JP6148666B2

JP6148666B2 - サイトメガロウイルス（ｃｍｖ）の遺伝子変異体

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Inventors: セシリアノークレール
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Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2017-06-14
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Description

本発明は、例えば癌疾患に罹患している患者に存在することが証明されている、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）の新規遺伝子変異体の分野に関する。したがって、本発明は、癌についての、およびより具体的にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の感染の存在を含む癌形態についての、診断方法の分野に関する。本発明は、特に、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、肉腫、腎臓癌、皮膚癌および膵臓癌の診断に関するが、他の癌形態にも応用できる。

サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、世界人口の大部分を感染させる一般的なウイルスであり、成人人口の６０〜１００％は、この感染の経験があり、このウイルスの保有者である。ＣＭＶは、一次感染後、潜伏性および持続性を確立し、殆どの感染は無症候性である。健常保有者の場合、このウイルスは、他に優先してミエロイド系列細胞において潜在ウイルスとして見つけられ、再活性化は、成熟マクロファージまたは樹状細胞への細胞の分化に依存し、これは、多くの場合、感染によって引き起こされる。１９７０年代まで、先天性感染症の重症症例のみが、このウイルスのヒト疾患に相当すると考えられていた。世の中の免疫抑制個体、例えばＡＩＤＳ患者および移植患者、の漸増に伴って、ＣＭＶの再活性化は、これらの患者の間で高い罹病率および死亡率の原因となる大きな臨床問題となった。したがって、ＣＭＶ疾患はこの群の患者に共通であり、命にかかわることもあるので、過去何十年にもわたってＣＭＶの重要性および関心が増してきている。このウイルスは炎症によって再活性化され、炎症性疾患の患者の組織検体におけるこのウイルスの高頻度の存在を示唆する証拠は増えている。最近、様々な起源の癌に活性ＣＭＶ感染が頻繁に存在することを含意する証拠も増えている。本発明者らは、癌におけるＣＭＶの新規遺伝子変異体を定義し、新たな癌発生機序を立証する。

ＣＭＶ感染および癌
最近の報告は、一定の悪性腫瘍、例えば結腸癌、悪性神経膠腫（非特許文献１−７）、髄芽腫（非特許文献８）、ＥＢＶ陰性ホジキンリンパ腫、子宮頚癌、前立腺癌および乳癌（総説については（非特許文献９、１０）を参照されたし）、におけるＣＭＶのゲノムおよびタンパク質の高頻度の存在を示している。本発明者らは、悪性膠芽腫腫瘍の９９％、髄芽腫（ＭＢ：ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）および神経芽腫（ＮＢ：ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、悪性黒色腫、結腸、乳、膵臓、前立腺、皮膚、卵巣および子宮癌の＞９０％において活性ＣＭＶ感染の存在を確認した（非特許文献１、８）。重要なこととして、このウイルス感染は、同じ患者から得た非癌組織検体において、および健常対照個体において、潜伏性のままである（非特許文献１、３）。

ＣＭＶおよび腫瘍調節（ｏｎｃｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）：
既に１９７０年代に、ＦｅｄＲａｐｐのグループは、前立腺癌におけるＣＭＶの高頻度の存在を報告し、動物モデルにおいて発癌性であった腫瘍からのウイルス株を単離した（非特許文献１１、１２）。幾つかのその後の研究において、ＣＭＶは正常ヒト癌を形質転換することができず、そのためこのウイルスは発癌性と見なされなかった。その代わり、宿主細胞機能に対して特異的な効果を持つ非常に多数のウイルスタンパク質によって媒介される腫瘍形成に対するＣＭＶの間接的影響を記述するために腫瘍調節という用語が提案されている（（非特許文献１３、１４）に総説されている）。進化の過程で、ＣＭＶは、多くの異なる細胞および免疫機能に影響を及ぼす洗練された機序を発達させてきた（非特許文献１５、１６）。このウイルスは、感染細胞において約１７０のタンパク質を生産し、それらのうちのおおよそ５０のみが、ウイルス生産に不可欠なものである（非特許文献１７）。したがって、これらのウイルスタンパク質のうちの圧倒的多数が、ウイルスのその宿主との共存を支援することとなる重要な宿主機能の制御に向けられる。これらのタンパク質が、癌発生の一因となる宿主機能の制御により、および免疫応答を変調させることにより、免疫系によって発見されないようにウイルス感染腫瘍細胞を守ることとなる（非特許文献１５）。癌の病理発生に関与する可能性を秘めているＣＭＶ機序は、腫瘍調節機序と呼ばれる（非特許文献１０、１３）。

腫瘍調節は、腫瘍細胞によってもたらされる適切な遺伝的環境の中で、細胞内シグナル伝達経路、転写因子および腫瘍抑制タンパク質の混乱を特徴とする発癌プロセスを促進する能力と定義される。ＣＭＶは、細胞分化を阻止することができ、発癌遺伝子発現に干渉するこができ、特異的染色体切断を誘導することができ、ＤＮＡ修復機序を阻害することができ、重要な後成的機能を制御することができ、細胞増殖を制御することができ、アポトーシスを阻害することができ、血管新生および細胞遊走を誘導することができ、これらすべてが腫瘍調節機序をもたらす（非特許文献１０、１３）。さらに最近のデータは、このウイルスが発癌性であり得ることも示唆している；ある研究は、ＣＭＶタンパク質ＵＳ２８の発現が、実際にはそれだけで腫瘍発生をもたらすことを、マウスモデルにおいて誘導ＣＯＸ−２発現およびＶＥＧＦ生産によって証明した（非特許文献１８、１９）。トランスジェニックマウスにおける腸上皮に標的化されたＵＳ２８の発現は、腸過形成、腺腫および腺癌を生じさせる結果となる（非特許文献２０）。Ｓｍｉｔｓグループとの共同研究で、本発明者らは、ＵＳ２８がＳＴＡＴ３のリン酸化ももたらし、その結果ＩＬ−６生産および増殖性表現型を生じさせることを最近立証した。ＳＴＡＴ３リン酸化、例えば、膠芽腫におけるＳＴＡＴ３リン酸化を膠芽腫患者の生存と相関させた（非特許文献６）。本発明者らは、最近、ＣＭＶタンパク質ＩＥ７２がプロモータのＳＰ−１結合部位との相互作用により高テロメラーゼ活性を誘導することも発見した（非特許文献７）。テロメラーゼ活性の誘導は、発癌性ウイルスの共通現象である。興味深いことに、本発明者らは、ＧＢＭ腫瘍においてＣＭＶ感染細胞のみがｈＴＥＲＴ発現増加を呈示することを見出した（非特許文献７）。癌におけるＣＭＶ感染の重要な役割についてのさらなる報告で、本発明者らは、最近、ＣＭＶ感染レベルが膠芽腫患者の生存延長に関連づけられることを見出した（非特許文献１）。さらに、膠芽腫腫瘍におけるＣＭＶ感染レベルは、患者生存についての強力な予後因子である。診断時に腫瘍におけるＣＭＶ感染度が低い（２５％未満のウイルス陽性細胞と定義される）患者は、感染度が高い患者より２．５倍より長く生存する（非特許文献２１）。ｉｎｖｉｔｒｏでのガンシクロビル処置は、腫瘍成長を８０〜９５％阻害し、および動物モデルは、ウイルス複製を標的にする薬物を使用すると、腫瘍成長の４０〜７５％阻害を明示する（非特許文献８、２２）。

ＣＭＶは免疫系による検出を回避する
ＣＭＶは、免疫系による認識を回避するように設計された、洗練された機序を発達させてきた。例えば、ＣＭＶは、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子の発現ならびに抗原提示を阻害し、Ｔ細胞活性化を制御し、ＮＫ細胞活性化を阻害し、活性化されたＴおよびＮＫ細胞から放出される細胞溶解性ペプチドから細胞を守る（非特許文献１６、２３）。ＣＭＶは、その独自のケモカイン、サイトカインおよび成長因子を生産し、ならびにケモカイン、サイトカインおよび成長因子の細胞生産を制御する（非特許文献１５）。これらは、感染細胞を免疫系に不可視にする戦略の例であり、ＣＭＶ感染腫瘍が、免疫系によってまたはそれらに対して開発された免疫療法によって制御されない理由を説明することができる。それ故、このウイルスが炎症依存性である（非特許文献２４）と同時に、感染腫瘍細胞は免疫系に不可視になる（（非特許文献１６、２３）において総説されている）。本発明者らのグループは、初めて、ミエロイド系列の細胞を潜在ウイルスの主要循環キャリアとして同定し（非特許文献２４）、Ｔ細胞の免疫活性化ならびにその結果としてのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ生産がマクロファージ分化を生じさせる結果となり、潜在ＣＭＶの再活性化の重要な要素であることを確認した（非特許文献２４、２５）。αウイルス感染は、ＣＯＸ−２も誘導し（非特許文献１８、２６−２８）、本発明者らは、最近、このウイルスが５−ＬＯ発現も誘導（非特許文献２９）して、炎症を誘導し、ウイルス複製を増進し、これが腫瘍生物学に大いに関連していることを発見した。

ＣＭＶ遺伝子産物は化学療法に対する耐性を付与する
アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、ＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される死滅についての機序の最終段階である。薬物によって誘導される死に対する腫瘍細胞の感受性減弱は、抗癌療法が失敗する主な理由の１つである。少なくとも５つの異なるＣＭＶタンパク質（すなわち、ＩＥ１、ＩＥ２、ＵＬ３６およびＵＬ３７、ＵＬ３８）は、ＣＭＶ感染腫瘍細胞のアポトーシスを阻害し、生存を増進することができる。これらのタンパク質は、所望の化学療法効果を妨げることもある。この仮説の裏付けとして、神経芽腫細胞におけるＵＬ３６発現は、化学療法に対する耐性を付与する（非特許文献３０）。

癌におけるＣＭＶ濃密体の重要な役割
様々な起源の癌においてＣＭＶタンパク質が頻繁に検出されることを実証するデータが増えている。膠芽腫；神経芽腫；髄芽腫；膵臓腫瘍からの結腸、乳および前立腺癌；肉腫；悪性黒色腫；扁平上皮癌腫；卵巣癌；子宮頚癌の＞９０は、腫瘍細胞における高ＣＭＶタンパク質発現を明示するが、その腫瘍を包囲する非腫瘍組織は、一貫してウイルス陰性である。本発明者らは、患者生検材料も調査し、それらがすべてＣＭＶタンパク質発現について非常に陽性であることを発見した。ＣＭＶタンパク質発現は腫瘍内に広範に分布し、ＣＭＶＲＮＡ転写産物は容易に検出されるが、極めて対照的に、ＣＭＶＤＮＡを同じ組織試料において検出することは難しかった。これは、物議をかもす問題となっており、当分野の研究者の多くを悩ませ、これが人為的結果を表すのかどうか関心が高まっている。

それ故、ＣＭＶ感染に対する戦略およびこれが例えば癌の開始または進行にどのように影響を及ぼすのかを明らかにすることへの長年の要求およびそのための広範な研究が当分野には存在する。これは、それを明らかにすることで、それを必要とする患者のより容易な処置を可能にする可能性のある診断方法はもちろん、可能性のある新たな治療的処置も明かすことができるだろうからである。

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本発明者らは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の、前初期遺伝子（ＩＥ：ｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｇｅｎｅ）ＣＭＶゲノムのイントロン２（配列番号１７）の欠如を示した、新規遺伝子変異体を定義することにより、本明細書において提起する問題を今般解消した。前記遺伝子変異体をＣＭＶＩＥΔｉ２という名にした。本発明はまた、主要最初期遺伝子におけるイントロン２（配列番号１７）の欠如による野生型ＣＭＶおよび／または新規ウイルス株の変異体を表す、ＣＭＶＩＥΔｉ２という名の、発見されたＣＭＶの新規遺伝子変異体はもちろん、前記遺伝子変異体から転写されたスプライス変異体および前記遺伝子変異体から翻訳されたタンパク質も包含する、方法および使用に関する。前記方法は、例えば、癌の素因の診断または既に発生した癌疾患の診断に用いられる。

