ES2378852T3 - Dianas y compuestos para la intervención terapéutica de la infección por VIH - Google Patents

Abstract

Complejo que comprende Vif y una proteína de interacción del VIH seleccionada de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 14), CTCF (SEC ID nº 15), RPUhn ( SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos que pueden formar un complejo con Vif.

Description

Dianas y compuestos para la intervención terapéutica de la infección por VIH.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general al campo técnico de la biología molecular y la virología, respectivamente, y al desarrollo de fármacos antivíricos en particular. En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para identificar y clonar moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una nueva clase de proteínas o fragmentos de las mismas, que pueden interactuar con proteínas asociadas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y que, de esta manera, resulten adecuados, solos o en un complejo con la proteína de VIH, como dianas para el desarrollo de fármacos antivíricos. En este contexto, la presente invención proporciona nuevas proteínas y complejos de interacción con el VIH. Otro objeto de la presente invención es un método para identificar y proporcionar fármacos anti-VIH que pueden modular la formación y/o estabilidad de un complejo de una proteína celular huésped humana con una proteína del VIH. De esta manera, la presente invención se refiere además a composiciones que resultan útiles para detectar y dirigirse a complejos entre proteínas del VIH y proteínas humanas, las cuales se cree que son esenciales en el establecimiento de la infección vírica.

Antecedentes de la invención

El SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado, alcanzando su extensión proporciones de pandemia. En 1984 se descubrió el agente etiológico del SIDA como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), siendo un retrovirus que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. La familia Lentiviridae incluye los retrovirus no oncogénicos que habitualmente infectan las células del sistema inmunológico, en particular macrófagos y células T, causando infecciones persistentes en enfermedades con periodos de incubación prolongados y efectos citopáticos en las células infectadas, tales como la formación de sincitios y la muerte celular. Las infecciones por lentivirus no son eliminadas por el sistema inmunológico, y conducen a la acumulación de daños inmunológicos durante un periodo de muchos años.

El VIH que pertenece a la familia Lentiviridae es un retrovirus, es decir, contiene un genoma de ARN y actividad de transcriptasa inversa y, por lo tanto, durante su ciclo de crecimiento el VIH copia su ARN en ADN provírico, que puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped (provirus). Debido a su naturaleza retrovírica y al pequeño tamaño de su genoma, la replicación del VIH es muy dependiente de la maquina celular del huésped. De esta manera, el VIH utiliza la maquinaria transcripcional y traduccional del huésped para expresar ARN y proteínas víricas y para finalmente liberar virus maduros de la célula mediante gemación de la membrana citoplasmática. En el caso del VIH, la replicación vírica resulta en la muerte de las células T ayudantes del huésped, lo que conduce a un estado de severa inmunodeficiencia (SIDA), al desarrollo de diversas malignidades y a infecciones oportunistas, y en última instancia a la muerte del organismo infectado.

Aparte de los genes "habituales" del genoma del VIH, tales como env (codificante de la proteína de cubierta del virus), gag (codificante de las proteínas internas responsables de la formación de las estructuras de cápside y nucleocápside) y pol (codificante de los enzimas transcriptasa inversa, integrasa y proteasa), los genes transactivador transcripcional (tat) y regulador de la expresión vírica (rev) producen pequeñas proteínas no del virión que resultan esenciales para la replicación vírica. Además, varios genes que no participan en la expresión vírica se encuentran codificadas en VIH, tales como vif, vpr, vpu y nef.

El tratamiento de la enfermedad del VIH ha realizado avances significativos al reconocer que puede interferirse en el ciclo vital del VIH en muchos niveles, por ejemplo mediante la inhibición de la transcripción inversa del virus y mediante la inhibición de la actividad o fusión de su proteasa. Por consiguiente, se han desarrollado tres clases principales de fármacos: los inhibidores de la transcriptasa inversa, los inhibidores de proteasa y los inhibidores de fusión, y en la actualidad existen aproximadamente 25 fármacos antiretrovíricos aprobados para el tratamiento de los individuos infectados por el VIH. Además, es conocido que la combinación de fármacos diferentes con actividades específicas contra diferentes funciones bioquímicas del virus (terapia de combinación) puede ayudar a reducir el rápido desarrollo de virus resistentes a fármaco observado en respuesta a los tratamientos de un solo fármaco.

Sin embargo, incluso la actual "terapia antiretrovírica altamente activa" (HAART), basada en un tratamiento de las personas infectadas con una combinación de fármacos antivíricos de por lo menos dos de las clases de fármaco anteriormente indicadas, y que hasta la actualidad es el único tratamiento eficaz para reducir el avance y extensión del SIDA, se asocia a varias desventajas y limitaciones al utilizarse a largo plazo, tales como el cumplimiento de un régimen de dosificación complejo, toxicidad de los efectos secundarios y el elevado coste; ver, por ejemplo, Richman, Nature 410:995-1001, 2001. Además, la elevada variabilidad genética y antigénica del VIH, debido a la elevada tasa de mutación de su genoma, en combinación con un cumplimiento inadecuado, es responsable de la resistencia de los fármacos HAART, lo que explica que la utilización de una HAART haya reducido en gran medida el número de muertes debidas al VIH/SIDA pero no haya conseguido la supresión vírica completa.

Además del desarrollo de inhibidores de los enzimas víricos "esenciales" (transcriptasa inversa, proteasa e integrasa), la investigación se centra en la actualidad en las proteínas accesorias del VIH como dianas. Para las proteínas accesorias de VIH llamadas Vif, Vpu, Vpr y Nef, todavía se están investigando los mecanismos bioquímicos exactos; sin embargo, existe evidencia creciente que sugiere que ninguna de estas proteínas presenta actividad catalítica propia, sino que aparentemente funcionan a modo de "moléculas adaptadoras" que conectan otros factores víricos o celulares a diversas rutas celulares.

Una de las cuatro proteínas accesorias, el factor de infectividad del virión (Vif), es una pequeña fosfoproteína básica con una masa molecular de 23 kDa que está compuesta de 192 aminoácidos y que se sintetiza de manera dependiente de Rev durante las últimas etapas de producción del virión. Existen homólogos de Vif en todos los lentivirus, con la sola excepción del virus de la anemia infecciosa equina (EIAV); ver Oberste y Gonda, Virus Genes 6:95-102, 1992, y los marcos de lectura abiertos de Vif están significativamente conservados en los diferentes lentivirus; ver Sonigo et al., Cell 42:369-382, 1985.

En el caso del VIH, Vif generalmente resulta necesaria para la replicación vírica en las células T primarias. Además, es conocido que contrarresta la supresión de la replicación del VIH mediada por una proteína huésped, la apolipoproteína B humana con actividad enzimática editora de ARNm de tipo polipéptido catalítico 3G (APOBEC3G), que pertenece a la familia de enzimas de la citosina desaminasa APOBEC. Es conocido que APOBEC3G se empaqueta en los viriones retrovíricos (partículas víricas maduras infecciosas) y que desamina la desoxicitidina en desoxiuridina en el ADN vírico de cadena menos nuevamente sintetizado, induciendo de esta manera la hipermutación de G en A. La interacción de Vif con APOBEC3G en la célula productora de virus impide la incorporación de APOBEC3G en los viriones y, de esta manera, que APOBEC3G actúe sobre el ADNc del VIH recién sintetizado. Por el contrario se ha encontrado que Vig interactúa con las proteínas celulares Cul5, elogina B, elongina C, Rbx1, A3G, Cem15, SP140 (ver, por ejemplo, Yu et al., Science 302:1056-1060, 2003; patentes WO-A-2007/044565, WO-A-2005/023985, WO-A-2005/024422, WO-A-2005/004798; Bovolenta, Current Drug Targets, Immune, Endocrine and Metabolic Disorders, Bentham Science Publishers 4(4):257-263, 2004; Baraz et al., Current Medicinal Chemistry 11(2):221-231, 2004; Chiu et al., Trends in Immunology 27(6):291-297, 2006; Navarro et al., Current Opinion in Immunology 16(4):477-482, 2004; Madani et al., Journal of Virology 76(21):11133-11138, 2002), induciendo de esta manera, tras su unión a APOBEC3G, su ubiquitinación y degradación proteosómica y finalmente la eliminación de APOBEC3G de las células, lo que permite que el VIH produzca virus infecciosos.

También se ha demostrado que Vif interactúa con las Src tirosina quinasas Fyn y Hck, resultando en una reducción de sus actividades catalíticas; ver, por ejemplo, Hassaine et al., J. Biol. Chem. 276:16885-16893, 2001, y que interactúa con la proteína dedo de cinc que inhibe NF-KB; ver Feng et al., J. Virol. 78:10574, 2004. Debido a que la red de interacciones proteicas de Vif en la célula huésped responsable del papel funcional de la proteína accesoria vírica sólo se conoce en parte, recientemente se han descrito nuevas funciones en la regulación del ciclo celular de las células infectadas (Wang et al., Virology 359:243-252, 2007).

Sin embargo, no se ha demostrado que resulte adecuada como diana para el desarrollo de fármacos anti-VIH ninguna de las proteínas humanas identificadas hasta hoy como de interacción con las proteínas accesorias del VIH. De esta manera, todavía existe una necesidad de proporcionar dianas farmacológicas anti-VIH que suplementen las proteínas "esenciales", la transcriptasa inversa, la proteasa y la integrasa, en la terapia anti-VIH combinada o que proporcionen una alternativa a las mismas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevas dianas farmacológicas en el tratamiento de las enfermedades víricas. Más concretamente, la presente invención se refiere a proteínas humanas que interactúan con la proteína Vif asociada al VIH y a fármacos que interfieren con dichas interacciones.

Los experimentos realizados según la presente invención inesperadamente han revelado una nueva clase de proteínas que interactúan con una proteína asociada a la enfermedad vírica, en particular Vif, que hasta hoy no se ha conocido como diana del VIH. Debido al sistema experimental utilizado para la identificación de las proteínas que se unen a la proteína del VIH, resulta razonable esperar que dichas proteínas huésped identificadas de acuerdo con el método de la presente invención se unan realmente a las proteínas asociadas al trastorno vírico respectivo, tal como el SIDA. Por consiguiente, las proteínas identificadas de esta manera, así como la interacción proteínaproteína y la formación de complejo entre Vif de VIH y la proteína huésped, respectivamente, proporcionan dianas adecuadas para la intervención terapéutica y el diseño de agentes capaces de modular los mismos. En este contexto, la presente invención proporciona tanto moléculas de ácidos nucleicos codificantes de las proteínas respectivas de interacción con la proteína asociada a la enfermedad vírica, como las proteínas codificadas por dichas moléculas de ácidos nucleicos u obtenibles según los métodos del a presente invención, así como complejos que comprenden la proteína asociada a la enfermedad vírica y la proteína huésped (ser humano) identificada mediante el método de la presente invención.

La presente invención se refiere además a un método para cribar compuestos que pueden modular una interacción proteína-proteína concreta y la formación y/o estabilidad de complejos, respectivamente, así como compuestos que pueden obtenerse según dicho método y la utilización de dichos compuestos para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de enfermedades lentivíricas. Por ejemplo, pueden derivarse fármacos antivíricos apropiados a partir de la proteína humana identificada como pareja de unión de la proteína accesoria del VIH mediante la identificación del dominio de unión y el diseño de péptidos correspondientes o miméticos del mismo, capaces de interferir con la interacción de la proteína nativa con la proteína accesoria del VIH; ver, por ejemplo, el Ejemplo 4.

Además, se proporciona un kit que resulta útil para aplicar los métodos de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras ilustran la invención y muestran:

Fig. 1: ilustra el crecimiento de células de levadura con la expresión simultánea de las dos proteínas de fusión (comprendiendo la primera proteína de fusión Vif fusionado con Sos [mediante un conector] y comprendiendo la segunda proteína de fusión una proteína derivada de la biblioteca de timo fusionada con un dominio de localización membranal). En particular, la fig. 1 muestra la interacción de las dos proteínas con la que se recluta Sos a la membrana celular, activando la ruta de señalización Ras y resultando en un fenotipo detectable, es decir, permitiendo el crecimiento de las células de levaduras incluso a la temperatura restrictiva de 37ºC. La expresión de la primera proteína de fusión se encuentra bajo el control del promotor constitutivo de la alcohol deshidrogenasa (ADH); sin embargo, debido a que la expresión de la segunda proteína de fusión se encuentra bajo el control de un promotor GAL1, el crecimiento a la temperatura restrictiva únicamente se detecta tras la adición de galactosa (parte izquierda). La adición de glucosa reprime la expresión dependiente del promotor GAL1 y no conduce al crecimiento celular. Se identificaron los clones positivos que crecían en placas con galactosa pero no en placas con glucosa, y se indican mediante círculos blancos. Los clones que crecían en ambos medios se identificaron como revertientes. Las células de levadura de control que expresaban una pareja de proteínas de interacción conocidas se indican con círculos de puntos.

Fig. 2: muestra la respuesta de crecimiento microbiano resultante de complejos de proteína Vif y diferentes factores del huésped identificados según el método de la presente invención. También se muestra la especificidad de unión de las proteínas huésped a Vif. El crecimiento de las células de levadura a la temperatura restrictiva de 37ºC depende de la expresión de factores del huésped, así como de la proteína de interacción diana Vif, debido a que sólo tras la interacción de las proteínas huésped con Vif se envía el efector responsable del crecimiento celular a la membrana celular. Sin embargo, en el caso de una proteína diana de control negativa, cJun, a la que las proteínas huésped identificadas con toda probabilidad no se unen, no se detectó ninguna interacción ni, por lo tanto, crecimiento celular. En particular, la columna izquierda de la fig. 2 representa proteínas huésped identificadas según el método de la presente invención y secuenciadas tras demostrar la interacción respectiva y específica con Vif. Bajo condiciones de cribado (columna Galactosa 37ºC), se inducía la expresión de los factores del huésped y el crecimiento dependía de su interacción con la proteína de fusión de Vif. Tal como puede observarse, todos los factores del huésped mediaban en el crecimiento únicamente en combinación con la proteína de fusión de Vif, pero no en combinación con la proteína de fusión heteróloga cJun. La tercera columna (Glucosa 37ºC) muestra el crecimiento dependiente de factores del huésped, debido a que la represión de la expresión de factores del huésped (la glucosa reprime el casete de expresión controlado por el promotor GAL1) anuló la respuesta de crecimiento en todos los casos. La columna derecha de la fig. 2 representa los controles de crecimiento celular a la temperatura no restrictiva (24ºC).

Fig. 3a: muestra una autorradiografía de un gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida al 12% que representa los resultados de los experimentos de precipitación ("pull down") de glutatión-S-transferasa (GST). En particular, la fig. 3a muestra la detección de interacciones entre GST-Vif y las proteínas traducidas in vitro.

Los carriles 1 a 4 representan proteínas traducidas in vitro marcadas radioactivamente, en particular el carril 1 muestra APOBEC3G (A3G) traducida in vitro; el carril 2 muestra HSPA8 traducido in vitro; el carril 3 muestra PTEN traducido in vitro, y el carril 4 muestra luciferasa (Luc.) traducida in vitro.

Los carriles 6 a 9 representan los resultados respectivos de pull-down de las proteínas traducidas in vitro marcadas radioactivamente anteriormente indicadas por parte de las perlas de GST-Vif glutatión-sefarosa.

En particular, el carril 6 muestra GST-Vif y APOBEC3G traducida in vitro (A3G, control positivo); el carril 7 muestra GST-Vif y HSPA8 traducida in vitro; el carril 8 muestra GST-Vif y PTEN traducida in vitro, y el carril 9 muestra GST-Vif y luciferasa traducida in vitro (Luc.; control negativo).

Los carriles 11 a 14 representan el control de la especificidad del experimento de pull-down de GST, es decir, de la especificidad de unión de las proteínas traducidas in vitro para Vif. Por lo tanto, los carriles 11 a 14, en particular, representan los resultados del pull-down de GST, en los que se utilizó sólo GST, es decir, no fusionada con Vif. Más concretamente, el carril 11 muestra GST y APOBEC3G traducida in vitro (A3G); el carril 12 muestra GST y HSPA8 traducida in vitro; el carril 13 muestra GST y PTEN traducida in vitro, y el carril 14 muestra GST y luciferasa traducida in vitro (Luc.). Se demuestra que no se produce unión no específica entre las proteínas traducidas in vitro y GST solo.

Fig. 3b: muestra una autorradiografía de un gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida al 12% que representa los resultados de los experimentos de pull-down de glutatión-S-transferasas (GST). En particular, la fig. 3b muestra la detección de las interacciones entre GST-Vif y las proteínas traducidas in vitro.

Los carriles 1 a 5 representan las proteínas traducidas in vitro marcadas radioactivamente; en particular, el carril 1 muestra APOBEC3G traducida in vitro (A3G); el carril 2 muestra HERC4 traducida in vitro; el carril 3 muestra NUP50 traducida in vitro; el carril 4 muestra TOM1L1 traducida in vitro y el carril 5 muestra luciferasa traducida in vitro (Luc.).

Los carriles 6 a 10 representan los resultados de pull-down respectivos de las proteínas traducidas in vitro marcadas radioactivamente anteriormente indicadas por parte de las perlas de GST-Vif glutatión-sefarosa.

