CN115747288B - 一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。所述筛选方法采用慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系，通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视肿瘤细胞淋巴结自发转移裸鼠模型；之后分离筛选得到淋巴结转移不同时期高转移的细胞，通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞。本发明从不同阶段淋巴结转移灶中寻找高转移细胞株，实现了对原发灶母系肿瘤细胞与不同转移时期淋巴结转移细胞的动态研究。本发明的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并应用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。

Description

一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医学以及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。

背景技术

肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要原因。肿瘤转移主要取决于异质性群体中少数具有高转移潜能的细胞，这些独特的肿瘤细胞可能像干细胞一样具有启动转移能力，称之为转移起始细胞。转移起始细胞的分离及其分子表征的鉴定对肿瘤转移的基础医学研究和临床实践具有重要价值。然而，由于缺乏起始细胞转移特异性生物标志物，从疑似疾病组织的混合细胞群体中识别转移起始亚群仍然具有挑战性。

目前分离鉴定转移起始细胞的策略仅限于细胞表面标志物，由于缺乏多类型肿瘤普适且灵敏度和准确度高的标志物，这种方法难以获得不同特征的转移起始细胞。还可以利用血流剪切应力物理筛选，不过这种方法仅依据肿瘤经血道的一部分步骤，不适用于非血道转移的转移起始细胞筛选。

因此，现有的分离转移起始细胞亚群的方法还有待改进。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种转移起始细胞的筛选方法与应用，旨在解决现有技术中缺乏针对多类型肿瘤普适，且准确度高的转移起始细胞筛选方法的问题。

本发明的技术方案如下：

一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，包括步骤：

构建荧光标记肿瘤细胞；

将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；

收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；

对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行鉴定，筛选得到肿瘤转移起始细胞。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述构建荧光标记肿瘤细胞的具体步骤包括：

将表达荧光蛋白的质粒与慢病毒包装质粒共转染到包装细胞中，产生荧光蛋白慢病毒；

将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞，筛选得到表达荧光蛋白的所述荧光标记肿瘤细胞。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述肿瘤细胞包括食管鳞癌细胞、乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肠道癌细胞中的一种。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述肿瘤细胞为人源的肿瘤细胞。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型之后，还包括：

通过体内成像检查所述荧光标记肿瘤细胞在裸鼠淋巴结内的转移；在种植荧光标记肿瘤细胞一定时间后，切除裸鼠种植部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结进行后续检查，通过荧光信号确认裸鼠淋巴结转移状况。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系的具体步骤包括：

收集小鼠的肿瘤组织或淋巴结，并在无菌溶液中切碎；之后用胶原酶和DNA酶消化5-30分分，同时手动涡旋；终止消化后，用细胞过滤器过滤，收集得到单细胞悬浮液；之后对单细胞悬浮液进行离心并收集细胞，得到肿瘤原代细胞；将所述肿瘤原代细胞在筛选培养基中培养，筛选得到所述带有荧光标记的肿瘤细胞系。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述带有荧光标记的肿瘤细胞系包括原发灶肿瘤细胞和自发淋巴结转移肿瘤细胞。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，筛选得到肿瘤转移起始细胞后，还包括：对所述肿瘤转移起始细胞进行生物学功能检测。

所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其中，所述生物学功能检测包括：通过单细胞测序进行转录组分析，通过功能实验进行增殖以及远端转移能力检测，细胞干性鉴定。

一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的应用，其中，将如上任一所述的筛选方法得到的肿瘤转移起始细胞在抗肿瘤转移药物筛选或者制备抑制肿瘤转移的靶向药物中的应用。

有益效果：本发明提供了一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。先采用慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系；再通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视肿瘤细胞淋巴结自发转移裸鼠模型；之后分离筛选得到淋巴结转移不同时期高转移的细胞，最后通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞。本发明从不同阶段淋巴结转移灶中寻找高转移细胞株，实现了对原发灶母系肿瘤细胞与不同转移时期淋巴结转移细胞的动态研究；同时，通过建立的荧光可视自发淋巴结转移裸鼠模型，结合体内成像动态监测荧光强度对肿瘤自发转移情况进行动态监测，提高对早期自发淋巴结转移的细胞检测的敏感性，便于筛选肿瘤起始细胞。不仅如此，本发明的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并应用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的流程图。

