CN101381706A

CN101381706A - 稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株及其建立方法

Info

Publication number: CN101381706A
Application number: CNA2007100456762A
Authority: CN
Inventors: 吴伟忠; 孙惠川; 汤钊猷; 王鲁; 夏景林; 杨毕伟; 梁英; 徐泱
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及可发射高强度红色或绿色荧光，具肺与淋巴结高转移能力的人肝癌细胞系及其建立方法。本发明以肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞系HCCLM3、HCCLM6为母细胞，通过慢病毒包装质粒对293细胞的质粒DNA共转染，获得真核表达红色或绿色荧光蛋白基因的假慢病毒颗粒，感染上述母细胞肝癌细胞株，得到染色体整合型、可稳定表达红色或绿色荧光的肺及淋巴结高转移肝癌细胞系。本发明的肺与淋巴结人高转移肝癌细胞系在体内外可作为肿瘤细胞的示踪研究、肝癌复发与转移的分子机理研究，以及抗肿瘤新药临床前期的药物疗效研究等，有广阔的应用前景。

Description

稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株及其建立方法

技术领域

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及荧光标记的人肝癌高转移细胞株，具体涉及能稳定表达红色荧光蛋白(RFP)或绿色荧光蛋白(GFP)、具肺与淋巴结高转移能力的人肝癌细胞株，及其建立方法。

背景技术

原发性肝细胞癌是我国乃至全球的高发恶性肿瘤之一。据统计，在我国每年约有20万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的50％左右。原发性肝细胞癌已日益成为严重影响人们健康的一种重大恶性疾病。近年来，各国政府、相关医疗与科研机构以及药物研发和生产企业加大了对原发性肝细胞癌的临床与基础研究工作。目前在临床上有多种肝癌治疗方法，如手术切除、肝动脉化疗栓塞(TACE)、外放射治疗、瘤内酒精注射(PAI)、微波固化治疗(PMCT)、射频消融(RFA)、激光热疗(LTT)及肝移植等，但疗效均有限。肝癌五年的复发与转移率高达60％，总体生存率仍低于5％。总之，现有治疗手段未能显著延长肝癌患者的生存期、改善病人的生存质量。究其原因有以下三点:第一、肝癌发病隐匿，癌细胞容易早期播散。第二、传统疗法均不能彻底消灭肝癌细胞且具有较大的毒副作用，限制了它们在临床上的反复应用。第三、目前国内外尚缺乏能在体内外长期稳定表达的、实验重复性能高的、荧光蛋白标记的、淋巴结与肺高转移的肝癌细胞系，以满足肝癌复发与转移生物学行为的早期示踪研究、分子机理研究以及抗肝癌新药疗快速效筛选的荧光标记研究模型。为此，复旦大学肝癌研究所建立了人肝细胞癌裸小鼠模型(肿瘤1986，6:10-13)、高转移人肝细胞癌裸小鼠模型(Int J Cancer 1996，66:239-243)、高转移人肝细胞癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(J Cancer Res Clin Oncol.2004；130:187-196；J Cancer Res Clin Oncol.2004；130:460-468；中华医学杂志.2004；84:675-679；Cancer Genet Cytogenet.2005；158:180-183；和Clin Cancer Res.2006；12:7140-7148)。目前国内外肿瘤细胞荧光蛋白标记技术多采用荧光蛋白编码基因的脂质体转染方法。采用该技术普遍存在着以下几大缺陷:1)在体外细胞培养体系中，荧光蛋白编码基因不易转染占细胞总数70％左右的G0-G1期肿瘤细胞，故目的基因转染效率低下；2)荧光蛋白编码基因转染的肿瘤细胞常需要一个连续、复杂的抗生素如新霉素(G418)等的体外筛选过程，极易造成细胞污染；3)荧光蛋白编码基因在肿瘤细胞染色体上的整合效率很低，在体外连续细胞传代过程中荧光蛋白编码基因很容易丢失，因此不易获得长期稳定表达的荧光示踪肿瘤细胞。研发新一代稳定表达红色或绿色荧光的人肝癌高转移细胞系已引起本领域研究人员的关注。

发明内容

本发明的目的是提供稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株及其建立方法，更具体的是建立染色体整合型、稳定表达红色或绿色荧光蛋白编码基因的、肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞系。

本发明所述的人肝癌细胞系是HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。

本发明所述的荧光蛋白是具有序列1的红色荧光蛋白(RFP)或具有序列2的绿色荧光蛋白(GFP)。

本发明为克服现有技术上的难点，采用荧光蛋白编码基因转染策略，用能感染包括G0-G1、S及G2期肿瘤细胞的、广谱的、染色体整合型的Lentivirus病毒载体系统，替代传统的脂质体转染方法，采用已克隆的肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(复旦大学肝癌研究所)为母细胞，通过三种慢病毒包装质粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G(Tronolab公司，图1-3)在大肠杆菌中的质粒DNA扩增、回收和纯化。纯化获得的三种质粒DNA按一定比例用CaCl₂方法共转染293细胞，产生可真核表达RFP或GFP荧光蛋白基因的假慢病毒颗粒，经病毒纯化、活性测定后，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞株(母细胞)，按常规方法分别进行荧光表达肝癌细胞的扩增建系，获得高强度、染色体整合型、稳定表达红色或绿色荧光的、肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞。分别命名为HCCLM3-R(红色荧光)，HCCLM3-G(绿色荧光)，HCCLM6-R(红色荧光)和HCCLM6-G(绿色荧光)(图4，图5)。

