JP2022089919A - 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ - Google Patents
循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022089919A JP2022089919A JP2022068266A JP2022068266A JP2022089919A JP 2022089919 A JP2022089919 A JP 2022089919A JP 2022068266 A JP2022068266 A JP 2022068266A JP 2022068266 A JP2022068266 A JP 2022068266A JP 2022089919 A JP2022089919 A JP 2022089919A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ctc
- cells
- unipro
- gfp
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title abstract description 66
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 title abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 28
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 33
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 19
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 17
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 abstract description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 35
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 32
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 29
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 29
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 25
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 14
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 10
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 6
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 5
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 5
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 4
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 1
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100049401 Human papillomavirus type 16 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001443980 Oplophoridae Species 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000018732 detection of tumor cell Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/20042—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
- C12N2710/22041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/22043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/01—DNA viruses
- G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/91045—Acyltransferases (2.3)
- G01N2333/91051—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1)
- G01N2333/91057—Acyltransferases other than aminoacyltransferases (general) (2.3.1) with definite EC number (2.3.1.-)
- G01N2333/91062—Chloramphenicol-acetyltransferases (2.3.1.28)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【課題】循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブの提供。【解決手段】血流中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得るパピローマウイルスおよび改変ＳＶ４０に基づくプローブ、このようなプローブを製造するための方法、およびこのようなプローブを使用するための方法が開示される。一実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることによって、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの上記改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリによって、作製される。【選択図】なし
Description
関連出願の参照
本出願は、２０１８年２月１４日出願の米国仮出願第６２／６３０，５７０号（その全体において本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
本出願は、２０１８年２月１４日出願の米国仮出願第６２／６３０，５７０号（その全体において本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
政府の権益に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所の国立がん研究所によって与えられた１ Ｒ０１ ＣＡ１８７９２３－０１Ａ１および１ Ｒ０１ ＣＡ２０３８５２－０１の下で政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所の国立がん研究所によって与えられた１ Ｒ０１ ＣＡ１８７９２３－０１Ａ１および１ Ｒ０１ ＣＡ２０３８５２－０１の下で政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、血流中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得るプローブ、およびこのようなプローブを使用してＣＴＣを検出するための方法に関する。
本発明は、血流中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するために使用され得るプローブ、およびこのようなプローブを使用してＣＴＣを検出するための方法に関する。
発明の背景
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍または転移部位のいずれかから血流へと入った悪性腫瘍細胞である。ＣＴＣは、腫瘍増殖の比較的初期のステージで循環血液中に出現すると考えられている。ＣＴＣは、リキッドバイオプシーを経て容易に入手できることから、それらは、腫瘍学において、早期診断の可能性、化学療法有効性およびがんの予後の評価、ならびに個体特異的抗がん薬の選択を含む種々の適用にとって魅力的な供給源である。しかし、近年の集中的な研究にも拘わらず、血液中のＣＴＣの単離および／または検出のための効果的でかつ単純な方法は未だになく、予後不良をもたらしている。これは、比較的後期のステージまで明確で特有の臨床上の症状を生じないこともある内臓腫瘍（例えば、膵臓がんおよび肺がん）に特にあてはまる。いくつかの理由が、ＣＴＣの検出のための効率的方法がないということに寄与している。第１に、ＣＴＣは、全血球量のうちのごくわずかな部分であるに過ぎない。第２に、ＣＴＣは、これらが由来する腫瘍細胞と同様に、全ての悪性腫瘍細胞タイプの中で、特有の、十分に定義されたユニバーサルな表面マーカーを欠いている。第３に、多くのＣＴＣは上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けており、これにより、悪性度と関連する表面マーカーの変化が生じ得ると考えられている。
