后宿主的免疫反应提供了大量解释。利用此种模型的最大限制是大猩猩来源少，且价格昂贵。树鼩是接近灵长类的一种小动物，很容易适应实验室环境。有研究表明树鼩也能感染多种人类病毒，包括肝炎病毒（die Z.C.et al.,Virology,1998,244:513-520）。
表达HCV核心蛋白的转基因鼠已被用来研究肝脏病理和肿瘤生成（Lemon S.M.et al.,Trans.Am.Clin.Climatol.Assoc.,2000,111:146-156）。多数转基因动物没有显示对肝细胞的毒性，有一种模型显示出淋巴细胞炎症和肝细胞坏死（Zhao X.et al.,J.Clin.Invest,2002,109:221-232），另外两种模型显示出脂肪变性和肝癌（Moriya K.et al.,J.Gen.Virol,1997,78(Pt.7):1527-1531;Moriya K.et al.,Nat.Med.,1998,4:1065-1067）。利用HBV转基因小鼠模型极大地开阔了对HBV引起的免疫疾病发生机理的研究（Chisari F.V.et al.,Science,1985,230:1157-1160;Chisari F.V.et al.,Hepatology,1995,22:1316-1325）。转基因小鼠在HCV免疫学方面尚未被广泛应用，对病毒蛋白的免疫耐受成为利用小鼠动物模型研究的一个问题。
以上现有的研究结果表明，获得具有肝癌类似功能的肝癌细胞系和动物模型是极为有利的。这些细胞系的潜在应用包括但不局限于：筛选和评价抗肿瘤药物；在细胞系中培养HBV、HCV，模拟病毒的自然感染方式；筛选和评价抗病毒药物；研究肝细胞的代谢动能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高分化、可在体外培养、具有肝脏的功能特性、可被肝炎病毒感染的人肝癌细胞系HLCZ01，还相应提供该人肝癌细胞系HLCZ01在细胞模型、动物模型、制备筛选抗病毒和抗肿瘤药物等方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种人肝癌细胞系HLCZ01，所述人肝癌细胞系HLCZ01为保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）、且保藏号为CCTCCNO：C201309的人肝癌细胞系。该人肝癌细胞系HLCZ01的保藏单位为中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2013年1月17日，该人肝癌细胞系HLCZ01被命名为人肝癌细胞系HLCZ01。
上述的人肝癌细胞系HLCZ01中，其染色体条数优选为54～63。
上述的人肝癌细胞系HLCZ01中，所述人肝癌细胞系HLCZ01经过染色体G带核型分析后表明其存在染色体异性化现象，且细胞核型中出现有一条标记染色体。
上述的人肝癌细胞系HLCZ01不仅含有肝细胞特异基因ALB和AAT，而且可表达肝细胞特异蛋白ALB和AAT。上述的人肝癌细胞系HLCZ01，一方面它属于高分化的人肝癌细胞系；另一方面，该人肝癌细胞系HLCZ01可被肝炎病毒感染，所述肝炎病毒特别是指乙肝病毒（HBV）和/或丙肝病毒（HCV），包括丙肝病毒2a型和乙肝病毒各型在内均可感染。HBV和HCV可在本发明的人肝癌细胞系HLCZ01中大量复制。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的人肝癌细胞系HLCZ01作为支持肝炎病毒感染的细胞模型的应用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒（特别是包括丙肝病毒2a型和乙肝病毒各型在内均可感染）。本发明的人肝癌细胞系HLCZ01支持HBV和HCV的完整生活周期；通过在细胞模型中培养HBV和HCV，可模拟病毒的自然感染方式。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的人肝癌细胞系HLCZ01作为建立支持病毒感染的动物模型的应用。所述病毒优选包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。具体的，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可用于非人类的动物模型，将人肝癌细胞系HLCZ01植入或转入动物体内（比如小鼠体内），可用于建立支持病毒感染的动物（例如小鼠）模型。利用本发明人肝癌细胞系HLCZ01建立的动物模型有利于进行肝脏病理学和肝炎病毒学研究。如前所述，由于人肝癌细胞系HLCZ01支持HBV和HCV的完整生活周期，因此，人肝癌细胞系HLCZ01中可以重现HBV和HCV的关键病理过程，使得含有该人肝癌细胞系HLCZ01的动物模型可用于研究人体对HBV和HCV的抗病毒反应。