免疫組織化学によるヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質の検出を示す図である。ＣＭＶ前初期抗原（ＣＭＶ−ＩＥＡ：ＣＭＶｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙａｎｔｉｇｅｎ）が、ＧＢＭ（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｍｕｌｔｉｆｏｒｍ：多形膠芽腫）患者から得た脳腫瘍組織（Ａ）において、神経芽腫、髄芽腫におけるＮＢ（Ｂ）、ＭＢ（Ｃ）において、ならびに結腸癌組織（Ｇ）において、および乳癌組織（Ｈ）において検出された。平滑筋細胞アルファアクチンに対する抗体（Ｄ、Ｅ、Ｆ）およびケラチン２０（Ｉ）およびサイトケラチン（Ｊ）に対する抗体は、対照としての役割を果たした。未指定のバー＝５０μｍ乳癌試料におけるヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶＩＥ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）および後期（ＬＡ：ｌａｔｅ）タンパク質の免疫組織化学染色を示す図である。ＣＫは、陽性または染色対照としての腫瘍細胞のサイトケラチン染色を表し、陰性（Ｎｅｇ）対照は、アイソタイプ対照抗体を表す。この写真は、腫瘍細胞においてＣＭＶ、すなわちＣＭＶタンパク質、が限定発現されることの例証となる。リンパ節における乳癌腫瘍のリンパ節マクロ転移のヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶＩＥ）および後期（ＬＡ）タンパク質の免疫組織化学染色を示す図である。ＣＫは、陽性、すなわち染色対照としての腫瘍細胞のサイトケラチン染色を表し、陰性対照は、アイソタイプ対照抗体を表す。この写真は、腫瘍転移の際にも腫瘍細胞においてＣＭＶタンパク質が限定発現されることの例証となる。ヒトサイトメガロウイルス前初期抗原（ＣＭＶＩＥＡ）およびｐｐ６５についての細胞系（髄芽種Ｄ２８３）のフローサイトメトリー染色を示す図である。ＣＭＶタンパク質発現は、様々な起源の腫瘍細胞系において様々なタンパク質発現レベルで頻繁に検出される（ｎ＝４０；ＣＭＶ陽性細胞は、０．５％から６９％まで幅があり、同じ細胞系でも試料採取時が異なると変わり得る）。野生型のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）遺伝子および該ＣＭＶＩＥ遺伝子領域のＰＣＲに使用した様々なプライマーの位置の略図である。ＣＭＶＩＥΔｉ２にはイントロン２が欠けており、これを、主要前初期（ＭＩＥ：ｍａｊｏｒｉｍｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙ）アウターおよびＭＩＥインナープライマーペアを使用するネステッドＰＣＲによって、または欠失変異体のみが陽性シグナルを与えることを可能にするエクソン２および３に及ぶプローブでのＴａｑｍａｎＰＣＲによって判定する。ネステッドＰＣＲが、癌患者における実験室サイトメガロウイルス株（ＣＭＶ）で感染させた細胞のＲＮＡ試料のｃＤＮＡと同様のサイズの、２１８ｂｐのＰＣＲＤＮＡ断片を増幅し（Ｃ３）、その一方で、同じ培養物のＤＮＡ調製物が３３２ｂｐのＰＣＲ断片を増幅する（Ｃ２）ことを示す図である。健常ドナー（ＨＤ：ｈｅａｌｔｈｙｄｏｎｏｒ）および伝染性単核球症（ＩＭＮ：ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｓ）を有するウイルス血症患者からの野生型のＤＮＡ断片を増幅した。ＨＤ：健常ドナー、ＣＣ：結腸癌、ＮＴＣ：無テンプレート対照、ＮＢ：神経芽腫、ＢｒＣ：乳癌細胞、ＯｖＣ：卵巣癌、Ｃ１：未感染線維芽細胞、Ｃ２：ＣＭＶ感染線維芽細胞からのＤＮＡ、Ｃ３：ＣＭＶ感染線維芽細胞からのｃＤＮＡ。ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体を保有する癌患者におけるイントロン２の欠失（Ａ）または健常ドナーにおける野生型変異体（Ｂ）を明示するクロマトグラムを示す図である。この図は、ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体を保有する癌患者におけるイントロン２欠失の部位（Ａ）（配列：ＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＴＣＧＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴ）または健常ドナーにおける野生型変異体（Ｂ）（配列：ＡＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＴＣＧＧＣＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＴＡＧ）を実証する。様々な起源の癌において見出されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥΔｉ２株におけるイントロン２の欠如を実証するシークエンシングされたＰＣＲ産物のアラインメントを示す図である。エクソン２およびエクソン３を示し、ネステッドＰＣＲに使用したプライマーの位置も示す。ＣＭＶＩＥΔｉ２は、例えば、乳癌、結腸癌、髄芽種、神経芽腫および膠芽腫において見出されるが、ウイルス血症患者または健常対照は、野生型ＣＭＶ株を保有する。実験研究において一般に使用される３つの異なるウイルス株（３３２ｂｐの野生型断片を増幅するＶＲ１８１４、ＴＢ４０およびＡＤ１６９）のネステッドＰＣＲを示す図である。ウイルスストックからまたはウイルス感染細胞から試料を調製した。ＮＴＣ：陰性対照、Ｃ２：２１８ｂｐの断片を増幅した感染細胞からのｃＤＮＡ。ネステッドＰＣＲがアテローム性動脈硬化症を有する患者および伝染性単核球症患者（ＩＭＮ）からの血清試料中の３１８ｂｐの野生型ＤＮＡ断片を増幅することを示す図である。Ｃ２：同じ細胞からのＤＮＡ調製物（Ｃ３）で見えるｗｔＤＮＡバンドも明示するＣＭＶ野生型感染細胞のｃＤＮＡ試料（この試料をＤＮＡｓｅ処理しなかった）。健常血液ドナーにおけるＤＮＡの増幅を示す図である。Ｃ２：ＤＮＡ野生型（ｗｔ）ＣＭＶについての陽性対照。ある個体（２２）は、ＣＭＶＩＥΔｉ２を有し、これは、調査した対照の１２〜１３％において見出された。前初期（ＩＥ）遺伝子の欠失されたイントロン２を描写する、ＧＢＭＲＮＡ転写産物、すなわち（３つの異なるフラスコから採集した）膠芽腫初代細胞培養物からのＣＭＶＤＮＡ、の配列アラインメントを示す図である。ＩＥ１、ＩＥ９、ＩＥ１７．５およびＩＥ１９のコード配列を、エクソン２およびエクソン３のＭｅｒｌｉｎ参照配列（遺伝子バンクＡＹ４４６８９４．２）と共に示す。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）モノクローナル抗体（クローン８１０Ｒ）を使用する神経芽腫（ＮＢ）原発性腫瘍からの細胞溶解産物のウエスタンブロット分析を示す図である。ＣＭＶタンパク質前初期（ＩＥ）５５、ＩＥ７２およびＩＥ８６は、豊富ではない；１つの試料のみがＩＥ５５を明示する（ＮＢ７）。その代わり、新規タンパク質は、３８、３１、２０および１０ｋＤａのサイズを再発現した。図１４に示す陽性対照。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）モノクローナル抗体（クローン８１０）を使用する膠芽腫原発性腫瘍からの細胞溶解産物のウエスタンブロット分析を示す図である。ＣＭＶタンパク質前初期ＩＥ５５、ＩＥ７２およびＩＥ８６は、豊富ではない；２つの試料のみがＩＥ７２を明示する（４２、５０）。その代わり、おおよそ５０、５３、２８、２４、１９および１０ｋＤａのサイズを有する新規タンパク質が発現された。陰性対照は、未感染線維芽細胞、ＭＲＣ−５であり、陽性対照は、感染後１５日の時点での感染ＭＲＣ−５である。ＩＥ８６に対するヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ペプチド抗体を使用する膠芽腫原発性腫瘍細胞培養物からの細胞溶解産物のウエスタンブロット分析を示す図である。ウイルス感染細胞の陽性対照と野生型ＣＭＶ株ＶＲ１８１４の供覧のための２コマ。ＣＭＶタンパク質ＩＥ５５およびＩＥ８６は、初代培養物にはもちろん４０ｋＤａおよび２０ｋＤａタンパク質にも非常に豊富にあるが、原発性膠芽腫において発現される特有のタンパク質の幾つかは失われる。２つの試料のみが５０、５３ｋＤａタンパク質を発現し（３０、４６）、３つが２８ｋＤａタンパク質を発現する（４２、４７、４８）。その代わり、新規タンパク質は、５０、５３、２８、２４、１９および１０ｋＤａのサイズを再発現した。細菌人工染色体（ＢＡＣ：ｂａｃｔｅｒｉａｌａｒｔｉｆｉｃａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクター内の全ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ゲノムを含有するＣＭＶプローブを使用する蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎ−ｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を示す図である。Ａ）感染後７日の時点でのＣＭＶ野生型感染細胞（ＡＤ１６９）。Ｂ）ＣＭＶ野生型ウイルスの健常保有者。Ｃ）別の膠芽腫患者Ｄ）に関して描写したように増幅されることがある、ＣＭＶゲノムの末梢位置を明示する膠芽腫腫瘍からのインプリント。ＣＭＶゲノムの末梢位置のパターンは、癌細胞内にＣＭＶＩＥΔｉ２株を保有する癌患者では非常に明瞭であり、再現可能である（ｎ＝４０；１００％）。図１７Ａは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクター内の全ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ゲノムを含有するＣＭＶプローブを使用する蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が、膠芽腫患者からの腫瘍細胞における染色体１７へのＣＭＶゲノムの組み込みを明示することを示す図である。図１７Ｂは、染色体１７の両方の染色分体中に存在するＣＭＶＤＮＡを表す２つの小点がより高倍率では見えることを示す図である。図１８Ａは、ＧＢＭ患者において見出されたＲＮＡ転写産物の配列アラインメントを示す図である。Ａｗａｓｔｈｉら、「ＪＶｉｏｌ」、２００４年８月、ｐ．８１９１−８２００（３１）からの公知スプライス変異体の略図。出版された学術雑誌（ＩＥ１およびＩＥ２のアミノ酸アラインメントおよびスプライス変異体を示しているＡｗａｓｔｈｉら、「ＪＶｉｒｏｌ」、２００４年８月、ｐ．８１９１−８２００（３１））からの前初期（ＩＥ）１９、ＩＥ１７．５およびＩＥ９の配列アラインメント。図１８Ｂは、ＩＥ遺伝子のエクソン２、３、４および５から誘導された多数のスプライス変異体を示すカートン図（ｃａｒｔｏｎｄｒａｗｉｎｇ）である。

定義
本明細書の中で言及する場合の「イントロン」は、遺伝子の最終成熟ＲＮＡ産物を生成するためにＲＮＡスプライシングによって除去される遺伝子内の任意のヌクレオチド配列である。用語イントロンは、遺伝子内のＤＮＡ配列を指すが、イントロンを有する遺伝子から転写されたＲＮＡ転写産物内の対応する配列では除去されている。

本明細書の中で言及する場合の「エクソン」は、メッセンジャーＲＮＡに転写されるタンパク質合成のための情報をコードするＤＮＡの核酸配列である。

本明細書中で「ＣＭＶＩＥΔｉｎｔ２」とも呼ぶ、本明細書中で定義する場合の「ＣＭＶＩＥΔｉ２」は、ＣＭＶの分離株である、ＣＭＶの遺伝子変異体であって、核酸配列は図５に示すとおりのＣＭＶＩＥゲノムに対応するが、前初期と称する領域のイントロン２（ＩＥのイントロン２を配列番号１７に提供する）に対応する部分が、図６、図７および図８で実証されるようにそのＤＮＡに欠損、欠如または欠失している遺伝子変異体を指す。ｗｔＣＭＶ株は、遺伝子バンクにおける（ＡＹ４４６８９４．２Ｍｅｒｌｉｎ）を指し、塩基対位置１７０６８９−１７６１８６におけるその最初期遺伝子は、図５において参照遺伝子としておよび図８においてイントロン２が欠如しているＣＭＶＩＥΔｉ２への参照として言及するようなＩＥ遺伝子を含む。本明細書において、前記遺伝子変異体は、Ｍｅｒｌｉｎ参照配列ＡＹ４４６８９４．２（野生型ＣＭＶ）の位置１７３９０３から位置１７４０１９の核酸配列が前記遺伝子変異体に欠如していることをさらに特徴とする。