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、原発腫瘍または転移部位のいずれかから血流へと入った悪性腫瘍細胞である。ＣＴＣは、腫瘍増殖の比較的初期のステージで循環血液中に出現すると考えられている。ＣＴＣは、リキッドバイオプシーを経て容易に入手できることから、それらは、腫瘍学において、早期診断の可能性、化学療法有効性およびがんの予後の評価、ならびに個体特異的抗がん薬の選択を含む種々の適用にとって魅力的な供給源である。しかし、近年の集中的な研究にも拘わらず、血液中のＣＴＣの単離および／または検出のための効果的でかつ単純な方法は未だになく、予後不良をもたらしている。これは、比較的後期のステージまで明確で特有の臨床上の症状を生じないこともある内臓腫瘍（例えば、膵臓がんおよび肺がん）に特にあてはまる。いくつかの理由が、ＣＴＣの検出のための効率的方法がないということに寄与している。第１に、ＣＴＣは、全血球量のうちのごくわずかな部分であるに過ぎない。第２に、ＣＴＣは、これらが由来する腫瘍細胞と同様に、全ての悪性腫瘍細胞タイプの中で、特有の、十分に定義されたユニバーサルな表面マーカーを欠いている。第３に、多くのＣＴＣは上皮間葉転換（ＥＭＴ）を受けており、これにより、悪性度と関連する表面マーカーの変化が生じ得ると考えられている。
現在、ＣＴＣの単離／同定ストラテジーには２つの大きな分類がある：１）特有の生体マーカー（すなわち、ＥｐＣＡＭ）の免疫学的認識に依拠する免疫ベースの捕捉／検出（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、および２）ＣＴＣの物理的特性を利用する技術である。各ストラテジーは、特有の欠点を有する。
第１の検出方法、免疫ベースの捕捉／検出（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）に関しては、ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨＴＭは、免疫ベースの捕捉アプローチの例であり、ＣＴＣ検出に関してＦＤＡ承認を受けている唯一の方法である。その方法は、まず鉄ナノ粒子にコンジュゲートした抗ＥｐＣＡＭ抗体を通じてＣＴＣを結合させ、続いて、磁石で捕捉することによって全血中のＣＴＣを富化する。次いで、ＣＴＣは、以下によってさらに特徴づけられ、確認される：１）有核細胞を同定するためのＤＡＰＩ染色、２）上皮構造サイトケラチン（ＣＫ８、ＣＫ１８、およびＣＫ１９）に関するさらなる抗体染色、ならびに３）ＣＴＣを循環白血球（ＷＢＣ）から区別する抗ＣＤ４５。これは、扱いづらくかつコストのかかる検出方法である。より重要なことには、この方法は、血液中の比較的小さな割合のＣＴＣを捕捉し得るに過ぎず、これは主に、腫瘍細胞および検出のために依拠する生体マーカーの不均一性に起因する。
第２の検出方法、ＣＴＣの物理的特性を利用することに関しては、物理的特性に基づくＣＴＣの単離は、ＣＴＣの比較的大きなサイズに主に依拠する。この原理に基づくいくつかの方法が報告されている。それらは、特定の孔サイズを有するフィルターベースの膜、富化ストラテジーにおいてＣＴＣのサイズおよび変形する能力の両方に依存する微小流体デバイス、ならびに密度遠心分離とサイズベースの濾過と統合したデバイスを使用することを含む。物理的特性に基づく単離の主な欠点のうちの１つは、多くの血球（例えば、単球／マクロファージ）が、サイズにおいて類似であるか、またはＣＴＣよりさらに大きく、そのため単離手順後にＣＴＣから分離されないことである。よって、物理的特性に基づく方法から単離されたＣＴＣは頻繁に、免疫染色またはＲＴ－ＰＣＲ分析（これは、扱いづらくかつコストがかかる）のいずれかによってさらに確認される必要がある。
従って、血液中のＣＴＣの単離および／または検出のための効果的かつ単純なデバイスおよび方法は、当該分野で必要である。
発明の要旨
本明細書で開示されるある種の実施形態の要旨は、以下でさらに記載される。この節が、読み手にある種の実施形態の簡潔な要旨を提供するために示されているに過ぎず、これらの説明が、本出願の範囲を限定するとは意図されないことが理解される。実際に、本開示は、本明細書で示されていないこともある種々の実施形態を含み得る。
本明細書で開示されるある種の実施形態の要旨は、以下でさらに記載される。この節が、読み手にある種の実施形態の簡潔な要旨を提供するために示されているに過ぎず、これらの説明が、本出願の範囲を限定するとは意図されないことが理解される。実際に、本開示は、本明細書で示されていないこともある種々の実施形態を含み得る。
血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブが、このようなプローブを製造するための方法、およびこのようなプローブを使用してＣＴＣを検出するための方法を含めて本明細書で開示される。一実施形態において、そのプローブは、ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた改変ＳＶ４０ウイルスを含み得る。そのプローブは、マーカー遺伝子を含み得、上記マーカー遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質が挙げられ得る。一実施形態において、上記ＳＶ４０ウイルスは、内因性開始コドンを排除することによるもの、４個の７２塩基対（ｂｐ）縦列反復エンハンサー配列を挿入することによるもの、ならびに／または野生型ＳＶ４０において、ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へ、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへ、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへ、および／もしくはヌクレオチド３２２をＧからＣへと置換することによるものを含む、少なくとも３つの方法で改変され得る。
一実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることによって、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの上記改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリによって、作製される。
別の実施形態において、本明細書で開示されるプローブは、血液中のＣＴＣを検出するために使用される。患者から血液が集められ、ＰＢＭＣおよびＣＴＣのような有核細胞がその血液から単離される。単離した有核細胞および本明細書で開示されるプローブを含む混合物が調製され得る。いったん混合されると、上記ＣＴＣは、その混合物中で検出され得る。
前述の要旨ならびに以下の詳細な説明は、添付の図面および配列表とともに読まれる場合によりよく理解される。例証目的のみのために、ある種の実施形態が図面の中で示される。しかし、本明細書で開示される発明の概念が図面に示される正確な配置および手段に限定されないことが理解される。
発明の詳細な説明
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本明細書で示される発明の概念が、それらの適用において、以下の説明で示されるかまたは図面の中で図示される構築の詳細または構成要素の配置に限定されないことが、理解されるべきである。本明細書で使用される表現法および用語法が説明目的に過ぎず、限定とみなされるべきではないことも理解されるべきである。
少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本明細書で示される発明の概念が、それらの適用において、以下の説明で示されるかまたは図面の中で図示される構築の詳細または構成要素の配置に限定されないことが、理解されるべきである。本明細書で使用される表現法および用語法が説明目的に過ぎず、限定とみなされるべきではないことも理解されるべきである。
記載される特徴のうちのいずれか１つが、別個に、または他の特長と組み合わせて使用され得ることもさらに理解されるべきである。他の考案されたシステム、方法、特徴および利点は、図面および本明細書中の詳細な説明を試験する際に、当業者に明らかであるかまたは明らかになる。全てのこのようなさらなるシステム、方法、特徴、および利点は、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
血液中のＣＴＣを極めて高感度で正確に検出する単純な手順において使用され得る新規なユニバーサルプローブが、本明細書で開示される。本明細書で使用される場合、用語「ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ」とは「ＣＴＣユニバーサルプローブ」を表し、２つの重要な構成要素を含む新規なプローブである。その第１の構成要素である、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）および／もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）もしくは他の種に由来するパピローマウイルスのＬ１およびＬ２タンパク質から形成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、そのプローブが他の血球ではなくＣＴＣに選択的に侵入することを可能にする。これにより、そのプローブは、血流中でＣＴＣを検出するための極めて高度の特異性を得る。その第２の構成要素である、マーカー遺伝子を含みＶＬＰにパッケージングされる本明細書で開示される改変ＳＶ４０ウイルスゲノムは、そのプローブが、腫瘍細胞内で大々的に増幅されることを可能にする。これにより、そのプローブは、血中で希にしか現れずかつ低濃度であるＣＴＣを検出するための高い感度を得る。専らＳＶ４０に基づくプローブに伴う大きな問題は、それらがＣＴＣに加えて他の血球（例えば、Ｔ細胞および単球）にも進入し得ることである。ＳＶ４０キャプシドをＨＰＶまたは他のパピローマウイルスから形成されるＶＬＰで置き換えることは、がん細胞の大部分が上皮起源のものであり、パピローマウイルスが専ら上皮細胞に感染するという事実を利用する。従って、この新規なプローブは、ＨＰＶ－ＶＬＰ媒介性進入の特異性およびＳＶ４０増幅によって提供される感度を併せ持つ。