图2为本发明实施例提供的荧光可视人食管癌自发淋巴结转移裸鼠模型及原代细胞提取扩增示意图。

图3为本发明实施例提供的KYSE180母系细胞与KYSE180-GFP细胞的绿色荧光强度的流式细胞对比图。

图4为本发明实施例提供的接种肿瘤细胞后第2、4及6周腘窝淋巴结内肿瘤细胞转移情况的流式细胞对比图。

图5为本发明实施例提供的自发淋巴结转移小鼠模型示意图以及食管癌自发淋巴结转移荧光可视细胞系来源淋巴结肿瘤转移情况示意图。

图6为本发明实施例提供的原发灶肿瘤细胞和早期、晚期淋巴结转移灶内肿瘤细胞的单细胞转录组分析。

图7为本发明实施例提供的细胞生长增殖及转移能力对比结果示意图。

图8为本发明实施例提供的细胞成球实验及免疫荧光鉴定结果示意图。

具体实施方式

本发明提供一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，如图1所示，包括步骤：

S10、构建荧光标记肿瘤细胞；

S20、将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；

S30、收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；

S40、对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行鉴定，筛选得到肿瘤转移起始细胞。

通过前期对小鼠足底-淋巴结自发转移模型研究，本发明发现荷瘤小鼠引流淋巴结中早期肿瘤转移负荷小的淋巴结转移中的肿瘤细胞具有转移起始细胞特征。利用这一特点，本发明首先通过慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系，通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视淋巴结自发转移裸鼠模型；然后在淋巴结转移形成的早期阶段，分离筛选淋巴结高转移细胞，通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞，过程如图2所示。本发明的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选及转移预后判断。

在一些实施方式中，所述荧光标记为绿色荧光(GFP)、红色荧光(RFP)、mCherry或其他任意合适的荧光标记。

在一些实施方式中，所述肿瘤细胞包括食管鳞癌细胞、乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞或肠道癌细胞中的一种，但不限于此。本发明的筛选方法针对多类型肿瘤，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，普适性强。

在一些实施方式中，所述肿瘤细胞为人源的肿瘤细胞。

具体的，人食管鳞癌细胞为KYSE18细胞。

在一些实施方式中，步骤S10的具体步骤包括：

S11、将表达荧光蛋白的质粒分别与慢病毒包装质粒共转染到包装细胞中，产生荧光蛋白慢病毒；

S12、将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞，筛选得到表达荧光蛋白的所述荧光标记肿瘤细胞。

具体的，可选择任意合适的表达荧光蛋白的质粒，例如表达绿色荧光蛋白的pCDH-EF1-copGFP-T2A-Puro质粒，之后可用嘌呤霉素选择慢病毒转导后稳定表达GFP的细胞；也可选择合适的表达其他荧光蛋白的质粒。

具体的，所述包装细胞可以为HEK293FT、HEK293T或其他合适的用于包装慢病毒的包装细胞。

在一些实施方式中，步骤S20中，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型之后还包括步骤：

通过体内成像检查所述荧光标记肿瘤细胞在裸鼠淋巴结内的转移；在种植荧光标记肿瘤细胞一定时间后，切除裸鼠种植部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结进行后续检查，通过荧光信号确认裸鼠淋巴结转移状况。

具体的，为建立自发淋巴结转移裸鼠模型，将一定数目(例如1-3×10⁶个)标记有荧光蛋白的肿瘤细胞注射到裸鼠的右后足垫，通过荧光或者生物发光体内成像检查在淋巴结内的转移情况。在注射肿瘤细胞后的2周至2个月之间收获小鼠，切除注射部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结(引流淋巴结)进行后续检查。通过流式细胞仪或者荧光显微镜检查淋巴结分离细胞或淋巴结切片中是否存在相应的荧光信号来确认是否存在淋巴结转移状况。

在一些具体的实施方式中，通过尾静脉注射体内转移实验以及体内致瘤和自发转移实验检测裸鼠的淋巴结转移状况。

具体的，尾静脉注射体内转移实验为：将GFP标记的肿瘤细胞通过尾静脉注射到小鼠体内；通过体内成像系统监测肿瘤在小鼠体内的转移情况；观察期结束后，处死小鼠并分离肺组织；对肺组织进行标准的固定、处理、包埋和切片，观察GFP荧光蛋白表达情况。

具体的，体内致瘤和自发转移实验为：将肿瘤细胞皮下注射到小鼠大腿附近的背部区域；通过仔细测量肿瘤大小，定期监测注射诱导的肿瘤，肿瘤体积通过公式计算：体积＝长度×宽度²×0.5；在观察期后，通常是接种后4-8周，通过体内图像或FACS评估肺和腹股沟LN的转移；将组织分离并固定在4％PFA中，然后进行组织处理、石蜡包埋、切片，观察荧光蛋白表达情况。