En particular, el carril 6 muestra GST-Vif y APOBEC3G traducida in vitro (A3G, control positivo); el carril 7 muestra GST-Vif y HERC4 traducida in vitro; el carril 8 muestra GST-Vif y NUP50 traducida in vitro; el carril 9 muestra GST-Vif y TOM1L1 traducida in vitro, y el carril 10 muestra GST-Vif y luciferasa traducida in vitro (Luc., control negativo).

Los carriles 11 a 15 representan el control de especificidad del experimento de pull-down de GST, es decir, de la especificidad de unión de las proteínas traducidas in vitro para Vif. Por lo tanto, los carriles 11 a 15, en particular, representan los resultados del pull-down de GST, en el que se utilizó GST sólo, es decir, no fusionado con Vif. Más concretamente, el carril 11 muestra GST y APOBEC3G traducida in vitro (A3G); el carril 12 muestra GST y HERC4 traducida in vitro; el carril 13 muestra GST y NUP50 traducida in vitro; el carril 14 muestra GST y TOM1L1 traducida in vitro, y el carril 15 muestra GST y luciferasa traducida in vitro (Luc.). Se demuestra que no se produce unión no específica de las proteínas traducidas in vitro y GST solo.

Fig. 3c: muestra una autorradiografía de un gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida al 12% que representa los resultados de experimentos de pull-down con glutatión-S-transferasa (GST). En particular, la fig. 3c muestra la detección de interacciones entre GST-Vif y proteínas traducidas in vitro.

Los carriles 1 a 6 representan proteínas traducidas in vitro traducidas radioactivamente, en particular el carril 1 muestra EIF4A2 traducida in vitro; el carril 2 muestra TPT1 traducida in vitro; el carril 3 muestra PTGES3 traducida in vitro; el carril 4 muestra TOM1L1 traducida in vitro; el carril 5 muestra HSPA8 traducida in vitro, y el carril 6 muestra luciferasa traducida in vitro (Luc.).

Los carriles 7 a 12 representan los resultados respectivos del pull-down de las proteínas traducidas in vitro marcadas radioactivamente anteriormente indicadas por parte de las perlas de GST-Vif glutatión-sefarosa.

En particular, el carril 7 muestra GST-Vif y EIF4A2 traducida in vitro; el carril 8 muestra GST-Vif y TPT1 traducida in vitro; el carril 9 muestra GST-Vif y PTGES3 traducida in vitro; el carril 10 muestra GST-Vif y TOM1L1 traducida in vitro; el carril 11 muestra GST-Vif y HSPA8 traducida in vitro, y el carril 12 muestra GST-Vif y luciferasa traducida in vitro (Luc., control negativo).

Los carriles 13 a 18 representan el control de la especificidad del experimento de pull-down con GST, es decir, de la especificidad de unión de las proteínas traducidas in vitro para Vif. Por lo tanto, los carriles 13 a 18, en particular, representan los resultados del pull-down con GST, en donde se utilizó GST solo.

Fig. 4: representa esquemáticamente el vector pGEX-4T2-vif, utilizado para la expresión de Vif para la utilización en experimentos de pull-down de GST. Se indican los sitios de promotor lacIQ, GST y Vif.

Fig. 5: representa esquemáticamente el vector pADH Sos-2xSpc-vif, utilizado para la expresión de la primera proteína de fusión para la utilización en el método de la presente invención. Se indican los sitios del promotor ADH (constitutivo), Sos, espaciador (conector) y vif.

Fig. 6: representa esquemáticamente el vector pMyr, utilizado para la expresión de la segunda proteína de fusión para la utilización en el método de la presente invención. Se indican los sitios del promotor GAL1 (inducible), la señal de miristoilación y la biblioteca de ADNc de timo.

Definiciones

El término "ADNc", tal como se utiliza el término en la presente memoria, describe de manera general el ADN complementario, es decir, un trozo de ADN que no presenta segmentos no codificantes (intrones) internos ni secuencias reguladoras de la transcripción. Un ADNc puede contener además regiones no traducidas (UTR) que son responsables del control traduccional en la molécula de ARN correspondiente. El ADNc puede producirse utilizando diversos métodos, tales como la síntesis en el laboratorio mediante transcripción inversa a partir de ARN mensajero extraído de las células.

El término "infección", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere de manera general a la entrada, replicación, inserción, lisis u otro suceso o proceso implicado en la patogénesis de un virus en una célula huésped. De esta manera, reducir la infección incluye reducir la entrada, replicación, inserción, lisis u otra patogénesis de un virus en una célula o sujeto, o combinaciones de los mismos. La infección incluye la introducción de un agente infeccioso, tal como un virus no recombinante, un virus recombinante, un plásmido u otro agente capaz de infectar un huésped, tal como la célula de un sujeto.

El término "mimético", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere de manera general a una molécula que imita la actividad de un agente. El término "mimético" utilizado en el contexto de péptidos se refiere a estructuras moleculares que actúan como sustitutos de los péptidos de la presente invención en la interacción con Vif de VIH. Entre los miméticos de péptidos, tal como se utiliza en la presente memoria, se incluyen estructuras sintéticas que pueden contener o no aminoácidos y/o enlaces peptídicos, pero que conservan las características estructurales y funcionales de un péptido ligando. La expresión "miméticos de péptidos" también incluye peptoides y oligopeptoides, que son péptidos u oligómeros de aminoácidos N-sustituidos. Se incluyen adicionalmente a modo de miméticos de péptidos las bibliotecas de péptidos, que son colecciones de péptidos diseñadas para ser de una longitud de aminoácidos dada y que representan todas las secuencias concebibles de aminoácidos correspondientes a los mismos.

La expresión "operablemente ligado", tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, describe de manera general una primera secuencia de ácidos nucleicos operablemente ligada a una segunda secuencia de ácidos nucleicos en el caso de que la primera secuencia de ácidos nucleicos se encuentre situada en una relación funcional con la segunda. Por ejemplo, un promotor se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que el promotor afecte a la transcripción o expresión de dicha secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN operablemente ligadas son contiguas y, en caso de que resulten necesarias para unir dos regiones codificantes de proteína, en el mismo marco de lectura.

La expresión "agente farmacéutico o fármaco", tal como se utilizan los términos en la presente memoria, se refieren de manera general a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico o profiláctico deseado al administrarse en un sujeto, solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos o portadores farmacéuticamente aceptables.

El término "prevenir" referido a una enfermedad, tal como se utiliza el término en la presente memoria, se refiere de manera general a la inhibición del desarrollo completo de una enfermedad, por ejemplo la prevención del desarrollo de una infección vírica.

El término "tratamiento", tal como se utiliza el término en la presente memoria, describe de manera general una intervención terapéutica que mejora un indicio o síntoma de una enfermedad o condición patológica relacionada con, por ejemplo, una infección por VIH-1, tal como la inhibición reducción de una infección por VIH-1.

La expresión "primera proteína de fusión", tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, se refiere de manera general a una proteína que comprende un efector y una proteína "diana", tal como una proteína del VIH. Una proteína diana generalmente es una proteína conocida que se examina para determinar si se encuentra implicada en una interacción proteína-proteína. Preferentemente, la primera proteína de la presente invención comprende una molécula de péptido conector dispuesta entre el efector y la proteína diana.

La expresión "segunda proteína de fusión" tal como se utiliza la expresión en la presente memoria, se refiere de manera general a una proteína que comprende un dominio de localización de un compartimiento celular y una segunda proteína, tal como una proteína humana, que puede unirse a la proteína diana o que se sospecha que puede unirse a la proteína diana.

El término "efector" tal como se utiliza el término en la presente memoria se refiere de manera general a un péptido o polipéptido que puede expresarse en forma de una proteína de fusión y, al expresarse de esta manera, puede activar una molécula informadora, con la condición de que la proteína efectora se trasloque al compartimiento celular que contiene la molécula informadora. Sin embargo, también puede utilizarse un fragmento activo de un efector, tal como un factor de intercambio de guaninas (GEF) para la puesta en práctica de la invención, con la condición de que el fragmento activo comprenda una parte suficiente del efector de manera que proporcione la función efectora. Dichos fragmentos activos de un efector se considera que se encuentran comprendidos en el significado del término "efector" tal como se utiliza en la presente memoria.

El término "lentivirus" tal como se utiliza el término en la presente memoria se refiere al virus 1 de inmunodeficiencia humana (VIH-1), al virus 2 de inmunodeficiencia humana (VIH-2), al virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) y al virus de la inmunodeficiencia felina (VIF).

La expresión "proteína candidata" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere de manera general a la proteína que se sospecha que se une a la proteína diana del VIH. La expresión "proteína candidata" puede utilizarse intercambiablemente con las expresiones "proteína huésped" y "proteína humana". Según la presente invención, la expresión "proteína candidata" no sólo incluye la proteína de longitud completa, sino que también comprende partes de la proteína, por ejemplo oligopéptidos y péptidos, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se centra en la identificación de dianas para el descubrimiento de fármacos para la utilización en el tratamiento y prevención de enfermedades víricas tales como el SIDA.

Tal como se describe en la sección de antecedentes, una estrategia para combatir adicionalmente la infección por VIH potencialmente podría ser presentar como diana las proteínas accesorias del virus y su interacción con parejas de unión a proteína de su huésped. Sin embargo, este enfoque se ve dificultado por la falta de información sobre la complejidad de la red de interacciones entre proteínas de dichas proteínas accesorias, por una parte, y también porque las proteínas humanas conocidas en la actualidad aparentemente no son candidatos apropiados para el desarrollo de fármacos en vista de su función normal en la célula. Los intentos iniciales para determinar adicionalmente la especificidad de la interacción de las proteínas accesorias del VIH con otros factores víricos o celulares han fracasado. Sin embargo, los experimentos llevados a cabo de acuerdo con la presente invención utilizando una versión modificada del sistema de reclutamiento Sos (SRS) esencialmente descrito en la patente US nº 5.776.689, que hasta el momento no ha sido considerado en el contexto de la interacción de proteínas víricas/humanas, inesperadamente han revelado nuevas proteínas huésped humanas como dianas específicas de una de las proteínas accesorias del VIH, es decir, Vif. De esta manera, podría identificarse una nueva clase de proteínas celulares humanas que participan en la infección por VIH, proporcionando de esta manera nuevas dianas para el desarrollo de fármacos.

Debido a la peculiaridad y fiabilidad del sistema de reclutamiento Sos y los avances posteriores realizados durante el desarrollo del método de la presente invención, puede afirmarse que las proteínas huésped (humano) de unión a Vif del VIH identificadas según el método de la presente invención en efecto desempeñan un papel crucial en el curso de la infección por VIH, el ciclo de vida vírico y el SIDA, respectivamente. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a la utilización del sistema de reclutamiento Sos para investigar la interacción de las proteínas asociadas a enfermedad vírica y las parejas de unión de las mismas, en particular para acercarse específicamente a la identificación de las proteínas de unión a proteínas relacionadas con el VIH, tales como Vif.

De esta manera, en un aspecto, en la presente memoria se da a conocer un método para identificar y clonar una molécula de ácidos nucleicos codificante de una proteína o fragmento de la misma capaz de interactuar con una proteína del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), comprendiendo el método:

(a)

expresar en una célula huésped una primera molécula de ácidos nucleicos codificante de una primera proteína de fusión que comprende una proteína efectora, que no es un factor de transcripción, fusionado con una proteína "diana" del VIH,

(b)

expresar adicionalmente en dicha célula una segunda molécula de ácidos nucleicos codificante de una segunda proteína de fusión que comprende un dominio de localización en membrana celular fusionado con una proteína humana o fragmento de la misma, y

(c)

detectar la activación de una molécula informadora mediante la detección de una señal que identifica una interacción entre la proteína diana del VIH de (a) y la proteína humana de (b), y opcionalmente

(d)

clonar la molécula de ácidos nucleicos codificante de la proteína humana o fragmento de la misma para la que se ha detectado la activación de la molécula informadora en la etapa (c).

Aunque el método resulta útil para investigar una amplia diversidad de diferentes factores, enzimas o proteínas asociadas al VIH; sin embargo, en una forma de realización preferida, la proteína diana del VIH utilizada en el método de la presente invención es una proteína accesoria del VIH, preferentemente el factor de infectividad vírica (Vif).

Durante los experimentos iniciales de optimización realizados según la presente invención y necesarios para establecer un método eficiente, inesperadamente resultó que la identificación de proteínas de interacción con Vif ("proteínas candidatas" y "proteínas huésped", respectivamente) mejoraba considerablemente en presencia de una molécula adicional de péptido conector. La utilización del conector, que presentaba la secuencia Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEC ID nº 3) y una descripción de la misma o de una secuencia similar puede encontrarse en, por ejemplo, Evers et al., Biochemistry 45:13183, 2006, y en Maeda et al., BioTechniques 20:116, 1996, dispuesta entre la molécula efectora y la proteína candidata, resultó en la posibilidad de identificar proteínas humanas que son una diana de Vif, que anteriormente no habían sido identificadas utilizando métodos convencionales. Por consiguiente, en una forma de realización adicional, el método comprende además expresar en una célula huésped una primera molécula de ácidos nucleicos codificante de una primera proteína de fusión que comprende un efector fusionado con una proteína diana de VIH mediante un péptido conector.

El presente método utiliza proteínas y poblaciones de proteínas codificadas por una biblioteca de ácidos nucleicos, por ejemplo una biblioteca de ADNc o de EST, un ejemplo de la cual se describe en detalle en los ejemplos. Por lo tanto, la proteína humana utilizada en el método se encuentra codificada por ADNc, preferentemente, en el que el ADNc se proporciona dentro de un grupo de ADNc, más preferentemente dentro de una biblioteca de ADNc. Aunque pueden utilizarse varias bibliotecas, tales como bibliotecas de células T, bibliotecas de ADNc de células B linfoblastoides humanas, bibliotecas de ADNc derivado de nódulo linfático o bibliotecas de células HeLa, más preferentemente la biblioteca de ADNc utilizada en el método es una biblioteca de timo.

Una ventaja principal del método es que puede aplicarse a prácticamente cualquier tipo de célula, tal como células de mamífero, ave, insecto, levadura y de E. coli. Sin embargo, en una forma de realización preferida, la célula huésped utilizada en el método según la presente invención es una célula de levadura.

De acuerdo con el método dado a conocer en la presente memoria, la interacción proteína-proteína se indica mediante la presencia o ausencia de crecimiento celular. Por lo tanto, resulta necesario utilizar células el fenotipo (crecimiento celular) de las cuales cambia al producirse la interacción proteína-proteína. Existen líneas celulares conocidas de la técnica que revelan un fenotipo respectivo, por ejemplo debido a la falta de un efector expresado endógenamente que resulta necesario para activar la ruta de señalización de Ras, que finalmente induce el crecimiento celular. Una de dichas líneas celulares, por ejemplo, es una línea celular de levadura mutada en el gen cdc25 (cdc25-2). Cdc25 es un factor de intercambio de guaninas (GEF) que, al encontrarse localizado en la membrana plasmática, conduce a la activación de Ras, ver Petitjean et al., Genetics 124:797-806, 1990. Por consiguiente, las mutaciones en Cdc25-2 conducen a una falta de un efector Ras funcional expresado, resultando en un defecto de crecimiento a la temperatura restrictiva, es decir 37ºC. Este defecto puede superarse proporcionando

o "reclutando" un efector Ras respectivo hasta/en la membrana celular. En este contexto, debido a que las proteínas de fusión según la presente invención están diseñadas de manera que una proteína de fusión comprende un dominio de localización en la membrana celular y la otra proteína de fusión comprende una molécula efectora, capaces de activar la ruta de señalización de Ras, tras la interacción proteína-proteína el efector Ras se envía a la membrana celular, activando de esta manera la ruta de señalización de Ras y permitiendo que crezcan las células. De esta manera, debido a que la utilización de dichas células permite que el método determine muy fácilmente la interacción proteína-proteína observando óptimamente la presencia o ausencia de crecimiento celular, en una forma de realización particularmente preferida del método de la presente invención, las células de levadura son células de Saccharomyces cerevisiae cdc25-2.

Tal como se ha indicado anteriormente, durante los experimentos de la presente invención, el crecimiento de las células en las que se lleva a cabo el ensayo es indicativo de la interacción proteína-proteína. Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, lo anterior requiere que una proteína de fusión comprenda el dominio de localización en membrana celular y que la otra proteína de fusión comprende una molécula efectora. Aunque existen varias moléculas conocidas de la técnica capaces de llevar a cabo una activación respectiva de Ras, en una forma de realización preferida del método, dicha molécula efectora es descendiente de la proteína sevenless (Sos).

La determinación de la secuencia de las proteínas codificadas inesperadamente ha revelado las moléculas de ácidos nucleicos que el método de la presente invención ha identificado que codifican una nueva clase de proteínas de unión a Vif, comprendiendo el motivo: [DLN][^AF][DLN][^P][^P][^P][^P][DLN], que, tal como reconocerá el experto en la materia, se representa utilizando el código de una letra generalmente aceptado de los aminoácidos. Sin embargo, se proporciona una breve explicación de los símbolos y letras, respectivamente, a continuación:

"[DLN]" se refiere a que el aminoácido en esta posición es D, L o N (ácido aspártico, leucina o asparagina).