健常ドナーから調製された単核細胞を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を有するＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏと混合する場合、単一のＧＦＰ陽性細胞は検出されない。健常ドナーから調製された同じ単核細胞をルシフェラーゼマーカー遺伝子を有するＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏと混合する場合、非常に低いバックグラウンドシグナルのみが高感度の機械で検出された。これらは、そのプローブの極度の特異性を証明する。なぜならそのプローブは、いかなる正常な血球をも検出しないからである。しかし、腫瘍細胞を添加した同じ単核細胞をこのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏと混合した場合、その腫瘍細胞は高い精度および感度で検出される。その同じ実験を、異なる組織起源のほぼ十数種の腫瘍細胞で反復し得、各場合において、その添加した腫瘍細胞はそのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏで容易に検出される。これは、そのプローブが、実質的に全ての腫瘍タイプを検出するためにユニバーサルに使用され得ることを証明する。タグ化膜タンパク質を有するＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、さらなる分析のためにＣＴＣを正確に集めることを可能にする。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、ＣＴＣを簡便に信頼性高く検出するための特異的かつ高感度のプローブであり、これは、広範囲のがんタイプのより早期の診断、化学療法有効性およびがん予後のより良好な評価、ならびに個体特異的抗がん薬のより良好な選択をもたらし得る。
一実施形態において、そのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、改変ＳＶ４０ウイルスに基づく。これは、短期間内で非常に大きな増幅を受け得、検出における高感度を可能にする。
一実施形態において、プローブの選択性を増大させるために、そのＳＶ４０ウイルスは、元のキャプシドをウイルス様粒子で置き換えることによって改変され得る。例えば、そのキャプシドは、ヒトパピローマウイルス１６のＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質によって形成され得る。
一実施形態において、そのプローブは、ＳＶ４０ウイルスの改変によって調製され得、その結果、そのプローブは、検出を容易にするためにマーカー遺伝子を有する。例示に過ぎないが、そのマーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、またはタグ（例えば、ＨＡタグ）を含む膜タンパク質であり得る。そのマーカー遺伝子は、ＳＶ４０後期プロモーターの下流に挿入され、その結果、そのマーカーはそのウイルスとともに増幅し、ウイルスを検出可能にする。ＳＶ４０遺伝子の後期プロモーターも改変され得、マーカー遺伝子の増幅を増大させる。例えば、ＳＶ４０内因性開始コドンからの干渉は、野生型ＳＶ４０におけるヌクレオチド３３５のアデニン（Ａ）をシトシン（Ｃ）で置換する（配列番号１において７０８をＡからＣにするものとして示される）ことによって排除され得、これは、そのマーカー遺伝子の発現を促進する。なお別の実施形態において、配列番号１２にさらに示される７２塩基対エンハンサー配列（配列番号１の２５２～３２３）はさらに４回反復され（配列番号１３）、２８８ｂｐのエンハンサーとして挿入され、後期プロモーターの活性を強化する。さらに、野生型ＳＶ４０において２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へ、２９９をＣからＴへ、および３０４をＣからＴへ（配列番号１において６７１、６７２および６７７をＣからＴにするものとして示される）とする一連のヌクレオチド置換も、後期プロモーターの活性を強化し得る。さらなる改変は、野生型ＳＶ４０において３２２番においてＧからＣへのヌクレオチド変異（配列番号１において６９５をＧからＣにするものとして示される）を含み得る。全てのこれらの改変は、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏの極めて高い検出感度を可能にするために重要である。
例示に過ぎないが、図１Ａ～図１Ｃは、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏプローブの構築を図示する。そのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ（図１Ｃ）は、ｐＳＶ－ＧＦＰ（図１Ａ）およびｐＨＰＶＬ１，２（図１Ｂ）を２９３ＴＴ細胞（これは、高レベルのＳＶ４０のラージＴおよびスモールＴ抗原を発現する１４）に共トランスフェクトすることによって形成され得る。他の哺乳動物細胞も、生成効率がわずかに低いとはいえ使用され得る。そのｐＳＶ－ＧＦＰは、ＨＰＶに由来するキャプシド内部にパッケージされる。４８～７２時間後にその細胞は集められ、溶解緩衝液でまたは超音波処置を通じて溶解され得る。そのプローブは、細胞デブリを遠心沈殿させた後にその上清を採取することによって集められ得る。別の実施形態において、そのプローブは、ＧＥ Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００カラムを通過させ、次いでＰＤ－１０カラムを通過させることによって、または他の精製手順によってさらに精製され得る。
なお別の実施形態において、そのプローブの力価は、その採取したプローブの連続希釈物と２９３ＴＴ細胞とをインキュベートすることによって力価測定され得、ここでＧＦＰ陽性細胞は、フローサイトメトリーによって定量され得る。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏプローブは、精製Ｌ１とｐＳＶ－ＧＦＰ構築物とを混合することによって、またはＬ１およびＬ２でトランスフェクトした２９３ＴＴ細胞から採取したＶＬＰとｐＳＶ－ＧＦＰ構築物とを混合することのいずれによっても、インビトロでアセンブリされ得る。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ － 健常細胞からの腫瘍細胞の選択的検出
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、腫瘍細胞のみを検出する。例えば、２種の異なるヒト肺がん細胞株に由来する腫瘍細胞および健常血液に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、等量のＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏと混合し、２４～７２時間インキュベートし得る。図３Ａに示されるように、蛍光顕微鏡下で撮影した写真は、ＧＦＰ陽性細胞が肺がん細胞株において広く検出されること、およびＧＦＰ陽性細胞がＰＢＭＣで検出されないことを示す。２８種の腫瘍細胞株（以下の表１で同定される）に由来する腫瘍細胞および３名の異なるドナーに由来するＰＢＭＣを使用する実施形態において、そのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、類似の結果を達成した。
表１．腫瘍細胞株
表１．腫瘍細胞株
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ － プローブ中のＴ抗原の存在の結果としての腫瘍細胞中での自己増幅
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、広く種々の悪性腫瘍細胞において自己増幅し得る。例えば、一実施形態において、コントロール構築物は、そのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏと同じＨＰＶキャプシド殻の中にパッケージされ得る。図２Ａ～２Ｂに図示されるように、このコントロールは、強力な哺乳動物プロモーター、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ－Ｐ）によって駆動されるＧＦＰ、およびＳＶ４０複製起点（Ｏｒｉ）およびプロモーターを含むｐｃＤＮＡ－ＧＦＰコントロール構築物（図２Ａ）を含み得る。そのコントロール構築物（図２Ｂ）は、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰコントロール構築物（図２Ａ）およびｐＨＰＶＬ１，２（図１Ｂ）を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることによって形成され得る。そのｐｃＤＮＡ－ＧＦＰコントロール構築物は、ＨＰＶに由来するキャプシドの内部へとパッケージされる。そのｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ単独では、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ中に含まれ自己増幅に必要なＴ抗原１５を欠いている。