在一些实施方式中，步骤S30具体包括：

S31、收集小鼠的肿瘤组织或淋巴结，并在无菌溶液中切碎；

S32、之后用胶原酶和DNA酶消化5-30分分，同时手动涡旋；

S33、终止消化后，用细胞过滤器过滤，收集得到单细胞悬浮液；

S34、之后对单细胞悬浮液进行离心并收集细胞，得到肿瘤原代细胞；

S35、将所述肿瘤原代细胞在含有嘌呤霉素的培养基中培养，筛选得到所述带有荧光标记的肿瘤细胞系。

具体的，步骤S35之前，还包括使用台盼蓝对肿瘤原代细胞进行活力染色。

在一些实施方式中，根据来源位置不同，所述带有荧光标记的肿瘤细胞系命名为原发灶肿瘤细胞PT和自发淋巴结转移肿瘤细胞LNM。

在一些实施方式中，筛选得到肿瘤转移起始细胞后，还包括：对所述肿瘤转移起始细胞进行生物学功能检测。

在一些具体的实施方式中，所述生物学功能检测包括：通过单细胞测序进行转录组分析，通过功能实验进行增殖以及远端转移能力检测，细胞干性鉴定

具体的，增殖以及远端转移能力检测步骤为：分别将3×10⁶PT、LNM接种于4周龄20g雄性裸鼠右侧背部，检测肿瘤生长情况，记录肿瘤生长曲线，进行动态肺部荧光显像监测肺转移情况。

具体的，细胞干性鉴定步骤为：将状态良好的肿瘤转移起始细胞消化后离心收集，用PBS清洗细胞2次。进行细胞计数，用超低吸附的细胞培养板培养细胞(6孔板中每孔加入1000个细胞)。培养大约7天，观察细胞成球情况，并进行IF检测干性相关因子SOX2的表达情况。

本发明实施例还提供一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的应用，将上述筛选方法得到的肿瘤转移起始细胞用于抗肿瘤转移药物筛选或者制备抑制肿瘤转移的靶向药物。

本发明操作简单，可应用于不同肿瘤类型的的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选、制备抑制肿瘤转移的靶向药物以及转移预后判断。

下面通过具体实施例对本发明一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用做进一步的解释说明：

实施例1建立稳定表达GFP的食管鳞癌细胞

(1)将表达绿色荧光蛋白的pCDH-EF1-copGFP-T2A-Puro质粒(来自addgene,#72263)与慢病毒包装质粒共转染到HEK293FT细胞(来自Invitrogen)中以产生慢病毒；

(2)将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞KYSE180细胞中，用嘌呤霉素筛选得到稳定表达GFP的肿瘤细胞。

图3所示为流式细胞分析对比KYSE180母系细胞与KYSE180-GFP细胞的绿色荧光强度，流式细胞分析对比结果显示，KYSE180-GFP较KYSE180母系细胞绿色荧光强度明显大福增强。

实施例2建立肿瘤转移小鼠模型

(1)为建立自发淋巴结转移裸鼠模型，将20μl PBS中的3×10⁶个标记有GFP的肿瘤细胞注射到裸鼠的右后足垫。通过荧光或者生物发光体内成像检查在淋巴结内的转移情况。

(2)在注射肿瘤细胞后的2周、4周、6周收获小鼠。切除注射部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结(引流淋巴结)进行后续检查。通过流式细胞仪或者荧光显微镜检查淋巴结分离细胞或淋巴结切片中是否存在GFP信号来确认是否存在淋巴结转移状况。

(3)尾静脉注射体内转移实验：将绿色荧光蛋白标记的肿瘤细胞通过尾静脉注射到小鼠体内。利用PE IVIS Spectrum体内成像系统监测肿瘤在小鼠体内的转移情况。观察期结束后，在实验结束时处死小鼠并分离肺。肺组织进行了标准的固定、处理、包埋和切片。

(4)对于体内致瘤和自发转移实验，将肿瘤细胞皮下注射到小鼠大腿附近的背部区域。通过仔细测量肿瘤大小，定期监测注射诱导的肿瘤。肿瘤体积通过公式计算：体积＝长度×宽度2×0.5。在观察期后，通常是接种后4-8周，对小鼠实施安乐死。通过体内图像或FACS评估肺和腹股沟LN的转移。

