CN101316604A - 人巨细胞病毒蛋白ie2衍生的炎性细胞因子转录抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供新型炎症抑制剂和利用这些抑制剂治疗炎症的方法。更具体说，本发明提供转录抑制剂，即能抑制炎性细胞因子如白介素1β(IFN－1β)产生的巨细胞病毒(CMV)IE2蛋白整合区衍生肽片段，和利用此IE2片段治疗炎性疾病和CMV感染及相关疾病的方法。也提供含有该转录抑制剂的药物组合物。

Description

人巨细胞病毒蛋白IE2衍生的炎性细胞因子转录抑制剂

相关申请

本申请要求2005年9月29日提交的美国临时专利申请系列号60/721.769的优先权，其表达内容纳入本文。

发明领域

本发明至少部分是关于新型炎症抑制剂和利用这些抑制剂治疗炎症的方法。更具体说，本发明涉及能抑制炎性细胞因子白介素1β(IL-1β)和其它炎性细胞因子产生的衍生自巨细胞病毒(CMV)IE2蛋白的肽片段，编码这些肽的DNA、肽模拟物和小分子，以及给予此种肽片段治疗炎性疾病的方法。

发明背景

炎症是一种复杂的过程，其特征是一系列组织学变化，由不同形式的组织损伤，包括身体和感染损伤所介导。对象机体的防御和修复机制功能上依赖于IL-1β。虽然炎症对(损伤的)愈合至关重要，但延长和失控的炎症可导致组织损伤和引起疾病症状。例如，败血性休克是住院病人发病和死亡的主要原因，部分是由于IL-1β对血管平滑肌和心肌功能的作用所致。类风湿关节炎是一种破坏性的慢性炎性疾病，特征为病损主要局限于关节。类风湿关节炎是全身关节的慢性疾病，表现为滑液组织和关节结构中的炎症变化和骨质萎缩疏松。IL-1β介导了软骨和骨的消蚀(Dinarello，C A，Clin Exp Rheumatol 20(增刊27)：S1-13，2002；van’t Hof，R.J.K.J.Armour等，Proc Natl Acad Sci USA.97(14)：7993-8，2000)。其它疾病包括动脉粥样硬化和局部缺血重灌注损伤，也依赖于IL-1β(Kato，A.，C.Gabay等，Am J Pathol 161(5)：1797-803，2002；Burne，M，J.，A.Elghandour等，J Leukoc Biol.70(2)：192-8，2001；Haq，M.，J.Norman等，JAm Soc Nephrol.9(4)：614-9，1998；van’t Hof，R.J.K.J.Armour等，Proc Natl AcadSci USA.97(14)：7993-8，2000)。

IL-1β是主要由单核细胞产生的蛋白(虽然损伤的上皮和内皮细胞也有少量释放)，它是白细胞向机体提供的损伤后早期警告信号。单核细胞的各种受体，如Toll-样受体激活后向细胞核发送信号诱导产生IL-1β。IL-1β然后释放到周围环境中作用于局部和远处靶细胞而改变机体的防御。这种应激信号的已熟知结果是发热。在某些情况下，如败血症休克和自身免疫疾病，包括类风湿关节炎和狼疮时，IL-1β导致的炎症可引起关节、骨和其它组织的严重损伤。已证明在类风关中阻断IL-1β蛋白的下游功能有益。实体器官移植动物模型中，阻断IL-1β功能显示能保护移植物不被排斥。其它临床试验显示阻断IL-1β对牙齿健康有益，因为慢性牙龈炎在IL-1β影响下可导致骨消蚀和牙齿稳定性丧失。因此，IL-1β抑制剂有许多潜在的治疗用途。

靶向IL-1β的长处是在非常早期就破坏炎症。事实上，IL-1β的促炎性作用是通过诱导环加氧酶(COX)介导的，可用NSAID如Viox^TM和Celebrex^TM抑制很少叫此名的此组酶。本发明IL-1β抑制剂的一个优点是不象某些COX抑制剂那样，IL-1β不抑制COX的功能。因此，没有理由预计由于抑制IL-1β表达而发生像心肌梗塞那样的不良作用。

IL-1β的启动子是位于IL-1β基因前面的一个DNA区域，通过结合称为转录因子的系列蛋白调节转录。转录因子含有的DNA结合域能结合启动子中的特定DNA序列。当结合时，转录所必须的称为反式激活蛋白的其它蛋白质通过结合于转录因子表面的其它结构域被募集到此启动子上。单核细胞中，IL-1β启动子的核心转录因子是Spi-1(也称为PU.1)。Spi-1是转录因子ETS家族成员，在造血过程的细胞谱系定型中起着关键作用，对免疫系统的多种效应基因，其中包括TNF、IL-6和髓过氧化物酶的反式激活至关重要(Friedman，A.D.Oncogene 21(21)：33377-90，2002)。Spi-1结合IL-1β启动子上二个分开的靶点，可能还需要另一转录因子C/EBPβ的作用(Kominato，Y，D.Galson等，Mol Cell Biol.15(1)：59-68，1995)。

已发现单核细胞系感染巨细胞病毒(CMV)导致诱生IL-1β(Iwamoto，G.K.，M.M.Monick等，J Clin Invest.85(6)：1853-7，1990)。此项观察后来解释为CMV编码的反式激活立即早期2蛋白(IE2)当与Spi-1共转染入细胞后能诱导IL-1β基因转录。此外，IE2的活性解释为它能与信于IL-1β启动子上的Spi-1物理上相互作用(Wara-aswapati，N.Z.Yang等，Mol Cell Biol.19(10)：6803-14，1999)。

已知和常用许多抗炎症治疗药物。最常用的是阿斯匹林和非类固醇抗炎药，如甲氧萘丙酸、布洛芬、氟苯水杨酸、甲灭酸和酮咯酸氨基丁三酸醇盐。通常用这些药物来治疗短暂的轻度炎症和疼痛。较严重的炎性疾病如关节炎用糖皮质激素和拮抗性抗体治疗。前者由于有许多副作用一般不能长期耐受，后者生产成本很贵。

现已有抗肿瘤坏死因子(TNF)单克隆抗体，可减轻炎症，近年来已投放市场用于治疗类风湿关节炎，如Remicade^TM和Humira^TM。然而近来发现施用这些抗体可能增加受感染和产生癌症的风险(Bongartz等，J American MedicalAssociation 295：2275，2006)。

近年来，只有很少的IL-1β特异性抑制剂可获得。不幸的是，这些抑制剂只能在IL-1β已合成、释放和开始起作用后通过结合靶细胞上其受体而阻断IL-1β。这类IL-1β抑制剂对于某些炎症环境来说作用太迟或可能只有最小的治疗效果。由于许多抗炎药只有短期作用，常常产生严重副作用(如糖皮质醇)和/或生产成本昂贵(如单克隆抗体)，故需要开发新的治疗药物。

发明概述

本发明至少部分是根据以下发现，即衍生自巨细胞病毒(CMV)立即早期2(IE2)蛋白内部一区域的肽片段能抑制炎性细胞因子白介素-1β(IL-1β)的产生，和阻断或抑制完整IE2的功能。本发明提供一种采用能干扰例如促炎性细胞因子，如IL-1β和肿瘤坏死因子(TNF)等分子表达(其表达受Spi-1调节)的竞争性拮抗剂来阻断，从而抑制、预防和治疗炎症的新方法。

巨细胞病毒(CMV)感染单核细胞系导致诱生IL-1β(Iwamoto，G.K.，M.M.Monick等，J Clin Invest 85(6)：1853-7，1990)。这种诱生是由于CMV编码的反式激活立即早期2蛋白(IE2)能诱导结合在Spi-1上的IL-1β基因转录(Wara-aswapati，N.Z.Yang等，Mol Cell Biol.19(10)：6803-14，1999)。