一実施形態において、２種のヒト肺がん細胞株（Ａ５４９および５８３８）は、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏまたはｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ コントロール構築物のいずれかとともにインキュベートされ得る。図３Ｂに示されるように、２４時間後および７２時間後にｐｃＤＮＡ－ＧＦＰを含むウェルにおいてＧＦＰは低く検出される。対照的に、図３Ｃに示されるように、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏを含むウェルにおいて高レベルのＧＦＰが存在し、これは、そのプローブの顕著な増幅を示す。当業者は、その高い増幅がＴ抗原の存在に起因することを理解する。
なお別の実施形態において、２９３ＴＴ細胞（これは、自己増殖に必要なＴ抗原を発現する）は、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ構築物およびＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏの両方とともにインキュベートされ得る。例示に過ぎないが、図３Ｂは、ｐｃＤＮＡ－ＧＰＦおよび２９３ＴＴ細胞を有するウェルにおけるＧＦＰ発現の増大を示し、これはＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏおよび２９３ＴＴ細胞が代わりに使用される図３Ｃに認められるものに類似する。繰り返しになるが、当業者は、２９３ＴＴ細胞におけるｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ構築物によるＧＦＰの増強された検出が、自己増幅を引き起こすＴ抗原の付加に起因することを理解する。
なお別の実施形態において、蛍光イルミネーターは、２９３ＴＴ細胞の添加ありでも添加なしでも、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏおよびｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ構築物によるＧＦＰ発現を定量するために使用され得る（各インキュベーションに関して三連のウェル）。図４は、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏがＣＴＣに進入後におよそ８０倍自己増幅し得ること（つまり、検出感度の顕著な増強）を図示する。Ｔ抗原から生じる増幅の増大は、Ｔ抗原が自己増幅に必要であること、およびＴ抗原の発現を操作することによって自己増幅がさらに改善され得ることを含むことも明らかに示す。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ － 広い範囲の腫瘍細胞の検出
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、広い範囲の腫瘍細胞を検出し得る。例示に過ぎないが、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが希なＣＴＣを検出する能力を決定するために、５００万個のヒトＰＢＭＣを種々の数の腫瘍細胞と混合し得、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏとともにインキュベートし得る。図５に示されるように、ＣＴＣは、ＰＢＭＣ中のＣＴＣの濃度が１：５，０００，０００程度の低さである場合ですら、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏによって検出され得る。
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、ＣＴＣを極めて高感度で定量的に検出し得る。例示に過ぎないが、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが希なＣＴＣを検出する能力を決定するために、５００万個のヒトＰＢＭＣを、種々の数の腫瘍細胞と混合し得、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏとともにインキュベートし得る。図７に示されるように、ＣＴＣは、ＰＢＭＣ中のＣＴＣの濃度が１：５，０００，０００程度の低さである場合ですら、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏによって定量的に検出され得る。
別の実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、種々の組織起源の悪性腫瘍細胞に由来するＣＴＣを検出し得る。例示に過ぎないが、ＰＢＭＣを４８タイプを超える腫瘍細胞と混合し得、その混合物中のそれらの全てをＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏで容易に検出し得る。例示に過ぎないが、図３Ａは、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰではなくＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが、３種の異なる器官組織起源の腫瘍細胞（肺に由来するＨ１９４４およびＨ３５８、肝臓に由来するＨｕｈ－７、および前立腺に由来するＰＣ－３）を容易に検出し得ることを示す。従って、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、多くの異なる組織に由来するＣＴＣ（表１に列挙されるとおり）を検出するにあたってユニバーサルな能力を有する。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏ － 他のウイルスベースの検出方法との比較
一実施形態において、本明細書で記載されるＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、他の検出器より高感度で血流中のＣＴＣを検出し得る。例えば、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によるＣＴＣの検出と比較される。ＨＳＶは、ＣＴＣを検出し得るが、正常血球（例えば、リンパ球、単球、および樹状細胞）にも感染し得、特異性の問題をもたらす１６～２０。Ｂａｃｏ－１（ＨＳＶ－１に由来する）およびＦｕｓＯｎ－Ｈ２（ＨＳＶ－２に由来する）は、ＧＦＰ遺伝子を含む２１，２２。ヒトＰＢＭＣは、Ｂａｃｏ－１、ＦｕｓＯｎ－Ｈ２、またはＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏのいずれかとインキュベートされ得る。図６は、インキュベーション後２４時間程度の期間での腫瘍溶解性ＨＳＶを含むウェルにおけるＧＦＰ検出、および７２時間のインキュベーション後のＧＦＰ検出の顕著な増大を図示する。比較において、ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏを含むウェルでは、７２時間後にＧＦＰ陽性細胞は検出されなかった。腫瘍溶解性ＨＳＶをＣＴＣの検出に使用した場合、それらは顕著な偽陽性診断を生じると思われる。さらに、ＨＳＶは、その細胞溶解性の性質に起因して短い時間量でＣＴＣを破壊し得、ＣＴＣの不正確な定量を引き起こし、ＣＴＣのその後の採取の可能性を排除する。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、ＨＰＶ－１６が上皮細胞にのみ感染する能力２３に起因してＣＴＣに対して極めて高い特異性を有する。これは、臨床状況において、がん患者から血液が採血され、そこからＰＢＭＣが単離されるからである。ＰＢＭＣは上皮起源ではないので、それらはＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが検出（すなわち、感染）できない（例えば、図３Ａに示されるとおり）。ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏによって検出され得る唯一の細胞は、ＰＢＭＣに含まれるＣＴＣのみである。
一実施形態において、がん患者の血液が集められる。血液からＰＢＭＣは分離され、そのＰＢＭＣは、本明細書で記載されるＣＴＣ－Ｕｎｉｐｒｏによる検出の前に種々の比で腫瘍細胞と混合される。次いで、ＣＴＣは、ＣＴＣ－Ｕｎｉｐｒｏを使用して検出され得る。そのＣＴＣ－Ｕｎｉｐｒｏは、例えば、緑色としてＣＴＣを示すことによって、それらを同定し得る（例えば、図５）。
細胞株およびＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏの構築のためのウイルス