"[^AF]" se refiere a que cualquier aminoácido podría encontrarse en esta posición excepto A o F (alanina o fenilalanina).

"[^P]" se refiere a que cualquier aminoácido podría encontrarse en esta posición excepto P (prolina).

De esta manera, la presente solicitud se refiere a la molécula de ácidos nucleicos obtenible mediante el método, más preferentemente, en la que la proteína codificada comprende el motivo siguiente: [DLN][^AF][DLN][^P][^P][^P][^P][DLN].

En general, la primera y segunda moléculas de ácidos nucleicos, codificantes de la primera y segunda proteínas de fusión, respectivamente, utilizadas en el método mencionado anteriormente, se encuentran presentes en un vector de expresión adecuado para las células particulares en las que debe producirse la interacción de las proteínas de fusión. Los ejemplos de vectores de expresión apropiados incluyen, por ejemplo, vectores de expresión levaduras o vectores de expresión de mamífero, dependiendo del as células en las que debe llevarse a cabo el método. En particular, los vectores según la presente invención contienen un sitio de clonación, tal como un sitio de clonación múltiple, que proporciona un medio conveniente para insertar una molécula de ácidos nucleicos codificante de una proteína diana. Según la presente invención, las moléculas de promotor y de ácido nucleico se disponen en los denominados "casetes de expresión", en donde el casete de expresión de la primera proteína de fusión comprende un promotor operablemente ligado a un ácido nucleico codificante de la proteína diana (Vif o un homólogo, derivado

o fragmento del mismo) en el mismo marco de lectura de la proteína efectora, y el otro casete de expresión comprende un promotor operablemente ligado a un ácido nucleico codificante de la proteína candidata (del huésped) (o un homólogo, derivado o fragmento de la misma) en el mismo marco de lectura que la molécula conectora y la señal de localización de compartimiento celular. Además, los vectores pueden contener señales apropiadas de inicio

o parada de la transcripción o traducción, o similares. Preferentemente, los casetes de expresión son casetes de expresión quiméricos que incluyen promotores heterólogos.

De esta manera, en otra forma de realización, la presente solicitud da a conocer un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos anteriormente indicada, preferentemente en la que el vector comprende además una molécula de ácidos nucleicos codificante de la proteína diana del VIH tal como se ha definido anteriormente o un fragmento de unión de la misma.

La presente solicitud da a conocer una célula huésped recombinante que comprende la molécula de ácidos nucleicos obtenible mediante el método anteriormente indicado o con el vector anteriormente indicado.

En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un método para preparar una proteína, capaz de interactuar con una proteína del VIH o con un complejo que comprende una proteína del VIH y una proteína humana, comprendiendo las etapas siguientes:

(a)

cultivar la célula huésped anteriormente caracterizada y/o expresar la molécula de ácidos nucleicos obtenible mediante el método de la presente invención o el vector según la presente invención in vitro, y

(b)

aislar la proteína o el complejo.

Hasta el momento, se ha identificado que varias proteínas interactúan con proteínas que participan en el ciclo de replicación del VIH. Sin embargo, utilizando el método de la presente solicitud, se han identificado proteínas huésped (humanas) que anteriormente no se había determinado que se uniesen a Vif. El análisis posterior reveló que las proteínas pertenecían a una nueva clase de proteínas, los miembros de la cual comparten la capacidad de unirse a Vif y el motivo anteriormente indicado.

Por lo tanto, en todavía otra forma de realización, la presente invención se refiere a una proteína de interacción con VIH codificada por una molécula de ácidos nucleicos u obtenible mediante el método anteriormente indicado de la presente invención, preferentemente en la que la proteína se selecciona de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 4), CTCF (SEC ID nº 15), hnRPU (SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3, SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA 1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28, HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31, HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34, HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36), o fragmentos o derivados de cualquiera de los mismos.

Aunque la actividad de Vif aparentemente se encuentra conectada íntimamente a la actividad de los factores de la célula huésped, todavía se desconoce cuál es el mecanismo molecular de Vif. Sin pretender restringirse a ninguna teoría, se cree que Vif "media" en el contacto entre la especie vírica y el huésped, es decir, actúa como un "adaptador" que conecta los factores víricos a factores y/o rutas celulares del huésped. Esto permite que el virus, que es fuertemente dependiente de su accesibilidad a la maquinaria celular del huésped debido a la naturaleza retrovírica de Vif y huésped, rechace el acceso a la maquinaria celular del huésped y se cree que es un enfoque terapéutico impedir la replicación del VIH y por lo tanto la aparición o el avance del SIDA.

De esta manera, se cree que Vif es una diana importante que debe estudiarse al considerar nuevos enfoques terapéuticos, haciendo necesario identificar los factores del huésped que interactúan con Vif y evaluar su posible impacto sobre la replicación del VIH. Aunque se han descrito en la técnica varios métodos para investigar las interacciones proteína-proteína, el desarrollo de métodos para identificar parejas de interacción de proteínas víricas y para detectar la interacción de una proteína vírica con una proteína huésped, respectivamente, bajo condiciones fisiológicas reviste gran interés.

A continuación se proporciona una breve vista general de las actividades "habituales" que presentan las proteínas identificadas como proteínas de unión a Vif según el método de la presente invención dentro de un organismo sano. A continuación se demuestra además que ninguna de las proteínas detectadas había sido determinada previamente, ni siquiera propuesto, como diana de Vif.

• Fosfatasa y homólogo de tensina (PTEN) (sinónimos: BZS, MHAM, TEP1, MMAC1, PTEN1, MGC1127), número de acceso: NM_000314. Este enzima cataliza la desfosforilación de la molécula segundo mensajero fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI-3,4,5-P3) que se genera mediante la adición de la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K), que resulta activada ella misma en respuesta a la unión de receptores de células T o de células B. Entre otras, PI3K también resulta activada por la señalización inducida por el factor de crecimiento similar a insulina IGF-1 (Yamamoto et al., Endocrinology 130:1490-98, 1992) y por la insulina (Hadari et al., J. Biol. Chem. 267:17483-17486, 1992) y se activa a sí misma cadena abajo de la ruta de la serina-treonina quinasa PKB/Akt, que participa principalmente en la antiapoptosis, proliferación y oncogénesis. PTEN es un regulador negativo de la ruta de señalización de PI3K, en ausencia de la cual la hiperactivación de la ruta PKB/Akt resulta en una resistencia incrementada a la apoptosis, y una supervivencia y proliferación celulares incrementadas. La investigación de ratones con deleción de PTEN específica de las células T indica su importante función reguladora de la proliferación de las células T en desarrollo en el timo; ver Hagenbeek et al., J. Exp. Med. 200:883-894, 2004.

Aunque la regulación de la apoptosis de las células T durante la infección por VIH resulta importante durante las etapas de latencia clínica y avance posterior de la enfermedad, los mecanismos moleculares de inducción de la muerte de las células T por parte del VIH, así como la protección de las células T infectadas por el VIH, no se encuentran bien definidas. En el caso de la infección por VIH, la apoptosis inducida por la infección vírica contribuye al agotamiento de las células T CD4+ y al avance de la infección por VIH y al SIDA, que se asocian a inmunodeficiencia. De esta manera, la inhibición de la apoptosis de las células T CD4+ podría ser una estrategia para prevenir o tratar la infección por VIH.

Se ha descrito que diferentes proteínas del VIH ejercen una función en la regulación de la muerte celular, ver Selliah y Finkel, Cell death and differentiation 8:127-136, 2001. Por ejemplo, puede inducirse la apoptosis de las células T vecinas por parte de VIH-Tat y VIH-Vpr. Además, la unión de la glucoproteína de cubierta VIH-Env a los receptores celulares CD4 y CXCR4 también se ha demostrado que induce apoptosis en linfocitos T primarios, ver Cicala et al., PNAS 97:1178-1183, 2000. Por otra parte, se ha demostrado que una interacción de PI3K con la proteína vírica Nef conduce a la señalización antiapoptótica debido a la activación de PI3K, ver Wolf et al., Nature Med. 7:1217-1224, 2001. La regulación negativa de PTEN por Tat intracelular y la infección por HIT-1 se ha sugerido que es un mecanismo potencial de estimulación de la ruta de supervivencia PI3K/Akt, ver Chugh et al., J. Mol. Biol. 366:67-81, 2007. En este contexto, los complejos de proteínas que comprenden VIH-Gag y PI3K y la utilización de estos complejos de proteínas ya han sido descritos en la solicitud de patente internacional WO 02/090549.

Además, la solicitud de patente internacional WO 03/060067 describe composiciones y métodos para inhibir las infecciones víricas y la maduración vírica mediante la administración de cantidades efectivas de un inhibidor de la ruta PI3K, así como complejos de proteínas de una subunidad reguladora de PI3K y las ubiquitina quinasas Herc.

PI(4,5)P2, el producto de la reacción catalizada por PTEN, también se ha demostrado que participa en la regulación de la localización de Gag y en el ensamblaje vírico, ver Ono et al., PNAS 101:14889-14894, 2004. Además, se ha demostrado que la producción vírica resulta fuertemente inhibida por los niveles reducidos de PI(4,5)P2 en la membrana plasmática, un efecto que se debe a la inhibición de la localización de Gag en la membrana plasmática. Además, se han llevado a cabo estudios estructurales del complejo del dominio de matriz de Gag y PI(4,5)P2 (Saad et al., PNAS 103:11364-11369, 2006). Sin embargo, no se han descrito anteriormente complejos de PTEN y Vif de VIH.

En el presente contexto, la identificación de PTEN (SEC ID nº 4 y 5, respectivamente) de acuerdo con el método de la presente invención como pareja de interacción directa y diana, respectivamente, de Vif, proporciona opciones para nuevas estrategias de tratamiento y prevención de la infección por VIH y el SIDA, respectivamente, tales como la prevención de la interacción respectiva mediante la administración de PTEN o miméticos del mismo, o la aplicación de compuestos capaces de modificar la expresión de PTEN o que afecten al complejo de PTEN y Vif. En consecuencia, el acceso vírico a la maquinaria celular del huésped resulta bloqueada y se detiene la replicación vírica. Además, la regulación de la apoptosis por parte del huésped se mantiene y se redirige al huésped, respectivamente, tal como sería el caso en ausencia de VIH.

• Ubiquitín ligasa E3 HERC, números de acceso HERC4: NM_001017972, NM_015601, NM_022079. Las ubiquitín ligasas E3 que contienen RCC1 dominios de tipo regulador de la condensación cromosómica 1 (RLD) además de un dominio HECT se denominan igual que HERC. RCC1 es un GEF (factor de intercambio de nucleótidos guanina) para Ran y participa en el transporte nucleocitoplasmático y en la formación del huso mitótico. Por lo tanto, se cree que las proteínas HERC, una familia de proteínas que consiste de 6 proteínas HERC diferentes (2 grandes, 4 pequeñas) presentan función tanto de GEF como de ubiquitín ligasa.

La interacción de Vif de VIH con una ligasa E3 basada en culina ya ha sido demostrada por Yu et al., Science 302:1056-1060, 2003; Mehle et al., Genes and Dev. 18:2861-2866, 2004; Mehle et al., J. Biol. Chem. 281:1725917265, 2006. Además, esta interacción de proteínas se ha descrito como esencial para la desactivación de la citidina desaminasa APOBEC3G por Shirakawa et al., Virology 344:263-266, 2006; Kobayashi et al., J. Biol. Chem. 280:18573-18578, 2005. Además, se ha demostrado que la proteína Vif del VIH se degrada rápidamente dentro de la célula y se ha sugerido que la rápida renovación de Vif resulta biológicamente importante para evitar los efectos perjudiciales de esta proteína a niveles de expresión elevados, ver Fujita et al., Microbes and Infection 6:791-798, 2004. Se han detectado grandes cantidades de derivados poliubiquitinados de Vif en las células. Además, la ubiquitinación de Vif de VIH ha sido investigada por Dussart et al., 2004, y se ha informado de la interacción con proteínas de la familia de la ubiquitín ligasa E3 HECT; además se han descrito complejos de Vif con hNedd4-1 y AIP4. Sin embargo, los complejos de proteínas de Vif de VIH y las ubiquitín ligasas E3 HERC descubiertas con el método de la presente invención no han sido descritas anteriormente.

Además, la patente internacional WO 02/090549 describe la interacción de las proteínas HERC con Gag de VIH, desempeñando un papel en la maduración vírica, y la solicitud de patente internacional WO 03/060067 describe complejos de proteínas de ubiquitín ligasas HERC y una subunidad reguladora de PI3K que contiene una proteína Nef.

Por lo tanto, la identificación de E3 HERC (SEC ID nº 6 y 7, respectivamente) de acuerdo con el método de la presente invención como proteína de unión a Vif, lo convierte en una diana adecuada al considerar nuevas estrategias en el campo de la infección por VIH y del SIDA. Tal como ya se indicado en relación a PTEN, lo anterior puede comprender la administración de E3 HERC o un mimético del mismo, o compuestos del mismo, capaces de modificar la expresión de E3 HERC o la formación del complejo E3 HERC y Vif con el fin de detener la replicación vírica.

• diana de tipo mybI 1 (TOM1L1) número de acceso NM_005486 y las proteínas relacionadas Tom1 y Tom1L2 constituyen una familia de proteínas que se caracteriza por un dominio VHS (Vsp27p, Hrs y Stam) en la región Nterminal y un dominio de homología GAT (GGA y Tom) que participa en el tráfico vesicular, ver Bonifacino J.S., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:23-32, 2004; Lohi et al., FEBS Lett. 513:19-23, 2002. Franco et al., Mol. Cell Biol. 26:1932-1947, 2006, identificaron TOM1L1 como un regulador negativo de la señalización mitogénica de Src mediante la modulación de la asociación de SFK (familia de la quinasa src)/receptor. Además, se ha demostrado que Vif interactúa con las Src tirosina quinasas Fyn y Hck, resultando en una reducción de sus actividades catalíticas (Hassaine et al., J. Biol. Chem. 276:16885-16893, 2001; Douaisi et al., Biochem. Biophys. Research Comm, 2005).

Las interacciones de TOM1L1 con la maquinaria de transporte de cuerpos multivesiculares han sido demostradas por Puertollano et al., J. Biol. Chem. 280:9258-9264, 2005. Más concretamente, se ha demostrado la interacción de proteínas con TSG101, siendo esta proteína un factor implicado en el transporte de las proteínas endosómicas. Resulta interesante que la interacción de Gag de VIH-1 con Tsg101 es importante para una gemación eficiente del virus; ver Serranto et al., 2001; solicitudes de patente internacional WO 02/090549 y WO02/072790. Además, se han descrito para el tratamiento de las infecciones virales los anticuerpos anti-TSG101 y los péptidos derivados de TSG101, ver las solicitudes internacionales WO04/031209 y WO 02/094314.

De esta manera, la identificación de la interacción molecular entre TOM1L1 (SEC ID nº 8) y Vif según el método de la presente invención convierte a TOM1L1 o el complejo de TOM1L1 y Vif en una diana adecuada en el campo del tratamiento y prevención del VIH y el SIDA, respectivamente. En particular, debido a que es conocido que la proteína vírica Vif se expresa tarde en el ciclo vital del virus y se ha comentado que Vif participa en el proceso de ensamblaje vírico, ver Zhang et al., J. Virology 74:8252-8261, 2000, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, se cree que la interacción molecular de Vif con las proteínas Tom es un componente clave de la modulación de Vif por parte de factores celulares del huésped, debido a que se cree que TomIL1 conecta las rutas celulares de señalización y degradación y por lo tanto desempeña un papel importante en la replicación del virus. Por lo tanto, se cree que la prevención de la formación correspondiente del complejo TOM1L1/Vif detiene la replicación vírica, y mantiene y redirige, respectivamente, los mecanismos de transporte y degradación de las proteínas al huésped.

• factor eucariótico de Homo sapiens 4A de inicio de traducción (eIF4A), número de acceso: NM_001967, un componente del complejo eIF4F, es una helicasa DEAD-box que funciona en la etapa de transporte a los ribosomas del inicio de la traducción. El complejo eIF4F también comprende eIF4E, que une la estructura de caperuza de ARNm de un modo dependiente de ATP y eIF4G; un andamiaje modular que actúa como mediador en la unión del ARNm del complejo 43S de preinicio. eIF4A desempeña un papel importante en la facilitación de la traducción al desenrollar la estructura secundaria de la región 5' del ARNm. eIF4A podría participar en la unión de ARNm-ribosoma tanto en su forma libre y como formando parte del complejo eIF4F.

Durante la infección vírica de las células huésped, los ARNm víricos deben competir con los ARNm del huésped para una cantidad limitada de factores eucarióticos de inicio que actúan de mediadores en el transporte a los ribosomas de los ARNm tanto víricos como celulares. Por lo tanto, los virus modifican determinados eIFs dentro de las células infectadas para la replicación del genoma vírico. Aunque ya han sido demostradas las interacciones de eIF4A con la proteína del virión inhibidora del huésped (vhs) del virus del herpes simplex (Feng et al., J. Virology 79:9651, 2005) y con la proteína NS5B del VHC (Kyono et al., Biochem. Biophys. Research Comm. 292:659, 2002), la presente invención proporciona la detección de complejos de eIF4A con proteínas del VIH, es decir con Vif del VIH.