图4所示为流式细胞分析对比接种肿瘤细胞后第2、4及6周，腘窝淋巴结内肿瘤细胞转移情况。将不同时期淋巴结解离为单细胞后，通过绿色荧光强度分析对比接种肿瘤细胞后第2、4及6周，腘窝淋巴结内肿瘤细胞转移情况。其中，方框中的散点代表淋巴结内的转移肿瘤细胞。数字代表转移肿瘤细胞数占淋巴结所有细胞数的百分比。如图4所示，发现第2周小鼠体内淋巴结中存在极少数转移肿瘤细胞，第4周与6周发展成早期转移淋巴结及晚期转移淋巴结。

将转移淋巴结分离并固定在4％PFA中，然后进行组织处理、石蜡包埋、切片，免疫荧光如图5所示，绿色荧光强度提示肿瘤淋巴结转移强度。图5所示为自发淋巴结转移小鼠模型示意图和食管癌自发淋巴结转移荧光可视细胞系来源淋巴结肿瘤转移情况，其中，A)脚踝注射GFP标记肿瘤细胞从而自发淋巴结转小鼠模型构建的示意图；B)HE显示注射肿瘤细胞后，引流腘窝淋巴结中的肿瘤细胞早期(左)和晚期(右)转移情况图。其中，虚线圆圈内为转移肿瘤；C)绿色荧光显示注射肿瘤细胞后引流腘窝淋巴结中的的肿瘤细胞早期(左)和晚期(右)转移情况图。其中，其中，虚线内为GFP标记的转移肿瘤细胞。

实施例3转移肿瘤细胞分离

收集来自小鼠的肿瘤组织或淋巴结并在无菌PBS溶液中切碎。随后，每个样品在37℃下用Liberase(0.1mg/ml；Roche)和DNAse I(0.1mg/mL Sigma)在PBS中消化5-30分分，同时手动涡旋。用含有10％胎牛血清(FBS，ThermoFisher Scientific)的DMEM培养基终止解离，并依次通过70-μm和40-μm细胞过滤器过滤以收集单细胞悬浮液。滤液在4℃300×g离心5分分，用培养基洗涤两次。使用台盼蓝对细胞进行活力染色。然后将原代细胞铺板在含有嘌呤霉素的培养基中的组织培养瓶上，以选择源自原发性肿瘤或转移性淋巴结的人肿瘤细胞。根据来源位置及时间不同将其进行以下命名：原发灶肿瘤细胞PT；自发淋巴结转移肿瘤细胞LNM。

实施例4转移起始细胞生物学功能检测

(1)通过单细胞测序对转录组进行测序分析

图6所示为单细胞转录组分析原发灶肿瘤细胞和早期、晚期淋巴结转移灶内肿瘤细胞的转录组。其中，A)分群分析显示早期淋巴结转移灶内肿瘤细胞富含干细胞样转移起始细胞亚群；B)细胞亚群的标志基因表达提示转移起始细胞具有多能性调控基因。由图6可知，早期淋巴结转移细胞较原发灶和晚期淋巴结转移肿瘤细胞具有明显多能性、抗药性及间质性，具有较强的转移起始细胞特征。

(2)增殖及远端转移能力

分别将3×10⁶PT、LNM接种于4周龄雄性裸鼠右侧背部，检测肿瘤生长情况，记录肿瘤生长曲线，进行动态肺部荧光显像监测肺转移情况。

图7所示为细胞生长增殖及转移能力对比。其中，A)裸鼠皮下接种分别从荷瘤小鼠原发灶和早期转移灶分离到的PT和LNM亚细胞系30天后小鼠皮下成瘤代表图；B)裸鼠皮下接种分别从荷瘤小鼠原发灶和早期转移灶分离到的PT和LNM亚细胞系30天后小鼠肺器官荧光代表成像图。如图7A所示，接种30天后，两个亚细胞系成瘤能力一致，但7B荧光成像显示LNM组较PT组小鼠肺部绿色荧光程度明显更高，显示LNM(早期淋巴结转移细胞)具有起始肺转移的能力。

(3)细胞干性

将状态良好的细胞胰酶(0.25％Trypsin-EDTA，gibco)消化后离心收集，PBS清洗细胞2次。细胞计数，用超低吸附的细胞培养板培养细胞(6孔板中每孔加入1000个细胞)。培养14天，观察细胞成球情况。