２９３ＴＴ細胞株を、国立がん研究所から得た。肺がん細胞株Ａ５４９、Ｈ１９４４、５８３８およびＨ３５８、ならびにアフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。２９３ＴＴ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１００ユニット／ｍＬ ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１％ 非必須アミノ酸、および１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充したＤＭＥＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中で培養した。他の細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を、５％ ＣＯ２を有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベースの腫瘍溶解性ウイルスＢａｃｏ－１およびＨＳＶ－２ベースのＦｕｓＯｎ－Ｈ２を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて最初から構築した。両方のウイルスはＧＦＰ遺伝子を含むので、それらの感染は、緑色の蛍光細胞またはプラークの出現によって容易に同定可能であり得る。それらを増幅させ、本明細書で記載されるようにＶｅｒｏ細胞で力価測定した。ＧＦＰの代わりにＬｕｃ遺伝子は、より正確な定量的測定を可能にし得る。タグ（例えば、ＨＡタグ）を含む膜タンパク質は、磁性ビーズにコンジュゲートした抗ＨＡ抗体の使用を通じて、ＣＴＣのその後の容易な採取を可能にし得る。
２９３ＴＴ細胞株を、国立がん研究所から得た。肺がん細胞株Ａ５４９、Ｈ１９４４、５８３８およびＨ３５８、ならびにアフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。２９３ＴＴ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、１００ユニット／ｍＬ ペニシリン、および１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、１％ 非必須アミノ酸、および１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を補充したＤＭＥＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中で培養した。他の細胞を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。全ての細胞を、５％ ＣＯ２を有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベースの腫瘍溶解性ウイルスＢａｃｏ－１およびＨＳＶ－２ベースのＦｕｓＯｎ－Ｈ２を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｕｓｔｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて最初から構築した。両方のウイルスはＧＦＰ遺伝子を含むので、それらの感染は、緑色の蛍光細胞またはプラークの出現によって容易に同定可能であり得る。それらを増幅させ、本明細書で記載されるようにＶｅｒｏ細胞で力価測定した。ＧＦＰの代わりにＬｕｃ遺伝子は、より正確な定量的測定を可能にし得る。タグ（例えば、ＨＡタグ）を含む膜タンパク質は、磁性ビーズにコンジュゲートした抗ＨＡ抗体の使用を通じて、ＣＴＣのその後の容易な採取を可能にし得る。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏおよびコントロールベクターの調製および精製
構築ストラテジーの詳細は、図１Ａ～図１Ｃに図示される。ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、２つの重要な構成要素を含む：特定のＣＴＣ診断プローブ（ｐＳＶ－ＧＦＰ）（図１Ａ）、およびプローブがＣＴＣに進入しその後の増幅および検出を可能にするパッケージングシステム（ｐＨＰＶ１，２）（図１Ｂ）。図１Ａに示されるように、そのｐＳＶ－ＧＦＰを、野生型（ｗｔ）ＳＶ４０ゲノムに基づいていくつかの改変とともにデザインした。最初に、そのＳＶ４０ゲノムに沿ってヌクレオチド（ｎｔ）３７１～２５３２のＶＰ１～３キャプシド遺伝子全体を欠失させ、ＧＦＰ遺伝子で置き換えた。その欠失させた領域は天然のポリＡシグナルを含むことから、合成ポリＡをそのＧＦＰ遺伝子の最後に挿入し戻した。ＧＦＰ発現を増強するために、３種の改変をＳＶ４０後期プロモーター領域に対して行った。第１に、７２塩基対反復のさらなる４コピーを天然の２１塩基対反復および２×７２塩基対反復の下流に付加して、その後期プロモーターを強化した。第２に、以下を含む一連の変異をその後期プロモーターに導入した：ヌクレオチド２９８、２９９、３０４においてＣからＴへ、およびヌクレオチド３２２においてＧからＣへ、ならびにヌクレオチド３３５においてＡからＣへ。そのパッケージング構築物であるｐＨＰＶＬ１，２を、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６の配列に基づいて、Ｌ１およびＬ２遺伝子の両方を合成することによって構築した。これら２種の遺伝子は、２Ａ配列によって分離される。
構築ストラテジーの詳細は、図１Ａ～図１Ｃに図示される。ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏは、２つの重要な構成要素を含む：特定のＣＴＣ診断プローブ（ｐＳＶ－ＧＦＰ）（図１Ａ）、およびプローブがＣＴＣに進入しその後の増幅および検出を可能にするパッケージングシステム（ｐＨＰＶ１，２）（図１Ｂ）。図１Ａに示されるように、そのｐＳＶ－ＧＦＰを、野生型（ｗｔ）ＳＶ４０ゲノムに基づいていくつかの改変とともにデザインした。最初に、そのＳＶ４０ゲノムに沿ってヌクレオチド（ｎｔ）３７１～２５３２のＶＰ１～３キャプシド遺伝子全体を欠失させ、ＧＦＰ遺伝子で置き換えた。その欠失させた領域は天然のポリＡシグナルを含むことから、合成ポリＡをそのＧＦＰ遺伝子の最後に挿入し戻した。ＧＦＰ発現を増強するために、３種の改変をＳＶ４０後期プロモーター領域に対して行った。第１に、７２塩基対反復のさらなる４コピーを天然の２１塩基対反復および２×７２塩基対反復の下流に付加して、その後期プロモーターを強化した。第２に、以下を含む一連の変異をその後期プロモーターに導入した：ヌクレオチド２９８、２９９、３０４においてＣからＴへ、およびヌクレオチド３２２においてＧからＣへ、ならびにヌクレオチド３３５においてＡからＣへ。そのパッケージング構築物であるｐＨＰＶＬ１，２を、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６の配列に基づいて、Ｌ１およびＬ２遺伝子の両方を合成することによって構築した。これら２種の遺伝子は、２Ａ配列によって分離される。
上述の改変を、ヒト細胞発現のためのコドン最適化を伴うＤＮＡ合成を通じて行い、その合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって行った。そのコントロールベクターは、ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰに由来した（図１Ｃ）。そのコントロールベクターは、ＳＶ４０ Ｏｒｉ－Ｐ配列のコピーならびにＧＦＰカセット（そのマーカー遺伝子はＣＭＶプロモーターによって駆動された）を含んだ。ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏおよびそのコントロールベクターの生成のために、２９３ＴＴ細胞をトランスフェクションの１６時間前に１０ｃｍディッシュにプレーティングした。プラスミドｐＨＰＶＬ１，２をｐＳＶ－ＧＦＰまたはｐＣＤＮＡ－ＧＦＰのいずれかと混合し、次いで、その混合物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトした。これらの共トランスフェクションにより、ｐＨＡＶ１，２から発現したＬ１およびＬ２はウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成し、次いで、これは、そのプローブ（ｐＳＶ－ＧＦＰ）またはそのコントロールベクター（ｐｃＤＮＡ－ＧＦＰ）をパッケージし得る。そのトランスフェクトした細胞を、トランスフェクションの４８時間後または７２時間後に採取した。細胞ペレットをＰＢＳで１回洗浄し、その後、それらを懸濁し、溶解緩衝液：９．５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） １００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、および０．１％ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）および２５ｍＭ ＮＨ４ＳＯ４（ｐＨ９）を補充したリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解して、そのプローブを放出させた。その溶解物を３７℃において２４時間インキュベートしてＶＬＰを成熟させ、その後、５Ｍ ＮａＣｌを添加して最終濃度８５０ｍＭにした。その溶解物を氷上で短時間冷却し、その後、それらを５，０００ｇにおいて５分間４℃で遠心分離した。その清澄化したプローブを、ＧＥ Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００およびＤＰ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で製造業者のプロトコールに従ってさらに精製した。その精製したプローブについて、小さいアリコートを２９３ＴＴ細胞とともに４８時間インキュベートすることによって定量した。ＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）によって確認し、フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって定量した。
ヒトＰＢＭＣ調製