IE2蛋白能帮助CMV在细胞中的复制。CMV IE2氨基酸序列的一个例子是SEQ ID NO：4，CMV IE2核苷酸序列的一个例子是SEQ ID NO：5(也参见Stenberg，RM，Depto，A.S.等，J Virol 63(6)：2699-2708，1989；Stenberg RM，Witte P.R.等，J Virol 56(3)：665-675，1985；Chee MS.，bankier A.T.等，Curr TopMicrobiol Immunol 154：125-169，1990)。IE2是病毒和宿主细胞基因的强反式激活蛋白，具有DNA和蛋白结合活性。IE2与Spi-1共转染到细胞内后能诱导IL-1β基因的转录。转录因子C/EBPβ也参与IL-1β基因的转录。

用基因报告物试验证明了Spi-1和C/EBPβ对IL-1β启动子的作用(图1B和1C)。这些研究中，用含有连接于荧火虫荧光素酶基因的IL-1β启动子的报告载体瞬时转染HeLa S3细胞(一种不表达Spi-1的非髓性细胞系)。当加入含这些转录因子的cDNA的真核表达载体后，上述载体能以可滴定形式表达报告蛋白荧光素酶。当在报告中共表达Spi-1和C/EBPβ时，观察到IE2对IL-1β启动子的超活化(图1D)。

本发明至少部分是根据以下令人惊奇的发现，即CMV IE2蛋白的肽片段作为竞争性拮抗剂，能阻断或抑制促炎性细胞因子如IL-1β、TNF(如TNFα)、IL-6和髓过氧化物酶转录所需的天然转录因子的作用，以及转录受Spi-1调节的其它分子的作用，从而能抑制这些细胞因子和其它分子的表达，也能阻断或抑制完整IE2的功能。

通过抑制早期炎症，本发明优于目前可得到的商品化抗炎药或拮抗剂，如糖皮质醇或单克隆抗体，它们不能阻止炎症级联反应的最早期活动，长期使用还有明显的副作用，或生产成本昂贵。

因此，本发明一方面内容涉及分离的CMV IE2蛋白的多肽片段(如SEQ IDNO：4的IE2 291-364和IE2 291-343)，它们能通过阻断IL-1β和其它促炎细胞因子的表达抑制炎症。本发明的另一方面涉及一个较小的肽，其含有IE2291-364多肽中最小的Spi-1相互反应区(SEQ ID NO：4的IE2 315-328)。因此，一方面，本发明涉及含有巨细胞病毒(CMV)立即早期2(IE2)蛋白的氨基酸残基315-328(SEQ ID NO：4的IE2 315-328)，优选SEQ ID NO：4的人CMV(hCMV)IE2 315-328。在一优选方面，本发明的多肽是包含hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-364(IE2 291-364)、hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-343(IE2291-343)和hCMV IE2蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)的IE2蛋白片段。本发明还提供上述多肽及其片段，和与上述多肽至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的多肽，及其衍生物，其中所述多肽保留了结合Spi-1和/或抑制Spi-1调节分子如促炎细胞因子(如IL-1β或TNF)转录的能力。

另一方面内容，本发明涉及的IE2多肽/IE2片段，包含hCMV IE2蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)，长度至少约14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、150、150、170、180、190、200个或更多个氨基酸，直到低于IE2的全长氨基酸序列，并保留了结合Spi-1和/或抑制Spi-1调节分子如促炎细胞因子(如IL-1β或TNF)转录的能力。

本发明也涉及编码本发明多肽/IE2片段的核酸分子。

本发明不限于IE2肽片段。本发明的转录抑制剂也包括其功能是结合Spi-1和/或抑制Spi-1调节分子转录的肽模拟物和小分子。

本发明还有一方面内容，涉及含有治疗有效量的本发明转录抑制剂和药学上可接受运载体的药物组合物。

一方面，本发明提供抑制炎症的方法，该方法是给予需要的对象足量的本发明转录抑制剂或药物组合物。

另一方面，本发明提供治疗炎性疾病的方法，该方法是给予需要的对象治疗有效量的本发明转录抑制剂或药物组合物。本发明考虑的炎性疾病包括但不限于：关节炎、类风湿关节炎、自身免疫疾病(如炎性肠病和系统性红斑狼疮)、实体器官移植、急性感染、急性期反应、过敏性哮喘、厌食、哮喘、恶病质、动脉粥样硬化、心血管疾病、血凝病、发热、牙龈炎、移植物抗宿主病、出血、多发性硬化症、新生血管性青光眼、骨关节炎、牙周炎、银屑病、银屑病关节炎、风湿热、中风和继发性转移造成的实体瘤生长和肿瘤侵袭。

另一方面，本发明提供治疗炎性疾病的方法，该方法是给予需要的对象治疗有效量的本发明转录抑制剂或药物组合物，并联用一种或多种其它抗炎药，包括但不限于：选择性COX-2抑制剂、白介素-1拮抗剂、二氢乳清酸合酶抑制剂、p38 MAP激酶抑制剂、TNF-α抑制剂、TNF-α螯合剂和氨甲喋呤。此方法可成功治疗败血性休克疾病，而此病在人群试验中用各种抑制剂治疗证明不能显著改善结果(Vincent，JL.，“败血症的新治疗方法(New therapies in sepsis)”Chest.112(6)：330S-338，1997)。

另一方面，本发明提供抑制细胞中促炎细胞因子如IL-1β或TNF表达的方法，该方法包括使细胞，如单核细胞接触足量的转录抑制剂如多肽/IE2片段。

还有一方面，本发明治疗对象CMV感染相关疾病的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的转录抑制剂，如本发明的多肽/IE2片段或药物组合物。在一实施方式中，CMV相关疾病或病症是例如，CMV视网膜炎、肝炎、CMV-相关急性横贯性脊髓炎、多发性单神经病变、脑炎、发热、疹和疲劳。

另一方面，本发明提供抑制细胞中CMV表达的方法，该方法包括使细胞接触转录抑制剂，如本发明的多肽/IE2片段。

在还有一方面，本发明提供治疗、预防或限制CMV病毒感染的方法，该方法包括给予对象治疗有效量的转录抑制剂，如本发明的多肽/IE2片段或药物组合物。

附图简述

图1A-1D说明Spi-1、C/EBPβ和IE2协同反式激活IL-1β启动子。图1A是启动子的示意图，显示二个组分Spi-1-C/EBPβ的结合位点临近转录起始位点。将全长启动子(HT)剪接入含荧火虫荧光素酶报告基因的载体中，用于HeLa-S3细胞瞬时转染试验。图1B说明HT报告物对滴定量的Spi-1表达载体和固定量共转染的C/EBPβ表达载体的剂量反应。图1C说明HT报告基因对滴定量的C/EBPβ表达载体和固定量共转染的Spi-1表达载体的剂量反应。图1D说明与IE2的功能协同活性。HT报告基因用滴定量的Spi-1表达载体(空心柱)或固定量的C/EBPβ表达载体(方格柱)或C/EBPβ和IE2二表达载体(斜线柱)对比转染。

图2A-2B显示IE2衍生片段IE2291-364和IE2 291-343抑制了IL-1β启动子的协同反式激活。此处显示的数据是三次独立实验合并的结果。图2A显示HT报告基因(如图1所述)与Spi-1和C/EBPβ表达载体一起瞬时转染入HeLa-S3细胞中。标出的转染组用滴定量的IE2 291-364或IE2 291-343表达载体对比转染。图2B显示IE2片段对野生型IE2外源调节IL-1β启动子的抑制作用。图2B描述的实验与图2A所述相似，除了在标出的转染组中也加入了野生型IE2外。这些是三次独立实验的合并数据。