Por lo tanto, el nuevo resultado de que eIF4A (SEC ID nº 9) según el método de la presente invención también es una diana directa de Vif proporciona una diana potencial útil para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos anti-VIH/SIDA. Por ejemplo, mediante efectos sobre eIF4A o el complejo de eIF4A y Vif se cree que se evita la competencia entre el virus y el huésped para la unión a factores de inicio del huésped, tales como eIF4A, dificultando de esta manera no sólo la replicación vírica sino también manteniendo a disposición del huésped la cantidad natural, aunque limitada, de factores de inicio.

• Proteína tumoral, controlada en la traducción (TCTP) (sinónimos: fortilina, factor liberador de histaminas, HRF, TPT1, p02), número de acceso NM_003295, no es una proteína específica de un tumor o tejido, sino que se expresa ubicuamente en todos los organismos eucarióticos y en más de 500 tipos de tejido y celulares, ver Bommer y Thiele, J. Biochem. Cell Biol. 36:379-385, 2004; Sánchez et al., Electrophoresis 18:150-155, 1997. Los niveles de TCPT se encuentran altamente regulados en respuesta a un amplio espectro de estímulos extracelulares tales como condiciones de estrés, ver Bommer et al., RNA 8:478-496, 2002; Bonnet et al., Yeast 16:23-33, 2000. También se ha demostrado que TCPT presenta una función extracelular como factor liberador de histaminas y una actividad antiapoptótica, ver Li et al., J. Biol. Chem. 276:47542-47549, 2001.

La proteína TCTP, también conocida como fortilina, se une a MCL1, una proteína de la familia antiapoptótica Bcl-2, sugiriendo que la fortilina podría ser un cofactor específico de MCL-1 en la regulación de la apoptosis, ver Zhang et al., J. Biol. Chem. 277:37430, 2002. Los métodos para modular la actividad de la fortilina y las interacciones con MTL-1 y p53 se han descrito en la solicitud de patente internacional WO 02/36624, y se ha demostrado que el gen antiapoptótico MTL-1 presenta una regulación positiva significativa en respuesta a una terapia antiretrovírica satisfactoria de pacientes de VIH (Balestrieri et al., J. Met. Virol. 79:111-117, 2007).

Además, TCTP interactúa específicamente con el regulador de la apoptosis BcI-XL, ver Yang et al., Oncogene 24:4778-4788, 2005. BcI-XL también es una proteína relacionada con BcI-2 que funciona como regulador de la apoptosis y se localiza en la membrana mitocondrial, en donde se une y cierra el canal mitocondrial aniónico dependiente del voltaje, evitando de esta manera el transporte del citocromo c, el activador de la caspasa del lumen mitocondrial al citoplasma, ver Shimizu et al., Nature 399:483-487, 1999. Se han descrito ensayos de cribado para moduladores de los complejos de proteínas BcI-XL/TCTP, la identificación de compuestos moduladores, y aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la apoptosis, entre ellas VIH, en la patente US nº 2002/0177692. Además, se ha descrito TCTP como una proteína inhibidora del VIH en la solicitud de patente internacional WO 01/16322. Sin embargo, los complejos de proteínas que contienen Vif de VIH y TCTP no han sido descritos anteriormente.

Según las ventajas expuestas ya en el contexto de las proteínas mencionadas anteriormente e identificadas como proteínas de unión a Vif, también la identificación de TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13, respetivamente) como diana directa de Vif, se cree que proporciona una diana adecuada adicional, es decir, TCTP o el complejo respectivo con Vif, para el desarrollo de nuevas estrategias en el campo del VIH/SIDA. En particular, la prevención de las interacciones respectivas de Vif y TCTP se cree que impide el acceso vírico a la maquinaria celular del huésped y, de esta manera, la replicación vírica. Además, la regulación de la apoptosis ya no se ve influida por el VIH, sino que se encuentra controlada por el huésped, tal como ocurriría en un organismo no infectado.

• Nucleoporina (NUP50) (sinónimos: NPAP60, NPAP60L, MGC39961, DKFZ564A043), números de acceso: NM_007172, NM_153645.

Con el fin de completar su ciclo vital, el virus de la inmunodeficiencia humana requiere la introducción de su genoma en los núcleos de células del huésped no en división. Tras la infección de la célula huésped, la cápside del VIH pierde rápidamente la cubierta y el ARN genómico del VIH se transcribe inversamente en ADNdc lineal, que permanece asociado a un complejo de nucleoproteína que se denomina complejo de preintegración (PIC). El genoma vírico se acompleja con proteínas víricas que contienen señales de localización nuclear (NLS) y es conocido que tres proteínas del VIH participan como proteínas cariofílicas en la importación nuclear del PIC mediante el transporte de la maquinaria celular de importación nuclear: la proteína de matriz VIH-1, la proteína auxiliar Vpr y la integrasa del VIH; para una revisión ver Bukrinsky, Mol. Med. 10:1-5, 2004. Además, la proteína vírica Rev es portadora de un motivo corto rico en leucinas C-terminal a modo de señal de exportación nuclear para su transporte nucleocitoplasmático y el transporte dependiente de Rev del ARNm vírico.

La investigación de la localización subcelular de Vif ha revelado que es una proteína predominantemente citoplasmática, ver Gonçalves et al., J. Virol. 68:704-712, 1994, Gonçalves et al., J. Virol. 69:7196-7204, 1995, Michaels et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 9:1025-1030, 1993. Sin embargo, también se ha observado la localización nuclear de Vif, ver Wichroski et al., J. Biol. Chem. 280:8387-8396, 2005. La secuencia de Vif contiene una 90RKKR93 de región básica que es similar a la señal prototípica de localización nuclear y este motivo ha sido identificado como señal inhibidora potencial de transporte nuclear. Se ha postulado que Vif podría funcionar como regulador del transporte nucleocitoplasmático, ver Friedler et al., J. Mol. Biol. 289:431-437, 1999. Además, algunos péptidos cíclicos esqueléticos de secuencia tipo NLS análogos de Vif han sido descritos como candidatos a fármacos basándose en la inhibición de la importación nuclear de genomas víricos en la solicitud de patente internacional WO 99/28338.

Se ha demostrado que la nucleoporina NUP50 actúa coordinadamente con el desensamblaje del complejo de importación y el reciclado de la importina, ver Matsuura et al., EMBO J. 24:3681-3698, 2005. Debido a su localización, se ha propuesto que NUP50 actúa dentro de la parte nucleoplasmática de las NPC y probablemente de modo principal en la cesta nuclear, ver Guan et al., Mol. Cell Biol. 20:5619-5630, 2000. Otras nucleoporinas, tales como NUP62 y NUP133, han sido identificadas como intensificadores de la infección por VIH mediante un cribado del ADNc, ver Nguyen et al., Virology 362:16-25, 2007.

De esta manera, la identificación de NUP50 (SEC ID nº 14) como diana directa de Vif convierte a NUP50 y/o al complejo entre NUP50 y Vif, en una diana adecuada para nuevos enfoques terapéuticos destinados al tratamiento de la infección por VIH y/o del SIDA. Aparte del hecho de que, en el caso de que se bloquee la formación de complejo, se cree que la replicación vírica resulta alterada o bloqueada, adicionalmente, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, ya que la interacción molecular entre Vif de VIH y NUP50 se cree que modula la maquinaria de transporte nucleocitoplasmático del huésped, tras la prevención o disrupción de la correspondiente interacción Vif/NUP50, el control del transporte nucleocitoplasmático en la célula debe redirigirse al huésped, tal como se encontraría en ausencia de infección por VIH.

• Factor de unión a CCCTC (CTCF), número de acceso NM_006565.

El represor transcripcional CTCF es una proteína ubicua que participa en múltiples tareas que conducen al silenciamiento génico. CTCF es un factor de transcripción de 11 dedos de cinc que desempeña un papel en diferentes aspectos de la regulación génica, incluyendo la activación o represión de promotores, el silenciamiento génico sensible a hormonas, el aislamiento de la cromatina dependiente de la metilación y la impresión genómica, ver Dunn y Davie, Biochem. Cell Biol. 81:161-167, 2003; Dunn et al., Exp. Cell Res. 288:218-223, 2003. Cabe indicar que la regulación positiva específica del represor de transcripción CTCF se ha relacionado directamente con la resistencia celular a VIH-1 de un clon de células T secretor de factores de resistencia a VIH1, ver Kartvelishvili et al., Immunology Letters 93:79-86, 2004. Sin embargo, no se han descrito anteriormente complejos de proteína que contengan Vif de VIH y CTCF.

De esta manera, la identificación de CTCF (SEC ID nº 15) como proteína de interacción con Vif también proporciona una diana adicional que debe estudiarse durante el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos en el campo de la infección por VIH y el SIDA, respectivamente. En particular, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, debido a que se cree que la interacción de Vif y el factor de transcripción CTCF resulta importante para la replicación del VIH en las células huésped humanas, su respectiva prevención debería obstruir el acceso vírico a la maquinaria celular del huésped y, de esta manera, detener la replicación vírica.

• HNRPU (sinónimos: RNPUhn, factor de unión a andamiaje A, SAF-A, p120, pp120), números de acceso: NM_004501, NM_031844.

La proteína pertenece a la subfamilia de las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas expresadas ubicuamente (RNPhn). Las RNPhn son proteínas de unión a ARN que presentan claras propiedades de unión a ácidos nucleicos y que forman complejos con ARN nuclear heterogéneo (ARNhn). Estas proteínas se asocian a pre-ARNm en el núcleo y aparentemente influyen sobre el procesamiento del ARNm y otros aspectos del metabolismo y transporte del ARNm. Aunque la totalidad de las RNPhn se encuentran presentes en el núcleo, algunas aparentemente se transportan entre el núcleo y el citoplasma.

Se ha descrito que la proteína hnRNPU contiene un dominio de unión a ARN y un dominio bipartito de unión a ADN específico de la región asociada a andamiaje (SAR) y se cree además que participa en el empaquetamiento del ARNhn en grandes complejos de ribonucleoproteína. Durante la apoptosis, esta proteína se corta de un modo dependiente de la caspasa, realizándose el corte en el sitio SALD y resultando en la pérdida de actividad de unión a ADN y en una separación concomitante de esta proteína de los sitios estructurales nucleares. Sin embargo, este corte no afecta a la función de la proteína codificada dentro del metabolismo del ARN.

La selección de una biblioteca de ADNc humano para los clones inductores de resistencia a infección con genomas recombinantes de VIH-1 resultó en la identificación de un fragmento génico con actividad restrictiva del VIH. El ADNc activa codifica un fragmento N-terminal de la RNPUhn. El fragmento diana presenta como diana la LTR3' en el ARNm vírico, bloqueando la acumulación citoplasmática de ARNm del VIH, ver Valente y Goff, Mol. Cell 23:597-605, 2006. Mediante un cribado de ADNc se han identificado algunas ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas que actúan como intensificadores de la infección por VIH, ver Nguyen et al., Virology 362:16-25, 2007.

Por lo tanto, la identificación por parte de la presente invención de que HNRPU (SEC ID nº 16) actúa como proteína de unión a Vif proporciona generalmente las mismas ventajas y opciones, respectivamente, referidas a la replicación vírica que se han comentado para las proteínas anteriormente indicadas, es decir, tras el bloqueo de la interacción respectiva de Vif y HNRPU, el acceso vírico a la célula huésped debería resultar bloqueado y por lo tanto la replicación del VIH debería resultar dificultada o bloqueada y detenida, respectivamente. Además, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, la participación "habitual" de la HNRPU en la formación de complejo con el ARN del huésped y el metabolismo y transporte del mismo, respectivamente, tras el bloqueo de la interacción entre Vif y HNRPU, debe encontrarse bajo el control del huésped únicamente y no en riesgo de resultar manipulado por el VIH.

• Cadena ligera reguladora de la miosina MRCL (sinónimos: MLCB, MRLC3), número de acceso: NM_006471.

Las interacciones de las proteínas del VIH con los componentes citoesqueléticos de la célula huésped resultan de gran importancia para una replicación vírica eficiente. Se han demostrado experimentalmente funciones específicas de la actina y los microtúbulos en la entrada de los virus, el tráfico intracelular, la gemación y la liberación de los virus. Además, se cree que la modulación del citoesqueleto también resulta importante para la apoptosis inducida por el VIH. Las proteínas víricas Tat, Rev, Vpr y Nef han sido identificadas como determinadas del remodelado citoesquelético, ver Fackler y Kräusslich, Curr. Opinion Microbiol. 9:409-415, 2006; Matarrese y Malorni, Cell Death Differ. 12:932-941, 2005.

Además, se ha demostrado la asociación citoesquelética de la proteína accesoria Vif del VIH y la confirmación mediante microscopía confocal ha revelado una estrecha colocalización con los filamentos intermedios vimentina y queratina, ver Karczewski y Strebel, J. Virol. 70:494-507, 1996. Se encontró que el Vif citoesquelético era más estable frente a la degradación en el proteasoma que el Vif citosólico soluble, ver Fujita et al., Microbes and Infection 6:791-798, 2004. Se observó la inducción de la agregación de vimentina y plectina por parte de Vif en diferentes células, ver Henzler et al., J. Gen. Virology 82:561-573, 2001.

Además, se ha demostrado que la miosina II desempeña un papel importante en la liberación de los viriones VIH-1 de las células infectadas, y se ha demostrado que algunos inhibidores químicos de la quinasa de la cadena ligera de la miosina bloquean la liberación de VIH-1 (Sasaki et al., PNAS 92:2026-2030, 1995). Se ha observado la inhibición de la fosforilación del MLC y se ha correlacionado con la interacción directa del MLC con Vpr (Zhao et al.: http://medschool.slu.edu/imv/index.phtml?page=zhao&cat = directory. Sin embargo, los complejos de proteínas que contienen Vif de VIH y MRCL no han sido descritos todavía.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la identificación de MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17) como diana directa de Vif lo ha convertido, además de su correspondiente complejo con Vif, en una diana adecuada para enfoques terapéuticos destinados a detener el ciclo vital del virus, en el que utiliza proteínas, enzimas y factores del huésped. En particular, debido a que la interacción de Vif con el componente citoesquelético MRCL podría permitir la modificación vírica del citoesqueleto del huésped, el bloqueo de la la formación de complejo entre MRCL y Vif debería mantener y redirigir la organización de la estructura esquelética bajo el control del huésped, tal como ocurriría en ausencia de una infección por VIH.

• El antígeno 1 de cáncer de colon definido serológicamente (SDCCAG1) (sinónimos: NY-CO-1, FLJ10051), número de acceso: NM_004713, ha sido identificado como proteína supresora tumoral. Se ha inducido la parada del ciclo celular en líneas celulares de cáncer mediante la inducción del SDCCAG1, ver Carbonnelle et al., Int. J. Cancer 92:388-397, 2001. Además, ha sido demostrado por Bi et al., Oncogene 24:8229-8239, 2005, que SDCCAG1 es un mediador de la exportación nuclear. Sin embargo, no se ha informado de funciones patológicamente relevantes en la patogénesis del VIH.

En el presente contexto, la identificación de SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19, respectivamente) como pareja de interacción directa de Vif permite su uso como diana, o del correspondiente complejo con Vif, con el fin de impedir o destruir la interacción respectiva para interrumpir el acceso vírico a la maquinaria celular del huésped. Además, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, la participación "habitual" de SDCCAG1 en la supresión tumoral y exportación nuclear debería encontrarse bajo el control del huésped y no en riesgo de manipulación por el VIH. De esta manera, la determinación de SDCAG1 como proteína de unión a Vif proporciona una opción adicional de nuevas estrategias anti-VIH y anti-SIDA, respectivamente.

Prostaglandina E sintasa 3 (PTGES3) (sinónimos: P23, TEBP), número de acceso: NM_006601.

La prostaglandina E2 (PGE2) es un eficaz mediador lipídico que eleva el nivel de AMPc, dotado de varios efectos inmunorreguladores. Se ha demostrado que los niveles séricos de PGE2 resultan significativamente elevados durante la infección por VIH, ver Delemarre et al., AIDS 9:441-445, 1995; Foley et al., Immunol. 75:391-397, 1992. En un estudio celular se ha demostrado que PGE2 incrementa la replicación del VIH, ver Kuno et al., PNAS 83:3487-3490, 1986; Lima et al., IAS Conf. HIV Pathog. Treat., nº de resumen WePe8.6B04, 2005. En este contexto, se ha observado la expresión inducida por PEG2 de los receptores inhibidores CD94/NKG2A funcionales en los linfocitos T CD8+ humanos (Zeddou et al., Biochemical Pharmacology 70:714724, 2005). Además, se ha demostrado que la producción de PGE2 resulta estimulada por péptidos derivados de un motivo de secuencia conservado de la proteína nuclear de VIH p24, ver Giacomini et al., Scand. J. Immunol. 48:248-253, 1998.