「最初期」（ＩＥ）遺伝子は、急性感染中におよび多種多様な細胞刺激に応答して一過的かつ迅速に活性化される遺伝子である。ＩＥ遺伝子は、感染中にＣＭＶゲノムから転写される遺伝子の第一セットであり、その後、初期および後期遺伝子が転写され、この転写をそれらのＩＥ遺伝子が制御する。ＩＥ遺伝子は、あらゆる新たなタンパク質が合成される前に刺激に対する第一の応答ラウンドにおいて転写レベルで活性化される、確立された応答機序を示す。ＣＭＶゲノムのウイルスユニークロング（ＵＬ：ｕｎｉｑｕｅｌｏｎｇ）遺伝子セグメント内にある主要前初期遺伝子ＵＬ１２３／１２２は、ｗｔＣＭＶＭｅｒｌｉｎ株（遺伝子バンクＡＹ４４６８９４．２）の塩基対位置１７０６８９−１７６１８６に位置する領域を指す。主要前初期遺伝子は、主要前初期（ＭＩＥ）プロモータの制御下で転写されて、幾つかのＩＥタンパク質（ＩＥ１またはＩＥ７２、ＩＥ２またはＩＥ８２−８６、ＩＥ８６、ＩＥ２−５５またはＩＥ５５）をコードするセンスＲＮＡ転写産物を生産する。これらのタンパク質は、エクソン２およびエクソン３を共有し、したがって同じタンパク質Ｎ末端を共有する。これらの主要ＩＥタンパク質に加えて、他のＩＥタンパク質が修飾ｍＲＮＡ分子の転写産物の翻訳によって生産される（下記参照）。

本明細書において述べる場合のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の「遺伝子変異体」は、イントロン２のみが欠如しているＣＭＶ変異体を指すか、他のＣＭＶ株と比較してＣＭＶゲノムの前初期領域と一般に称する領域（図５参照）が改変されており、その領域イントロン２を含まない（図６、図７および図８参照）ような変異体である、ＣＭＶの新規ウイルス株を指す。したがって、この変異体は、変異が既にＣＭＶウイルスのＤＮＡレベルで起こっており、その後、この遺伝子変異体からのＣＭＶタンパク質の転写および翻訳の結果として起こる事象で増殖されるため、「遺伝子による」または「遺伝子改変された」ものであり、それをここでさらに説明する。配列番号１の核酸配列は、本明細書中で定義するとおりのおよび野生型ＣＭＶと比較されるようなこの遺伝子変異体の特徴ＤＮＡ領域を定義するものである。この領域は、ｗｔＣＭＶのエクソン２および３であって、イントロン２を欠如したため該ｗｔＣＭＶの遺伝子変異体のＤＮＡ内で今や直接接続されているエクソン２および３に対応する。ＣＭＶウイルスが、かかる修飾領域を有する場合、これを、かかるＣＭＶウイルスがｗｔＣＭＶの遺伝子変異体であることの識別に用いることができる。これは、例えば、ＰＣＲ法を使用することにより、または本明細書においてさらに定義するように行うことができる。

「スプライス変異体」は、遺伝子の転写によって生産されたＲＮＡ（一次遺伝子転写産物またはプレｍＲＮＡ）、例えば本文脈では遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２、のエクソンがＲＮＡスプライシング中に多数の方法で再接続されるプロセスによって生産され、このプロセスは、時として選択的スプライシング（または差次的スプライシング）と呼ばれる。分子生物学において、「ＲＮＡスプライシング」は、イントロンが除去され、エクソンが連結される、転写後のＲＮＡの修飾である。典型的な真核生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にはこの修飾が必要であり、その後、そのｍＲＮＡを用いて翻訳により正しいタンパク質を生産することができる。多くの真核生物イントロンについて、スプライシングは、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰｓ：ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅａｒｒｅｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）の複合体であるスプライソソームによって触媒される一連の反応で行われるが、自己スプライシングイントロンもある。

結果として生ずる様々なｍＲＮＡは、様々なタンパク質アイソフォームに翻訳され得、すべてが、野生型ＣＭＶ感染では５プライマー末端からの転写によって生産される。主要ＩＥ遺伝子の中で、６つの公知スプライス変異体、例えば、エクソン２およびエクソン３を含有するもの（図５および図８参照）；ＩＥ９（ＡＹ４４５６６１．１；エクソン２および３、ならびにエクソン４の２つのアミノ酸；感染細胞では観察されないが１０ｋＤのものであると予測されるタンパク質）；ＩＥ１９（ＡＹ４３６３８０．１；エクソン２、３、およびエクソン４の断片が３８ｋＤタンパク質を生産する）；ＩＥ１７．５（ＡＹ４４５６６０．１；ＩＥ１９と共有される、エクソン２、３、ならびにエクソン４のより小さい断片が、３１ｋＤａタンパク質を生産する）；ＩＥ１８（配列番号２；エクソン２、３および５が１８ｋＤａタンパク質を生産する）が、変異体ＩＥタンパク質を生産することは公知である。２つのＩＥタンパク質、ＩＥ４０（配列番号３；４０ｋＤａタンパク質）およびＩＥ６０（配列番号４；６０ｋＤａタンパク質）、はエクソン５から作られる。かくて、その結果、単一遺伝子が多数のタンパク質をコードすることができる。したがって、本明細書における様々な「スプライス変異体」は、遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２の転写中に起こる様々なスプライシング事象によって生産されて、新規ＩＥＲＮＡ転写産物およびＩＥタンパク質を生産する。

したがって、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の遺伝子変異体であって、本明細書においてＣＭＶＩＥΔｉ２またはＣＭＶＩＥΔｉｎｔ２とも呼ばれ、ＣＭＶゲノムのＩＥ遺伝子内のイントロン２が欠如している遺伝子変異体に関する。ＣＭＶの本遺伝子変異体が、癌疾患に罹患している患者に高い出現率で存在することは証明されており、それをここでさらに明らかにする。

ＣＭＶＩＥΔｉ２は、様々な癌形態を有する患者に非常に多く見られる（７２／８６、８５％）が、ウイルス血症患者（１／１９、１０％）および健常集団（２０１０年に試験して１５／１００；１５％、１９９５年に試験して０／２８５）ではさほど頻繁には検出されないことが判明した（３２）。ＣＭＶのこの遺伝子変異体に感染した腫瘍細胞は、スプライスＲＮＡ変異体および新規ＣＭＶＩＥタンパク質を発現し、これらが癌の樹立および進行をさらに助長する。この新規ＣＭＶ株は、様々な組織／器官の腫瘍細胞において活性ウイルス感染生産ウイルスタンパク質として検出されるが、腫瘍を包囲する非腫瘍組織は、ＣＭＶタンパク質陰性のままである。

ＣＭＶＩＥΔｉ２は、１００の臨床単離物のうちの３つから単離された。３ケースすべてにおいて、ＣＭＶＩＥΔｉ２ウイルスは、ｗｔＣＭＶウイルスと共に単離されたので、より遅い成長速度およびより低い複製効率を有するようである。

ＣＭＶＩＥΔｉ２株の保有者の如何なる生涯リスクが、癌またはＣＭＶ陽性腫瘍の発生についてのものなのかは今のところ不明であり、その８４％しかＣＭＶＩＥΔｉ２株を保有しない。したがって、ＣＭＶＩＥΔｉ２株に感染している個体の１０〜１５％のうちの何名が癌を発生することとなるのかは不明であるが、本明細書の中でさらに提起する多くの理由のためやはりこのＣＭＶＩＥΔｉ２株の保有者を同定する必要がある。

遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２の転写が如何にして調節されるのかは今のところ不明である。腫瘍組織検体において、ＣＭＶＩＥΔｉ２の存在は、スプライスＣＭＶ変異体ＩＥタンパク質の高い発現と関連づけられる。

したがって、本発明の１つの態様では、ＣＭＶΔＩＥｉ２株の保有者を同定することにより、例えば、配列番号１で開示する変異体同定マーカについて検索することにより、および様々な一般に用いられている技術を用いることにより、哺乳動物における癌の素因を検出することおよび／または癌形態を診断することが可能である。この情報は、生体試料を通した、例えば献血、器官および幹細胞移植ならびに授乳による、個体間のＣＭＶΔＩＥｉ２株の伝達を回避するのに有用であり得る。

成人人口の約７０％はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の保有者である。ＣＭＶタンパク質および核酸は、最近、膠芽腫、神経芽腫、髄芽腫、乳、結腸および前立腺癌をはじめとする様々な起源の腫瘍の＞９０％において見出された。非常に多数のＣＭＶタンパク質が発癌性または腫瘍調節性（ｏｎｃｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）であるが、ほんの少数のＣＭＶ保有者しか癌を発生しないことを示唆する証拠が増えている。これまでに未知のＣＭＶウイルス株が腫瘍患者、原発性腫瘍培養物（８９％）または細胞系の８４％において検出されるのに対して、この株が健常血液ドナーの０〜１５％およびＣＭＶウイルス血症患者の１０％において見出されることが判明した。このウイルス株は、ＣＭＶゲノムの最初期領域内のイントロン２の欠如によって同定された。スプライスＲＮＡ変異体および特有のウイルスタンパク質は、腫瘍細胞内のＣＭＶＩＥΔｉ２株によって生産された。ＣＭＶＩＥΔｉ２株の個体において癌を生じさせる発癌能力の浸透度をやはり明らかにすべきである。さらに、輸血によるこのウイルスの伝播を、哺乳動物におけるかかるＣＭＶ株の存在を判定するための方法、例えば、本発明の態様により例示されるもの方法によって予防することができる。

本発明は、腫瘍におけるＣＭＶ感染が、様々な癌形態と高度に関連づけられるＣＭＶの新規変異体を説明する決定的証拠を開示する。このＣＭＶ変異体での癌細胞の感染は、癌幹細胞から欠陥粒子「濃密体」を生じさせ、それにより癌の診断および発生の新規モデルを提案する、感染の新規実体を表す。その裏付けとして、ＣＭＶゲノムの主要前初期領域内のイントロン２が一貫して欠如しているＣＭＶの新規遺伝子変異体を明らかにした。

新規ＲＮＡ転写産物およびＣＭＶＩＥタンパク質は、原発性腫瘍、原発性腫瘍培養物および細胞系におけるＣＭＶ感染腫瘍細胞によって生産される。ＲＮＡ転写産物は、濃密体またはエキソソームによってＣＭＶＤＮＡ陽性細胞から周囲の細胞へと送達され、その結果、ウイルスを複製しない細胞においてＣＭＶタンパク質が発現されることとなり、それによって、細胞の形質転換が可能になる。それらの細胞は溶解感染を受けることとならないからである。

特定の理論により拘束されないが、どの組織／器官において腫瘍が発生することとなるのかは、主として、欠陥ウイルス粒子、すなわち濃密体、でのまたはエキソソームによるＣＭＶタンパク質およびＲＮＡの送達による、細胞の発癌性形質転換および標的組織での癌発生を生じさせる結果となる、ＣＭＶΔＩＥｉ２株を保有する潜伏感染細胞のその組織への動員およびそのウイルスの再活性化に依存することとなる可能性が高い。炎症は、潜在ＣＭＶの再活性化のための駆動力であるので、癌開始のこの初期段階は、癌の周知リスク因子である炎症に依存することとなる可能性が高い。活性時、ＣＭＶＩＥΔｉ２は、ＣＭＶＩＥ領域から新規ＲＮＡ転写産物（図１２でＣＭＶＩＥΔｉ２によって生産されることが説明されるようなセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡ両方）を生産することとなる。ＩＥタンパク質は、ＣＭＶ濃密体で細胞間を移動するので、多くの細胞形態の主因となる。