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から得られるバッフィーコートから調製した。そのバッフィーコートを等量のＰＢＳと混合し、その後、それらをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）に載せ、ブレーキを外して室温において８００ｇで３０分間の遠心分離を行った。ＰＢＭＣを血漿：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ境界面にある層から集め、２％ ＦＢＳ－ＰＢＳで２回洗浄した。その細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で処理して赤血球を除去し、再び２％ ＦＢＳ－ＰＢＳで２回洗浄した。その精製したＰＢＭＣを実験のために直接使用した。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から得られるバッフィーコートから調製した。そのバッフィーコートを等量のＰＢＳと混合し、その後、それらをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）に載せ、ブレーキを外して室温において８００ｇで３０分間の遠心分離を行った。ＰＢＭＣを血漿：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ境界面にある層から集め、２％ ＦＢＳ－ＰＢＳで２回洗浄した。その細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で処理して赤血球を除去し、再び２％ ＦＢＳ－ＰＢＳで２回洗浄した。その精製したＰＢＭＣを実験のために直接使用した。
プローブによる腫瘍細胞検出
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが腫瘍細胞の中で増幅する能力を試験するために、種々の組織起源の１～２×１０５ 腫瘍細胞を、１２ウェルプレートまたは２４ウェルプレートで一晩プレーティングした。次いで、２感染単位（ＩＵ）／細胞のＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏまたはコントロールベクターのいずれかとともに、各個々の実験に依存して２４～９６時間にわたって、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を蛍光顕微鏡下で分析した。臨床診断の状況を模倣するために、１０個または１００個のがん細胞を、１２ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ１６４０ ＋ １０％ ＦＢＳ中で２×１０６ ＰＢＭＣと混合した。その混合した細胞またはＰＢＭＣ単独を、１×１０７ ＩＵのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏとともに３７℃で７２時間インキュベートした。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＰＢＭＣに感染する能力を試験するために、細胞を、Ｂａｃｏ－１またはＦｕｓＯｎ－Ｈ２のいずれかに１ｐｆｕで７２時間にわたって感染させた。
ＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏが腫瘍細胞の中で増幅する能力を試験するために、種々の組織起源の１～２×１０５ 腫瘍細胞を、１２ウェルプレートまたは２４ウェルプレートで一晩プレーティングした。次いで、２感染単位（ＩＵ）／細胞のＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏまたはコントロールベクターのいずれかとともに、各個々の実験に依存して２４～９６時間にわたって、細胞をインキュベートした。次いで、細胞を蛍光顕微鏡下で分析した。臨床診断の状況を模倣するために、１０個または１００個のがん細胞を、１２ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ１６４０ ＋ １０％ ＦＢＳ中で２×１０６ ＰＢＭＣと混合した。その混合した細胞またはＰＢＭＣ単独を、１×１０７ ＩＵのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏとともに３７℃で７２時間インキュベートした。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスがＰＢＭＣに感染する能力を試験するために、細胞を、Ｂａｃｏ－１またはＦｕｓＯｎ－Ｈ２のいずれかに１ｐｆｕで７２時間にわたって感染させた。
ＧＦＰ定量
がん細胞におけるプローブ強度を定量的に測定するために、記載の細胞を、２ＩＵのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏまたはそのコントロールベクターのいずれかとともにインキュベートした。その細胞を７２時間後に採取した。ＧＦＰの定量的測定を、ＧＦＰ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で行った。簡潔には、その採取した細胞をアッセイ緩衝液で１０分間溶解した。その上清を遠心分離によって清澄化し、その後、それらを９６ウェルプレートへと移した。そのサンプルを蛍光マイクロプレートリーダー（ＶｉｃｔｏｒＴＭ Ｘ４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）で定量した。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブであって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、プローブ。
（項目２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１に記載のプローブ。
（項目３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目２に記載のプローブ。
（項目４）
前記マーカー遺伝子は、前記改変ＳＶ４０ウイルスの中でＳＶ４０ウイルス後期プロモーターの下流に挿入されている、項目１に記載のプローブ。
（項目５）
前記ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目６）
前記ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目７）
前記ＳＶ４０ウイルスは、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目８）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得るプローブをアセンブリするためのプロセスであって、
パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることを包含するか、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリを包含する、プロセス。
（項目９）
前記共トランスフェクトすることは、ｐＳＶ－ＧＦＰおよびｐＨＰＶＬ１，２を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることを包含する、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記哺乳動物細胞は、２９３ＴＴ細胞である、項目８に記載のプロセス。
（項目１１）
前記プローブは、マーカー遺伝子を含む、項目８に記載のプロセス。
（項目１２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目１１に記載のプロセス。
（項目１４）
ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１５）
ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１６）
前記ＳＶ４０は、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１７）
患者において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための方法であって、
患者から血液を集める工程；
前記血液から有核細胞を単離する工程；
前記血液から単離した有核細胞、およびＣＴＣを検出するためのプローブを含む混合物を調製する工程であって、ここで前記プローブは、パピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成される改変キャプシドを有し、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、工程；ならびに
前記混合物中のＣＴＣを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記有核細胞は、ＰＢＭＣまたはＣＴＣを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記ＳＶ４０ウイルスは、（ｉ）ＳＶ４０の内因性開始コドンを排除する、（ｉｉ）４個の７２縦列反復エンハンサー配列をＳＶ４０に挿入する、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換する、（ｉｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換する、（ｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換する、および（ｖｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換する、