图3说明在单核细胞系RAW264.7中IE2 291-364片段抑制了全长IL-1β启动子。剪切天然IL-1β上游片段(XT)使之在荧光素酶基因上活计含通过启动子序列的增强子，制备荧光素酶报告基因。将其与pCDNA3.1/V5-His空载体(对照)或pCDNA3.1/V5-His IE2 291-364经磷酸钙沉淀共转染入RAW264.7细胞中。为激活此报告基因用LPS剌激细胞。

图4A-4D。图4A说明转染入HeLa-S3细胞后GFP-IE2 291-343融合蛋白的胞浆和核定位。图4B说明GFP-IE2 291-343抑制了IL-1β启动子活性。图4C是特异性对照，如图2B所述用转染的HeLa-S3细胞裂解液作Western印迹分析，显示肽IE2 291-364不抑制C/EBPβ的表达。图4D另一特异性对照，显示IE2 291-364或IE2 291-343都不影响对照GFP表达载体。用GFP表达载体和IE2 291-364或IE2 291-343表达载体共转染HeLa-S3细胞，24小时后用荧光激活细胞检索分析GFP表达。

图5显示IE2、Spi-1 ETS结构域和C/EBPβ bZIP结构域放射标记探针不能与内部缺失残基315-328的IE2 291-364片段(delA)相互反应。标出的探针仍能与对照肽IE2 291-343和IE2 291-364相互反应。此结果表明IE2区域315-328赋予了这些多肽的结合能力，可能是最小的肽抑制剂。

图6说明将递增量的表达IE2 291-364Δ315-328或E2 291-364的载体转染到含全长C/EBPβ调节蛋白作为报告荧光素酶的RAW细胞中。用CaPO₄瞬时转染后，利用发光检测RAW细胞裂解液，结果按共转染的半乳糖苷酶表达载体导入的半乳糖苷酶活性标准化，与对照相比，测定转染效率。如所示，IE2291-364和315-328的数值报告为荧光素酶活性与野生型片段315-364相比的百分比。

图7说明IE2分子(SEQ ID NO：4)的氨基酸和核苷酸序列的一个例子，和编码本发明片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)的一个例子。图7也包括SEQ IDNO：1、2和3所示IE2肽片段的例子。其氨基酸序列包括在GenBank登录号P19893(GI：59803018)中，其核苷酸序列包括在GenBank登录号M11298(GI：330552)中。本发明不限于任何特定CMV病毒株衍生的IE2序列。氨基酸和核苷酸序列的其它变体公众可获得。

发明详述

本发明至少部分是根据以下发现，即衍生自巨细胞病毒(CMV)立即早期2(IE2)蛋白内部一区域的肽片段(例如含有SEQ ID NO：4的IE2氨基酸315-328的，如SEQ ID NO：4的IE2氨基酸291-364或291-343的人CMV(hCMV)IE2片段)能抑制炎性细胞因子白介素-1β(IL-1β)的产生，和阻断或抑制完整IE2的功能。由于IL-1β参与了炎症级联反应的最早期步骤，故本发明通过抑制IL-1β而能预防和治疗炎症和炎性疾病。

在一具体实施方式中，由于除IL-1β外的重要促炎性基因(包括编码肿瘤坏死因子(TNF)的基因)类似于Spi-1，也需要转录因子，本发明考虑本发明的转录抑制剂也能阻断这些其它分子，包括但不限于TNF(如TNFα)、IL-6T和溶酶体髓过氧化物酶的表达。因此本发明的转录抑制剂是优良的抗炎药，因为许多其它抗炎药只能阻断炎症的一条通路。

按照本发明的一种实施方式，本发明的转录抑制剂是能在基因转录水平上，即将遗传密码转变为蛋白质的最初过程中抑制IL-1β产生的拮抗性小肽。不希望受特定理论的限制，相信通过减少炎症能联反应早期的IL-1β产生，将有更好的机会来抑制某些类型的炎症反应带来治疗效益。也相信较小的肽，如IE2片段制造更容易，也更便宜，从而使得本发明所选的药物开发更具吸引力。也考虑到可利用本发明提供的IE2片段及其经鉴定的靶转录因子相互作用位点，作为基础来开发甚至更小的分子，从而可能成为另一类新型的抗炎药。

也不希望受特定理论的限制，据信，本发明的IE2片段虽能结合Spi-1，但没有激活基因转录的功能，因为此IE2片段失去了IE2蛋白转录所必须的功能组分。认为此IE2片段能与完整的IE2蛋白竞争结合Spi-1，从而抑制炎性细胞因子如IL-1β和其它受Spi-1调节的分子的转录。也认为此IE2肽片段的作用是抑制感染细胞中CMV表达的抗病毒药物，因为已证明此IE2肽也能阻断IE2依赖性基因的作用。

本文所用的术语“转录抑制剂”或“拮抗剂”包括能抑制受Spi-1调节的基因，例如但不限于TNF(如TNFα)、IL-6T和溶酶体髓过氧化物酶基因的转录。拮抗剂可包括例如本发明的IE2蛋白片段、肽模拟物、核酸分子或小分子。也可用转录抑制剂来抑制CMV表达和/或感染。本文所用术语“抗炎药”包括任何上述的拮抗剂，不限于肽。

“炎性病症”、“炎性疾病”或“炎性症状”指细胞损伤伴有的或倾向引起的局部反应状况，其表现为毛细血管扩张、白细胞渗出、发红、发热、疼痛、肿胀，功能常常丧失。哺乳动物机体的防御和修复机制在“炎性病症”、“炎性疾病”或“炎性症状”中认为依赖于IL-1β的功能。“炎性病症”、“炎性疾病”或“炎性症状”也包括自身免疫疾病或病症。

“与CMV相关的疾病或病症”指与CMV相关的或由其引起的任何疾病、失调或状况。与CMV相关的疾病或病症包括但不限于：CMV视网膜炎、肝炎、CMV-相关急性横贯性脊髓炎、多发性单神经病、脑炎、发热、疹和疲劳。

“IE2片段”指衍生自立即早期2(IE2)蛋白但不能诱导促炎细胞因子转录的肽片段。IE2片段中优选含有人巨细胞病毒(hCMV)IE2蛋白的氨基酸残基315-328但不包含IE2蛋白中诱导促炎基因(如IL-1β和TNF)转录所必须的任何功能组分的肽片段。本发明考虑更优选衍生自hCMV IE2蛋白区域SEQ IDNO：4的291-364氨基酸残基和包含SEQ ID NO：4的315-328氨基酸残基的肽片段。

“治疗有效量”指治疗症状或疾病或病症，具体是治疗炎性症状或疾病或病症所需的剂量。“治疗有效量”意味包括声称能有效抑制炎症或细胞中CMV感染的本发明多肽/IE2片段的用量，或多肽/IE2片段组合的用量。

术语“治疗”或“处理”指治疗哺乳动物，特别是人的疾病状况，如炎性疾病或病症或感染，其包括(a)预防哺乳动物发生疾病，特别是当该哺乳动物倾向发病但还没有诊断患有疾病时；(b)抑制疾病，如停止疾病发展；(c)降低、减轻或缓解疾病或感染，或其临床症状，即使疾病消退；和/或(d)缩短患病时间。

“预防”疾病，本文用此术语指给予还没有诊断为已患疾病，如已患炎症或感染的个体(药物)来减少该个体发生所要诊断的疾病的风险。

“限制”感染，本文用此术语指限制感染在个体体内和/或个体之间的传播。

“对象”指任何哺乳动物对象，优选人。

I.多肽

本发明的IE2多肽，例如SEQ ID NO：4的291-364氨基酸区段能抑制IL-1β启动子上的Spi-1行使功能。在一实施方式中，本发明能与Spi-1相互作用的肽片段是包含在IE2的氨基酸291-364内的14个氨基酸的区段(IE2 315-328)。