本发明所采用的红色或绿色荧光蛋白编码基因、转染方法及荧光表达肝癌细胞具有以下特征:

1、所采用的红色荧光及绿色荧光蛋白编码基因是经过基因改造，可有效延缓荧光淬灭的时间，增加荧光的表达强度。

2、所采用的假慢病毒感染新策略，对各期即G0-G1、S及G2期的肝癌细胞均有感染，是广谱的、外源基因染色体整合型的、稳定表达的病毒感染系统。红色或绿色荧光阳性表达HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞系不需要经过体外繁复、连续的筛选程序，避免了细胞克隆中的可能污染，缩短了获得阳性细胞的克隆时间。同时极大地提高了红色荧光或绿色荧光蛋白编码基因的细胞转染效率和稳定表达率，提高了实验的重复率。

3、本发明获得的红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R，HCCLM6-R细胞以及绿色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-G，HCCLM6-G均可在常规条件下进行细胞传代。其中HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌细胞可在激发波长为560nm、发射波长为585nm的条件下，用荧光显微镜进行观察；HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌细胞可在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下，用荧光显微镜进行观察。

4、本发明所获得的红色或绿色荧光蛋白表达的高转移人肝癌细胞系，其特征是稳定发射红色或绿色荧光，细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白。其余主要生物学行为与其相应的母细胞基本一致。

本发明用慢病毒感染的方法获得了高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定的、肺与淋巴结高转移人肝癌细胞系HCCLM3-R，CCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G。所述的肝癌细胞具有持续表达高强度红色荧光及绿色荧光的能力，其荧光强度不随肝癌细胞的连续传代(观察至36代)而丢失。荧光基因的整合和表达不影响肝癌细胞的主要生物学行为，为理想的、荧光示踪的肝癌细胞模型。

本发明获得的荧光表达肝癌细胞系，在体外常规的二维及三维细胞培养体系中生长良好，可用于肝癌生长、转移及死亡的分子机理研究；或作为抗肿瘤新药疗效判别的效应细胞。此外，还可作为裸鼠皮下接种的肝癌细胞，用于裸鼠皮下和肝脏原位荧光示踪肝癌模型的建立，为尽早发现裸鼠体内肝癌细胞复发与转移等生物学行为的变化提供参考，以及为在体抗肿瘤新药或其他干预治疗的效果评估提供便利。

本发明在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。

附图说明

图1、慢病毒包装质粒pLVTH的结构示意图。

图2、慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74的结构示意图。

图3、慢病毒包装质粒pMD2.G的结构示意图。

图4不同传代时间的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌细胞的红色荧光表达情况。

图5不同传代时间的HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌细胞的绿色荧光表达情况。

具体实施方式

实施例1

1、慢病毒包装质粒(Lentivirual vector):采用Lentivirus慢病毒载体系统(Tronolab公司)。该病毒包装系统由pLVTHM(图1)，pCMV-dR8.74(图2)和pMD2G(图3)三质粒组成，其中pLVTH含有RFP或GFP基因，由EF1(Elongation Factor)启动子驱动(图1)。pCMV-dR8.74含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子(图2)。pMD2G含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白(图3)。

2、质粒DNA的扩增:质粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G按常规方法转化大肠杆菌，用相应抗生素筛选阳性克隆，用DNA提取试剂盒(Qiagen公司)进行质粒DNA抽提，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Promega公司)进行质粒纯化。

3、慢病毒的包装与纯化:将10μg pLVTHM，5μg pCMV-dR8.74和3.5μg pMD2G的质粒DNA溶于1800μl无菌水中，加入200μl 2.5mol/LCaCl2溶液，混匀后再逐滴加入2000μl 2×BBS缓冲液，在室温放置20～30min。将上述DNA-磷酸钙混合液转染融合度为50％-70％的新鲜培养293细胞，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中，12小时后换新鲜细胞培养液，继续培养72小时，经低速离心、过滤和超速离心，收集上清液中的病毒颗粒。

4、病毒滴度的测定:用5×10⁵/100μl/孔的293细胞铺在96孔板中。用DMEM培养液10倍连续稀释病毒颗粒。12小时后吸尽96孔板中的细胞培养液，加人45μl病毒颗粒稀释液，37℃温育36小时后，更换含10％FBS的新鲜培养液，3天后在倒置荧光显微镜下检测GFP或RFP的表达量。以5个克隆细胞均为阳性的病毒最高稀释度为该批病毒的最终滴度。