En el presente contexto, la identificación de PTGES3 (SEC ID nº 20) como proteína de unión a Vif por la presente invención convierte a esta proteína, o al correspondiente complejo con Vif, en una diana adecuada para impedir o destruir dicha interacción. En particular, sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, partiendo de que se produce la modulación de los efectos inmunorreguladores durante la patogénesis del VIH mediante una interacción directa de Vif con PTGES, dicha modulación de los efectos inmunorreguladores durante el curso de la infección por VIH debería resultar bloqueada por el correspondiente bloqueo de la interacción y, por el contrario, la regulación del sistema inmunológico debería encontrarse bajo el control del huésped, tal como se encontraría en un organismo sano.

• Proteínas de choque térmico: HSPA1, HSPA5, HSPA8, HSPB (sinónimos: HSP72, HSP70-1), número de acceso de HSPA1: NM_005345 (sinónimos: BIP, MIF2, GRP78); número de acceso de HSPA5: NM_005347 (sinónimos: LAP1, HSC54, HSC70, HSC71, HSP71, HSP73, HSPA10, MGC29929), números de acceso de HSPA8: NM_006597, NM153201 (sinónimos: HSP90B, HSPC2, D6S182); número de acceso de HSPB: NM_007355.

Las proteínas de choque térmico son proteínas altamente conservadas evolutivamente que actúan de chaperones moleculares en las células. Sus funciones moleculares se asocian al plegamiento, transporte y ensamblaje de las proteínas. Las HSP también participan en la prevención de la agregación y degradación de las proteínas. Además, se ha demostrado que la biosíntesis de las HSP resulta inducida no sólo por el calor sino también por otros agentes agresores celulares, entre ellos el estrés oxidativo, la influencia de metales pesados y las infecciones bacterianas y víricas.

Las proteínas de choque térmico ya han sido reconocidas como nuevas herramientas terapéuticas para el tratamiento de la infección por VIH (Brenner y Wainberg, Exp. Opin. Biol. Ther. 1:1471-2598, 2001). Sin embargo, el papel de las HSP en la patogénesis de la enfermedad del VIH sólo se conoce parcialmente. Los estudios in vitro con líneas celulares de linfocitos CD4+, así como el análisis de los linfocitos de individuos infectados por VIH, han demostrado que la infección por VIH induce un incremento de la síntesis de proteínas de choque térmico, ver Wainberg et al., Virology 233:364-373, 1997; Agnew et al., AIDS 17:1985-1988, 2003; Fust et al., Mol. Immunol. 42:79-85, 2005. Además, se ha demostrado que Hsp70 inducida en estadios tardíos de la infección protege a las células frente a la apoptosis, ver Mosser et al., Mol. Cell Biol. 17:5217-5327, 1997.

La interacción de diferentes proteínas del VIH con las proteínas de choque térmico ha sido expuesto anteriormente, por ejemplo se ha demostrado que la interacción entre Nef y Hsp40 resulta importante para una traslocación incrementada de Hsp40 al núcleo de las células infectadas, ver Kumar et al., J. Biol. Chem. 280:40041-40050, 2005. Además, la incorporación en el virión de diferentes proteínas de choque térmico ha sido demostrada por Gurer et al.,

J. Virol. 76:4666-4670, 2002. En este contexto, la interacción de Gag presenta una participación crítica en la incorporación de Hsp70 por parte del virión. Los complejos de proteínas de un polipéptido HECT-RCC1 con gag del VIH y proteínas de choque térmico y la utilización de moduladores de estos complejos para el tratamiento del VIH han sido descritos en la solicitud de patente internacional WO 02/090549. Sin embargo, no se han descrito anteriormente complejos de Vif con proteínas de choque térmico.

De esta manera, la identificación mediante el método de la presente invención de HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31, respectivamente; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34, respectivamente; HSPH1: SEC ID nº 35) como parejas de interacción directa de Vif, proporciona generalmente opciones similares para el desarrollo de nuevas estrategias anti-VIH y anti-SIDA, respectivamente, tal como se ha expuesto anteriormente para las proteínas anteriormente indicadas. En particular, mediante el bloqueo de la interacción de Vif y las HSP, debería impedirse el (ab)uso de la maquinaria de "chaperón" molecular del huésped por parte del VIH para el plegamiento de las proteínas víricas, el ensamblaje del virus o la formación de complejos víricos, obstaculizando de esta manera el ciclo de replicación vírico. Además, el bloqueo de la interacción impide la competencia entre Vif y el huésped para la unión a HSP del huésped, lo que finalmente garantiza el mantenimiento de una cantidad suficiente de HSP a disposición del huésped.

• Proteína E que contiene dominio de choque frío (CSDE1), número de acceso: NM_001007553, sinónimos: la proteína UNR, proteína del gen N-ras situado cadena arriba, es una proteína de interacción con ARN que contiene el dominio de choque frío altamente conservada (CSD) que consiste de aproximadamente 70 aminoácidos y que contiene los motivos de unión a ácidos nucleicos RNP1 y RNP2. Esta proteína participa en el inicio de traducción mediado por sitio interno de entrada ribosómica (IRES) del ARN del rinovirus y poliovirus humanos, ver Hunt et al., Genes Dev. 15:437, 1999; Boussadia et al., J. Virol. 77:3353-3359, 2003. Se encontró que era una proteína de unión a mCRD y de interacción con PABP, y una interacción independiente de ARN con la proteína mayor PABP de unión a poli(A) citoplasmático ha sido demostrada por Chang et al., Genes Dev. 18:2010, 2004. Sin embargo, no se han descrito anteriormente complejos con proteínas del VIH.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la identificación de CSDE1 (SEC ID nº 36) como diana directa de Vif también proporciona opciones similares, tal como ya se ha mencionado en relación a las proteínas anteriormente indicadas, tal como interrumpir el acceso vírico a los "recursos" del huésped y obstaculizar el ciclo vital vírico, respectivamente, impidiendo, por ejemplo, la formación respectiva del complejo entre Vif y CSDE1. En particular, se produce una competición entre Vif y el huésped para la unión a CSDE1 del huésped, manteniendo de esta manera una cantidad suficiente de CSDE1 a disposición del huésped y garantizando de esta manera la renovación del ARNm del huésped tal como ocurriría en ausencia de una infección por VIH.

Las proteínas de unión a Vif anteriormente indicadas, identificadas mediante la utilización del método de la presente invención, no han sido descritas anteriormente como dianas directas de Vif y, por lo tanto, son específicamente objeto de la presente invención.

Tal como ya se ha indicado anteriormente, se cree que Vif actúa como "adaptador" que conecta factores víricos a factores del huésped, una interacción tras la cual varias funciones celulares del huésped resultan interrumpidas, reprogramadas o abusadas con fines víricos, en las que estas diferentes funciones de Vif se llevan a cabo mediante la unión de Vif a diferentes proteínas huésped. De esta manera, Vif ejerce varios efectos diferentes, dependiendo de la proteína con la que interactúe. Tal como se ha indicado anteriormente y sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, Vif afecta a la apoptosis cuando se encuentra unida a PTEN o TCTP; modifica el transporte y degradación de las proteínas al interactuar con TOM1L1; influye sobre la maquinaria de transporte nucleocitoplasmático del huésped en el caso de que forme un complejo con Nup50, así como la organización del citoesqueleto al unirse a MRLC. Además, se cree que Vif compite para factores de inicio o de transcripción del huésped, y de esta manera retira su disponibilidad, al unirse a, por ejemplo, EIF4A2 o CTCF. Además, se cree que Vif afecta a la regulación inmunológica del huésped al formar un complejo con PTGES y se plante además que abusa de la maquinaria de "plegado de proteínas" del huésped cuando se encuentra unida a las HSP, así como desactiva APOBEC3G, mediante la unión a, por ejemplo, HERC E3.

Sin embargo, tal como ya se ha expuesto para cada proteína individual, se cree que se evitan estos efectos de Vif mediante el desarrollo de nuevas estrategias basadas en el conocimiento de dicha nueva clase de proteínas de unión a Vif identificadas mediante el método de la presente invención, que hasta hoy no se han descrito ni se conocen. Tal como ya se ha indicado anteriormente, un ejemplo de una nueva estrategia anti-VIH puede comprender el suministro de las proteínas identificadas o miméticos de las mismas, o la administración de compuestos, capaces de influir sobre la expresión de la proteína identificada respectiva o capaces de afectar (impedir o destruir) los complejos respectivos entre la proteína huésped identificada y Vif. Sin embargo, existen varios modos de modular la interacción de Vif con la proteína huésped (humana) identificada o la proteína o proteínas individuales. De esta manera, estas nuevas parejas de unión identificadas de Vif representan nuevas dianas para la intervención terapéutica y la modulación farmacológica, respectivamente.

Adicionalmente, además de las proteínas identificadas como dianas de Vif mediante el método dado a conocer en la presente memoria, el complejo entre Vif y la proteína huésped también puede utilizarse para aplicaciones analíticas, terapéuticas o diagnósticas en el campo del VIH/SIDA. En particular, los complejos entre Vif y proteínas huésped identificadas según el método de la presente invención, preferentemente entre Vif y las proteínas anteriormente indicadas, también proporcionan dianas adecuadas para el análisis o desarrollo correspondiente de nuevas estrategias anti-VIH/anti-SIDA. Sin embargo, un complejo según la presente invención no sólo comprende proteínas de longitud completa sino también fragmentos de proteínas diana y huésped, así como homólogos o derivados de las mismas. En este contexto, debe apreciarse que el complejo según la presente invención puede comprender cualquier fragmento o parte mínima de la proteína diana y/o huésped con la condición de que pueda establecer la correspondiente interacción de complejo. Los complejos de proteína-proteína de la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, para diagnosticar el desarrollo de la enfermedad por el VIH, en la realización del cual pueden incorporarse en un microchip o micromatriz de proteínas.

De esta manera, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un complejo que comprende una proteína de VIH, preferentemente una proteína de VIH accesoria, tal como Vif, y una proteína codificada por una molécula de ácidos nucleicos identificada tal como se ha indicado anteriormente u obtenible mediante el método de la presente invención.

Además, puede resultar deseable una proteína que corresponde generalmente a la proteína identificada mediante la presente invención, pero que ya no es capaz de formar un complejo con Vif. Estas proteínas puede conseguirse mediante, por ejemplo, modulación de la secuencia de aminoácidos de una proteína identificada, por ejemplo mediante sustitución, deleción o adición, en el que dichas modificaciones, así como el método para llevarlas a cabo, son conocidas por el experto en la materia. En particular, dichas proteínas pueden considerarse útiles con fines analíticos, tales como para determinar la región de unión y los aminoácidos esenciales para la unión a Vif, respectivamente. Sin embargo, existen varios propósitos concebibles para diseñar y utilizar las proteínas, capaces, por ejemplo, por una parte de ejercer la "función habitual en estado de salud" aunque, por la otra, no sean capaces de unirse a Vif, denegando de esta manera el acceso vírico a la célula y manteniendo su función celular habitual. Por lo tanto, en otra forma de realización, la presente solicitud también da a conocer una proteína derivada de la proteína codificada por la molécula de ácidos nucleicos identificada según la presente invención mediante sustitución, deleción y/o adición de aminoácidos que ya no es capaz de formar un complejo tal como se ha caracterizado anteriormente.

Se proporciona adicionalmente un anticuerpo que se une específicamente al complejo caracterizado anteriormente o al dominio de unión de la proteína de VIH correspondiente y a la proteína humana, respectivamente, o a la proteína anteriormente indicada que se deriva de la proteína codificada por la molécula de ácidos nucleicos de la presente invención, pero que, debido a alteraciones de la secuencia de aminoácidos, ya no es capaz de formar el respectivo complejo.

Los anticuerpos adecuados que resultan útiles según la presente invención preferentemente son anticuerpos monoclonales, pero también anticuerpos sintéticos, así como fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab, Fv o scFv, etc. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden obtenerse mediante la utilización de métodos que se describen en, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, o en la solicitud de patente europea EP-A-0 451 216 y referencias citadas en la misma. La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 89/09622, y en particular, se describen métodos para la producción de anticuerpos humanizados en, por ejemplo, los documentos EP-A1-0 239 400 y WO 90/07861. Son fuentes adicionales de anticuerpos para utilizar según la presente invención, anticuerpos denominados xenogénicos. El principio general para la producción de anticuerpos xenogénicos, tales como anticuerpos humanos en ratones, se describe en, por ejemplo, las solicitudes de patente WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 y WO 96/33735.

Uno de los objetivos principales de la presente solicitud es la identificación de proteínas huésped, preferentemente proteínas humanas, capaces de interactuar con proteínas asociadas al VIH, tales como Vif. Sin embargo, tras identificar una proteína huésped mediante el método de la presente invención como de unión a Vif, proporciona además un nuevo punto de contacto para interferir en el ciclo vital vírico. Debido a que el virus VIH es fuertemente dependiente de la maquinaria celular del huésped para mantener su propio ciclo vital y multiplicarse, y debido a que además Vif se cree que es un "adaptador", que entre otras presenta la "función" de proporcionar acceso vírico a los "recursos" celulares del huésped, la obstrucción de esta interacción entre el virus y el huésped se cree que es una herramienta terapéutica prometedora para detener la replicación vírica, el avance de la infección y la aparición del SIDA, respectivamente. De esta manera, el conocimiento de nuevas proteínas de unión a Vif, identificadas según el método de la presente invención y no conocidas anteriormente, de unión a Vif, permite el cribado para compuestos adecuados capaces de afectar a Vif, a la proteína de unión a Vif o a la interacción entre los mismos.

De esta manera, aparte de la identificación de las proteínas de interacción con Vif mediante el método dado a conocer en la presente memoria, es otro objetivo de la presente invención identificar y cribar para, respectivamente, compuestos capaces de afectar a la interacción de una proteína huésped y Vif, preferentemente inhibiendo u obstaculizando dicha interacción. Un modo de descubrir los compuestos puede comprender exponer la célula en la que debe producirse la interacción y el efecto, por ejemplo la inhibición, Vif mismo o la proteína de interacción a compuestos, es decir compuestos de ensayo con respecto a su capacidad de ejercer los efectos anteriormente ejemplificados. En particular, la célula en la que debe llevarse a cabo el ensayo puede someterse a un compuesto de ensayo antes, durante o después de la formación de complejo entre la proteína diana del VIH, o un fragmento de la misma, con su pareja putativa de interacción, tal como una proteína huésped. Pueden monitorizarse los cambios producidos tras el contacto con el compuesto en la formación y/o estabilidad del complejo, y el compuesto de ensayo se selecciona para su capacidad de modular la unión de Vif a la proteína huésped, que preferentemente es una proteína identificada según el método de la presente invención, tal como se ha indicado anteriormente.

El modo de acción del compuesto puede ser otro, es decir, puede interactuar con Vif mismo o con la proteína huésped, preferentemente identificada mediante el método de la presente invención, en donde dicha interacción puede producirse en el sitio de unión de la proteína, la cual es habitualmente responsable de la unión a la pareja de interacción respectiva, bloqueándose de esta manera dicho sitio. Sin embargo, la interacción también puede producirse en un sitio habitualmente no implicado directamente en la unión a una potencial molécula de interacción, cambiando de esta manera, por ejemplo, la conformación de la proteína y conduciendo a la desaparición o alteración del sitio de unión y, en consecuencia, impidiendo la interacción anteriormente indicada. De esta manera, el compuesto de ensayo puede actuar como inhibidor competitivo o alostérico. Además, según la presente invención, "modular" o "afectar" no sólo se refiere a presentar un efecto sobre la interacción durante el curso de su formación, sino también actuar sobre complejos ya formados, es decir, destruirlos. Sin embargo, tal como ya se ha indicado anteriormente, en el caso de una interferencia real con dicha interacción de proteína huésped/Vif, se obstruye el acceso del virus a la maquinaria celular del huésped y, en consecuencia, se impide o por lo menos, limita en un grado elevado, la infección y extensión del virus.

De esta manera, en una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a un método para cribar compuestos, capaces de modular la formación de complejo y/o la estabilidad del complejo, comprendiendo las etapas siguientes:

(a)

someter un compuesto de ensayo a:

(i)

la proteína diana del VIH y la proteína humana tal como se ha definido y caracterizado anteriormente, o

(ii)

el complejo según la presente invención,

(b)

monitorizar los cambios en la formación de complejo y/o en la estabilidad del complejo, y

(c)

identificar un compuesto capaz de modular la formación y/o estabilidad del complejo basándose en su capacidad de modificar la formación de complejo entre las proteínas de (i) y/o modificar la estabilidad de (ii) comparado con un control.

Aunque el método resulta útil para cribar nuevos compuestos que presentan el efecto y características deseados, este método también resulta útil para someter a ensayo compuestos o fármacos que se conoce o se cree que presentan propiedades antivíricas por su eficacia y efecto reales. En particular, los métodos que utilizan los complejos de proteínas según la presente invención también pueden utilizarse para estudios funcionales y de control de calidad de polinucleótidos, proteínas, péptidos o anticuerpos terapéuticos relacionados con Vif tal como se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 06/111866. De esta manera, en una forma de realización particular, la presente invención se refiere al método anteriormente indicado para el análisis de la eficacia de un fármaco antivírico conocido.