本发明另一实施方式涉及包含至少一个本发明多肽/IE2片段的抗炎药。

不希望受特定理论的限制，认为此IE2片段含有Spi-1 ETS结构域(DNA结合域)相互作用区和在谷胱甘肽S-转移酶(GST)或绿荧光蛋白(GFP)骨架存在时保留了三级结构完整性。因为此IE2片段缺乏IE2反式激活结构域的大部分，故相信此IE2片段可阻断IL-1β启动子上的IE2/Spi-1相互协同作用而赋予显性失活功能，从而减少IL-1β的转录和起着抗炎药的作用。

本发明的一实施方式涉及含有巨细胞病毒(CMV)立即早期2(IE2)蛋白氨基酸残基315-328(IE2 315-328)(SEQ ID NO：1)，优选人CMV(hCMV)IE2 315-328的分离或纯化的多肽，此种多肽能抑制炎症。在一优选实施方式中，本发明的多肽是IE2蛋白片段，包括但不限于hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-364(IE2291-364)(SEQ ID NO：2)。本发明的多肽也包括包含在IE2的氨基酸291-364内的IE2蛋白片段，其保留了结合Spi-1和/或抑制受Spi-1调节的分子如IL-1β或TNF转录的能力，例如hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-343(IE2 291-343)(SEQ ID NO：3)和hCMV IE2蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)(SEQ IDNO：1)。此外，本发明的多肽片段至少长约14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75个或更多个氨基酸，但短于全长IE2蛋白。此片段也可含有IE2的291-364氨基酸以外的但不影响此多肽抑制功能的额外氨基酸残基。

本发明的多肽也包括上述多肽的衍生物或同类物，即以上列出的序列中的一个或多个氨基酸被其它天然或非天然氨基酸取代，但仍保留了其活性，如结合Spi-1和/或抑制受Spi-1调节分子(如IL-1β或TNF)转录的能力的衍生物或同类物。保守性氨基酸取代宜发生在一个或多个预测的非必须氨基酸残基处。“保守性氨基酸取代”是该氨基酸残基被另一含有类似侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义了含有类似侧链的氨基酸家族。这些家族包括：含有碱性假冒链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、含酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、颉氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

在某些实施方式中，可以是同源取代，即同类氨基酸的取代或置换，如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性氨基酸。也可以是非同源取代，即一类残基取代另一类残基，或者包括非天然氨基酸，如鸟氨酸、二氨基丁酸鸟氨酸、正亮氨酸鸟氨酸、亚硫基鸟氨酸、噻吩鸟氨酸、萘基鸟氨酸和苯基甘氨酸。可选择氨基酸取代来提高变体肽的疏水性、变体肽的两亲性，和提高或降低变体肽形成α螺旋结构或构型的几率。

在其它实施方式中，本发明的多肽序列与上述氨基酸序列基本上相同，并保留了结合Spi-1和/或抑制受Spi-1调节分子(如促炎细胞因子，例如但不限于IL-1β或TNF)转录的能力，但氨基酸序列由于天然的等位基因变异或诱变而有所不同。在另一实施方式中，本发明的多肽所含氨基酸序列与上述肽至少有约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。

可用已知的重组分子生物学方法(例如Mullis等，Methods Enzymol 155：335-50，1987和Ausubel等，《分子生物学当前方法》(Current Protocols inMolecular Biology)第3.17.1-10页)。制备本发明的多肽/IE2片段或抗炎药。也可用肽连接方法(参见如Dawson等，Science.266：776-9，1994和Coligan等，《多肽的天然化学连接》(Native chemical ligation of polypeptides)，威利出版社(Wiley)：18.4.1-21，2000)合成本发明的多肽。可用本领域已知的标准化学合成方法(如商品购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的肽合成仪)生产此多肽、其模拟物和变体。

可用标准的纯化方法分离本发明的多肽。所谓“分离的”或“纯化的”肽、多肽或蛋白质，应基本上无细胞物质或污染其它细胞蛋白质或细胞来源的蛋白质，或基本上无化学合成时所用的化学前体分子或其它化学物质。“基本上无”指多肽制品或其变体制品含有的非IE2多肽(本文也称为“污染蛋白质”)或化学前体分子或非受体或配体化学物质成分不到干重的约30％、20％、10％，更优选不到5％。当用重组方法生产此多肽或其生物学活性部分时，应通常不含培养基成分，具体说培养基成分低于该多肽制品体积的约20％、低于约10％、通常低于5％。分离或纯化的多肽制品干重可以是0.01mg或以上、或0.1mg或以上、常常是1.0mg或以上，和10mg或以上。

本发明包括的还有与另一化合物，例如蛋白转导结构域(PTD)、PEG化肽(携带有一个或多个聚乙二醇分子)、或核定位信号序列(NLS)相连的IE2肽片段。另外，可将本发明的IE2片段与第二蛋白相连，或将其包含在较大的肽中，此较大肽不是IE2，以提高其在细胞中的稳定性。

除了本文所述的肽外，本发明的转录抑制剂也包括肽模拟物，这是小的类似肽的分子，能模拟IE2多肽片段的抑制活性。

II.核酸分子

本发明另一方面涉及编码本发明多肽的分离的核酸分子。例如，本发明包括编码hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-364(IE2 291-364)(SEQ ID NO：2)、hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-343(IE2 291-343)(SEQ ID NO：3)和hCMV IE2蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)(SEQ ID NO：1)及它们互补序列的IE2核酸分子片段。这些分离的核酸分子片段编码的多肽保留了结合Spi-1和/或抑制受Spi-1调节的分子如IL-1β或TNF转录的能力。本发明也包括含有的核苷酸序列与编码上述多肽的全长核苷酸序列，或这些核苷酸序列的一部分至少约有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高相同性的分离的核酸分子，这些核酸分子保留了结合Spi-1和/或抑制受Spi-1调节的分子如促炎细胞因子和其天然等位基因变体和同源物转录的能力。

本文所用术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)及利用核苷酸同类物产生的DNA或RNA同类物。此核酸分子可以是单链或双链，但优选双链DNA。

术语“分离的核酸分子”包括与该核酸天然来源中存在的其它核酸分子相分离的核酸分子。例如，就基因组DNA而言，术语“分离的”包括与该基因组DNA天然相关的染色体相分离的核酸分子。优选“分离的”核酸没有产生此核酸的DNA中天然侧接该核酸的序列(即位于该核酸5’和3’末端的序列)。然而当用重组技术生产时，“分离的”核酸分子是基本上没有其它细胞物质或培养基成分，或化学合成时基本上没有化学前体分子或其它化学物质。

III.其它抗炎药

在一具体实施方式中，本发明也考虑了设计能抑制IL-1β产生的药物方法，包括利用本领域已完好建立的任何结晶方法，包括但不限于：悬滴(hangingdrop)、孵滴(sitting drop)、液体自由扩散、分批或分小批方法来重结晶IE2315-328和Spi-1 ETS结构域，获得三维结构的位于Spi-1 ETS结构蛋白上的至少一个IE2 315-328结合位点，附加至少一个候选配体化合物，优选此配体化合物的分子量小于在配体结合位点三维结构上的IE2氨基酸315-328的分子量，评价该候选化合物与该结合位点之间的结合，选择空间上适合此配体结合位点的化合物。

IV.药物组合物及其给药

在另一实施方式中，本发明涉及含有治疗有效量的至少一种本发明转录抑制剂，如多肽/IE2片段、编码本发明多肽/IE2片段的DNA分子、肽模拟物或小分子或它们组合，及药学上可接受运载体的药物组合物。