のうちの１または複数によって改変されている、項目１７に記載の方法。
がん細胞におけるプローブ強度を定量的に測定するために、記載の細胞を、２ＩＵのＣＴＣ－ＵｎｉＰｒｏまたはそのコントロールベクターのいずれかとともにインキュベートした。その細胞を７２時間後に採取した。ＧＦＰの定量的測定を、ＧＦＰ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）で行った。簡潔には、その採取した細胞をアッセイ緩衝液で１０分間溶解した。その上清を遠心分離によって清澄化し、その後、それらを９６ウェルプレートへと移した。そのサンプルを蛍光マイクロプレートリーダー（ＶｉｃｔｏｒＴＭ Ｘ４，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ａｋｒｏｎ，ＯＨ）で定量した。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するためのプローブであって、
ヒトまたはウシまたは他のパピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成されるキャプシドへとパッケージされた、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、プローブ。
（項目２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１に記載のプローブ。
（項目３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目２に記載のプローブ。
（項目４）
前記マーカー遺伝子は、前記改変ＳＶ４０ウイルスの中でＳＶ４０ウイルス後期プロモーターの下流に挿入されている、項目１に記載のプローブ。
（項目５）
前記ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目６）
前記ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目７）
前記ＳＶ４０ウイルスは、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目１に記載のプローブ。
（項目８）
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し得るプローブをアセンブリするためのプロセスであって、
パピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子と改変ＳＶ４０構築物とを哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることを包含するか、またはパピローマウイルスＬ１およびＬ２遺伝子を哺乳動物細胞へと共トランスフェクトすることから形成されるキャプシドへの改変ＳＶ４０構築物のインビトロアセンブリを包含する、プロセス。
（項目９）
前記共トランスフェクトすることは、ｐＳＶ－ＧＦＰおよびｐＨＰＶＬ１，２を２９３ＴＴ細胞へと共トランスフェクトすることを包含する、項目８に記載のプロセス。
（項目１０）
前記哺乳動物細胞は、２９３ＴＴ細胞である、項目８に記載のプロセス。
（項目１１）
前記プローブは、マーカー遺伝子を含む、項目８に記載のプロセス。
（項目１２）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１１に記載のプロセス。
（項目１３）
前記ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）は、配列番号１０のものである、項目１１に記載のプロセス。
（項目１４）
ＳＶ４０ウイルス後期プロモーターは、内因性開始コドンを排除することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１５）
ＳＶ４０ウイルスは、４個の７２縦列反復エンハンサー配列を挿入することによって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１６）
前記ＳＶ４０は、以下のうちの１または複数：ヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換すること、ヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換すること、ヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換すること、およびヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換すること、によって改変されている、項目８に記載のプロセス。
（項目１７）
患者において循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出するための方法であって、
患者から血液を集める工程；
前記血液から有核細胞を単離する工程；
前記血液から単離した有核細胞、およびＣＴＣを検出するためのプローブを含む混合物を調製する工程であって、ここで前記プローブは、パピローマウイルスのＬ１およびＬ２キャプシドタンパク質から形成される改変キャプシドを有し、マーカー遺伝子を含む改変ＳＶ４０ウイルスを含む、工程；ならびに
前記混合物中のＣＴＣを検出する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記有核細胞は、ＰＢＭＣまたはＣＴＣを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）酵素、およびタグを含む膜タンパク質からなる群より選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記ＳＶ４０ウイルスは、（ｉ）ＳＶ４０の内因性開始コドンを排除する、（ｉｉ）４個の７２縦列反復エンハンサー配列をＳＶ４０に挿入する、および（ｉｉｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９８をシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）へと置換する、（ｉｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド２９９をシトシンからチミンへと置換する、（ｖ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３０４をシトシンからチミンへと置換する、および（ｖｉ）ＳＶ４０においてヌクレオチド３２２をグアニン（Ｇ）からＣへと置換する、
のうちの１または複数によって改変されている、項目１７に記載の方法。
Claims (1)
- 本願明細書に記載の発明。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862630570P | 2018-02-14 | 2018-02-14 | |
| US62/630,570 | 2018-02-14 | ||
| PCT/US2019/018120 WO2019161139A2 (en) | 2018-02-14 | 2019-02-14 | Probe for universal detection of circulating tumor cells |
| JP2020543352A JP7287972B2 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-14 | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020543352A Division JP7287972B2 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-14 | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022089919A true JP2022089919A (ja) | 2022-06-16 |
Family
ID=67619577
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020543352A Active JP7287972B2 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-14 | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ |
| JP2022068266A Pending JP2022089919A (ja) | 2018-02-14 | 2022-04-18 | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020543352A Active JP7287972B2 (ja) | 2018-02-14 | 2019-02-14 | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210102946A1 (ja) |
| EP (1) | EP3752605A4 (ja) |
| JP (2) | JP7287972B2 (ja) |
| CN (1) | CN111727244B (ja) |