作为一个总的技术构思，正是基于本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可以作为支持肝炎病毒感染的细胞模型或作为建立支持病毒感染的动物模型进行应用，这便有利于临床筛选抑制或干预HBV和HCV的药物（包括病毒疫苗及其他辅助试剂），因此，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01还可在制备、筛选或评价抗肝炎病毒药物中进行应用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。
作为一个总的技术构思，本发明上述的人肝癌细胞系HLCZ01可在培养基中体外培养，进而可被用于预测化合物对细胞的致癌和致畸研究；通过化学致癌研究可进一步用于制备、筛选或评价抗肿瘤药物。
作为一个总的技术构思，本发明上述的人肝癌细胞系HLCZ01具有肝脏的重要功能和特性，可将氨转化为尿素；而将氨代谢为尿素的功能使其成为制造人造肝或肝辅助设备的有利工具，以用于临床或科研。因此，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01还可在人造肝的制备中进行应用。
除上述基本的应用方式外，本发明上述的人肝癌细胞系HLCZ01还可用于研究肝细胞代谢（例如评价化合物在肝脏中的代谢激活作用）及其他代谢功能研究、肝细胞中肝炎病毒生存复制研究、人类寄生虫研究等；还可在在细胞中转入外源基因研究其功能；由于本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可以表达细胞色素P450、CyP1A1、CyP1B1和CyP2C9蛋白，因此，该人肝癌细胞系HLCZ01还可应用于需要进行大量同源细胞实验的场合，例如药物代谢研究，
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明筛选、得到了一种具有开创性意义的人肝癌细胞系HLCZ01，该人肝癌细胞系HLCZ01不仅属于高分化的人肝癌细胞系，而且可在培养基中体外培养；其具有肝脏的重要功能和特性，可将氨转化为尿素，可以表达细胞色素P450、CyP1A1、CyP1B1和CyP2C9蛋白，更重要的是其可被肝炎病毒感染，HBV和HCV可在其中大量复制；由于本发明人肝癌细胞系HLCZ01所具有的特殊性能，使得本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可广泛应用于抗病毒、抗肿瘤药物的制备、研发、筛选和评价，可用于制备生物人造肝等各种临床治疗用生物制品，本发明的筛选培养的人肝癌细胞系HLCZ01比其他动物肝细胞更有利于研究人肝脏代谢功能和疾病发展过程。
一种人肝癌细胞系HLCZ01，其保藏单位为中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201309，保藏日期为2013年1月17日。
附图说明
图1为本发明实施例中通过RT-PCR检测三种细胞中基因ALB和AAT的对比检测结果，其是在凝胶成像仪下拍摄到的电泳图。
图2为本发明实施例中通过Western Blot检测三种细胞中ALB和AAT蛋白表达的对比检测结果。
图3为本发明应用实施例1中人肝癌细胞系感染HCV后病毒拷贝量随培养时间的变化曲线。
图4为本发明应用实施例1中人肝癌细胞系感染HCV后免疫荧光的检测结果，其中，左图表示以抗丙肝病毒NS5A的抗体检测病毒感染细胞内的病毒；中图表示以DAPI衬染细胞核；右图表示将左图与中图合并后的图像。
图5为本发明应用实施例2中HLCZ01细胞被来源于HepaG2.2.15细胞内的HBV感染后PCR定量检测结果。
图6为本发明应用实施例3中两种人肝癌细胞系感染HCV后病毒拷贝量随培养时间的变化曲线。