认为含有IE2片段或IE2片段编码核酸或本发明其它转录抑制剂的药物组合物能显示有效的治疗活性，例如，抑制炎症和治疗炎性疾病或病症或CMV感染。含有转录抑制剂如IE2片段的治疗组合物中的活性成分的治疗给药用量取决于具体疾病。作为非限制性具体例子，有效用量的范围在约1mg-1g/kg之间、约1-100/kg之间、约5-20mg/kg之间，取决于对象的体重。例如，用每天100mg-1000mg治疗类风湿关节炎时IE2片段的血峰值浓度可达到约5-100mg/ml。可调节此剂量方案以提供最优的治疗反应。本发明的药物组合物可以是部分剂量、单剂量或多剂量。例如，可每天给予几次分剂量，或者按治疗情况的变化按比例减少此剂量。在某些实施方式中，局部给予此组合物，如治疗关节炎时，或可全身给予。

考虑可给予一种或多种形式的转录抑制剂，如IE2 315-328、IE2 291-343和IE2 291-364。在一实施方式中，将本发明的IE2多肽片段与另一转导序列，如蛋白转导结构域(PTD)相连递送给细胞以促进该肽跨细胞膜转运。蛋白转导结构域是能有效穿过细胞膜的独立于转运蛋白或特定受体的小蛋白结构域，能促进肽和蛋白、DNA和其它化合物递送入细胞。例如，PTD的例子有人免疫缺陷病毒(HIV-1)TAT蛋白的结构域、果蝇Antp基因同源域的第三α螺旋、单纯疱疹病毒的VP22蛋白和聚精氨酸结构域。例如，可采用已发表的Tat转导信号肽序列YARAAAAQARA(SEQ ID NO：6)。其它PTD本领域已知。也可参见例如Mi，Z等，Mol Therapy(4)：339-47，2000；Ryu，J等，Mol Cell 16(3)：385-91，2003；Matsui等，Curr Protein Pept Sci.(2)：151，2003；Matsui等，NipponYakurigaku Zasshi 121(6)：435，2003；Dietz，GP和Bahr，M.，Mol Cell Neurosci.27(2)：85，2004；Trochilin.，Annual Review of Biomedical Engineering.8：343-375，2006和Harda等，Breast Cancer.13(1)：16，2006中的描述。其它PTD可参见美国专利No.6,881,925和美国专利申请系列号20030104622A1、20030219826A1和20050074884A1中的描述。称为Pep-1的另一种肽运载体也已有描述，可用于递送本发明的多肽(Morris，M等，Nat Biotechnol.(12)：1173-6，2001)。所有上述文献的内容纳入本文作参考。

根据给药途径，含有转录抑制剂的活性成分可能需要用物质包衣，以保护这些成分防止酸的作用和可能灭活这些成分的其它天然条件。例如，可将所述转录抑制剂放在佐剂、脂质体、微球、纳米颗粒中(参见Shinji等，Int.J.Pharmacol.149：93-106，1997)或微胶囊中给药，保护其避免受到蛋白酶降解(参见如Arhewoh等，African J Biotechnol 4：1591-1597，2005)。本文考虑的佐剂包括：间苯二酚，非离子表面活性剂如聚氧乙烯油酰醚和n-十六烷基聚乙烯醚。脂质体包括水-油-水P40乳剂及常规脂质体。其它特定的非限制性例子包括包裹在壳多糖包衣的海藻酸珠内部的含有转录抑制剂的胶囊制剂，其中的转录抑制剂包裹在水凝胶制剂中(参见例如blanchette等，Biomed & Pharmacother.58：142-151，2004)，转录抑制剂可包含在适合肺部给药的液体或干粉制剂中(参见例如Patton，Chemtech 27(12)：34-38，1997和Patton，NatureBiotechnol.16：141-143，1998)，可将转录抑制剂掺入基质释放装置中(参见Krishnaiah等，J Controlled Rel.77：87-95，2001)或为前药形式(参见Yano等，JControlled Rel.79：103-112，2002)。

在平常的贮存和使用条件下，本发明的制品含有防腐剂以预防微生物生长。适合注射的药物剂型包括无菌水性溶液(水可溶)或分散液以及灭菌粉末以供用时制备灭菌可注射溶液或分散液。在所有情况下，剂型必须灭菌，必须是液体，其成分易于用注射器抽取。在制造和贮存条件下必须稳定，必须防止微生物如细菌和真菌的污染。运载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等等)，它们的合适混合物和植物油。例如可利用包衣材料如卵磷脂、维持分散剂的所需颗粒大小和采用表面活性剂来维持其适当的流动性。可用各种抗菌、抗真菌药物，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗制剂，如糖和氯化钠。可在该制剂组合物中包含延缓吸收的可注射组分，例如单硬脂酸铝和明胶以延缓吸收。

将所需量的活性化合物加入含有以上列举其它各种成分的适当溶剂中，然后如需要，过滤除菌制备灭菌可注射溶液。通常将各种灭菌的活性成分(IE2片段或编码IE2片段的DNA分子或它们的组合)加入到灭菌运载体(含有基础分散介质和需要的惧上列出的其它)中制备分散剂。就用于制备灭菌可注射溶液的灭菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，产生活性成分加先前过滤除菌溶液的其它所需成分。

特别优选配制单位剂量剂型的组合物，而易于给药和剂量一致。本文所用的单位剂型指物理上分开的单位用量，适合哺乳动物治疗对象的同一剂量给药，每一剂量单位含有经计算能产生所需治疗效果的预定量的活性物质和所需的药物运载体。在本发明新型剂量单位形式的说明书中给予了详细说明，(a)直接取决于活性物质的独特特性和所要达到的特定治疗效果，(b)取决于活体对象中(该对象机体健康有无受损)要治疗的损伤所用化合物如活性物质本身的局限性。

如本文所述以单位剂量剂型，可方便和有效地给予有效量的主要的活性化合物与适合的药学上可接受的运载体。例如，每天给予本发明的IE2多肽片段的一个单位剂量约100mg-1000mg，其血浓度可达到约2mg-30mg/ml。

配制的本发明药物组合物应与其给药途径相容。给药途径的例子包括胃肠道外如静脉内、皮内、皮下给药；口服(如吸入)、透皮(局部)、经粘膜、动脉内、鞘内、眼内、心室内和直肠给药。本文所用“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌和抗真菌药物、等渗和吸收延缓制剂等等。药物活性物质的这些媒介制剂的应用是本领域熟知的。考虑在所述治疗组合物中可采用除了迄今已知与所述活性成分不相容以外的任何常规媒介或制剂外。也可将添加的活性成分加入该组合物中。

可将上述药物组合物装在医学装置中。一个非限制性例子，这种装置是注射器。在另一非限制性例子中，这种装置是吸入器，作为特殊的例子，该吸入器能递送正压力(参见美国专利No.6,708,688)。

给予的转录抑制剂，如IE2片段也可以是该转录抑制剂的变化形式或衍生物，或能提高其在对象中的活性、稳定性或利用度的药物。采用上述共结晶设计药物的方法，或体外检测药物或转录抑制剂(IE2片段)的磷酸化，不难测定和筛选鉴定能增强可应用转录抑制剂活性的药物。

也可用基因转移技术给予需要的对象编码IE2片段的DNA。这类技术包括但不限于病毒、脂质体和变化形式的DNA或RNA及其衍生物。

V.应用方法

本发明通过应用转录抑制剂来治疗对象，限制或预防对象的炎性疾病或病症，或治疗、限制或预防CMV感染或相关疾病。上述适合的转录抑制剂是含有所述转录抑制剂的合适药物组合物。