5、HCCLM3和HCCLM6细胞的病毒感染:用1×10⁶/2ml/孔的HCCLM3和HCCLM6细胞铺在6孔板中，12小时后吸尽细胞培养上清液，加入2ml 5×10⁵-1×10⁶TU/ml病毒感染液，48小时后换用新鲜细胞培养液，72小时观察荧光表达细胞的阳性率。当HCCLM3和HCCLM6细胞的病毒感染率小于95％时，用400-600ng/ml的G418杀灭低表达或不表达荧光的细胞。

6、荧光表达细胞的扩增及表达稳定性的鉴定:荧光表达HCCLM3和HCCLM6细胞，经体外180天的连续传代培养，结果显示，肝癌细胞的荧光表达强度及表达率没有发生明显的改变。获得稳定表达红色和绿色荧光的HCCLM3和HCCLM6细胞。分别命名为HCCLM3-R(红色荧光)，HCCLM3-G(绿色荧光)，HCCLM6-R(红色荧光和HCCLM6-G(绿色荧光，)(图4，图5)。

7、荧光表达细胞的生物学功能验证:HCCLM3-R，HCCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G肝癌细胞的一般生物学特性为，多边形上皮样肿瘤细胞，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，可在裸鼠皮下及肝脏原位成瘤。HCCLM3-R和HCCLM3-G细胞的倍增时间、细胞周期、侵袭与转移能力与其母细胞HCCLM3相似；HCCLM6-R和HCCLM6-G细胞的倍增时间、侵袭与转移能力与其母细胞HCCLM6相似。

结果表明，本发明较现有技术明显地提高了红色荧光及绿色荧光蛋白编码基因的转染效率及对肝癌细胞染色体的整合效率；同时对红色及绿色蛋白编码基因通过有目的性的基因改造，有效地延缓了荧光淬灭的时间，增加荧光的强度；此外，免除了红色及绿色荧光表达的肝癌HCCLM3和HCCLM6细胞系的体外连续筛选程序。本发明所获得的红色荧光及绿色荧光标记的、肺与淋巴结高转移的人肝癌HCCLM3和HCCLM6细胞，经体外180天、36代的连续培养发现，红色及绿色荧光表达HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞具有荧光强度强、荧光不易被淬灭，荧光表达稳定，且不改变原有细胞生物学功能等特性，是较为理想的人高转移肝癌荧光示踪细胞。可在体外二维及三维细胞培养体系中作为荧光标记的实验细胞，用于肝癌生长、转移及死亡的分子机理研究；也可作为效疗判别细胞用于抗肝癌新药的疗效观察；也可作为裸鼠皮下接种的荧光标记肝癌细胞，用于荧光可视人高转移肝癌裸鼠皮下模型和肝脏原位模型的建立，用于肝癌早期复发与转移生物学行为的监视，以及在体药物或其他干预治疗效果的评估。

表1是慢病毒与其他常用病毒感染系统的特性比较。

表2是HCCLM3-R，HCCLM3-G与野生型HCCLM3的生物学特性比较。

表3是HCCLM6-R，HCCLM6-G与野生型HCCLM6的生物学特性比较。

表1

表2

表3:

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学附属中山医院

<120>稳定表达荧光蛋白的入肝癌高转移细胞株及其建立方法

<130>11

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>675

<212>DNA

<213>昆虫

<400>1

<210>2

<211>720

<212>DNA

<213>昆虫

<400>2

Claims

1、稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株，其特征是以HCCLM3或HCCLM6为母细胞，假慢病毒转染荧光蛋白编码基因，稳定发射红色或绿色荧光，命名为红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R或HCCLM6-R以及绿色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-G或HCCLM6-G，细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，分泌AFP蛋白。

2、按权利要求1所述的稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株，其特征是所述的荧光蛋白是具有序列1的红色荧光蛋白RFP或具有序列2的绿色荧光蛋白GFP。

3、按权利要求1所述的稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株，其特征是所述的HCCLM3-R和HCCLM6-R肝癌细胞的荧光显微镜观察条件是:激发波长为560nm、发射波长为585nm；HCCLM3-G和HCCLM6-G肝癌细胞的荧光显微镜观察条件是:激发波长为488nm、发射波长为509nm。

4、权利要求1的稳定表达荧光蛋白的人肝癌高转移细胞株的建立方法，其特征是采用荧光蛋白编码基因转染，用假慢病毒感染替代传统的脂质体转染方法，通过下述步骤:

1)采用肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞系HCCLM3和HCCLM6为母细胞，通过三种慢病毒包装质粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G在大肠杆菌中的质粒DNA扩增、回收和纯化；

2)纯化获得的三种质粒DNA按比例用CaCl₂方法共转染293细胞，产生可真核表达RFP或GFP荧光蛋白基因的假慢病毒颗粒，经病毒纯化、活性测定后，感染上述HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞株；

3)分别进行荧光表达肝癌细胞的扩增建系，获得高强度、染色体整合型、稳定表达红色或绿色荧光的、肺与淋巴结高转移的人肝癌细胞HCCLM3-R或HCCLM3-G或HCCLM6-R或HCCLM6-G。