图7为本发明应用实施例3中人肝癌细胞系感染HBV和HCV后免疫荧光的检测结果，其中四张图片从左至右依次为：以针对丙肝病毒的NS5A抗体检测细胞内丙肝病毒；以乙肝病毒核心蛋白抗体检测细胞内乙肝病毒；以DAPI衬染细胞核；左侧三张图片合并得到的图片，其中个别细胞可以被两种病毒同时感染。
图8为本发明应用实施例1中以HLCZ01细胞制备人源化小鼠被丙肝病毒感染后，小鼠血清中病毒含量随感染时间的变化曲线。
图9为本发明应用实施例2中HLCZ01细胞内乙肝病毒含量随干扰素用量和处理时间的变化关系图。
图10为本发明应用实施例1中HLCZ01细胞内丙肝病毒含量随干扰素用量和处理时间的变化关系图。
图11为本发明应用实施例4中流式检测HLCZ01细胞对TRAIL的敏感性结果。
图12为本发明具体实施方式中对人肝癌细胞系HLCZ01染色体核型分析后的染色体分布频率图。
图13为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系HLCZ01（2n=54）的染色体核型分析图片结果。
图14为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系HLCZ01（2n=59）的染色体核型分析图片结果。
图15为本发明具体实施方式中人肝癌细胞系HLCZ01（2n=63）的染色体核型分析图片结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料或生物制剂，如无特殊说明，均为可从市场上购得的常规试剂。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的主要实验材料与试剂：
（1）细胞培养：人肝癌细胞系HLCZ01（已保藏）、Huh7.5细胞（Huh7.5细胞从美国洛克菲勒大学Charles Rice教授实验室馈赠得到），HCVcc（JFH1病毒上清，HCV材料从日本传染病国立中心Takaji Wakita教授实验室馈赠得到），100mm细胞培养板（Costar公司），60mm细胞培养板（Costar公司），六孔细胞培养板（Costar公司），DMEM培养基（Invitrogen公司）、青霉素和链霉素（Invitrogen公司）、谷氨酰胺（Invitrogen公司）、羊血清（Invitrogen公司）、胰蛋白酶（Invitrogen公司）、非必需氨基酸（Invitrogen公司）、1×PBS（Hyclone公司）；
（2）细胞总RNA提取：TRIZOL（Invitrogen公司）、异丙醇（上海生工）、无水乙醇（上海生工）、DEPC（上海生工）；
（3）Reverse Transcription PCR和Real Time PCR：Invitrogen RT-PCR试剂盒（Invitrogen公司）、SYBR Premix Ex Taq（Taraka公司）、200μL PCR八联管（Eppendorf公司）；
（4）细胞总蛋白提取：RIPA裂解液（Thermo公司）、蛋白酶抑制剂（Merck公司）、蛋白浓度测定试剂（Bio-Rad公司）；
（5）Western Blot：PVDF膜（Bio-Rad公司）、抗ALB抗体（SANTA CRUZ）、抗AAT抗体（SANTA CRUZ）、抗HCV NS5A抗体（美国佛罗里达大学馈赠），二抗goat anti-mouse IgG（HRP）（Invitrogen公司）、Western Blot化学发光底物（Thermo公司）、Western Blot曝光机（Keda公司）；
（6）免疫荧光：载玻片和盖玻片（SPI Supplies公司）、免疫组化笔（ZLI-9305，PAP Pen）、1×PBS（Hyclone公司）、羊血清（Invitrogen公司）、抗HCV NS5A抗体（自制）、二抗goatanti-mouse IgG（FITC）（Invitrogen公司）、DAPI（Invitrogen公司）。
实施例：
本实施例获得了一种本发明的人肝癌细胞系HLCZ01，该人肝癌细胞系HLCZ01已保藏于中国典型培养物保藏中心，且保藏号为CCTCC NO：C201309，保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2013年1月17日，该人肝癌细胞系HLCZ01被命名为人肝癌细胞系HLCZ01。
HLCZ01细胞系的建立与培养方法
1.取一男性肝癌患者手术切除的新鲜手术标本，PBS洗一次，将组织块用手术刀切成1mm3的小块铺于已用胶原蛋白处理过的培养皿（100毫米）内，加入8ml新鲜培养基，同时加入表皮生长因子，终浓度为10ng/ml；