一方面，本发明提供抑制受Spi-1调节的分子如促炎细胞因子(如IL-1β或TNF)在细胞中表达的方法，该方法包括使细胞如单核细胞接触足量的转录抑制剂。

另一方面，本发明提供抑制炎症的方法，该方法是给予需要的对象足够量的本发明的转录抑制剂或药物组合物。

另一方面，本发明提供治疗炎症的方法，该方法是给予需要的对象治疗有效量的本发明的抗炎药或药物组合物。本发明考虑的炎性疾病包括但不限于：关节炎、风湿性关节炎、自身免疫疾病(如炎性肠病和系统性红斑狼疮)、实体器官移植、急性感染、急性期反应、过敏性哮喘、厌食、哮喘、恶病质、动脉粥样硬化、消退型心肌梗塞、血凝病、发热、牙龈炎、移植物抗宿主病、出血、多发性硬化症、新生血管性青光眼、骨关节炎、牙周炎、银屑病、银屑病关节炎、风湿热、中风和继发性转移造成的实体瘤生长和肿瘤侵袭。

在另一实施方式中，本发明提供治疗炎症的方法，该方法是给予需要的对象治疗有效量的本发明的转录抑制剂或药物组合物，并联用一种或多种其它抗炎药，其它抗炎药包括但不限于：非类固醇类抗炎药(如NSAIDS)、阿斯匹林、皮质类固醇、选择性COX-2抑制剂、白介素-1拮抗剂、二氢乳清酸合酶抑制剂、p38 MAP激酶抑制剂、TNF-α抑制剂、TNF-α螯合剂和氨甲喋呤。

本发明也提供治疗对象CMV感染相关疾病或病症的方法，包括给予对象治疗有效量的本发明转录抑制剂或药物组合物。在一实施方式中，与CMV相关的疾病或病症选自：CMV视网膜炎、肝炎、CMV-相关急性横贯性脊髓炎、多发性单神经病、脑炎、发热、疹和疲劳。

另一方面，本发明提供抑制细胞中CMV表达或感染的方法，该方法包括使细胞接触本发明的多肽/IE2片段。在一相关方面，本发明提供治疗、预防或限制对象中CMV病毒感染的方法，包括给予对象治疗有效量的本发明多肽/IE2片段、抗炎药或药物组合物。

包含在药物组合物中的治疗有效量的转录抑制剂，例如可通过任何已知的给药途径给予，包括但不限于：气溶胶(经鼻或肺)、口服、皮下、局部、眼内、肌肉内、静脉内、鞘内等。

此转录抑制剂给药可以是单剂量，或随时间推移给予多剂量。多剂量之间的时间间隔的非限制性例子包括多至4小时、多至8小时、多至12小时、多至24小时、多至36小时、多至48小时、多至72小时、多至一周、多至二周、多至一月、多至二个月、多至三个月、多至6个月和多至一年。

可预防性给予患病对象，或有患炎性疾病或病症风险的个人，或已知或怀疑已接触了CMV病毒的个人治疗有效量的转录抑制剂。

现通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。

实施例

方法和材料

细胞培养。HeLa细胞(S3株)获自ATCC，按他们推荐方法培养。简言之，用含10％FBS、0.5％青霉素-链霉素的Dulbecco改进的Eagel培养基(DMEM)培养细胞。每三天用胰蛋白酶(0.25％)EDTA(0.1％)(Cellgro)处理细胞使之脱壁，按1∶10分置培养。

报告构建物和表达载体。用聚合酶链式反应(PCR)产生人IL-1β启动子区(-131+12和-59/+12及其突变体)(图1A)，将其插入pGL3-基础载体(帕玛咖公司)的Mlu I和BgI II位点或Hind III位点，从而构建启动子-荧光素酶报告质粒。HCMV IE表达载体pEQ273和pEQ326含有插入到pGEM1载体中的基因组HCMV IE DNA。将NFIL6 cDNA插入表达载体pcDNA3.1或pcDNA1(因维曲根公司(Invitrogen))中，构建表达全长NFIL6和在二个Spl I限制位点之间含内部缺失的截短形式NFIL6的质粒(Tsukada，J.，K.Saito等，Mol CellBiol.14(11)：7285-97，1994)。将编码氨基酸269-345的PCR扩增的NFIL6片段插入pcDNA3.1中构建含NFIL6的bZIP区的表达载体(Yang，Z.，N.Wara-Aswapati等，J Biol Chem.275(28)：21272-7，2000)。

转染和报告基因试验。用Effectene试剂(恰根公司(Qiagen Inc.))以上述表达载体和荧光素酶报告质粒转染HeLa(S3)细胞。转染后24小时将细胞接种于24孔板。为确保各孔之间转染效率相似，在每次实验中，加入不同量的亲代载体和/或表达NFIL6或IE蛋白的载体，使每孔转染的DNA量保持恒定。用Western印迹验证这些载体的表达。转染24或48小时后，检测荧光素酶的活性或β半乳糖苷酶的活性(用帕玛咖公司的试剂)来衡量启动子活性，分别各实验的荧光素酶活性标准化。误差棒代表最少三次重复实验的标准差。

融合蛋白的纯化和GST拉下试验。用曾报导的方法(Wara-aswapati，1999)收集大肠杆菌BL21(DE)pLYsS(威斯康星州麦迪逊帕玛咖公司(Promega，Madison，WI))产生的GST融合蛋白。简言之，用0.5mM IPTG诱导培养的大肠杆菌3-4小时，用含1mM DTT，PefaBloc(印第安纳州印第安纳波利斯罗氏公司(Roche，Indianapolis，IN))和一份Complete^TM蛋白酶抑制混合药片(罗氏)/50ml的NETN缓冲液(20mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，0.05％NP-40)重悬沉淀。在冰上超声处理此悬液，收集上清液。用NETN缓冲液洗涤谷胱甘肽-琼脂糖珠，4℃与融合蛋白摇动培育过夜。用NETN缓冲液洗涤珠三次，体外与翻译的感兴趣蛋白探针4℃摇动培育45分钟。用冰冷的NETN洗涤三次后，将珠煮沸并用SDS-PAGE分离。用快速蓝安全染色试剂(SimplyBlueSafestain，因维曲根公司)染色凝胶作蛋白测定，用放射自显影分析结合。体外合成放射标记的蛋白质探针(TNT T7快速偶联网织细胞裂解液系统，帕玛咖公司)，按照厂商说明书用³⁵S甲硫氨酸(爱美沙公司(Amersham))标记。

实施例1

IE2片段抑制IL-1β上的Spi-1功能

用基因报告物试验检测了IE2 291-364对IL-1β启动子上的Spi-1功能抑制。此系统中，在荧火虫荧光素酶报告基因前部剪切IL-1β启动子。当该启动子被Spi-1活化时，细胞将产生荧火虫荧光素酶。通过使细胞如何发亮来测定此酶活性。采用此普通技术是因为它是一种测定启动子功能比测定基因产物如IL-1β更容易和更灵敏的方法。

当Spi-1和C/EBPβ被转染入HeLa-S3细胞之后，报告物显示出可滴定的反应(图1B和C)。然而，当在细胞转染中加入全长野生型IE2时，基因的活性提高了4-10倍(图1D)。这证明了IE2的功效。但是，如果滴加入抑制剂肽，则不存在和存在全长IE-2时报告物的活性都降低(图2A-2B)。

为进一验证IE2 291-364的效能，用RAW 264.7细胞系进行了测试。已证明此细胞系对LPS诱导内源性和转染的IL 1B基因具有反应(Shirakawa，F.，K.Satio等，同上)并能表达高水平的Spi-1(Kominato，1995)和C/EBPβ(Tsukada，1994)。用细菌细胞壁产物LPS处理RAW 264.7细胞系时，它产生的IL-1β类似于正常单核细胞产生的。此系统中IE2 291-364肽抑制了IL-1β启动子活性的约50％(图3)。

为了更可靠地检测IE2肽对IL-1β基因表达的抑制能力，将IL-1β基因中含有LPS-反应增强子和细胞类型特异性Spi-1依赖启动子(Shirakawa，F.，K.Satio等，Mol Cell Biol 13(3)：1332-44，1993)的整个单核细胞特异性3.8kbp调节区，作为荧光素酶报告基因，转染入LPS-处理的RAW264.7单核细胞中。结果显示，共转染3.8kbp的整个IL-1β调节区和含His尾的IE2 291-364肽表达载体，导致剂量依赖的活性抑制。与缺乏IE2载体时报告物表达相比，最大抑制为50％-75％，与用含IE2 291-364区和缺乏内部315-328残基的对照载体delA共转染相比，抑制程度相似(图6)。