ＣＭＶＩＥΔｉ２株が、樹立された癌においてそのように多くみられることに鑑みて、その潜在的高悪性能の疑いをさらに強める。したがって、変異体ＣＭＶ株（ＣＭＶＩＥΔｉ２）の検出を輸血または幹細胞移植片注入の前、臓器移植前に行って、この外見上発癌性のＣＭＶ株の伝達を回避すること、および患者においてより晩年に疾患が発生するのを予防することができるだろう。これは、本発明の例証態様に従って行うことができるだろう。

さらに、ＣＭＶ血清陽性授乳母の９０％より多くが、彼女たちの母乳中に再活性化された潜在ＣＭＶを有し、１歳の子供におけるＣＭＶの出現率は、主として母乳によるウイルス伝達のため、３９〜４０％である。したがって、授乳婦は、彼女たちの子供へのこの外見上発癌性のＣＭＶ株の授乳および伝達を避けるため、およびそれによって子供の将来の癌発生リスクを低下させるために、ＣＭＶＩＥΔｉ２株の保有者であるかどうか検査することを選択することができるだろう。受精によるその伝達を避けるために、ウイルスを含有するかもしれない新鮮およびバンク保存精液にもこの試験法を適用すべきである。したがって、本発明は、授乳母から得た生体試料において本明細書中で定義するとおりの遺伝子変異体を同定および／または検出するための方法にも関する。

ヒト試料（組織、または体液、例えば血液、血漿、血清、母乳、精液、尿および唾液、または幹細胞試料）中のＣＭＶＩＥΔｉ２の存在を、最初期遺伝子のイントロン２の欠如を特異的に検出するＰＣＲ技術で診断し、新規タンパク質をウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ法で検出する。様々な一般的な癌形態を有する患者から得た生体試料における野生型ＣＭＶ株からのＣＭＶＩＥΔｉ２株の検出の実行可能性を立証するために３つの診断ＰＣＲ法の例を本明細書に開示し、これらの例は本発明に包含され、材料および方法の項でこれらの例を詳細に説明する。

様々なＣＭＶ特異的抗体を使用するウエスタンブロットにより、腫瘍細胞の細胞溶解産物において、ＣＭＶＩＥΔｉ２株によって生産された新規タンパク質を検出する。

これらのタンパク質に特異的な抗体を使用するＥＬＩＳＡを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ設定でのさらなる検出のためのタンパク質を捕捉する。したがって、このＥＬＩＳＡを本発明の態様において利用することができるだろう。さらに、５プライマー末端または３プライマー末端からそれぞれ転写された新規センスおよびアンチセンス転写産物のタンパク質をＥＬＩＳＡに使用して、ＣＭＶＩＥΔｉ２株の保有者を定義するために血清または血漿中のそれらの存在をスクリーニングしながら、これらの特有のタンパク質に対して生産された抗体を検出して、疾患のバイオマーカとして使用する。本発明の他の態様では、静脈内免疫グロブリン中のＣＭＶに対する抗体またはＣＭＶＩＥΔｉ２株によって生産された濃密体のエンベロープ中に存在するＣＭＶタンパク質に対する特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体を使用して、ヒト試料、例えば血清または血漿、中のこれらの粒子を濃縮して、活性形態のＣＭＶＩＥΔｉ２株を検出する。ＰＣＲ、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ技術を用いて、核酸または新規タンパク質の存在を確認する。

したがって、１つの態様において、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の遺伝子変異体であって、ＣＭＶゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子のイントロン２（ＩＥのイントロン２の配列を配列番号１７に示す）の欠如を特徴とする遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）に関する。したがって、前記遺伝子変異体は、配列番号１７の核酸、すなわち、Ｍｅｒｌｉｎ参照配列ＡＹ４４６８９４．２の位置１７３９０３から位置１７４０１９における核酸配列の欠如をさらに特徴とし得る。野生型株と比較して前記遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２において前記配列（配列番号１７）が除去されているまたは欠失している場合、ゲノム内のその領域では、配列番号１に明記するとおりのＤＮＡ配列が産生される、すなわち、この場合、イントロン２が不在のためエクソン２および３は隣接している。

配列番号７および８に明記するようなプライマーを使用することにより配列番号１を産生し、それを使用してＣＭＶＤＮＡを増幅する。プライマー位置は、Ｍｅｒｌｉｎ配列ＡＹ４４６８９４．２の位置１７３７４１から１７４０７３である。

本明細書における他の態様では、本明細書中で定義するとおりの遺伝子変異体の転写によって得られるＲＮＡスプライス変異体を包含する。もう１つの態様では、本発明は、遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２の転写によって得られるＲＮＡスプライス変異体に関する。１つの態様において、前記ＲＮＡスプライス変異体は、ＣＭＶＩＥ遺伝子のエクソン２および３、ならびに／またはそれらの一部から成る。

本発明に関して、エクソンの１つ以上の部分を含むＲＮＡスプライス変異体は、例えば、あるエクソンの一部分および完全な他のエクソンから成る、例えば図１２ｂに例示するような、ＲＮＡスプライス変異体を指す。

もう１つの態様において、前記ＲＮＡスプライス変異体は、ＣＭＶＩＥ遺伝子のエクソン２、３および４、またはそれらの一部から成る。もう１つの態様において、前記ＲＮＡスプライス変異体は、ＣＭＶＩＥ遺伝子のエクソン２、３および５、ならびに／またはそれらの一部から成る。本明細書に例示するような本発明のすべての態様において、前記遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはＲＮＡスプライス変異体および／または本明細書中で述べるタンパク質を、例えば、本発明の任意の方法または使用またはキットにおいて、ＣＭＶＩＥΔｉ２株およびしたがってその保有者を同定するために使用できることは、理解されるはずである。

本発明のもう１つの態様において、本発明は、本明細書中で定義するとおりのＲＮＡスプライス変異体によってコードされるタンパク質であって、おおよそ１５０、１２５、８６、７２、５５、５３、５０、４０、３８、３６、３２、３１、２４、２０、１９、１８、１４、１２および１０ｋＤａのサイズを有するＣＭＶタンパク質から成る群より選択されるタンパク質に関する。

本発明のもう１つの態様は、生体試料中のＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された本明細書中で定義するとおりの１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／または前記スプライス変異体から翻訳された本明細書中で定義するとおりの１つ以上のタンパク質の存在または不在を検出するための方法であって、ａ）哺乳動物からの生体試料を用意する段階、ｂ）本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記１つ以上のスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質が、前記生体試料中に存在するかどうかを、段階ａ）において得た前記試料の専門分析によって判定する段階を含む方法に関する。

本発明のもう１つの態様は、生体試料中のＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写されたＲＮＡスプライス変異体および／または前記スプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在を検出するための方法であって、ａ）前記試料の専門分析を行う段階、およびその後、ｂ）前記生体試料中のＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在を検出する段階を含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するための方法であって、ａ）前記哺乳動物からの生体試料を用意する段階、およびｂ）本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記ＲＮＡスプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質が、前記生体試料中に存在するかどうかを、段階ａ）において得た前記試料の専門分析によって判定する段階、およびｃ）前記生体試料中の、本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはその／それらのスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在に基づいて、癌を発生する素因を判定する段階を含む方法に関する。

さらに１つの態様では、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するための方法であって、ａ）生体試料の専門分析により、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質が、前記生体試料中に存在するかどうかを判定する段階、およびｂ）前記生体試料中のＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはその／それらのスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在に基づいて癌を発生する素因を判定する段階を含む方法を、本明細書において定義する。

さらなる態様において、本発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連癌形態を、ＣＭＶ感染を保有する哺乳動物において診断するための方法であって、ａ）前記哺乳動物からの生体試料を用意する段階、ｂ）本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはその／それらのスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質が、前記生体試料中に存在するかどうかを、段階ａ）において得た前記試料の専門分析によって判定し、そして前記生体試料中の、本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳されたタンパク質の存在または不在に基づいて、前記哺乳動物がＣＭＶ関連癌疾患に罹患しているかどうかを診断する段階を含む方法に関する。

なお、さらなる態様では、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連癌形態を、ＣＭＶ感染を保有する哺乳動物において診断するための方法であって、ａ）生体試料の専門分析により、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはその／それらのスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質が、前記生体試料中に存在するかどうかを判定する段階、およびｂ）前記生体試料中の、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体および／またはそのＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはそのスプライス変異体から翻訳されたタンパク質の存在または不在に基づいて、前記哺乳動物がＣＭＶ関連癌疾患に罹患しているかどうかを診断する段階を含む方法を、本明細書において定義する。

本明細書中で定義するとおりの方法では、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在を、それ／それらに対する抗体の前記哺乳動物における存在または不在によって判定することができる。

加えて、本明細書中で定義するとおりの方法では、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在または不在を、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体、このＣＭＶの遺伝子変異体から転写された１つ以上のスプライス変異体および／またはその／それらのスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質に対して産生されたＴ細胞の前記哺乳動物における存在または不在によって判定することができる。

本明細書中で定義するとおりの方法において使用するための前記生体試料は、検出のために試料ウイルス粒子を単離することができる、本明細書中で定義するとおりの任意の生体試料であり得る。前記生体試料が細胞を含む場合、これらの細胞をウイルス材料の検出前に溶解することができ、その後、そのウイルス材料をそこから単離する。前記生体試料は、細胞試料に加えて血漿試料であることもある。したがって、本発明に関して、前記生体試料は、血液試料、血漿試料、組織試料、幹細胞試料、臓器移植移植片試料、精液試料、尿試料、唾液試料および母乳試料から成る群より選択することができるが、これらに限定されない。

本明細書中で定義するとおりの方法では、前記専門分析をＤＮＡ検出法、例えば、ＩＳＨ（ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション）によって行うことができる。

１つの態様において、本発明は、本明細書中で定義するとおりの方法であって、前記方法の前記専門分析がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲまたはシーケンスキャプチャーＰＣＲを含む方法によって行われる方法に関する。１つの態様では、前記ＰＣＲを、ＣＭＶのＩＥ遺伝子のエクソン２および３の少なくとも一部分を増幅することによって行って、配列番号１の存在を判定することができる、すなわち、前記試料中のＣＭＶＩＥΔｉ２を検出することができる。これは、図５および図８および表１に例示するようなプライマーを使用することによって行われる。この方法はまた、例えばＣＤ３４陽性造血幹細胞における潜在型のＣＭＶＩＥΔｉ２を保有する幹細胞において、循環または組織定住ＣＤ１３３陽性幹細胞において、および血管内皮細胞成長因子２（ＶＥＧＦＲ２：ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２）の発現によって同定される循環または組織定住内皮前駆細胞において、ＣＭＶＩＥΔｉ２を検出するために用いられる。

もう１つの態様では、本発明による方法の技術的分析を、ＦＩＳＨ技術（蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を用いることによって行う。ＦＩＳＨは、染色体上の特異的ＤＮＡ配列の存在または不在を検出および局在定位するために用いられる技術である。ＦＩＳＨには、蛍光プローブであって、染色体の該蛍光プローブと高い配列類似度を示す部分のみに結合するものである蛍光プローブが使用される。蛍光顕微鏡法を用いて、染色体に結合した蛍光プローブの位置を見つけ出すことができる。ＦＩＳＨは、多くの場合、遺伝相談、医学および種同定に使用するためのＤＮＡの特異的特徴を見つけるために用いられる。ＦＩＳＨを用いて、組織試料内の特異的ｍＲＮＡを検出および局在定位することもできる。これに関連して、ＦＩＳＨは、細胞および組織内の遺伝子発現の時空間パターンを定義するのに役立ち得る。他の態様において、ＦＩＳＨ技術は、遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２に感染した細胞内のＤＮＡ位置の特異的パターンを検出するためのならびにＣＭＶＩＥΔｉ２のヒト染色体への組み込みを同定するための分析用のＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含む場合がある。ＤＮＡ位置のパターンは、ＣＭＶ陽性腫瘍細胞では潜在ｗｔＣＭＶ、またはｗｔＣＭＶの活性複製と比較して明確に異なる。