2.培养2天后换新鲜培养基，以后每3天换新鲜培养基；
3.观察培养皿中长出细胞克隆后，PBS洗一次细胞，将0.25%胰酶滴于细胞克隆上，置培养箱中约1min后取出，用移液枪吸取新鲜培养基将消化后的克隆冲起吸出，转移到12孔板中继续培养；
4.带细胞在12孔板中长满后转移至六孔板中，长满后再扩大至10cm培养皿中；
5.将1×107个细胞接种到NOD-SCID鼠皮下，约45天后长出明显肿块，取出肿块后继续按照人肝癌组织培养方法培养而得到HLCZ01细胞。
通过RT-PCR检测本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01中含有肝细胞特异基因ALB和AAT，具体过程如下：
将人肝癌细胞系Huh7、本发明的人肝癌细胞系HLCZ01和中国仓鼠卵巢细胞系CHO（从美国ATCC购买）平铺于六孔细胞培养板中（30万/孔），每种细胞各铺占两孔；培养24h后，三种细胞各取一孔，用TRIZOL提取细胞总RNA，然后取1μg总RNA逆转录成cDNA，以1μL cDNA为模板进行PCR，扩增ALB和AAT基因，扩增后的结果如图1所示。由图1可见，人肝癌细胞系Huh7和人肝癌细胞系HLCZ01中均能扩增出肝细胞特异基因ALB和AAT，而非肝癌细胞系CHO中不能扩出这两种基因。
通过Western Blot证实本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01中可表达肝细胞特异蛋白ALB和AAT，具体过程如下：
取上述六孔细胞培养板中剩余三孔的三种细胞，用RIPA Buffer裂解细胞，将细胞裂解液置于冰上15min，然后以13000rpm离心15min（4℃），取上清转入新EP管中；Lowry法测蛋白浓度，分别取50μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，最后用Anti-ALB、Anti-AAT一抗和带HRP标记的二抗来检测各蛋白样品中ALB和AAT的表达，结果如图2所示，由图2可见，人肝癌细胞系Huh7和HLCZ01细胞中均有ALB和AAT蛋白表达，而非肝癌细胞系CHO中不表达这两种蛋白。
由以上实验可以证实，本发明筛选获得的人肝癌细胞系HLCZ01不仅含有肝细胞特异基因ALB和AAT，而且可表达肝细胞特异蛋白ALB和AAT。
我们对上述本发明的人肝癌细胞系HLCZ01进行了染色体核型分析，该染色体核型分析参考美国ATCC动物细胞系染色体核型分析方法。送检细胞常规传代，分别对P2、P4、P7世代的细胞（1000个中期分裂细胞）进行染色体制片，普通核型染色体计数，计算染色体分布频率；G带染色观察、CCD成像并用VideoTest-Karyo3.1软件进行核型分析。
本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01中，染色体核型分析结果显示染色体条数为54～63，其分布频率如图12所示。
本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01中，人肝癌细胞系HLCZ01经过染色体G带核型分析后表明其存在染色体异性化现象，且细胞核型中出现有一条标记染色体。我们以其中最典型的三组染色体（2n=54、2n=59、2n=63三组染色体）核型分析为例，其分析结果如图13～图15所示，由图13～图15可以看出，细胞核型均出现有一条标记染色体。
应用实施例1：HLCZ01被肝炎病毒HCV感染。
1.将本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01和现有的Huh7.5铺设于六孔细胞培养板中（20万/孔），24h后将培养基换成只含有2%FBS的培养基，以MOI=0.2的JFH1病毒感染细胞；24h后换新鲜的完全培养基，将细胞分别培养1天、2天、3天和6天，对应时间点用TRIZOL提取两种细胞的总RNA，然后取1μg总RNA逆转录成cDNA，以1μL cDNA为模板进行定量PCR，检测两种细胞中的HCV RNA水平，结果如图3所示。