实施例2

转染试验中的IE2片段表达

为了验证转染试验中表达的IE2片段，将这些片段插入GFP表达载体中，检测它们是否定位于细胞核(图4A)。结果表明了该蛋白的表达以及位于IE2片段中的假想核定位序列的功能。

转染后24小时，在胞浆和核中都发现了GFP 291-364片段。GFP 291-364片段能抑制Spi-1和C/EBPβ对HT报告基因的内源性反式激活。为控制转染效率，先用FACS纯化GFP表达细胞。然后用等量细胞制备裂解液以进行报告物试验。这些数据显示二种GFP融合产物都保留了显性失活功能(图4B)。此种功能为插入的IE2片段所特有，因为当用空的GFP表达载体(e.v)共转染Spi-1和C/EBPβ时报告基因活性很强。

因为先前的基因图显示IE2 291-364区是IE2上三个TBP结合位点之一，此抑制功能可能是由于与TBP的相互作用所致。为了排除此可能性，研究了它们的启动子中含有TATA盒的二种其它基因的表达。首先进行Western印迹观察此表达载体的C/EBPβ表达(图4C)。显示共表达GFP 291-364时C/EBPβ蛋白不减少。其次，用流式细胞术测定带His尾的抑制剂与ev GFP共转染时，转染细胞的平均几何亮度(图4D)。二种抑制剂都不降低GFP的表达，说明抑制IL-1β启动子的活性不是由于IE2片段抑制剂与TBP之间的全面相互作用所致。因此，此实施例证明了表达IE2分子有肽片段，通过与Spi-1和C/EBPβ竞争性相互作用，能够抑制IL-1β基因的表达。相信其基础是位于IE2分子残基315-328处的相互作用，因为在GST融合拉下(pull-down)试验中丢失了315-328区的IE2 291-364变体(delA)不能结合Spi-1 ETS结构域。

虽然可对本说明书内容作出各种修改和变化，附图也已显示了具体的实施方式，和文中作了详细描述。但应知道，这些具体辨方式的描述不是为了限制本发明于所述的具体形式，而是相反，本说明书公开的内容覆盖了附件权利要求书所定义的所有修改和等同条款。

本文所引用的所有专利、专利申请、出版物、产品描述和方案及参考文献，为了所有目的纳入本文作参考，特别是所参考的方法和方案。

序列表

<110>匹兹堡大学联邦系统高等教育(UNIVERSITY OF PITTSBURGH OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF

     HIGHER EDUCATION)

     纽约上州医科大学(SUNY UPSTATE MEDICAL UNIVERSITY)

<120>人巨细胞病毒蛋白IE2衍生的炎性细胞因子转录抑制剂

<130>072396.0293

<140>PCT/US06/037918

<141>2006-09-29

<150>US 60/721,769

<151>2005-09-29

<160>6

<170>PatentIn版本3.4

<210>1

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>1

Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys

1               5                   10

<210>2

<211>74

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>2

Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser

1               5                   10                  15

Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro

            20                  25                  30

Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val

        35                  40                  45

Arg Asn Ile Met Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro Asn Val

    50                  55                  60

Gln Thr Arg Arg Gly Arg Val Lys Ile Asp

65                  70

<210>3

<211>53

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>3

Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser Ser Ser

1               5                   10                  15

Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr Gly Pro

            20                  25                  30

Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu Lys Val

        35                  40                  45

Arg Asn Ile Met Lys

    50

<210>4

<211>580

<212>PRT

<213>人疱疹病毒5

<400>4

Met Glu Ser Ser Ala Lys Arg Lys Met Asp Pro Asp Asn Pro Asp Glu

1               5                   10                  15

Gly Pro Ser Ser Lys Val Pro Arg Pro Glu Thr Pro Val Thr Lys Ala

            20                  25                  30

Thr Thr Phe Leu Gln Thr Met Leu Arg Lys Glu Val Asn Ser Gln Leu

        35                  40                  45

Ser Leu Gly Asp Pro Leu Phe Pro Glu Leu Ala Glu Glu Ser Leu Lys

    50                  55                  60

Thr Phe Glu Gln Val Thr Glu Asp Cys Asn Glu Asn Pro Glu Lys Asp

65                  70                  75                  80

Val Leu Ala Glu Leu Gly Asp Ile Leu Ala Gln Ala Val Asn His Ala

                85                  90                  95

Gly Ile Asp Ser Ser Ser Thr Gly Pro Thr Leu Thr Thr His Ser Cys

            100                 105                 110

Ser Val Ser Ser Ala Pro Leu Asn Lys Pro Thr Pro Thr Ser Val Ala

        115                 120                 125

Val Thr Asn Thr Pro Leu Pro Gly Ala Ser Ala Thr Pro Glu Leu Ser

    130                 135                 140

Pro Arg Lys Lys Pro Arg Lys Thr Thr Arg Pro Phe Lys Val Ile Ile

145                 150                 155                 160

Lys Pro Pro Val Pro Pro Ala Pro Ile Met Leu Pro Leu Ile Lys Gln

                165                 170                 175

Glu Asp Ile Lys Pro Glu Pro Asp Phe Thr Ile Gln Tyr Arg Asn Lys

            180                 185                 190

Ile Ile Asp Thr Ala Gly Cys Ile Val Ile Ser Asp Ser Glu Glu Glu

        195                 200                 205

Gln Gly Glu Glu Val Glu Thr Arg Gly Ala Thr Ala Ser Ser Pro Ser

    210                 215                 220

Thr Gly Ser Gly Thr Pro Arg Val Thr Ser Pro Thr His Pro Leu Ser

225                 230                 235                 240

Gln Met Asn His Pro Pro Leu Pro Asp Pro Leu Gly Arg Pro Asp Glu

                245                 250                 255

Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Ser Ala Ser Asp Ser

            260                 265                 270

Glu Ser Glu Ser Glu Glu Met Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ser

        275                 280                 285

Val Thr Ser Ser His His Gly Arg Gly Gly Phe Gly Gly Ala Ala Ser

    290                 295                 300

Ser Ser Leu Leu Ser Cys Gly His Gln Ser Ser Gly Gly Ala Ser Thr

305                 310                 315                 320

Gly Pro Arg Lys Lys Lys Ser Lys Arg Ile Ser Glu Leu Asp Asn Glu

                325                 330                 335

Lys Val Arg Asn Ile Met Lys Asp Lys Asn Thr Pro Phe Cys Thr Pro

            340                  345                  350

Asn Val Gln Thr Arg Arg Gly Arg Val Lys Ile Asp Glu Val Ser Arg

        355                 360                 365

Met Phe Arg Asn Thr Asn Arg Ser Leu Glu Tyr Lys Asn Leu Pro Phe

    370                 375                 380

Thr Ile Pro Ser Met His Gln Val Leu Asp Glu Ala Ile Lys Ala Cys

385                 390                 395                 400

Lys Thr Met Gln Val Asn Asn Lys Gly Ile Gln Ile Ile Tyr Thr Arg

                405                 410                 415

Asn His Glu Val Lys Ser Glu Val Asp Ala Val Arg Cys Arg Leu Gly

            420                 425                 430

Thr Met Cys Asn Leu Ala Leu Ser Thr Pro Phe Leu Met Glu His Thr

        435                 440                 445

Met Pro Val Thr His Pro Pro Glu Val Ala Gln Arg Thr Ala Asp Ala

    450                 455                 460

Cys Asn Glu Gly Val Lys Ala Ala Trp Ser Leu Lys Glu Leu His Thr

465                 470                 475                 480

His Gln Leu Cys Pro Arg Ser Ser Asp Tyr Arg Asn Met Ile Ile His

                485                 490                 495

Ala Ala Thr Pro Val Asp Leu Leu Gly Ala Leu Asn Leu Cys Leu Pro

            500                 505                 510

Leu Met Gln Lys Phe Pro Lys Gln Val Met Val Arg Ile Phe Ser Thr

        515                 520                 525

Asn Gln Gly Gly Phe Met Leu Pro Ile Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Ala