他の態様では、本発明による方法の技術的分析を、抗体を使用することによって行う。かかる抗体は、例えば、ＣＭＶゲノムの前初期（ＩＥ）領域のエクソン２および３、すなわちそれらによってコードされたタンパク質、に対して産生されたものであり得、したがって、かかる抗体によりＣＭＶの遺伝子変異体が分析している生体試料中に存在するかどうかを判定することができる。他の態様では、他の領域に対して産生された抗体、例えば、癌患者の血液、血漿または血清からの非感染性ＣＭＶ粒子、すなわち濃密体またはエキソソーム、に対して産生された抗体も使用することができる。本発明の他の態様では、本明細書に開示するような様々な専門分析方法を併用して、例えば、抗体検出、続いてのＰＣＲもしくはウエスタンブロット、または他の任意の組み合わせを併用して、遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２および／またはその１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／または前記ＲＮＡスプライス変異体から発現された１つ以上のタンパク質の存在または不在を同定することができる。遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２から翻訳された濃密体を含めて、非感染性または欠陥ＣＭＶ粒子の存在を、抗体を使用して検出することもできる。

本発明に関連して、本明細書中で例示するような前記方法を癌の診断に用いることができ、前記癌は、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、および肉腫、腎臓癌、膵臓癌ならびにそれらの転移から成る群より選択される。本明細書において述べない他の癌形態も、前記癌形態が本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体の感染を含むのであれば、診断することができる。

本明細書に開示するような方法では、本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質を、配列番号１に含まれる核酸の、ＰＣＲ法で前記領域を増幅することによるような、使用により検出することができる。

本明細書に開示するようないずれの方法も、ｉｎｖｉｔｒｏ法である場合がある。

もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物において癌の素因を検出するための、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された本明細書中で定義するとおりの１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳された本明細書中で定義するとおりの１つ以上のタンパク質の使用にも関する。

もう１つの態様において、本発明は、哺乳動物においてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連癌形態を診断するための、本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質の使用に関する。診断することができる癌形態は、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、肉腫、基底細胞癌腫および膵臓癌から成る群より選択することができる。本明細書において述べない他の癌形態も、前記癌形態が本明細書中で定義するとおりのＣＭＶの遺伝子変異体の感染を含むのであれば、診断することができる。この場合、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のスプライス変異体および／または前記スプライス変異体（単数もしくは複数）から翻訳された１つ以上のタンパク質の使用であって、前記変異体が、配列番号１に含まれる核酸を使用することによって、例えば、ＰＣＲ法で配列番号１を、前記領域を増幅することにより、使用することによって検出される使用にも関する。

本発明に関して、本明細書で述べる場合の前記哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば人間であり得る。

１つの態様において、本発明は、潜在ＣＭＶＩＥΔｉ２を保有する細胞、例えばＣＤ３４およびＶＥＧＦＲ２陽性細胞も含めて、哺乳動物から得た生体試料において、本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳されたタンパク質の存在を診断および／または検出するための試薬を含むキットにも関する。１つの態様において、前記試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うための試薬を含む。もう１つの態様において、前記試薬は抗体を含む。

１つの態様において、本発明は、ＣＭＶＩＥΔｉ２株関連ペプチドに特異的な抗体およびより高レベルのこれらの抗体を検出する方法を用いて、例えば、ＩＥスプライス変異体タンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート、膜またはビーズを使用して、患者血清または血漿試料中のＣＭＶＩＥΔｉ２株のスプライス変異体ＩＥタンパク質に対して作られたタンパク質に対する抗体を癌のバイオマーカまたは癌発生のリスクのバイオマーカとして診断および／または検出するための試薬を含む、診断方法／キットにも関する。

１つの態様において、本発明は、患者におけるＣＭＶＩＥΔｉ２株から作られたペプチドに対して反応性Ｔ細胞を癌のバイオマーカまたは癌発生のリスクのバイオマーカとして診断および／または検出するための試薬を含む診断方法／キットにも関する。

さらに、ＣＭＶＩＥΔｉ２株によって感染された細胞は、一般的なヒト癌形態では悪性形質転換細胞を意味する。腫瘍細胞においてより高い存在量で生産される、本明細書中で定義するとおりの新規ＩＥＣＭＶタンパク質の同定は、この新規ＣＭＶタンパク質を標的にする免疫療法および治療的ワクチン接種を可能にし、それによってＣＭＶＩＥΔｉ２株感染細胞の効率的排除を可能にする。腫瘍内の幹細胞が、これらのＣＭＶタンパク質と高レベルのＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の両方を発現していることを証明し、それによって特異的免疫療法のためのそれらの標的化の実行可能性を立証する。

癌患者から血漿交換によって濃縮された抗原提示細胞、例えば樹状細胞にベクターでＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡ、ＲＮＡをｅｘｖｉｖｏ供給して、細胞内でタンパク質を生産することとなり、または腫瘍からび精製タンパク質もしくはエクソン２およびエクソン３への組換えタンパク質を使用して、患者からの自家Ｔ細胞に提示することとなる。培養で増殖させた反応性Ｔ細胞を養子療法として患者に戻して、癌からの治癒を生じさせる。あるいは、樹状細胞ワクチン接種戦略で樹状細胞を患者に逐次注射で戻して、ＣＭＶＩＥΔｉ２関連ペプチドへのＴ細胞増殖をｉｎｖｉｖｏで刺激する。両方の戦略は、癌患者におけるウイルス感染腫瘍細胞および腫瘍幹細胞を死滅させることを目的とする。

癌患者に移入してウイルス感染腫瘍細胞および腫瘍幹細胞を見つけて死滅させるために使用することを目的としたアポトーシス誘導抗体をはじめとする抗体の生産を誘導するために、ＣＭＶＩＥΔｉ２株タンパク質を使用する。したがって、１つの態様において、本発明は、本明細書に提示するようなかかる処置方法に関する。

他の態様では、本明細書に提示するようなＣＭＶＩＥΔｉ２遺伝子変異体を使用して、世の中からこのウイルス株をなくすための予防ワクチンを開発することとなる。タンパク質ベースの発現ベクターおよび技術を用いて、予防および治療ワクチンのためのＣＭＶＩＥΔｉ２株に対するサブユニットワクチンを生産するために使用される新規ＣＭＶＩＥΔｉ２ＩＥタンパク質を発現させる。この新規ＣＭＶＩＥΔｉ２株に対するＤＮＡワクチンを、該ＣＭＶＩＥΔｉ２株を標的にする予防および治療ワクチンに使用される新規ＩＥタンパク質の発現のために開発することとなる。したがって、本発明の他の態様において、本発明は、ＣＭＶＩＥΔｉ２株をコードする、治療または予防ワクチンとして使用するための、ワクチンベクターに関する。他の態様において、本発明は、ＣＭＶ感染に対する治療または予防ワクチン接種用のワクチンベクターを調製するための、本明細書中で定義するとおりの、ＣＭＶの遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）、もしくは配列番号１の利用、および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のＲＮＡスプライス変異体および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳されたタンパク質に関する。一部の態様では、ＲＮＡ転写産物を使用して、本明細書に開示するような新規ＣＭＶタンパク質をＣＭＶＩＥΔｉ２のＩＥ領域から発現させて、治療または予防ワクチン接種用のワクチンベクターとして使用することができる。他の態様では、ＣＭＶＩＥΔｉ２のＩＥ領域から生産されたＩＥタンパク質を使用して、養子療法のためにＴ細胞を（ｅｘｖｉｖｏ）刺激することができる。加えて、本明細書に提示する転写産物およびタンパク質は、さらに免疫療法の標的として有用なものであり得、ならびに本明細書中で例示するような予防および治療ワクチンの開発に使用するためのものであり得る。本発明の一部の態様では、粒子を血液から選出することができ、および原発癌または転移性疾患のバイオマーカとして使用することができる。かかる粒子を腫瘍細胞培養物から単離し、ワクチン接種のために使用することもできる。遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２を保有する循環腫瘍細胞を、例えば癌および転移性疾患のバイオマーカとして、ＰＣＲで検出することができる。

本発明の他の態様では、人間などの哺乳動物から得た生体試料中の遺伝子変異体ＣＭＶＩＥΔｉ２および／またはそのＣＭＶＩＥΔｉ２から転写された１つ以上のＲＮＡスプライス変異多および／またはその／それらのＲＮＡスプライス変異体から翻訳された１つ以上のタンパク質の存在を検出することにより、ヒト組織もしくは細胞移植（輸血を含む）、幹細胞もしくは臓器移植移植片による、または授乳婦から子供への、ＣＭＶＩＥΔｉ２株の伝達を回避して、癌のリスクの伝達をなくすことができる。本方法は、ＣＭＶＩＥΔｉ２器官および血液ドナーと同株を保有するレシピエントとを適合させるために用いることもできる。

実験の項
略号
５−ＬＯ５−リポオキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｘｉｇｅｎａｓｅ）
ＢｒＣ乳癌
ＣＣ結腸癌
ＣＤＳコード配列
ＣＫサイトケラチン
ＣＭＶサイトメガロウイルス
ＣＯＸシクロオキシゲナーゼ
ＣＴＬ細胞傷害性Ｔリンパ球
ＥＢＶエプスタイン・バーウイルス
ＦＡＣＳフローサイトメトリー
ＦＩＳＨ蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＧＢＭ多形膠芽腫
ＨＣＭＶヒトサイトメガロウイルス
ＨＣＭＶ−ＩＥＡヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子抗原
ＨＤ健常ドナー
ＨＨＶヒトヘルペスウイルス
ＨＬＡヒト白血球抗原
ＨＳＶ単純ヘルペスウイルス
ＩＥ前初期遺伝子
ＩＥΔｉ２イントロン２が欠失した最初期遺伝子
ＩＨＣ免疫組織化学
ＩＭＮ伝染性単核球症
ＭＢ髄芽種
ＭＨＣ主要組織適合遺伝子複合体
ＭＩＥ主要前初期遺伝子
ＮＢ神経芽腫
ＮＫナチュラルキラー細胞
ＮＴＣ無テンプレート対照
ＯｖＣ卵巣癌
ＰＢＳリン酸緩衝食塩水
ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応
ｐｐ６５ポリペプチド６５
ＲＮＡリボ核酸
ＳｎＲＮＰ核内低分子リボ核タンパク質
ＳＴＡＴシグナル伝達兼転写活性化因子
ＵＬユニークロング
ＵＳユニークショート
ＶＥＧＦＲ血管内皮細胞成長因子
ＲＴ室温

方法
臨床試料
本発明者らは、膠芽腫（ｎ＝１２０）、髄芽腫（ｎ＝３７）、神経芽腫（ｎ＝４９）、結腸（４１）、乳房（６９）、前立腺（ｎ＝１７）、卵巣（２５）、子宮頚（４０）、膵臓（ｎ＝１０）の腫瘍についての、ならびに乳癌のリンパ節転移（ｎ＝３５）および結腸および乳癌の８９の脳転移についての固定パラフィン包埋腫瘍検体から４００を超える試料を得、ＣＭＶタンパク質発現について分析した。本発明者らは、ＤＮＡ調製および可能な場合はＲＮＡ調製のために２４名のＧＢＭ患者から３３の膠芽腫、２３の神経芽腫、２の髄芽腫、１８の結腸癌、２０の乳癌、１０の卵巣癌、１０の膵臓癌検体および原発性腫瘍細胞培養物の新鮮または凍結腫瘍試料を得た。