图8所示为细胞成球实验及免疫荧光鉴定结果示意图。其中，A)从原发灶和早期淋巴结转移灶分别分离到的PT和LNM细胞在干性培养基中生长14天后形成的肿瘤细胞微球体示意图；B)PT和LNM细胞形成肿瘤微球体的数目对比柱状图；C)免疫荧光成像显示干性调控基因Sox2在PT和LNM细胞形成肿瘤微球体中的表达情况。如图8A所示，LNM的成球能力明显高于PT，并进行IF检测干性相关因子SOX2(11064-1-AP，proteintech)的表达情况，如图8B，发现LNM具有更高的SOX2表达水平。最终发现，早期淋巴结微转移灶细胞具有更强的癌干性。

综上所述，本发明提供了一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法与应用。先采用慢病毒荧光蛋白编码基因转染技术，建立荧光示踪的肿瘤细胞系；再通过裸鼠脚踝皮下种植肿瘤细胞构建相应荧光可视肿瘤细胞淋巴结自发转移裸鼠模型；之后分离筛选得到淋巴结转移不同时期高转移的细胞，最后通过肿瘤细胞生物学特性检测得到肿瘤转移起始细胞。本发明从不同阶段淋巴结转移灶中寻找高转移细胞株，实现了对原发灶母系肿瘤细胞与不同转移时期淋巴结转移细胞的动态研究；同时，通过建立的荧光可视自发淋巴结转移裸鼠模型，结合体内成像动态监测荧光强度对肿瘤自发转移情况进行动态监测，提高对早期自发淋巴结转移的细胞检测的敏感性，便于筛选肿瘤起始细胞。不仅如此，本发明的筛选方法操作简单，可应用于不同肿瘤类型的肿瘤细胞系或临床组织中转移起始细胞的分离筛选，并应用于后续转移机理研究、抗肿瘤转移药物筛选以及肿瘤转移预后判断。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，包括步骤：

构建荧光标记肿瘤细胞；

将所述荧光标记肿瘤细胞种植入裸鼠体内，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型；

收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系；

对带有荧光标记的肿瘤细胞系进行肿瘤细胞生物学特性检测，筛选得到早期淋巴结转移肿瘤细胞具有肿瘤转移起始细胞特性；

所述肿瘤细胞系包括原发灶肿瘤细胞、早期淋巴结转移肿瘤细胞、晚期淋巴结转移肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述构建荧光标记肿瘤细胞的具体步骤包括：

将表达荧光蛋白的质粒与慢病毒包装质粒共转染到包装细胞中，产生荧光蛋白慢病毒；

将荧光蛋白慢病毒转导入肿瘤细胞，筛选得到表达荧光蛋白的肿瘤细胞；

3.根据权利要求2所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞包括食管鳞癌细胞、乳腺癌细胞、鼻咽癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肠道癌细胞中的一种。

4.根据权利要求2所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为人源的肿瘤细胞。

5.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，构建荧光标记肿瘤细胞的淋巴结自发转移裸鼠模型之后，还包括：

通过荧光或者生物发光体内成像检查所述荧光标记肿瘤细胞在裸鼠淋巴结内的转移；在种植荧光标记肿瘤细胞一定时间后，切除裸鼠种植部位的原发肿瘤和右侧腘窝淋巴结进行后续检查，通过荧光信号确认裸鼠淋巴结转移状况。

6.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，收集来自所述淋巴结自发转移裸鼠模型的小鼠肿瘤组织或淋巴结，从所述肿瘤组织或淋巴结中分离带有荧光标记的肿瘤细胞系的具体步骤包括：

收集小鼠的肿瘤组织或淋巴结，并在无菌溶液中切碎；之后用胶原酶和DNA酶消化5-30分钟，同时手动涡旋；终止消化后，用细胞过滤器过滤，收集得到单细胞悬浮液；之后对单细胞悬浮液进行离心并收集细胞，得到肿瘤原代细胞；将所述肿瘤原代细胞在筛选培养基中培养，筛选得到所述带有荧光标记的肿瘤细胞系。

7.根据权利要求6所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述带有荧光标记的肿瘤细胞系包括原发灶肿瘤细胞和自发淋巴结转移肿瘤细胞。

8.根据权利要求1所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，筛选得到肿瘤转移起始细胞后，还包括：对所述肿瘤转移起始细胞进行生物学功能检测。

9.根据权利要求8所述的肿瘤转移起始细胞的筛选方法，其特征在于，所述生物学功能检测包括：通过单细胞测序进行转录组分析，通过功能实验进行增殖以及远端转移能力检测，细胞干性鉴定。

10.一种肿瘤转移起始细胞的筛选方法的应用，其特征在于，将如权利要求1-9任一所述的筛选方法得到的肿瘤转移起始细胞在抗肿瘤转移药物筛选或者制备抑制肿瘤转移的靶向药物中的应用。