    530                 535                 540

Tyr Ala Val Gly Gln Phe Glu Gln Pro Thr Glu Thr Pro Pro Glu Asp

545                 550                 555                 560

Leu Asp Thr Leu Ser Leu Ala Ile Glu Ala Ala Ile Gln Asp Leu Arg

                565                 570                 575

Asn Lys Ser Gln

            580

<210>5

<211>1659

<212>DNA

<213>人疱疹病毒5

<400>5

atcctactca ataaacgtgt cacgcctgtg aaaccgtact aagtctcccg tgtcttctta    60

tcaccatcag gtgacatcct cgcccaggct gtcaatcatg ccggtatcga ttccagtagc   120

accggcccca cgctgacaac ccactcttgc agcgttagca gcgcccctct taacaagccg   180

acccccacca gcgtcgcggt tactaacact cctctccccg gggcatccgc tactcccgag   240

ctcagcccgc gtaagaaacc gcgcaaaacc acgcgtcctt tcaaggtgat tattaaaccg   300

cccgtgcctc ccgcgcctat catgctgccc ctcatcaaac aggaagacat caagcccgag   360

cccgacttta ccatccagta ccgcaacaag attatcgata ccgccggctg tatcgtgatc   420

tctgatagcg aggaagaaca gggtgaagaa gtcgaaaccc gcggtgctac cgcgtcttcc   480

ccttccaccg gcagcggcac gccgcgagtg acctctccca cgcacccgct ctcccagatg   540

aaccaccctc ctcttcccga tcccttgggc cggcccgatg aagatagttc ctcttcgtct   600

tcctcctgca gttcggcttc ggactcggag agtgagtccg aggagatgaa atgcagcagt   660

ggcggaggag catccgtgac ctcgagccac catgggcgcg gcggttttgg tggcgcggcc   720

tcctcctctc tgctgagctg cggccatcag agcagcggcg gggcgagcac cggaccccgc   780

aagaagaaga gcaaacgcat ctccgagttg gacaacgaga aggtgcgcaa tatcatgaaa   840

gataagaaca cccccttctg cacacccaac gtgcagactc ggcggggtcg cgtcaagatt   900

gacgaggtga gccgcatgtt ccgcaacacc aatcgctctc ttgagtacaa gaacctgccc   960

ttcacgattc ccagtatgca ccaggtgtta gatgaggcca tcaaagcctg caaaaccatg  1020

caggtgaaca acaagggcat ccagattatc tacacccgca atcatgaggt gaagagtgag  1080

gtggatgcgg tgcggtgtcg cctgggcacc atgtgcacct ggccctctcc actcccttcc  1140

tcatggagca caccatgccc gtgacacatc cacccaaagt ggcgcagcgc acacccgatg  1200

cttgtaacga aggcgtcaag gccgcgtgga gcctcaaaga attgcacacc caccaattat  1260

gcccccgttc ctccgattac cgcaacatga tcatccacgc tgccaccccc gtggacctgt  1320

tgggcgctct caacctgtgc ctgcccctga tgcaaaagtt tcccaaacag gtcatggtgc  1380

gcatcttctc caccaaccag ggtgggttca tgctgcctat ctacgagacg gccacgaagg  1440

cctacgccgt ggggcagttt gagcagccca ccgagacccc tcccgaagac ctggacaccc  1500

tgagcctggc catcgaggca gccatccagg acctgaggaa caagtctcag taagtgaaaa  1560

actggaaaga gagacatgga ctcttgtaca tagtgattcc ccgtgacagt attaacgtgt  1620

ggtgagaatg ctgtttaata aaagtagctt tttttatac                         1659

<210>6

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成的肽

<400>6

Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gln Ala Arg Ala

1               5                   10

Claims (22)

1.一种含有分离的多肽的抗炎药，所述分离的多肽含有人巨细胞病毒(hCMV)立即早期2(IE2)蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)(SEQ ID NO：1)，其中所述多肽能抑制炎症。

2.一种多肽，其选自：人巨细胞病毒(hCMV)立即早期2(IE2)蛋白的氨基酸残基291-364(IE2 291-364)(SEQ ID NO：2)，hCMV IE2蛋白的氨基酸残基291-343(IE2 291-343)(SEQ ID NO：3)，和hCMV IE2蛋白的氨基酸残基315-328(IE2 315-328)(SEQ ID NO：1)。

3.一种含有治疗有效量的权利要求2所述多肽和药学上可接受运载体的药物组合物。

4.一种氨基酸序列与氨基酸残基291-364(IE2 291-364)(SEQ ID NO：2)至少90％同源的多肽。

5.一种氨基酸序列与氨基酸残基(IE2 291-343)(SEQ ID NO：3)至少90％同源的多肽。

6.一种氨基酸序列与氨基酸残基(IE2 315-328)(SEQ ID NO：1)至少90％同源的多肽。

7.一种含有氨基酸序列SEQ ID NO：1的长度在14-75个氨基酸残基之间的IE2多肽片段。

8.一种含有权利要求4、5、6或7所述多肽和药学上可接受运载体的药物组合物。

9.一种含有能抑制Spi-1调节分子转录的肽模拟物的药物组合物。

10.一种抑制需要治疗对象的炎症的方法，该方法包括给予所述对象足量的含权利要求2、4、5、6或7所述多肽的药物组合物。

11.一种抑制需要治疗对象的炎性病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的含权利要求2、4、5、6或7所述多肽的药物组合物。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述炎性病症选自：关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、实体器官移植、急性感染、急性期反应、过敏性哮喘、厌食、哮喘、恶病质、动脉硬化、消退型心肌梗塞、血凝病、发热、牙龈炎、移植物抗宿主病、出血、多发性硬化症、新生血管性青光眼、骨关节炎、牙周炎、银屑病、银屑病关节炎、风湿热、类风湿关节炎、中风和继发性转移造成的实体瘤生长和肿瘤侵袭。

13.一种治疗需要治疗对象的炎性病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的含有权利要求2、4、5、6或7所述多肽的药物组合物及联用一种或多种其它抗炎药。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述其它抗炎药选自：选择性COX-2抑制剂、皮质类固醇、白介素-1拮抗剂、二氢乳清酸合酶抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、TNF-α抑制剂、TNF-α螯合剂和氨甲喋呤。

15.一种治疗对象巨细胞病毒(CMV)感染相关疾病或病症的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的含权利要求2、4、5、6或7所述多肽的药物组合物。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述CMV相关疾病或病症选自：巨细胞病毒(CMV)视网膜炎、肝炎、CMV-相关急性横贯性脊髓炎、多发性单神经病、脑炎、发热、疹和疲劳。

17.一种抑制巨细胞病毒(CMV)在细胞中表达的方法，该方法包括使细胞接触权利要求2、4、5、6或7所述的多肽。

18.一种抑制细胞表达促炎性细胞因子的方法，该方法包括使细胞接触权利要求2、4、5、6或7所述的多肽。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述细胞是单核细胞。

20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述促炎性细胞因子是IL-1β。

21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述促炎性细胞因子是TNF。

22.一种治疗、预防或限制对象中的巨细胞病毒(CMV)病毒感染的方法，该方法包括给予所述对象治疗有效量的含权利要求2、4、5、6或7所述多肽的药物组合物。

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