ＣＭＶタンパク質の検出
免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＣＭＶＩＥ、ｐｐ６５および後期タンパク質に対する３つの異なるＣＭＶ特異的抗体を使用して免疫組織化学で切片をＣＭＶタンパク質について染色した。すべてのパラフィン包埋組織切片を脱ろうし、アルコール系列で再水和し、記載されている（１、３）ような高感度免疫組織化学によって染色した。使用した一次抗体は、ＣＭＶ−ＩＥＡに対する抗体（抗ＩＥ１−７２およびＩＥ１−８６、ＩｇＧ２ａ、ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国）、ＨＣＭＶ−ＬＡに対する抗体（ＩｇＧ２ａ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＣＭＶ−ｐｐ６５に対する抗体（ＩｇＧ１、ＮｏｖｏＣａｓｔｒａ、米国）、ならびにアイソタイプ対照としての役割を果たす、平滑筋細胞アルファアクチンに対する抗体（ＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、カリフォルニア州サン・ラモン）およびフォン・ヴィレブランド因子（ＩｇＧ１、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、デンマーク）であった。

フローサイトメトリー
ＧＢＭ組織の単個細胞浮遊液用に、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が入っているペトリ皿の中で、滅菌したメスの刃で腫瘍を小片に切断した。腫瘍を１５分間、３７℃でインキュベートした。この間に、腫瘍を１回インキュベーターから取り出し、ピペットによって解離させた。インキュベーション後、腫瘍をピペッティングによってさらに解離させ、５０ｍＬチューブでセルストレーナ（７５μｍ）（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ、スウェーデン国ストックホルム）に移した。２ｍＬシリンジプランジャーを使用して、セルストレーナに通して腫瘍を細分した。ＰＢＳを使用してストレーナをすすぎ、その後、８分間、１２００ｒｐｍで遠心分離した。

キットＰｅｒｍ２（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示書に従って使用して、細胞を透過性にした。次の抗体を使用した：ＣＭＶ−ＩＥＡ（マウスモノクローナルＩｇＧＭ０８５４、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＣＭＶ−ＩＥＡ（マウスモノクローナル１１−００３Ａｒｇｅｎｅ、ＰａｒｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｑｕｅ）、ＣＭＶ−ＩＥＡ（マウスモノクローナルＭＡＢ８１０Ｒ（８１０）、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国カリフォルニア州テメキュラ）およびＣＭＶ−ｐｐ６５（マウスモノクローナル、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）。この細胞をこの一次抗体と共に３０分間４℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、３０分間、４℃で二次抗体、ＦＩＴＣまたはＰＥコンジュゲート型ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＣｙＡｎ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）およびＳｕｍｍｉｔ４．３ソフトウェアを使用して細胞を分析した。

フローサイトメトリーを使用してＣＭＶタンパク質について膠芽腫腫瘍の初代細胞培養物を分析した。次の市販細胞系をＣＭＶタンパク質について調査した：膵臓細胞（ＡＳＰＣ１、Ｂｘｃｐ３、ｐａｎｃ１、ＭｉａｐａＣａ２、ｃａｐａｎ２、ｃａｐａｎ１、ｐａｔｕ８９０２）、前立腺癌細胞（ＬＷＧ、ＰＣ３）、結腸癌（ＣＡＣＯ２）、肺癌（Ｕ１８１０、Ｈ２３）、乳癌細胞系（ｓｋｆ３、ＭＣＦ７、ＭＤＡ２３１）。多形膠芽腫を有する患者からの新鮮なＧＢＭ腫瘍組織検体（ストックホルム地域倫理委員会（ＳｔｏｃｋｈｏｌｍＲｅｇｉｏｎａｌＥｔｈｉｃａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）からの倫理許可番号２００８／６２８−３１）を小片に切断し、酵素的に（０．５％トリプシン−ＥＤＴＡを使用）および機械的に解離させて単個細胞浮遊液にした。単離された細胞を、７％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかにおいて増殖させた。血清含有培地中で成長させた細胞をＧＢＭ細胞と名づけた。

ＶＥＧＦ−２およびＣＤ３４発現細胞のＦＡＣＳ選別
健常ドナーからのバッフィーコート（倫理許可０１／４２０）を受け取り、一晩、室温で振盪し続けた後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ、ノルウェー国オスロ）を製造業者の指示書に従って使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。１０分間のＲＢＣバッファー［ｐＨ８．０］での溶解によって赤血球を除去した。２５〜３０×１０^６の精製ＰＢＭＣを、２００μＬの各抗体ＶＧＥＦＲ２／ＫＤＲ−ＦＩＴＣ（Ｒ＆Ｄ、ＦＡＢ３５７Ｆ）およびＣＤ３４−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３４３５０６）で希釈し、５ｍＬの最終体積になるまでＰＢＳを添加し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を回転沈降させ（５分、１５００ｒｐｍ）、ＰＢＳで１回洗浄し、４０μｍセルストレーナ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）に通した。ＭｏＦｌｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ計器での選別まで、細胞を氷上で保持した。いずれかの抗体について陽性のまたは二重陽性の細胞を選別後に別々に回収し、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＤＮＡ抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、対照としての非標識細胞と一緒にＤＮＡ抽出した。本明細書中で述べるＴａｑＭａｎＰＣＲにおいてその精製されたＤＮＡを使用してウイルス含有量を検証した。

ＭＩＥ遺伝子のＰＣＲおよびシークエンシング
ＤＮＡ抽出
ＱＩＡＧＥＮキット（カリフォルニア州バレンシア）を製造業者の指示書に従って使用することにより、塩析技術により、またはＴｒｉｚｏｌ抽出により、腫瘍組織、腫瘍細胞および血液細胞からＤＮＡを抽出して、同じ試料からＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を得た。

ＩＥ遺伝子におけるイントロン２の欠失の検出のためのネステッドＰＣＲ
腫瘍組織、腫瘍細胞および血液細胞から抽出したＤＮＡ試料を、フォワードおよびリバースプライマーを使用するネステッドＰＣＲによって、ＭＩＥ遺伝子のエクソン２および３（配列番号５〜８；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇら、「ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９３年）から増幅した。この方法は広範に使用されているが、この方法によって、以前に、健常対照において、ＣＭＶウイルス血症患者において、または様々な起源の細胞タイプ（線維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、癌細胞）を感染させる多数のＣＭＶ株の実験研究において、イントロン２が欠如しているＣＭＶＩＥゲノム変異体が検出されたことはない。

社内ネステッドＰＣＲを、本発明者らの研究所において、少し改良したが以前に記載されたように行った（参照：Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇら、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ」、１９９３年、６７（６）、３１６６−３１７５（３３））。簡単に言うと、おおよそ５０〜３００ｎｇのＤＮＡまたはｃＤＮＡを第一ＰＣＲ段階で合計４０サイクル、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増幅した。第二ＰＣＲ段階で１μＬの第一ＰＣＲ産物を使用し、その後、３０サイクルの増幅に付した。両方の対照、陽性および陰性試料を記載のとおり増幅し、最終アンプリコンを１．５％ＧｅｌＲｅｄ染色アガロースゲル上で泳動させた。バンドを切り出し、精製し（ＱｉａｇｅｎＧｅｌ精製キット）、シークエンシング（ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙａｔＫａｒｏｌｉｎｓｋａＩｎｓｔｉｔｕｔｅｔ）に送った。フリーソフトウェアＣｈｒｏｍａｓを使用してシークエンシング結果を分析し、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントでアラインした。

イントロン２欠失変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）の検出のためのＴａｑＭａｎＰＣＲ
全ＣＭＶＭＩＥ遺伝子をカバーするプライマーを使用することによる一段階ＰＣＲを開発した。簡単に言うと、ＰＣＲバッファー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）から成るＰＣＲ反応混合物中おおよそ７０〜２００ｎｇのＤＮＡを使用した。増幅サイクルをＰＣＲマシン（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）で行った。５０増幅サイクルは、５０℃で２分間のＵＮＧ活性化、９５℃で１０分間のホットスタート、９５℃で１０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリングおよび伸長から成った。未感染またはＣＭＶ（ＡＤ１６９もしくはＶＲ１８１４もしくはＴＢ４０）感染ＭＲＣ−５細胞からＤＮＡおよびＲＮＡを抽出した。ＯｌｉｇｏｄＴ_２０でのＲＴ−ＰＣＲのためにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍでｃＤＮＡを調整した。ＧｅｌＲＥＤＮｕｃｌｅｉｄＡｃｉｄＧｅｌＳｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、カリフォルニア州ヘイワード）を含有する増幅ＰＣＲ産物を１．５〜２％アガロースゲル上で泳動させ、ＵＶ線で可視化した。ＰＣＲ増幅バンドを切り出し、精製し、自動シークエンシング（ＡＢＩ３７３０ＤＮＡアナライザー）によって分析した。米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ＢＬＳＡＴ検索をＣＭＶゲノムの確認に用いた。シークエンシングしたすべてのデータを、アラインメントソフトウェアを使用して参照ＣＭＶ−ＩＥゲノム（ＭＥＲＬＩＮ）に対してアラインした。

ＴａｑｍａｎＰＣＲは、Ｆａｓｔ９６−ＷｅｌｌＢｌｏｃｋＭｏｄｕｌｅを備えたＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ７９００ＨＴＦａｓｔＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｍｔｅｍをマニュアルに従って用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＦａｓｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘを使用して行った。温度プロファイルのデフォルト設定を、以下のプライマー／プローブを使用する５０サイクルおよび１０μＬの試料体積と共に使用した：

ＩＥｃＤＮＡ：
配列番号９：フォワード：５’−ＴＧＡＣＧＡＧＧＧＣＣＣＴＴＣＣＴ−３’、
配列番号１０：リバース：５’−ＣＣＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＴ−３’、
配列番号１１：プローブ、５’ＦＡＭ−ＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＣＣＣＧ−ＮＦＱＭＧＢ−３’
配列番号１２：ＩＥＤＮＡ：フォワード：５’−ＧＴＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴＣＴＡＴ−３’、
配列番号１３：リバース：５’−ＣＴＣＡＡＣＡＴＡＧＴＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴ−３’、
配列番号１４：プローブ、５’ＦＡＭ−ＴＴＧＧＴＣＡＣＧＧＧＴＧＴＣＴＣＮＦＱＭＧＢ−３’

ＴａｑｍａｎＰＣＲの特異性を３つの近縁ヘルペスウイルス、すなわち、ＨＨＶ−６、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２で試験した。両方のプライマー／プローブで増幅は認められなかった。各試料を、陰性対照としての試薬対照および無テンプレート対照と共に、三重反復で実行した。ＤＮＡについての陽性対照は、ＡＤ１６９感染ＭＲＣ−５線維芽細胞であり、ＶＲ１８１４感染マクロファージは、ｃＤＮＡ対照としての役割を果たした。陽性および陰性対照が十分に働いた場合にのみ、結果を有効と見なした。場合によっては、ＰＣＲ産物を１．５％（ｗ／ｖ）高分解能ＧｅｌＲｅｄ染色（Ｓｉｇｍａ）アガロースゲル上で泳動させ、精製し、ＤＮＡシークエンシングに送ってアンプリコンをさらに確認した。

全ＩＥ遺伝子に及ぶＩＥプライマーおよびＭＩＥプロモータ領域のための２セットのプライマーを利用するシングルおよびネステッドＰＣＲ
使用したプライマーを図５に記載する。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍＶｅｒｉｔｉ９６ウェルサーマルサイクラーを使用してＰＣＲを行い、そのＰＣＲプロファイルは、９４℃で２分間；９４℃で３０秒の３５サイクル；５５℃または６０℃（表に示すとおり）、４０秒；７２℃で５０秒間；７２℃で７分間の最終伸長および４℃で保持であった。ＤＮＡまたはｃＤＮＡ試料を増幅し、ＣＭＶＩＥ遺伝子セグメントの検出のための高感度で高特異的な方法を明らかにした。ＰＣＲ産物を１．５％ＧｅｌＲｅｄ染色アガロースゲル上で泳動させ、Ｂｉｏ−ｒａｄゲル・ドキュメンテーション・システムで可視化した。

シーケンスキャプチャーＰＣＲ
ＤＮＡ抽出
Ｏｍｅｇａｂｉｏ−ｔｅｋキット（米国ジョージア州）を製造業者の指示書に従って使用することにより３ｍＬの全血からＤＮＡを抽出し、１００ｕＬのＨ_２Ｏで溶出した。