2.另取感染3天后的上述部分人肝癌细胞系铺于60mm培养皿中的盖玻片上，继续培养3天。1×PBS冲洗细胞两次后，用冰丙酮将上述的两种人肝癌细胞系固定8min。1×PBS清洗固定后长有前述人肝癌细胞系的盖玻片3次，每次5min，羊血清室温下封闭30min，然后加Anti-NS5A一抗孵育1h，1×PBS洗3次后加FITC标记的二抗孵育1h，1×PBS洗3次后DAPI封片，最后在荧光显微镜下观察，结果如图4所示，图4可进一步证明，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01细胞中可检测出病毒蛋白NS5A。
由上可见，HCV感染HLCZ01细胞后，通过荧光定量PCR检测细胞中HCV RNA水平，以及免疫荧光检测细胞中病毒蛋白表达，进一步证实本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可被肝炎病毒HCV（JFH1）感染。基于此，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可作为支持肝炎病毒HCV感染的细胞模型进行应用，也可作为建立支持HCV病毒感染的动物模型进行应用，还可用于制备、筛选或评价抗HCV肝炎病毒药物。
以本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01作为支持肝炎病毒（上述丙肝病毒）感染的细胞模型进行应用的情形如图3和图4所示。
以本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01作为建立支持上述丙肝病毒感染的动物模型的应用情形如图8所示，图8为本实施例中以人肝癌细胞系HLCZ01制备人源化小鼠被丙肝病毒感染后，小鼠血清中丙肝病毒含量随感染时间的变化曲线。
本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗丙型肝炎病毒药物。根据我们的实验发现，上述丙肝病毒感染该人肝癌细胞系HLCZ01后，目前用于治疗丙肝的药物——α-干扰素可以降低丙肝病毒感染该人肝癌细胞系HLCZ01内的病毒含量（参见图10），图10即显示了HLCZ01细胞内丙肝病毒含量随干扰素用量和处理时间的变化关系，由此可见，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可用于制备、筛选或评价抗丙型肝炎病毒药物。
应用实施例2：HLCZ01被肝炎病毒HBV感染。
将本实施例中的人肝癌细胞系HLCZ01铺于60mm培养皿中，24h后将培养基（DMEM培养基）换为HepaG2.2.15细胞上清与完全培养基（按1∶1的体积比）混合，继续培养5天。5天后细胞传代，换为正常培养基培养，每3天传代时取部分细胞提取总细胞DNA。取第46天所提DNA作为模板进行定量PCR，检测人肝癌细胞系HLCZ01细胞中的HBV含量，结果如图5所示，由图5可见，人肝癌细胞系HLCZ01细胞中可被检测出HBV。
由上可见，HBV感染HLCZ01细胞后，通过荧光定量PCR检测细胞中HBV的含量水平，进一步证实本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可被肝炎病毒HBV（来源于HepaG2.2.15细胞内的乙肝病毒）感染。基于此，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可作为支持肝炎病毒HBV感染的细胞模型进行应用，也可作为建立支持HBV病毒感染的动物模型进行应用，还可用于制备、筛选或评价抗HBV肝炎病毒药物。
以本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01作为支持肝炎病毒（上述乙肝病毒）感染的细胞模型进行应用的情形如图5所示。
本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗乙型肝炎病毒药物。根据我们的实验发现，上述乙肝病毒感染该人肝癌细胞系HLCZ01后，目前用于治疗乙肝的药物——α-干扰素可以降低乙肝病毒感染该人肝癌细胞系HLCZ01内的病毒含量（参见图9），图9即显示了HLCZ01细胞内乙肝病毒含量随干扰素用量和处理时间的变化关系，由此可见，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可用于制备、筛选或评价抗乙型肝炎病毒药物。
应用实施例3：HLCZ01同时被肝炎病毒HBV和HCV感染。