Aunque se conocen varias maneras en la técnica para detectar la formación, estabilidad y constantes de unión de los complejos, en ausencia y en presencia de un potencial compuesto modulador, y algunos métodos populares tales como la calorimetría isotérmica, la espectroscopía de resonancia de plasmón superficial, técnicas de fluorescencia y espectroscopía de RMN utilizados para las investigaciones respectivas y que también pueden utilizarse en la presente invención, una desventaja de los métodos anteriormente indicados es su necesidad de un montaje experimental amplio y caros equipos. Por lo tanto, en una forma de realización preferida de la presente invención, la formación y/o estabilidad del complejo se somete a ensayo en un experimento de precipitación de GST seguido de un análisis de gel SDS, que se describe en detalle en el Ejemplo 3. El rendimiento del SDS-PAGE es conocido por el experto en la materia y se encuentra bien descrito en los libros de texto pertinentes, tales como las ediciones actuales de Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) Para el ensayo de compuestos farmacéuticos y fármacos conocidos para su efecto antivírico real se hace referencia generalmente al libro de texto estándar "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997.

Según el método de la presente invención, se evalúa un compuesto o colección de compuestos como capaz de modular la formación de un complejo en el caso de que resulte obstaculizado o reducido, en presencia de dicho compuesto o colección de compuestos en comparación con un control en el que no se añade el compuesto. Lo mismo es de aplicación evidentemente al someter a ensayo la estabilidad y constante de unión del complejo, en el que se evalúa si un compuesto es capaz de modular la estabilidad del compuesto al debilitarse (reducirse) dicha estabilidad en presencia de dicho compuesto en comparación con un control en el que no se añade compuesto. En general, según la presente invención, la reducción de la formación o estabilidad de los complejos en comparación con la realización del método sin el compuesto de ensayo es indicativa de un putativo agente terapéutico (fármaco) futuro. El fármaco identificado de esta manera puede introducirse adicionalmente en cualquier ensayo estándar para someter a ensayo su efecto sobre el ciclo vital del VIH, es decir, por ejemplo la replicación y multiplicación víricas. A continuación, se selecciona el fármaco que preferentemente rescate y/o proporcione resistencia frente a trastornos mediados por una infección por VIH.

A partir de lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona varias proteínas huésped identificadas por primera vez que unen con Vif y con los complejos del mismo la proteína del VIH, es decir, dianas viables para el cribado de compuestos que se espera que interfieran con el ciclo vital del VIH y que de esta manera son muy prometedores como terapéuticos potenciales que alivien enfermedades víricas, preferentemente enfermedades lentivíricas tales como el SIDA. Los compuestos según la presente invención pueden comprender cualquier sustancia que muestre el efecto deseado, es decir, capaz de interferir en la interacción de Vif con una proteína huésped mediante efectos sobre Vif, la proteína huésped o la interacción entre los mismos. Entre dichos compuestos incluyen péptidos, polipéptidos, APN, miméticos de péptidos, anticuerpos, moléculas de ácidos nucleicos, aptámeros o compuestos orgánicos pequeños, naturales o preparados sintéticamente de manera no limitativa.

Tras la identificación de un compuesto potencial, pueden seleccionarse adicionalmente análogos químicos de entre una biblioteca de compuestos químicos, tales como los disponibles comercialmente de la mayoría de grandes compañías químicas, entre ellas Merck, GlaxoWelcome, Bristol Meyers Squib, Monsanto/Searle, Eli Lilly, Novartis y Pharmacia UpJohn, o alternativamente sintetizarse de novo. La síntesis de dichos compuestos potenciales es conocida por el experto en la materia.

Aunque los compuestos que pueden identificarse mediante el método anteriormente indicado que son capaces de afectar a la interacción de Vif con su molécula de interacción, tal como una proteína huésped (humana), no se encuentran limitados, en una forma de realización preferida de la presente invención, el compuesto se selecciona de entre el grupo constituido por anticuerpos, proteínas, péptidos y aptámeros, y preferentemente es un péptido. En una forma de realización preferida adicional de la presente invención, el péptido se obtiene a partir de la proteína diana del VIH o a partir de la proteína humana y está constituido preferentemente por aproximadamente 10 a 20 aminoácidos.

También pueden obtenerse péptidos adecuados mediante el método para detectar particularmente interacciones de proteína-péptidos in vivo y aislando la pareja o parejas de interacción respectivas, tal como da a conocer el solicitante en la solicitud de patente europea en trámite EP 06 018 227.1, "Means and methods for detecting proteinpeptide interactions" (expediente del cesionario nº CA18A04/P-EP), presentada el 31 de agosto de 2006, y su posterior solicitud de patente internacional presentada el 31 de agosto de 2007. Sin embargo, evidentemente también se encuentran comprendidos péptidos sintéticos, por ejemplo derivados de proteínas identificadas según el método de la presente invención, y pueden prepararse utilizando las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o técnicas de condensación de péptidos, o cualquier combinación de los ismos. Pueden incluir aminoácidos naturales o no naturales. Los péptidos útiles pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de Daminoácidos y L-aminoácidos, y diversos aminoácidos "de diseño" (por ejemplo aminoácidos $ -metilo, aminoácidos Ca-metilo y aminoácidos Na-metilo, etc.) para transmitir propiedades especiales. Tal como se ha mencionado anteriormente en relación a las proteínas derivadas de las identificadas según el método de la presente invención, pero que comprenden una secuencia de aminoácidos modificada, también pueden utilizarse péptidos para la identificación de las regiones de unión o secuencia de aminoácidos mínima necesaria para formar el complejo respectivo. Según la presente invención, preferentemente los péptidos utilizados para la identificación de dominios de interacción de las proteínas determinadas como de unión a Vif y tal como se describe en detalle en el Ejemplo 4, se prepararon tal como se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 05/111061.

Además, aparte de los compuestos nuevamente identificados, la presente invención también contempla la validación de compuestos o agentes que es conocido que se unen a cualquiera de las proteínas de interacción con Vif, identificadas según el método de la presente invención pero que hasta el momento no se han considerado útiles en el tratamiento de enfermedades víricas, en particular enfermedades lentivíricas tales como el SIDA. Dichos compuestos pueden obtenerse fácilmente a partir de la literatura referente a cualquiera de las proteínas de interacción con Vif, por ejemplo en bases de datos de patentes, tales como "espacenet", de la oficina europea de patentes o en bases de datos de literatura públicas, por ejemplo "Medline". Además, el experto en la materia podrá identificar compuestos que deban utilizarse según la presente invención mediante el cribado de las denominadas "bases de datos primarias", tales como "Genbank", "EMBL" o "UniprotKB/Swiss-Prot" para secuencias de nucleótidos y de proteínas, respectivamente, por ejemplo mediante la introducción del número de acceso o la nomenclatura IUPAC o el nombre de la proteína. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos en las bases de datos indicadas habitualmente se anotan con citaciones correspondientes que, a su vez, proporcionar información adicional sobre la regulación de los genes correspondientes y, de esta manera, proporcionan guías sobre los agentes moduladores que deben utilizarse según la presente invención. Además, pueden utilizarse las denominadas "bases de datos secundarias", por ejemplo "PROSITE", "PRINTS", "Pfam", "INTER Pro", "SCOP" o "CATH", que son bases de datos de familias y dominios de proteínas, que proporcionan huellas digitales como clasificación de secuencias o estructuras de proteínas. Una interfaz muy adecuada en Internet que permite iniciar búsquedas es "Entrez" de la NCBI y el sistema de obtención de secuencias "SRS". Con frecuencia una búsqueda con palabras clave en "Google" ya resultará suficiente para identificar las fuentes de información adecuadas.

Para el método de cribado de la presente invención, la proteína diana, la proteína huésped o el compuesto capaces de afectar a la interacción pueden fijarse a una superficie sólida. Un modo de aplicar el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, unir la proteína diana (Vif) a un soporte sólido que seguidamente se lava para eliminar el exceso de proteína diana que no se encuentra unido. A continuación, se pone en contacto el soporte, y de esta manera se expone Vif, por ejemplo con una proteína candidata marcada que debe someterse a ensayo para la interacción, o un compuesto de ensayo. A continuación, el soporte sólido se lava nuevamente para eliminar la proteína o compuesto no unido a la proteína diana y seguidamente la cantidad que queda en el soporte sólido, identificada de esta manera como unida a Vif, puede ser determinada. Alternativamente, o adicionalmente, puede identificarse, por ejemplo, la constante de disociación entre el compuesto marcado y Vif. Los marcajes adecuados para Vif, la proteína candidata o el compuesto son bien conocidos del a técnica y entre ellos se incluyen enzimas, fluoróforos (por ejemplo isotiocianato de fluoresceno (FITC), ficoeritrina (PE), rojo de Texas (TR), rodamina, sales de la serie de los lantánidos libres o queladas, especialmente Eu3+, entre otros fluoróforos), cromóforos, isótopos radioactivos, tales como 35S, agentes quelantes, pigmentos, oro coloidal, partículas de látex, ligandos (por ejemplo biotina) y agentes quimioluminiscentes.

Por lo tanto, en una forma de realización preferida adicional del método de la presente invención, la proteína diana del VIH, la proteína humana o el compuesto que debe cribarse se disponen sobre un soporte sólido, preferentemente en donde el soporte sólido es una matriz o chip, tal como un microchip o una micromatriz. En este contexto, la presente invención naturalmente también se refiere a un chip o matriz para la utilización en los métodos de la presente invención.

Los métodos para unir, por ejemplo, proteínas a un soporte sólido son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo, unir una etiqueta a una proteína diana. Según el método de la presente invención, y descrito en detalle en el ejemplo 3, la etiqueta es, por ejemplo, glutatión-S-transferasa (GST) y la proteína diana es Vif, preferentemente, en donde Vif se expresa como la correspondiente proteína de fusión Vif-GST. Además, se proporciona un soporte sólido y matriz respectivos, tales como perlas de glutatión (GSH)-agarosa. Tras la puesta en contacto de Vif etiquetado con GST al soporte sólido y lavado posterior para eliminar las especies no reaccionadas, Vif se une al soporte mediante la interacción glutatión-GST. Existen varias maneras adicionales de unir la proteína a un soporte sólido, tales como unir biotina a Vif y unir avidina al soporte sólido. Se encuentra comprendido dentro de los conocimientos generales del experto en la materia que la elección de la manera más adecuada de unir la proteína al soporte sólido puede depender de las características individuales del ensayo que debe llevarse a cabo y del diseño experimental.

Sin embargo, en una forma de realización preferida particular del método de la presente invención para cribar compuestos, capaz de modular la formación de complejos y/o la estabilidad de los mismos, la proteína de diana del VIH es una proteína de fusión que comprende glutatión-S-transferasa y preferentemente la proteína humana se marca con metionina-35S.

En una forma de realización todavía más preferente de la presente invención, la formación de complejo resulta de la interacción proteína-proteína en un sistema celular de dos o tres híbridos.

Aunque el ensayo anteriormente indicado se ha descrito a título de ejemplo para la proteína diana (Vif) que se unirá al soporte sólido, el experto en la materia conocerá que dicho ensayo evidentemente podrá llevarse a cabo en sentido contrario, es decir, uniendo, por ejemplo, la proteína candidata al soporte sólido.

Al aplicar métodos de cribado, con frecuencia se pretende cribar para una diversidad de compuestos en un experimento. Por lo tanto, los métodos de la presente invención pueden diseñarse de manera general en un formato para utilizar en un laboratorio convencional o adaptarse para el cribado de alto rendimiento. En este contexto, la expresión "cribado de alto rendimiento" (HTS) se refiere a un diseño de ensayo que permite el fácil análisis de múltiples muestras simultáneamente y la capacidad de manipulación robotizada. Otra característica deseada de los ensayos de alto rendimiento en un diseño de ensayo optimizado para reducir el uso de reactivos, o que minimiza el número de manipulaciones para llevar a cabo el análisis deseado.

Además de la detección e identificación de proteínas que forman un complejo con Vif, así como compuestos capaces de afectar a la formación y/o estabilidad de dicho complejo, una cuestión importante se refiere a la "naturaleza" del complejo, en particular del complejo según la presente invención, es decir, formado entre factor vírico y factor del huésped. Debido a que, concretamente, al considerar enfoques terapéuticos, el complejo mismo puede considerarse una diana farmacológica, resulta necesario conocer las características del complejo respectivo para desarrollar agentes terapéuticos y terapias. Las características típicas de un complejo comprenden características físicas o estructurales, tales como estabilidad, tipo, tamaño (complejo multimérico o monomérico), forma y estructura tridimensional, aunque también propiedades biológicas, tales como la composición de aminoácidos de la región de unión o el tipo de interacciones en la región de unión, así como el impacto de la formación de complejo sobre, por ejemplo, la generación de sitios de unión adicionales no disponibles en los componentes individuales del complejo. La generación de estos sitios de unión alternativos puede deberse, por ejemplo, a un cambio conformacional de por lo menos un componente del complejo durante la formación del mismo

o la falta anterior de sitios de unión de los componentes individuales del complejo debido a la ocupación de dicho sitio por la pareja del complejo o por reorganización conformacional, conduciendo de esta manera a la desaparición de los sitios de unión anteriores. Además, puede ser importante conocer la duración de vida de un complejo, lo que depende de diversos parámetros conocidos de la técnica, tales como la concentración de sales, el valor del pH y similares. Además, las propiedades químicas, magnéticas o electrostáticas pueden resultar de interés, por ejemplo el tipo de interacción por la que se mantiene unido el complejo, tal como enlaces de hidrógeno, así como la carga superficial del complejo.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el conocimiento de las características anteriormente indicadas a título de ejemplo es importante para predecir, por ejemplo, el comportamiento del complejo o potenciales regiones de unión (en particular para agentes capaces de modular la formación y/o estabilidad del complejo) y las dianas del fármaco. Por lo tanto, el conocimiento de las propiedades del complejo proporciona información necesaria durante la consideración de cómo afecta el complejo respectivo para diversos fines, tales como su destrucción o la prevención de su formación. Tal como conocerá el experto en la materia, existen varias maneras de preparar, detectar y analizar un complejo respectivo. Entre dichos métodos pueden incluirse procedimientos de formación de complejos de proteínas utilizando sistemas in vitro e in vivo, que pueden adaptarse a la presente invención. Por ejemplo, los métodos pueden comprender la síntesis y aislamiento de la primera proteína Vif y la segunda proteína seleccionada de entre el grupo de proteínas de la célula huésped y la formación de complejos de proteínas utilizando métodos in vitro bien conocidos. Alternativamente, los complejos de proteínas también pueden aislarse o purificarse a partir de tejidos o células o producirse mediante expresión recombinante de sus componentes proteicos. El método particular que se utilizará depende del tipo de complejo, del propósito de la investigación, así como de parámetros experimentales individuales.

Sin embargo, en una forma de realización particular, la presente invención proporciona un método para preparar, detectar y analizar el complejo de la presente invención y definido anteriormente, comprendiendo las etapas siguientes:

(a)

sintetizar y/o aislar la proteína del VIH,

(b)

sintetizar y/o aislar la proteína humana,

(c)

poner en contacto las proteínas de (a) y (b),

(d)

monitorizar la formación de complejo, y opcionalmente

(e)

determinar las características del complejo (estabilidad y cinética) mediante métodos in vitro conocidos.

En todavía otra forma de realización, la presente solicitud da a conocer una composición diagnóstica que comprende el ácido nucleico, el vector, la célula huésped recombinante, la proteína, el complejo, el anticuerpo, el compuesto y/o el chip o matriz de la presente invención.

Tal como se ha mencionado anteriormente, tras identificar que un compuesto según la presente invención interfiere en la formación y/o estabilidad de los complejos, se considera que podría ser una herramienta terapéutica prometedora y por lo tanto que podría utilizarse para desarrollar un agente terapéutico, fármaco y medicamento. Dicho fármaco preferentemente es capaz de impedir la formación de complejo o de romper los complejos ya formados o por lo menos reducir la estabilidad de los mismos y, por lo tanto, de inhibir el acceso del virus y el efecto vírico sobre la maquinaria celular del huésped. Sin embargo, en el caso de que se bloquee el acceso vírico, en consecuencia la replicación vírica, se impide o se cree que por lo menos se reduce en gran medida, la multiplicación, extensión y aparición de la enfermedad vírica, tal como SIDA. Además, la maquinaria celular del huésped se mantiene "en funcionamiento" para el huésped únicamente y se previene su abuso por parte del virus.

En una forma de realización adicional, la presente invención también se refiere a un kit o sistema de ensayo para la utilización en los métodos de la presente invención, comprendiendo dicho kit o sistema de ensayo un componente de la presente invención tal como se ha descrito anteriormente y/o reactivos, herramientas de automatización, dispositivos de almacenamiento, robots de manipulación de líquidos, disposiciones de monitorización o similares. En particular, la presente invención se refiere a un kit para la utilización en cualquiera de los métodos indicados anteriormente, es decir, para identificar, clonar, preparar, cribar, seguir, determinar, someter a ensayo, analizar y/o utilizar las moléculas de ácidos nucleicos, proteínas, compuestos, complejos y formación de complejos, respectivamente, o composiciones de la presente invención. Por lo tanto, dicho kit preferentemente comprende los componentes esenciales, tales como la proteína diana (Vif), una o más proteínas candidatas (del huésped) o fragmentos de las mismas, o moléculas recombinantes de ácidos nucleicos codificantes de dichas proteínas (Vif, proteína candidata o fragmento de la misma), más preferentemente en forma de una primera y segunda moléculas expresables correspondientes de ácidos nucleicos. Todavía más moléculas expresables de ácidos nucleicos se encuentran presentes en un vector de expresión adecuado para las células particulares en las que se lleva a cabo el ensayo de interacción. Los vectores de expresión apropiados pueden ser, por ejemplo, vectores de expresión levaduras o vectores de expresión células de mamífero, dependiendo de las células en las que debe aplicarse el método.