シーケンスキャプチャーＰＣＲ（Ｍａｎｇｉａｐａｎら、１９９６（３４）から改良した方法）
１０分間、９５℃でＤＮＡを加熱することによってＤＮＡを変性させた。その試料を氷上で１０分間冷却して、鎖分離を保った。その後、０．１２５ｐｍｏｌの各々のビオチン化された捕捉用プライマーを含有する３６．４μＬの３．７５ＭＮａＣｌを添加した。
（ネステッドＰＣＲにも使用したものであり、上述のＴａｑｍａｎプライマーの結合領域外にハイブリダイズする）プライマーの補足後、ビオチンで５’を標識し、ＨＰＬＣ精製した（Ｃｙｂｅｒｇｅｎｅ）：

配列番号１５：ＭＩＥＩＩ５’−ビオチン：ＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＴ（２３−ｍｅｒ）
配列番号１６：ＭＩＥＩＩ３’−ビオチン：ＣＴＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＧＴＴＧＣＡＡＴ（２１−ｍｅｒ）

６０℃の水浴内で３時間、チューブをインキュベートすることにより、プライマーとＤＮＡとをハイブリダイズさせた。２μＬのＭ−２８０ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｇＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ、ノルウェー国オスロ）を製造業者の指示書に従って洗浄した後、チューブに加え、穏やかに回転させながら室温でさらに２時間インキュベートした。ビオチン標識された捕捉プライマーおよびハイブリダイズしたＤＮＡを伴う磁性ビーズを、Ｄｙｎａｌ磁石を使用して取り出し、製造業者の指示書に従って洗浄した後、最後に５０μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ［ｐＨ８］）に再懸濁させた。

前に説明したＴａｑｍａｎＰＣＲにおけるテンプレートとして３μＬのこのビーズ懸濁液を直接使用した。

タンパク質抽出およびウエスタンブロット分析
ＣｏｍｐｌｅｔｅＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を補足した、放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ：ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎａｓｓａｙ）タンパク質抽出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２ｍＭＥＤＴＡ）で細胞ペレットまたは組織試料を可溶化した。腫瘍組織から、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＤＮＡおよびＲＮＡのＴＲＩＺＯＬ単離後に、タンパク質を抽出した。ミクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を定量した。０．１Ｍのジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するＮｏｖｅｘＴｒｉｃｉｎｅＳＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で試料を調製し、５分間、沸騰させた。同量（２５μｇ／レーン）のタンパク質をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離し、トランスブロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に電気的に転写した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）を補足したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝食塩水に溶解した５％脱脂粉乳で４５分間、膜をブロックした。次の一次抗体を明記する希釈度で用いて免疫標識を行った：マウスモノクローナル抗前初期抗原（ＩＥＡ）（１：１０００；Ａｒｇｅｎｅ）ならびにウサギポリクローナル抗ＩＥ７２（１：２０００）および抗ＩＥ８６（１：１０００；親切にも米国ＯｒｅｇｏｎＨｅａｌｔｈａｎｄＳｃｉｅｎｃｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＪａｙＮｅｌｓｏｎ教授から提供されたもの）。同等の負荷量のタンパク質を、マウスモノクローナル抗β−アクチン（１：３０００）での免疫標識によって検証した。３回のＴＢＳＴ洗浄の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた抗マウス（１：３０００）または抗ウサギ（１：３０００）ＩｇＧのいずれかと共に膜をインキュベートした。結合抗体をＥＣＬ−ｐｌｕｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって検出した。

蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
プローブ調製のために、全ＣＭＶゲノムを含有するプラスミド（親切にもポートランドのＮｅｌｓｏｎ博士によって提供されたもの）を、ＮｉｃｋＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｖｙｓｉｓ、米国イリノイ州ダウナーズ・グローブ）を製造業者の推奨基準に従って使用することにより標識した。スライド調製のために、細胞をコルセミド（Ｇｉｂｃｏ）で処理し、ＨＢＳＳで洗浄した。細胞ペレットを冷４％ＫＣｌに再浮遊させ、１４〜１６時間、３７℃でインキュベートした。遠心分離によって細胞を回収し、４％ＫＣｌにまた再浮遊させた。冷固定溶液（３：１メタノール：酢酸）をその細胞浮遊液にゆっくりと添加し、氷上で１時間インキュベートした。固定細胞を洗浄し、固定溶液に再浮遊させ、使用するまで２０℃で保管した。２０ｕＬの細胞浮遊液をスライド調製に使用した。おおよそ２００ｎｇのプローブを、８ｕＬのハイブリダイゼーション混合物［２ｕＬのＨｙｂｒｉｚｏｌ、２ｕＬのＣｏｔ−１ＤＮＡ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのもの）、および０．５Ｍｏｌの酢酸Ｎａ、ｐＨ５．２（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）中］および３０ｕＬのエタノール（９５％）に添加し、ドライアイス上で１５分間、インキュベートした。遠心分離後、上清を廃棄し、そのペレット（プローブ）に７０％エタノールを添加し、再び遠心分離してそのプローブを精製した。プローブを８ｕＬのＨｙｂｒｉｄｉｓｏｌおよび２ｕＬの蒸留水に溶解し、スライドに添加し、７２℃で８分間変性させ、その後、一晩、３７℃でインキュベートした。スライドを２×食塩水・クエン酸ナトリウム（ＳＣＣ：Ｓａｌｉｎｅｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）中で３分間、７０℃で洗浄し、脱水し、その後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）でマウントした。

結果
調査したすべての腫瘍検体および調査したすべての転移の９０％より多くが、免疫組織化学またはフローサイトメトリー分析により、ＣＭＶタンパク質陽性であった（図１Ａ、図１Ｂ、表１）。さらに、フローサイトメトリーにより、膠芽腫の２１の初代細胞培養物がＣＭＶＩＥ、ｐｐ６５および後期タンパク質を発現することが明らかになった（図１）。ＣＭＶタンパク質陽性細胞の数は、細胞系によって異なり、および同じ細胞系でも試料採取時が異なると異なった（図４、および４〜６９％の幅がある）。しかし、同じ試料採取時のＩＥ、ｐｐ６５および後期ＣＭＶタンパク質に対する４つの抗体を使用すると陽性細胞数についてかなり一致した結果が得られた（図４に例示）。悪性黒色腫、皮膚癌、肉腫、腎臓癌および膵臓癌の試料は、調査したすべての試料（ｎ＝１８）に関してＣＭＶ陽性であることが判明した。腫瘍細胞における高いタンパク質発現の事実にもかかわらず、本発明者らは、腫瘍組織からの組織検体または細胞溶解産物と繊維芽細胞または内皮細胞とを共培養することによって、髄芽腫、神経芽腫および膠芽腫腫瘍の新鮮腫瘍組織（ｎ＝２１）から感染性ウイルスを得ることができなかった（図示なし）。上気道感染を有する１名の１歳の男児およびＣＭＶ症候群（移植後の潜在ＣＭＶの再活性化に起因するＣＭＶ感染）を有する２名骨髄移植患者からＣＭＶＩＥΔｉ２変異体を単離した。

ＩＥタンパク質は、初期および後期遺伝子の発現の調節に中心的役割を果たすので、本発明者らは、必須ウイルスタンパク質の発現の喪失に起因して非生産性感染をもたらし得る特異的遺伝子変異体が腫瘍内に存在し得るという仮説を立てた。スプライス変異体タンパク質は、溶解感染を受けない細胞において動作することができるので、このシナリオは危険であり得る。本発明者らは、全ＣＭＶＩＥ遺伝子領域に及ぶプライマーペア（プロモータ領域内の２つのプライマーペア、および図５に記載のＩＥ遺伝子のためのプライマーペア）を設計した。すべてのプライマーセットが予想サイズのＰＣＲ産物を増幅し、ＰＣＲ産物のＤＮＡシークエンシングにより、ｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞においておよびＣＭＶウイルス血症患者のＤＮＡサンプルにおいてＩＥＤＮＡが確認された。特異性対照として使用したＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２またはＨＨＶ−６感染細胞培養物から抽出したＤＮＡからはＰＣＲ産物が増幅されなかった。１２名のＣＭＶウイルス血症患者（１０名の単核球症および２名の移植患者）およびｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞（ＡＤ１６９、ＴＢ４０およびＶＲ１８１４株）のＤＮＡを試験した；１名の単核球症患者は、ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体を有し、他のすべては、ＣＭＶの野生型変異体を有した。４つのＰＣＲ産物のＤＮＡシークエンシングにより、単核球症患者の試料において正常完全長ＤＮＡの存在が確認され、癌患者の６０／６０（１００％）において、および１名の単核球症患者において、イントロン２が欠如している欠失変異体が確認された。

本発明者らは、本発明者らが１９９３年に設計したＩＥ遺伝子のエクソン２およびエクソン３におけるプライマーペアでのネステッドＰＣＲを用いた。このネステッドＰＣＲアッセイは、腫瘍患者の悪性腫瘍（膠芽腫、神経芽腫、結腸、乳、卵巣癌）の検体のＤＮＡの７２／８４（８４％）、細胞培養物の検体のＤＮＡ（１２／１５、８０％）および血液の検体のＤＮＡ（９／３３、２７％）から約２１８塩基対（ｂｐ）のより短いＰＣＲ産物を増幅した。そのＰＣＲ産物のＤＮＡシークエンシングによって、イントロン２がＰＣＲ産物中に不在であることが明らかになった（図６〜図８および表１）。さらに、患者からの膠芽腫腫瘍の初代培養の１２／１５は、イントロン２が欠如しているＣＭＶ株を保有した。この株をＣＭＶＩＥΔｉ２と名づけた。

本発明者らは、１００名の健常ドナーからの血液細胞から、１００名のドナーからの濃縮単球から、１２名のＣＭＶウイルス血症患者（単核球症および移植患者）および心筋梗塞と診断された２４名の患者（心血管系患者）の血清から、ならびに１００の臨床ＣＭＶ単離物からＤＮＡを調製した。単球を濃縮した健常血液ドナーの１５／１００（１５％）は、ＣＭＶＣＭＶＩＥΔｉ２についてＣＭＶＩＥΔｉ２陽性であった一方で、１５％は、野生型を有し、後に、５２／１００（５２％）であることが明らかになり、単球を濃縮していない血液細胞のいずれのＤＮＡ試料もＣＭＶについて陽性でなかった。さらに、心血管系患者、および全血から調製した健常対照ＤＮＡはいずれも、ＣＭＶＩＥΔｉ２株を有さなかった。９名のウイルス血症患者のＤＮＡならびにＣＭＶ実験室株ＶＲ１８１４、ＴＢ４０およびＡＤ１６９に感染したｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞からのＤＮＡは、野生型株を有した。

その後の分析において、心血管系患者の２／２４（８％）、健常対照の２０／１００（２０％）およびウイルス血症患者の１／１１（９％）は、ＣＭＶＩＥΔｉ２株を有した。１１名のウイルス血症患者のＤＮＡならびにＣＭＶ実験室株ＶＲ１８１４、ＴＢ４０およびＡＤ１６９に感染したｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞からのＤＮＡは、野生型株を有した。１名の単核球症患者は、ＣＭＶＩＥΔｉ２株を保有し、この患者は、前立腺癌とも診断された。１００／１００（１００％）臨床分離物は、ＣＭＶｗｔウイルスについて陽性であり、これらのうちの３つ、３／１００％は、ＣＭＶＩＥΔｉ２株も有した。留意すべきこととして、１９９５年に、本発明者らは、ネステッドＰＣＲを用いて２８５名の血液ＣＭＶドナー（１４５名は血清陽性で１４０名は血清陰性）を調査し、彼らのうちの１名しか、イントロン２が欠如しているＣＭＶ株を保有しなかった。