| WO (1) | WO2019161139A2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114431560A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-05-06 | 广州市赛特检测有限公司 | 一种新冠病毒快速检测口罩及生物探针修饰方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003263163A1 (en) | 2002-09-20 | 2004-04-08 | Cym1P A/S | Methods for increasing the production of a recombinant polypeptide from a host cell |
| DK2145189T3 (en) | 2007-05-08 | 2016-06-06 | Us Health | Papillomavirus pseudo viruses for the detection and treatment of tumors |
| US10913934B2 (en) * | 2013-02-21 | 2021-02-09 | Laboratory Corporation Of America Holdings | Methods and systems for rapid detection of microorganisms using infectious agents |
| EP3517130B1 (en) | 2013-09-18 | 2022-03-30 | Aura Biosciences, Inc. | Method of producing photosensitive molecules |
| MX2017004507A (es) * | 2014-10-06 | 2017-06-28 | Univ Pennsylvania | Composiciones y metodos para el aislamiento de celulas tumorales circulantes (ctc). |
| EP3209770B1 (en) * | 2014-10-23 | 2019-11-27 | Sanofi | Novel selection marker for cell transfection and protein production |
-
2019
- 2019-02-14 CN CN201980013511.8A patent/CN111727244B/zh active Active
- 2019-02-14 EP EP19753988.5A patent/EP3752605A4/en active Pending
- 2019-02-14 US US16/970,163 patent/US20210102946A1/en active Pending
- 2019-02-14 WO PCT/US2019/018120 patent/WO2019161139A2/en unknown
- 2019-02-14 JP JP2020543352A patent/JP7287972B2/ja active Active
-
2022
- 2022-04-18 JP JP2022068266A patent/JP2022089919A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3752605A2 (en) | 2020-12-23 |
| CN111727244A (zh) | 2020-09-29 |
| WO2019161139A2 (en) | 2019-08-22 |
| JP7287972B2 (ja) | 2023-06-06 |
| WO2019161139A3 (en) | 2019-11-07 |
| CN111727244B (zh) | 2023-09-15 |
| EP3752605A4 (en) | 2021-12-15 |
| US20210102946A1 (en) | 2021-04-08 |
| JP2021513845A (ja) | 2021-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2019214063A1 (zh) | 一种循环肿瘤细胞的检测方法 | |
| JP6148666B2 (ja) | サイトメガロウイルス（ｃｍｖ）の遺伝子変異体 | |
| JPWO2011099565A1 (ja) | 血液中癌細胞の検出方法及びそれに用いるプログラム | |
| Li et al. | Expression of immune-related molecules in primary EBV positive Chinese nasopharyngeal carcinoma: associated with latent membrane protein 1 (LMP1) expression | |
| JP2022089919A (ja) | 循環腫瘍細胞のユニバーサル検出のためのプローブ | |
| Limam et al. | Investigation of simian virus 40 (SV40) and human JC, BK, MC, KI, and WU polyomaviruses in glioma | |
| WO2010071114A1 (ja) | 血液試料中の癌細胞の検出方法 | |
| EP3483588B1 (en) | Usages of recombinant extracellular vesicles | |
| Mitarnun et al. | Epstein‐Barr virus‐associated peripheral T‐Cell and NK‐Cell proliferative disease/lymphoma: clinicopathologic, serologic, and molecular analysis | |
| JP2002505122A (ja) | エプスタイン−バーウイルス（ｅｂｖ）核酸の増幅と検出のためのオリゴヌクレオチド | |
| WO2015174539A1 (ja) | 細胞の検出方法 | |
| AU776155B2 (en) | Noninvasive detection of colorectal cancer and other gastro intestinal pathology | |
| Sais et al. | Differential patterns of large tumor antigen-specific immune responsiveness in patients with BK polyomavirus-positive prostate cancer or benign prostatic hyperplasia | |
| Chuang et al. | Multicentric primary intestinal EBV-positive diffuse large B cell lymphoma of the elderly presenting with perforation | |
| JP2019060869A (ja) | がんの転移形成能に関与する因子および前記因子を用いたがん患者の予後予測方法 | |
| Gärtner et al. | Epstein‐Barr Virus | |
| Jasani et al. | Simian virus 40 detection in human mesothelioma: reliability and significance of the available molecular evidence | |
| JP3907338B2 (ja) | Ｅｂｖ感染胃癌細胞株 | |
| CN114480402B (zh) | 一种新型her2 dna适配体及其制备方法和应用 | |
| Mohan et al. | Effects of hypoxia on antigen presentation and T cell-based immune recognition of HPV16-transformed cells | |
| López et al. | Lack of association between Epstein–Barr virus and mammary tumours in dogs | |
| Chan et al. | A novel technique for the enrichment of primary ovarian cancer cells | |
| Aslane et al. | Characteristics of gastric carcinoma associated with Epstein Barr virus in Algeria | |
| de Assis et al. | DNA detection of JC and BK virus in archival urine cytospin slides | |
| Ariel et al. | OPEN ACCESS EDITED BY |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220517 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230412 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230711 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230911 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231201 |