Si se desea, el kit contiene además reactivos, por ejemplo que resultan en una eficiencia de transfección óptima de los ácidos nucleicos para el tipo de célula huésped particular. Además, pueden incluirse células huésped apropiadas en un kit, aunque estas células generalmente se encuentren disponibles o pueden seleccionarse para una forma de realización particular del método. Preferentemente, el kit de la presente invención contiene reactivos tales como los indicados anteriormente en la presente memoria, que resultan útiles para llevar a cabo cualquiera de los métodos anteriormente indicados de la presente invención, comprendiendo, por ejemplo, marcadores seleccionables, un medio o componentes de medios, muestras de referencia, micromatrices, recipientes de cultivo, vectores, proteínas, péptidos y quizá unos medios de detección adecuados, dispositivos espectroscópicos y/o sistemas de monitorización, capaces de monitorizar la formación de complejo, es decir, la reducción o incremento de la formación de complejo de Vif (opcionalmente etiquetado) and la molécula o moléculas de interacción de la misma, tal como proteína o proteínas huésped (opcionalmente etiquetadas). Además, puede detectarse una capacidad incrementada

o reducida de unión comparado con un control mediante, por ejemplo, marcajes, comprendiendo un marcaje fluorescente, un marcaje fosforescente, un marcaje radioactivos, que son conocidos por el experto en la materia. Opcionalmente, el kit comprende además instrucciones sobre cómo llevar a cabo cualquier método de la presente invención, preferentemente la utilización del kit en los métodos referentes a la identificación y/o clonación de moléculas de ácidos nucleicos codificantes de molécula de interacción de Vif o la validación o evaluación de fármacos, agentes, composiciones o compuestos que potencialmente influyan (inhibiendo o potenciando) sobre dicha interacción. Dichas instrucciones pueden proporcionarse para detallar la utilización de los componentes del kit, tales como instrucciones escritas, presentaciones en vídeo o instrucciones en un formato que pueda ser abierto en un ordenador, por ejemplo un disquete o un disco CD-ROM.

Además, este tipo de kit típicamente comprende un portador compartimentado adecuado para alojar herméticamente por lo menos un recipiente y los compuestos del kit, que pueden ser estériles, en su caso. El kit puede incluir además un medio de transferencia, tal como pipetas, para transferir cualquier componente fluido. El kit de la presente invención preferentemente resulta adecuado para la fabricación y escala comerciales y todavía puede incluir además estándares apropiados, y controles positivos y negativos.

Debe apreciarse que las formas de realización tal como se describe en cualquiera de los ejemplos pueden utilizarse independientemente y combinarse con cualquiera de las formas de realización descritas anteriormente en la presente memoria. De esta manera, se dan a conocer dicha forma de realización y otras, y se encuentran comprendidas en la descripción y ejemplos de la presente solicitud. Puede obtenerse de bibliotecas y bases de datos públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos, literatura adicional referente a cualquiera de los materiales, métodos, usos y compuestos que deben utilizarse según la presente invención. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos pública "Medline", alojada en el National Center for Biotechnology Information, y/o la biblioteca nacional de medicina del National Institutes of Health. El experto en la materia conocerá bases de datos y sitios de Internet adicionales, tales como los del European Bioinformatics Institute (EBI), que forma parte del European Molecular Biology Laboratory (EMBL), y también pueden obtenerse utilizando motores de búsqueda en Internet. Se proporciona una visión general de la información de patentes en biotecnología y un estudio de las fuentes relevantes de información de patentes que resulta útil para las búsquedas retrospectivas y para obtener los conocimientos actuales, en Berks, TIBTECH 12:352-364, 1994.

Se citan varios documentos a lo largo de la presente memoria. Pueden encontrarse las citas bibliográficas completas al final de la memoria, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

La exposición anteriormente proporcionada describe de manera general la presente invención. Puede obtenerse una comprensión más completa haciendo referencia a los ejemplos específicos siguientes, que se proporcionan en la presente memoria únicamente a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención, pero no debe interpretarse que limitan el alcance de la invención en modo alguno. Pueden encontrarse descripciones detalladas de métodos convencionales, tales como los utilizados en la presente invención, en la literatura citada; ver también "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", decimoséptima edición, editado por Beers y Berkow (Merck & Co., Inc., 2003).

La práctica de la presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran comprendidas dentro de los conocimientos de la técnica.

Los métodos de genética molecular e ingeniería genética se describen de manera general en las ediciones actuales de Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, volúmenes I y II (editor: Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (editor: Gait, 1984); Nucleic Acid Hybridization (editores: Hames y Higgins, 1984); Transcription And Translation (editores: Hames y Higgins, 1984); Culture of Animal Cells (Freshney y Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (editores: Miller y Calos); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición (editores: Ausubel et al.); y Recombinant DNA Methodology (editor: Wu, Academic Press); Gene Transfer Vectores For Mammalian Cells (editores: Miller y Calos, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987); Methods in Enzymology, vols. 154 y 155 (editores: Wu et al.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (editores: Mayer y Walker, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (editores: Weir y Blackwell, 1986). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en la presente exposición se encuentran disponibles en proveedores comerciales, tales como BioRad, Stratagene, Invitrogen y Clontech. Las técnicas generales de cultivo celular y recolección de medios se describen de manera general en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148, 1997); medios libres de suero (Kitano, Biotechnology 17:73, 1991); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2:375, 1991); y Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19:251, 1990); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et al., CHAOS 11:98-107, 2001.

Ejemplo 1: Identificación de nuevas moléculas de interacción con Vif

El ejemplo muestra la identificación de complejos de proteínas de un Vif de VIH recombinante (SEC ID nº 2) con nuevos polipéptidos humanos codificados por una biblioteca de ADNc de timo (biblioteca de ADNc de timo humano CytoTrap® XR, Stratagene).

Construcción de cebo

Se clonó el ADNc de Vif NL4-3 en un vector apropiado para la expresión de proteínas heterólogas en levaduras (pADH-Sos-2xSpc, modificado a partir del vector pSos (Sikorski y Hieter, Genetics 122:19-27, 1989) en forma de una proteína de fusión con Sos que incluía un pequeño espaciador (SEC ID nº 3). El ADNc de Vif se amplificó mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con el cebador Vif/RsrII (5'ttttCGGACCGGAAAACAGATGGCAGGTGATG-3', SEC ID nº 37) y Vif/NotI (5' aaatatGCGGCCGCCTATCTGGGGCTTGTTCCATCTG-3', SEC ID nº 38). Tras la digestión de restricción con RsrIi y NotI, se clonó el producto de PCR de Vif en pADH-Sos-2xSpc igualmente digerido, resultando en que pADH-Sos2xSpc-Vif expresó la proteína de fusión Sos aminoterminal, ver la fig. 5.

Amplificación de biblioteca

Se llevó a cabo la transformación de una biblioteca con E. coli (células ultracompetentes XL10-Gold®, Stratagene) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la amplificación de la biblioteca, se requirieron 1x107 clones individuales para garantizar que la mayoría de los ADNc se encontrase representado en la biblioteca de ADNc amplificada. Por lo tanto, se utilizaron placas de Petri de 160 mm para la amplificación de la biblioteca. En cada placa de Petri pueden crecer aproximadamente 5x104 unidades formadoras de colonia (ufc). El título de la biblioteca de ADNc de timo obtenida era de 2,6x106 E. coli por cada μl. Las placas se inocularon con 0,20 μl de la cepa de biblioteca de E. coli para alcanzar el número deseado de cfu.

Se descongeló la cepa de E. coli de la biblioteca. Tras descongelar la suspensión de E. coli, se agitó suavemente y se diluyeron 41 μl 1:25 con medio LB (LB al 2,5% (p/v), Miller). Antes de la inoculación de las placas de LBcloranfenicol (agar LB-cloranfenicol:agar LB suplementado con 1 ml de cloranfenicol filtrado a esterilidad a una concentración de 30 μg ml-1), se añadieron 100 μl de medio LB a cada placa para una mejor distribución de la cepa de E. coli añadida posteriormente. A continuación, se añadieron 5 μl de la cepa de E. coli de la biblioteca diluida a cada placa de Petri y se distribuyeron con ayuda de perlas de vidrio autoclavadas (2,85 a 3,3 mm, Roth). Tras incubar durante la noche a 37ºC, se rasparon las colonias de E. coli de las placas con ayuda de una espátula de goma.

Se transfirieron los E. coli de 10 placas a un tubo de centrífuga de 50 ml y se resuspendieron cuidadosamente en 50 ml de medio LB-cloranfenicol. A continuación, se transfirió el contenido de cinco de dichos tubos de centrífuga a un vaso de centrifugación estéril de 500 ml y se centrifugó durante 15 minutos (a 4ºC, 6.000 rpm (JA-10)). Se descartó el sobrenadante y se determinó el peso del sedimento celular. Se resuspendió el sedimento en 20 ml de tampón STE helado (NaCl 0,1 M, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) que contenía glicerol al 10%. Al final, se transfirió el volumen apropiado que contenía 3 gramos de sedimento celular de E. coli a un criotubo de 10 ml y se almacenó a -80ºC. Se generaron cuatro grupos de ADNc de timo a partir de cada agrupado de 50 placas de Petri. Para el aislamiento del plásmido se utilizó el kit AX2000 (Macherey-Nagel).

Transformación de levaduras

La transformación de las células de levadura cdc25-2 (MATa, ura3, lys2, Leu2, trpl cdc25-2, his3L200, ade100, GAL+) se llevó a cabo según el protocolo modificado para un método de transformación de alta eficiencia de Schietl y Gietz (1989). Para la preparación de células de levadura competentes, se inocularon 10 ml de medio YEPD con células de levadura cdc25-2 y se incubaron durante la noche a 24ºC. Se utilizó un volumen apropiado del cultivo de durante la noche para inocular 50 ml de medio YEPD y obtener una DO600 de 0,2. Tras la incubación a 24ºC (hasta alcanzar una DO600~0,8), se sedimentó el cultivo (1.000 g, 5 minutos, temperatura ambiente), se lavó el sedimento con ddH2O estéril y se centrifugó tal como se ha indicado anteriormente. A continuación, se resuspendió el sedimento en 10 ml de LiSORB (acetato de litio 100 mM, D-sorbitol 1 M en Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5, esterilizado mediante filtración) y se sedimentó nuevamente. El sedimento se resuspendió en 50 μl de LiSORB por cada transformación (máximo: 500 μl). Las células se utilizaron directamente para la transformación.

Para la preparación de la mezcla de ADN portador, se sometieron a ebullición a 95ºC durante 5 minutos 10 μl de ADN portador fragmentado (ADN de esperma de salmón 10 mg ml-1 en tampón TE) por cada transformación. A continuación, se mezcló el ADN portador con 40 μl de LiSORB por cada transformación y se dejó sobre hielo para que se enfriase hasta la temperatura ambiente.

Para la transformación misma, se mezclaron 0,5 a 1 μg de plásmido de ADN, 50 μl de mezcla de ADN portador y 50 μl de células de levadura competentes. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 24ºC bajo agitación. Se añadieron 900 μl de LiPEG (acetato de litio 100 mM (pH 7,5), PEG4000 al 40% (p/v) en Tris 10 mM, EDTA 1 mM (pH 7,5), esterilizado mediante filtración) a cada muestra y se incubó nuevamente a 24ºC bajo agitación durante 30 minutos. Se añadieron 100 μl de DMSO y las células se sometieron a choque térmico durante 7 minutos a 42ºC sin agitación. Las células se sedimentaron (1 minuto, 1.000 g) y se resuspendieron en 100 μl de sorbitol 1 M (esterilizado mediante filtración). Se inocularon 50 μl de la suspensión en una placa de selección apropiada y se incubaron a 24ºC. Aparecieron colonias tras 4 a 6 días.

Cribado de la biblioteca

Se transformó la biblioteca de timo mediante transformación a gran escala (Schiestl y Gietz, 1995) en la cepa de cebo. Se generó una cepa de cebo mediante transformación de la cepa cdc25-2 con el plásmido pADH-SOS-2xSpcvif tal como se ha indicado anteriormente. Se utilizó un cultivo fresco de cepa de cebo (600 ml con una DO de 1,0) para la transformación de 70 μg de plásmido de ADN de la biblioteca tal como se ha indicado anteriormente y se sembró en placas de 160 mm con Leu-Ura-glucosa+. La incubación durante 3 a 4 días a 24ºC resultó en aproximadamente 30.000 transformadas en cada placa. Para la selección de los clones que expresaban las proteínas que interactuaban con Vif, se sembraron réplicas de placas con los transformantes en filtros de membrana sobre placas de Leu-Ura-galactosa+ y se cultivaron a 37ºC durante 4 a 10 días.

Se recolectaron las colonias que aparecieron, se resuspendieron en 200 μl de medio Leu-Ura-glucosa+ y se incubaron a 24ºC durante la noche. Para explorar la posibilidad de que el crecimiento de los candidatos de interacción putativos a 37ºC dependiese de la expresión de las proteínas presa, los clones se sembraron en placas leu-ura-galactosa+, así como en placas leu-ura-glucosa+ tras la incubación a 37ºC durante 5 a 7 días. La expresión de las proteínas de fusión de interacción con Vif se encuentra bajo el control del promotor inducible GAL1 del plásmido de biblioteca. Por lo tanto, la expresión resultó inducida por la adición de galactosa al medio (galactosa al 3% y rafinosa al 2%) y, sin embargo, resultó reprimida por la adición de glucosa. Las células de levadura que expresaban proteínas de interacción con Vif de la biblioteca de timo crecían únicamente en las placas con galactosa (galactosa al 3%, rafinosa al 2%) pero no crecían en las placas con glucosa, ver la fig. 1.

Aislamiento de plásmidos que comprenden una proteína codificada de interacción con Vif

Se aislaron plásmidos siguiendo el protocolo de Michael Jones utilizando el kit miniprep QIAprep® Spin (www.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf). Se inoculó una única colonia de levadura en 5 ml de medio Uraglucosa+ y se cultivó a 24ºC durante 24 horas bajo agitación. Se recolectaron las células mediante centrifugación durante 5 minutos a 5.000xg y se resuspendieron en 250 μl de tampón P1 (Qiagen) que contenía 0,1 mg/ml de ARNasa A (Qiagen). La suspensión celular se transfirió a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 ml. Para la disrupción, se añadieron 50 a 100 μl de perlas de vidrio lavadas con ácido (Sigma) y la suspensión se agitó con vórtex durante 5 minutos. Tras sedimentar las perlas, se transfirió el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo. A continuación, se añadieron 250 μl de tampón de lisis P2 (Qiagen) al tubo, se invirtió el tubo 4 a 6 veces y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Tas la incubación, se añadieron 350 μl de tampón de neutralización N3 (Qiagen) al tubo y se invirtió el tubo inmediatamente pero suavemente 4 a 6 veces. Se centrifugó el lisado a 15.000xg durante 10 minutos. Seguidamente, el lisado clarificado se transfirió a una columna de centrifugación QIAprep y se centrifugó durante 1 minuto a 15.000xg. La columna se lavó mediante la adición de 0,75 ml de tampón PE (Qiagen) y centrifugación durante 1 minuto a 15.000xg. La elución del ADN se llevó a cabo mediante la adición de 25 μl de EB (Qiagen) al centro de la columna de centrifugación QIAprep. Tras 1 minuto de incubación, se obtuvo el eluido mediante centrifugación durante 1 minuto a 15.000xg. La posterior transformación en

E. coli competentes por adición de CaCl2 se llevó a cabo con 10 μl de eluido. Las bacterias se sembraron en placas de LB que contenían 50 μg/ml de cloranfenicol. Los plásmidos presa se aislaron a partir de las E. coli y se analizaron mediante digestión de restricción EcoRI/XhoI, la cual libera la inserción.

Ejemplo 2: Detección de complejos de proteína Vif en células de levadura

El presente ejemplo demuestra que la invención también resulta útil para la detección de complejos de proteínas específicos en levaduras mediante la expresión de una proteína de fusión de Vif y proteínas de fusión de los factores del huésped identificados.

Para la identificación de los "interactores positivos" identificados en el Ejemplo 1, se aisló a partir de las células el ADN de la secuencia correspondiente de la biblioteca.