次に、本発明者らは、ｃＮＤＡおよびＤＮＡ特異的プローブを使用してｃＤＮＡを検出するが正常ＤＮＡＩＥ変異体を検出しないようなＴａｑＭａｎＰＣＲアッセイを開発した。エクソン２および３に及ぶｃＤＮＡプローブを使用して、腫瘍患者および対照の血液および組織から調製したＤＮＡ試料中のｃＤＮＡとＤＮＡ変異体とを区別した。この方法は、高特異的であり、ｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞からのＲＮＡ調製物のｃＤＮＡのみを認識するが、同じ感染培養物から調製したＤＮＡを認識しなかった。ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２およびＨＨＶ−６感染細胞培養物のＤＮＡ調製物は、このアッセイにおいて陰性であった。

原発性腫瘍組織の３０／３２（９４％）ＤＮＡ試料および１６／２１の原発性膠芽腫細胞培養物検体は、ｃＤＮＡプローブを使用するＴａｑｍａｎＰＣＲによって陽性であった。重ねて、膠芽腫患者から調製したＤＮＡは、この方法を用いて陰性であったが、３つのｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞培養物（株ＡＤ１６９、ＴＢ４０ＥおよびＶＲ１８１４）から調製したｃＤＮＡは陽性であった。ｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞（株ＡＤ１６９、ＴＢ４０ＥおよびＶＲ１８１４）からのＤＮＡ調製物または単核球症を有する７名のウイルス血症患者からのＤＮＡ調製物は、ｃＤＮＡプローブを使用して陰性であった。しかし、前立腺癌と潜在ウイルスの再活性化に関連したＣＭＶの単核球症とを有する１名のウイルス血症患者において、本発明者らは、イントロン２が欠如しているＣＭＶ変異体を検出した。

その後の分析により、原発性腫瘍組織の８１／１０６（７６．４％）ＤＮＡ試料および１９／１４（７９％）原発性膠芽腫細胞培養検体は、ｃＤＮＡプローブを使用するＴａｑｍａｎＰＣＲによって陽性であることが明らかになった。ｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞（株ＡＤ１６９、ＴＢ４０ＥおよびＶＲ１８１４）からのｃＤＮＡ調製物または単核球症を有する７名のウイルス血症患者からのｃＤＮＡ調製物は、ｃＤＮＡプローブを使用して陽性であった。３つのｉｎｖｉｔｒｏ感染細胞培養物（株ＡＤ１６９、ＴＢ４０ＥおよびＶＲ１８１４）から調製したＤＮＡは、ｃＤＮＡプローブを使用して陰性であった。

ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体の検出の感度および特異性を増すために、本発明者らはシーケンスキャプチャーＰＣＲ法を開発した。この方法を用いてＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡを首尾よく捕捉し、ネステッドＰＣＲ法またはＴａｑＭａｎＰＣＲアッセイによるビオチン化捕捉ＤＮＡの増幅に使用した（表１）。

表１：テンプレートとして健常ドナーの末梢血単核細胞を選別した蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）からのＤＮＡを使用するＴａｑＭａｎＰＣＲ結果の要約。野生型またはＩＥΔｉ２いずれかのヒトサイトメガロウイルスは、主として、ＣＤ３４、ＶＧＥＦ２Ｒまたは両方を発現する細胞によって保有される。

潜在ＣＭＶが、骨髄におけるＣＤ３４陽性細胞（これらの幹細胞は造血細胞を生じさせる）、成熟血液細胞および内皮細胞によって保有されることは公知である。したがって、本発明者らは、ＣＤ３４または血管内皮成長因子２（ＶＥＧＦＲ２：Ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ２、循環内皮細胞について）に対して産生された抗体を使用してフローサイトメトリーまたは磁性ビーズ（ＭｉｎｉＭＡＣＳ、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＩｎｃ．、カリフォルニア州）により患者または健常保有者の血液試料からこれらの細胞を選別することによって、これらの細胞を選出した。本発明者らは、ＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡが、血液中のＣＤ３４陽性細胞およびＶＥＧＦＲ２陽性細胞に存在することを発見した。これは、ＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡが、造血幹細胞または内皮細胞の幹細胞集団中に含有されることを含意する。本発明者らは、膠芽腫のＣＤ１３３陽性細胞中でもＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡを同定した。ＣＤ１３３は、膠芽腫および髄芽腫の仮定幹細胞マーカである。

したがって、このシーケンスキャプチャーＰＣＲ法ばかりでなく、潜伏感染細胞を選択するこれら２つの方法を用いて、健常保有者および癌患者におけるＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡの検出を最適化することができる。

２０の原発性膠芽腫、１１の膠芽腫細胞培養物、１１の神経芽腫、４つの卵巣癌、６つの乳癌および５つの結腸癌腫瘍試料の細胞溶解産物をウエスタンブロットによって調査し、様々なサイズのＣＭＶＩＥタンパク質を検出した（図１３、図１４、図１５）。膠芽腫患者の腫瘍検体と初代培養物の細胞培養検体の両方において、ＩＥＣＭＶタンパク質に対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いて様々なサイズのＩＥタンパク質を検出した。ＣＭＶ特異的抗体は、腫瘍細胞において次の重量：１５０、１２５、８６、７６、７２、５５、５３、５０、４０、３８、３６、３０、３１、２６、２５、１９、１８、１４、１２、１０ｋＤａのＩＥタンパク質、およびｉｎｖｉｔｒｏ感染線維芽細胞において１２５、８６、７２、５５、４７、３８、１８ｋＤａのタンパク質を認識した。タンパク質パターンは、異なる腫瘍タイプ間では異なったが、異なる腫瘍内ではかなり類似しており、また膠芽腫腫瘍の初代細胞培養物間で異なった（図１３、図１４、図１５）。最も一般的なＩＥタンパク質ＩＥ８６、ＩＥ７２およびＩＥ５５についての腫瘍試料内での存在量は、腫瘍内で同定された１２５、５３、５０、４０、３８、３１、２５、１８、１４、１０ｋＤａの他のＣＭＶタンパク質と比較して一般に非常に低かった。これらの結果は、腫瘍細胞がｉｎｖｉｔｒｏで野生型ＣＭＶに感染させた細胞と比較して異なるサイズのＩＥタンパク質を生産したことを実証する。最も一般的なＩＥ反応性タンパク質は、腫瘍によって生産される最も一般的なＩＥタンパク質であるようである約５３、５０、３８および２５、１９および１４および１０ｋＤといったより小さいサイズのタンパク質であった。図５において設計し、図１８において実証するように、様々なＩＥプライマーを使用するプライマー伸長に付した膠芽腫初代細胞において観察された新規ＩＥ転写産物からこのタンパク質を合成することができる。

全ＣＭＶゲノムをプローブとして使用する蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法を開発した。第一継代培養物（ｎ＝５）における微量コルセミド処理原発性膠芽腫細胞は、様々な染色体へのウイルスゲノムの組み込みを明示した（１７）。ウイルスＤＮＡは、様々な染色体に組み込まれるようであった（本発明者らは、染色体１、３９、１７への組み込みを観察した）。有糸分裂を受けない細胞において、本発明者らは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ感染細胞において観察される往々にしてフクロウの目の形状で中央位置とは対照的に、ＣＭＶＤＮＡが腫瘍細胞の細胞核の辺縁に位置することを観察した（図１６）。かくて、ＣＭＶのｃＤＮＡおよびまたはＤＮＡ変異体は、染色体に組み込まれ、欠陥ウイルス粒子を生産した。

これらの観察により、以下のことが実証される：
１）前初期遺伝子のイントロン２が欠如しているＣＭＶの新規遺伝子変異体（ＣＭＶＩＥΔｉ２）は、調査した試料の８４％で存在する、癌患者におけるＣＭＶの最も一般的な変異体である。この株は、健常ドナーの１５％で存在し、ウイルス血症患者の１０％で血漿中に存在し、臨床ＣＭＶ単離物間でのその出現率は３％である。
２）多数のＣＭＶタンパク質が、腫瘍細胞におけるＣＭＶＩＥΔｉ２変異体から生産された。
３）ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体は、ヒトのＣＤ３４陽性細胞において検出される。
４）ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体は、ヒトの内皮成長因子−２（ＶＥＧＦＲ２）陽性細胞において検出される。
５）ＣＭＶＩＥΔｉ２変異体は、ヒトのＣＤ１３３陽性細胞において検出される。
６）ＣＭＶＩＥΔｉ２ＤＮＡは、ＦＩＳＨによって実証されるように、ｗｔ感染細胞におけるまたは野生型ＣＭＶＤＮＡを保有する健常ドナーにおける中央位置とは対照的に、癌細胞の核の辺縁に位置した。
７）癌細胞におけるＣＭＶＩＥΔｉ２感染は、腫瘍細胞では許容されず、標的細胞へのウイルスＲＮＡおよびタンパク質の伝達を媒介するエキソソーム／微粒子／濃密体と同様の欠陥ウイルス粒子の生産を生じさせる結果となった。

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Claims

野生型ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）Ｍｅｒｌｉｎ株Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＡＹ４４６８９４．２（野生型ＣＭＶ）の遺伝子変異体であって、
前記遺伝子変異体は、サイトメガロウイルスＭｅｒｌｉｎゲノムの前初期（ＩＥ）遺伝子の位置１７３９０４から位置１７４０１９のイントロン２ヌクレオチド（配列番号１７）を欠き、且つ配列番号１の配列を含む、遺伝子変異体。
哺乳動物におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連癌形態を診断するため、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するため、又は輸血若しくは移植による癌の危険の伝達を除去するために哺乳動物組織、細胞及び体液をスクリーニングするためのデータを得る方法であって、該方法は、
ａ）前記哺乳動物、哺乳動物組織、哺乳動物細胞、又は哺乳動物体液からの生体試料の専門分析を行う工程；及びその後、
ｂ）前記生体試料において、請求項１記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）の存在又は不在を検出する工程と、を含む方法。
前記哺乳動物または哺乳動物組織または細胞移植からの前記生体試料が、血液試料、組織試料、幹細胞試料、臓器移植移植片試料、精液試料、尿試料、唾液試料、細胞スワブまたは母乳試料から成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
請求項１記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）の存在又は不在は、ＴａｑｍａｎＰＣＲ若しくはシーケンスキャプチャーＰＣＲアッセイ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等のＤＮＡ配列若しくはｃＤＮＡ配列の検出法、又はＦＩＳＨ（蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術等のＩＳＨ（ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含む方法により決定される、請求項２又は３記載の方法。
前記ＰＣＲは、少なくとも請求項１記載のＩＥ遺伝子の対立遺伝子のエクソン２及びエクソン３の部分を増幅することにより、又はＧｅｎｂａｎｋ参照配列ＡＹ４４６８９４．２のＣＭＶＭｅｒｌｉｎゲノムの前初期（ＩＥ）領域のエクソン２及びエクソン３の部分を増幅することにより、あるいは少なくとも請求項２記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）のエクソン２及びエクソン３の部分を増幅することにより行われる、請求項４記載の方法。
前記癌が、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、および肉腫、腎臓癌、膵臓癌ならびにそれらの転移から成る群より選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
配列番号１又はそのＰＣＲプライマー若しくはそのＩＳＨプローブを含む核酸を用いることにより、請求項１記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）の遺伝子変異体を検出する、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
ｉｎｖｉｔｒｏ法である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）関連癌形態を診断するため、哺乳動物において癌を発生する素因を検出するため、又は輸血若しくは移植による癌の危険の伝達を除去するために哺乳動物組織、細胞及び体液をスクリーニングするための、請求項１記載のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）の遺伝子変異体若しくはそれに由来するＰＣＲプライマー若しくはＩＳＨプローブの使用であって、
癌等が、膠芽腫、髄芽腫、神経芽腫、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、悪性黒色腫、皮膚癌、肉腫、腎臓癌、及び膵臓癌から成る群より選択される、使用。
哺乳動物、哺乳動物組織又は細胞移植から得られた生体試料において、請求項１記載のヒトサイトメガロウイルスの遺伝子変異体（ＣＭＶＭｅｒｌｉｎＩＥΔｉ２）を検出するための、ＴａｑＭａｎポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、シーケンスキャプチャーＰＣＲアッセイ、又はＩＳＨ若しくはＦＩＳＨ検出を行うための試薬を含む、キット。