1.取HBV（应用实施例2中的HBV）感染53天后的HLCZ01细胞铺于六孔细胞培养板中（20万/孔），同时取未被HBV感染的HLCZ01细胞铺于六孔细胞培养板中（20万/孔），24h后将完全培养基换成只含有2%FBS的培养基，以MOI=0.2的JFH1病毒感染前述的两种HLCZ01细胞（HBV感染和未被HBV感染的两种细胞）。24h后换新鲜的完全培养基，将细胞分别培养1天、2天、3天和6天，对应时间点用TRIZOL提取细胞总RNA，然后取1ug总RNA逆转录成cDNA，以1uL cDNA为模板进行定量PCR，检测细胞中HCV RNA水平，结果如图6所示，由图6可见，HCV在两种HLCZ01细胞中的含量均随感染时间延长而增加，但被HBV感染过的HLCZ01细胞中HCV含量低于未被感染过的HLCZ01细胞。
2.取被HBV感染过的HLCZ01细胞，再以上述方法感染HCV6天，丙酮固定细胞，分别用针对HBV核心蛋白抗原和HCV NS5A蛋白的抗体检测细胞中的肝炎病毒，结果如图7所示，由图7可见，HLCZ01细胞中能检测出HBV和HCV两种病毒蛋白，且能在同一个HLCZ01细胞中检测到两种病毒蛋白。
由上可见，HBV和HCV同时感染HLCZ01细胞后，通过荧光定量PCR检测细胞中HBV和HCV RNA水平，以及免疫荧光检测细胞中病毒蛋白表达，进一步证实本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可同时被肝炎病毒HBV（来源于HepaG2.2.15细胞内的乙肝病毒）和HCV（JFH1）感染。基于此，本发明的人肝癌细胞系HLCZ01可作为支持肝炎病毒HBV和HCV同时感染的细胞模型进行应用，也可作为建立支持HBV和HCV病毒同时感染的动物模型进行应用，还可用于制备、筛选或评价同时抗HBV和HCV肝炎病毒药物（参见图6～图10）。
应用实施例4：HLCZ01在制备、筛选或评价抗肿瘤药物中的应用。
图11给出了目前用于临床试验II期的药物TRAIL可诱使该HLCZ01细胞发生死亡的实验数据，由此可以看出，本实施例的人肝癌细胞系HLCZ01还可用于制备、筛选或评价抗肿瘤药物。
综合以上应用实施例的检测结果，这有力证明本发明建立的细胞系HLCZ01为一株人肝癌细胞系，该人肝癌细胞系HLCZ01能被HBV和/或HCV（同时感染），但HBV并不局限于实施例2中的来源于HepaG2.2.15细胞中的HBV，HCV也并不局限于来源于2a型HCV的JFH1感染。本发明人肝癌细胞系HLCZ01的建立将给HBV、HCV等肝炎病毒学方面、肝癌肿瘤学方面及其他方面的研究提供有力的工具，拥有广阔的应用价值和应用前景。

Claims (10)

1.一种人肝癌细胞系HLCZ01，所述人肝癌细胞系HLCZ01为保藏于中国典型培养物保藏中心、且保藏号为CCTCC NO：C201309的人肝癌细胞系。
2.根据权利要求1所述的人肝癌细胞系HLCZ01，其特征在于：所述人肝癌细胞系HLCZ01的染色体条数为54～63；所述人肝癌细胞系HLCZ01经过染色体G带核型分析后表明其存在染色体异性化现象，且细胞核型中出现有一条标记染色体。
3.根据权利要求1或2所述的人肝癌细胞系HLCZ01，其特征在于：所述人肝癌细胞系HLCZ01为可被肝炎病毒感染的人肝癌细胞系。
4.根据权利要求3所述的人肝癌细胞系HLCZ01，其特征在于：所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒2a型。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的人肝癌细胞系HLCZ01作为支持肝炎病毒感染的细胞模型的应用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒2a型。
6.一种如权利要求1～4中任一项所述的人肝癌细胞系HLCZ01作为建立支持肝炎病毒感染的动物模型的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。
8.一种如权利要求1～4中任一项所述的人肝癌细胞系HLCZ01在筛选或评价抗肝炎病毒药物中的应用，所述肝炎病毒包括乙肝病毒和/或丙肝病毒。
9.一种如权利要求1～4中任一项所述的人肝癌细胞系HLCZ01在筛选或评价抗肿瘤药物中的应用。
10.一种如权利要求1～4中任一项所述的人肝癌细胞系HLCZ01在制备人造肝中的应用。
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