Además de la identificación de las nuevas proteínas de interacción con Vif, se sometió a ensayo esta interacción para su especificidad, es decir, para la dependencia de la interacción proteína-proteína respecto de la expresión de la primera proteína de fusión (el cebo), siendo Vif la proteína diana. Por lo tanto, no sólo se introdujo el plásmido de biblioteca aislado de las proteínas de interacción con Vif en la cepa de levadura que contenía el vector pADH-Sos2xSpc-Vif que comprendía la primera proteína de fusión codificada, es decir con Vif como proteína diana, sino también se introdujo adicionalmente en la cepa cdc25-2 de levadura que contenía el vector cebo heterólogo pADH-Sos-2xSpc-cJun a modo de control que comprendía una proteína de fusión, proporcionando cJun como proteína diana "de control negativo". Tal como se ha indicado anteriormente, las células se sembraron en placas con YNB-Leu, -Ura y glucosa y se incubaron a 24ºC. Los clones de cada ensayo de transformación se suspendieron en medio líquido y se transfirieron a un juego de placas con galactosa y dos juegos de placas con glucosa (cada uno Ura-Leu-), respectivamente, y se incubaron a 37ºC. En las placas con galactosa, se sometió a ensayo la dependencia de la interacción a parir de la expresión de la proteína presa, la cual se encuentra bajo el control de un promotor inducible con galactosa. Las placas con glucosa, incubadas a 37ºC, se utilizaron para someter a ensayo el crecimiento potencial de revertientes. El juego de placas con glucosa, incubado a 24ºC, se utilizó como control general del crecimiento. El vector de control (que proporcionaba la proteína diana "de control negativo") a la temperatura restrictiva de 37ºC indicaba la especificidad de unión de los nuevos interactores celulares del huésped identificados para el constructo de cebo pADH-Sos-2xSpc, debido a que no se producía crecimiento de células que contenían los nuevos factores del huésped identificados en combinación con el constructo no relevante pADH-Sos2xSpc-cJun, ver la fig. 2. Tras demostrar la especificidad de las proteínas de interacción del huésped para la unión a Vif, Se secuenció el ADN de la secuencia de biblioteca correspondiente.

Ejemplo 3: Formación de complejos de proteína Vif del VIH in vitro (precipitación con GST)

Vectores de Vif

Se amplificó el gen de longitud completa de Vif de pNL4.3 mediante PCR utilizando los cebadores Vif/Bam (5'-CGCGGATCCACCATGGAAAACAGATGGCAGGTGATG-3', SEC ID nº 39) y Vif/Xho (5'CCGCTCGAGCTAGTGACCATTCATTGTATG-3', SEC ID nº 40). El ADN de Vif amplificado por PCR se cortó con BamHI/XhoI y se subclonó en el vector de expresión pGEX-4T2 digerido con BamHI/XhoI (Amersham PharmaciaBiotech), resultando en pGEX-4T2-Vif, que contenía un marco de lectura abierto de la fusión GST-Vif, ver la fig. 4.

Expresión y purificación de GST-Vif

Se llevó a cabo la expresión y purificación de GST-Vif según un protocolo modificado de Hassaine et al., J. Biol. Chem. 276:16885-16893, 2001. Por lo tanto, se cultivó a 30ºC E. coli BL21 RP Codón-Plus (Stratagene) transformado con el plásmido pGEX-4T2-Vif. Se indujo la expresión de proteínas a una DO a 600 nm de 0,5-0,7 con isopropil-b-D-tiogalactopiranósido 0,1 mM durante 3 horas a 30ºC. Se centrifugaron las bacterias a 5.000xg durante 15 minutos y el sedimento se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía inhibidor de proteasa (Roche) y lisozima (1 mg/ml). Las bacterias se lisaron mediante sonicación (3x30 s) sobre hielo y el lisado se incubó durante 30 minutos a 4ºC en presencia de Triton X-100 al 1% bajo agitación. El material insoluble se peletizó durante 40 minutos a 14.000xg, y el sobrenadante se incubó durante la noche a 4ºC con perlas de glutatiónagarosa al 50% (v/v) (Amersham). Tras tres lavados en NaCl 0,5 M en PBS, las proteínas de fusión con GST inmovilizadas en perlas de agarosa Gush se cuantificaron mediante electroforesis de una alícuota en un gel de dodecilsulfato sódico (SDS)-poliacrilamida al 12% con tinción posterior del gel con azul brillante de Coomassie.

Formación in vitro de complejos de proteínas

Las proteínas marcadas radioactivamente de los candidatos de interacción se generaron mediante transcripcióntraducción in vitro acopladas (sistema TNT T7 de lisado de reticulocitos acoplado, Promega) en presencia de 35S

(1.000 Ci/mmol, Amersham Pharmacia Biotech) siguiendo la recomendación del fabricante, utilizando el plásmido de biblioteca correspondiente como molde. Se incubó 1/5 del extracto de proteínas traducidas con GST-Vif unido a perlas de agarosa.

Para un experimento de unión, se utilizó proteína Vif correspondiente a 40 ml de células BL21 que expresaban Vif en forma de proteína de fusión con GST. Los protocolos de purificación han sido descritos anteriormente.

Se llevó a cabo la unión de los candidatos de interacción a Vif bajo agitación durante una hora a temperatura ambiente en tampón de unión que contenía NaCl 20 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, NP40 al 0,5% y albúmina de suero bovino 100 μg/ml. Tras la incubación, se peletizaron las perlas mediante centrifugación a 500xg durante 2 minutos y se realizaron 4 etapas de lavado a continuación con 1 ml de tampón de lavado (tampón de unión sin albúmina sérica). Las proteínas se eluyeron con 30 μl de tampón para muestras SDS y la mitad del eluido se analizó mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) seguido de autorradiografía, ver la fig. 3a-c.

Ejemplo 4: Identificación de los dominios de interacción

Para la identificación de los dominios de interacción, se produjeron tal como se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 05/111061, micromatrices que contenían péptidos de 14 aminoácidos de longitud derivados de secuencias de proteína de las proteínas que interaccionaban. Los péptidos se sintetizaron siguiendo la metodología Fmoc utilizando un sintetizador totalmente automático (Multipep Automated Peptide Synthesizer, Intavis AB Bioanalytical Instruments). Se sintetizaron péptidos individuales en discos separados de celulosa derivatizada (Fmoc-$-alanina celulosa). Tras finalizar la síntesis y eliminar los grupos protectores de cadena lateral con TFA, los discos de celulosa se disolvieron en TFA al 90% (89,5% de TFA, 4% de ácido trifluorometanosulfóncio, 2,5% de triisopropilsilano y 4% de H2O) durante la noche. Los péptidos unidos a la celulosa fueron añadidos con éter tercbutilmetílico frío y se centrifugaron (5 minutos, 1.500 rpm). Tras el lavado con éter terc-butilmetílico, se disolvió el sedimento con DMSO. A continuación, las soluciones resultantes de péptidos conjugados con celulosa en DMSO se utilizaron para la producción de matrices mediante la transferencia por puntos de 0,06 μl de volumen de las soluciones a portaobjetos de microscopía.

Las matrices de péptidos se incubaron con soluciones de proteínas de interacción marcadas con 35S producidas in vitro utilizando plásmidos aislados a partir de clones positivos del cribado de interacción y el sistema TNT de transcripción/traducción acoplada de Promega siguiendo las recomendaciones del fabricante. La formación de proteínas se verificó mediante electroforesis en gel SDS, autorradiografía y tinción con plata. Se añadieron cincuenta microlitros de la proteína sintetizada in vitro cruda a 10 ml de tampón de bloqueo de membranas 10x (Sigma-Aldrich, tampón de bloqueo basado en caseína, azida sódica al 0,05%) y se mezclaron uniformemente. Esta mezcla se aplicó directamente en matrices de péptidos bloqueadas previamente durante la noche. La incubación se llevó a cabo durante cuatro horas bajo agitación horizontal lenta constante a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y la membrana se lavó tres veces durante diez minutos con TBST 25 mM, TrisCl, pH 7,5, NaCl 125 mM, Tween-20 al 0,1%). La formación de complejos de péptidos con proteínas marcadas con 35S se detectó con el sistema Imaging screen K (Biorad), que en todos los casos se había borrado antes de su utilización, situado durante 70 horas sobre la cara recubierta de Saran de la membrana con puntos, y se leyó en un instrumento Personel Molecular Imager FX (Biorad, resolución: 50 μm). El archivo gráfico resultante se evaluó directamente respecto a las intensidades de los puntos utilizando el programa Biorad Quantity One (versión 4.4).

Listado de secuencias

<110> Stiftung caesar 5 <120> Nuevos dianas y compuestos para la intervención terapéutica de la infección por VIH

<130> CA18A06/P-EP

<160> 40 10

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<213> viral

<220>

<221> CDS 20 <222> (1)..(624)

<400> 1

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> viral <400.> 2

10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> secuencia artificial

15

<220>

<223> oligopéptido

<400> 3

<210> 4

<211> 171 25 <212> PRT

<213> humana

<220>

<221> PTEN

<222> (1)..(171)

<223> clon R1P1-1/G3

<400> 4

<210> 5 10 <211> 219

<212> PRT

<213> humana

<220> 15 <221> PTEN

<222> (1)..(219)

<223> clon R14P1-12/C5

<400> 5 20

<210> 6 5 <211> 143

<212> PRT

<213> humana

<220> 10 <221> HERC4

<222> (1)..(143)

<223> clon-R8P1-4/D1

<400> 6 15

<210> 7 5 <211> 143

<212> PRT

<213> humana

<220> 10 <221> Herc4

<222> (1)..(193)

<223> clon 3R12P3-5/G9

<900> 7 15

<210> 8

<213> humana

<220>

<221> TOM1L1 25 <222> (1)..(257)

<223> clon 3R8P3-4/C11

<400> 8

<210> 9

<211> 407

<212> PRT 10 <213> humana

<220>

<221> EIF4A2

<222> (1)..(407)

<223> clon P1-2-A9

<400> 9

<212> PRT

<213> humana

<220> 10 <221> TPT1

<222> (1)..(172)

<223> clon R5P1-9/A2

<210> 11

<211> 172

<212> PRT

<213> humana 5

<220>

<221> TPT1

<222> (1)..(172)

<223> clon 2R2P2-1/C4 10

<400> 11

15 <210> 12

<211> 172

<212> PRT

<213> humana

20 <220>

<221> TPT1

<222> (1)..(172)

<223> clon 3R1P3-1/B7

25 <400> 12 <210> 13

<213> humana

<220>

<221>

TPT1 10 <222> (1)..(172)

<223> clon Psyx1-1-C3

<400> 13

<210> 14

<213> humana

<220>

<221>

NUP50 10 <222> (1)..(45)

<223> clon R16P1-12/G11

<900> 14

<210> 15

<211> 168 20 <212> PRT

<213> humana

<220>

<221>

CTCF 25 <222> (1)..(168)

<223> clon R4P1-3/G10

<400> 15

<210> 16

<213> humana

<220>

<221>

HNRPU 10 <222> (1)..(162)

<223> clon R12P1-5/H7

<400> 16

<212> PRT

<213> humana

<220>

<221> MRCL3

<222> (1)..(171)

<223> clon 3R11P3-5/G7

<400> 17

10 <210> 18

<211> 196

<212> PRT

<213> humana

15 <220>

<221> SDCCAG1

<222> (1)..(196)

<223> clon 2R6P2-6/B11

20 <400> 18 <210> 19

<213> humana

<220>

<221>

SDCCAG1 10 <222> (1)..(196)

<223> clon 3R16P3-6/F11

<400> 19

<210> 20

<213> humana

<220>

<221>

PTGES3 10 <222> (1)..(150)

<223> clon 2R4P2-3/A10

<400> 20

<210> 21

<213> humana

<220>

<221>

HSP90 10 <222> (1)..(724)

<223> clon 3R13P3-5/H6

<400> 21

<210> 22

<213> humana

<220>

<221>

HSPA1 10 <222> (1)..(218)

<223> clon R2P1-3/F6

<400> 22

<210> 23

<213> humana

<220>

<221>

HSPA1 10 <222> (1)..(198)

<223> clon R10P1-5/D6

<400> 23

<210> 24

<213> humana

<220>

<221>

HSPA1 10 <222> (1)..(190)

<223> clon R15P1-12/C9

<400> 24

<210> 25

<213> humana

<220>

<221>

HSPA1 10 <222> (1)..(197)

<223> clon 2R8P2-8/E1

<400> 25

<210> 26

<211> 218

<212> PRT

<213> humana 5

<220>

<221> HSPA1

<222> (1)..(218)

<223> clon P1-1-A4 10

<900> 26

15

<210> 27

<211> 223

<212> PRT

<213> humana

20

<220>

<221> HSPA1

<222> (1)..(223)

<223> clon P1-1-C4

<400> 27

<210> 28

<213> humana

<220>

<221> HSPA1 15 <222> (1)..(218)

<223> clon P1-2-A12

<400> 28 <212> PRT

<213> humana

<220>

10 <221> HSPA5

<222> (1)..(215)

<223> clon R3P1-3/G6

<212> PRT

<213> humana

<220>

10 <221> HSPA5

<222> (1)..(215)

<223> clon R7P1-4/A5

<212> PRT

<213> humana

<220>

10 <221> HSPA5

<222> (1)..(215)

<223> clon R13P1-8/C8 <210> 32

<213> humana

<220>

<221>

HSPA8 10 <222> (1)..(239)

<223> clon 2R1P2-1/B9

<400> 32

<210> 33

<213> humana

<220>

<221>

HSPA8 10 <222> (1)..(183)

<223> clon 3R3P3-2/D2

<400> 33

<210> 34

<213> humana

<220>

<221>

HSPA8 10 <222> (1)..(221)

<223> clon P1-2-A10

<400> 34

<212> PRT

<213> humana

<220>

<221> HSPH1

<222> (1)..(378)

<223> clon 3R2P3-1/C8

<400> 35

<210> 36

<213> humana

<220>

<221>

CSDE1 10 <222> (1)..(931)

<210>

35 20 <211> 378

<223> clon 3R15P3-6/C2

<400> 36

5

<210> 37 <211> 32 <212> ADN <213> secuencia artificial

10

<220> <223> oligonucleótido

57

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> Cebador (Vif/Rsr)

<400> 37

ttttcggacc ggaaaacaga tggcaggtga tg

32

<210> 38

<211> 37

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> Cebador (Vif/Not)

<400> 38

aaatatgcgg ccgcctatct ggggcttgtt ccatctg

37

<210> 39

<211> 36

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223> Cebador (Vif/Bam)

<400> 39

cgcggatcca ccatggaaaa cagatggcag gtgatg

36

<210> 40

<211> 30

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> oligonucleótido

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> Cebador (Vif/Xho)

<400> 40

ccgctcgagc tagtgaccat tcattgtatg

30

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Complejo que comprende Vif y una proteína de interacción del VIH seleccionada de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 14), CTCF (SEC ID nº 15), RPUhn (SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos que pueden formar un complejo con Vif.

2. 2.

   Método para cribar compuestos, que puede modular la formación de un complejo y/o la estabilidad de un complejo, que comprende las etapas que consisten en:

   a) someter un compuesto de ensayo a:

   i) la proteína Vif diana del VIH y una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 14), CTCF (SEC ID nº 15), RPUhn (SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36) o fragmentos de los mismos, o

   ii) el complejo según la reivindicación 1;

   b) monitorizar los cambios en la formación de un complejo y/o en la estabilidad de un complejo, y

   c) determinar un compuesto que puede modular la formación y/o estabilidad de un complejo basándose en su capacidad de modificar la formación de complejos entre las proteínas de (i) y/o modificar la estabilidad de (ii) en comparación con un control.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en el que la proteína diana del VIH es una proteína de fusión que comprende glutatión-S-transferasa, preferentemente, en el que la proteína humana se marca con 35S-metionina.

4. 4.

   Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la formación de un complejo resulta de la interacción proteínaproteína en un sistema a base de células de dos o tres híbridos.

5. 5.

   Método para preparar, detectar y analizar el complejo según la reivindicación 1, que comprende las etapas que consisten en:

   a) sintetizar y/o aislar la proteína del VIH; b) sintetizar y/o aislar la proteína humana; c) poner en contacto las proteínas de a) y b); d) monitorizar la formación de un complejo; y opcionalmente e) determinar las características del complejo (estabilidad o cinética) mediante métodos in vitro conocidos.

6. 6.

   Kit o sistema de ensayo para la utilización en los métodos según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, comprendiendo dicho kit o sistema de ensayo la proteína diana (Vif) y una o más proteínas candidatas (huésped) seleccionadas de entre el grupo constituido por: PTEN (SEC ID nº 4 y 5), HERC4 (SEC ID nº 6 y 7), Tom1L1 (SEC ID nº 8), EIF4A2 (SEC ID nº 9), TCTP (TPT1: SEC ID nº 10, 11, 12 y 13), NUP50 (SEC ID nº 14), CTCF (SEC ID nº 15), RPUhn (SEC ID nº 16), MRCL (MRCL3: SEC ID nº 17), SDCCAG1 (SEC ID nº 18 y 19), PTGES3 (SEC ID nº 20), HSP (HSP90: SEC ID nº 21; HSPA1: SEC ID nº 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; HSPA5: SEC ID nº 29, 30 y 31; HSPA8: SEC ID nº 32, 33 y 34; HSPH1: SEC ID nº 35) y CSDE1 (SEC ID nº 36), o que comprende las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes codificantes de la proteína diana (Vif) y una o más proteínas candidatas (huésped) de las mencionadas anteriormente, y que comprende opcionalmente reactivos, herramientas de automatización, dispositivos de almacenamiento, robots de manipulación de líquidos o disposiciones de monitorización.