CN108588081A - 一种靶向细胞核的序列及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向细胞核的序列，包括：a)至少含有序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第100‑141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第100位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向5′端延长，得到长度为42至141 bp的任意一个可被3整除的DNA片段；或者从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向3′端延长，得到长度为42至1305 bp的任意一个可被3整除的DNA片段；所述DNA分子具有核定位功能。实验证明，本发明的核定位序列能够准确标记核。

Description

一种靶向细胞核的序列及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体来说是一种核定位序列及其应用。
背景技术
真核细胞的重要特征之一是具有细胞核。细胞核中存储有遗传物质，外面包围着一层极薄的膜，称为核膜。核膜上有许多孔，称为核孔，对控制核内外物质的出入，维持核内环境的稳定有重要作用。大多数分子量小于40 kD的蛋白质或小于250 bp的DNA片段可以通过核孔自由扩散进入细胞核，而大分子如病毒蛋白、大多数转录因子、组蛋白、mRNA和一些特殊的小分子蛋白质必须以能量依赖的方式通过其本身携带的核定位信号，被相应的核转运蛋白识别进入核内。核定位信号是蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，能与入核载体相互作用，介导外源DNA或者蛋白质进入核内，具有引导其所在序列趋向定位于核区的功能，进而对转录调控、信号传导、基因表达、细胞分化发挥至关重要的作用。目前利用核定位序列进行蛋白核导入存在以下问题：1）核定位序列的选择余地比较少；2）核定位序列介导的蛋白质核导入效率还比较低；3）核定位序列介导蛋白进入细胞核后，难以确定入核后的分布。因此，核定位序列的发现对我们进一步研究核内外物质转运的机制以及解决一些细胞生物学难题具有重大意义。
核孔蛋白50（nucleoporin 50，NUP50）是定位于核孔复合体的核质原纤维，含有苯丙氨酸和甘氨酸重复组成的NUP基序，目前的研究表明，NUP50能与输入蛋白importin-α和β相互作用，对核蛋白输入具有促进作用。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种核定位序列及其应用，所述的这种核定位序列及其应用要解决现有技术中核定位序列的选择余地比较少、核定位序列的效率比较低、核定位序列难以确定入核后的分布的技术问题。
本发明提供了一种细胞中的核定位序列，是下述a)或b)或c)的DNA片段：
a)3′端至少含有序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第100位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ IDNO.1所示序列的5′端延长，得到长度为42 至141 bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
或者从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为42至1305 bp的任意一个可被3整除的DNA片段；所述DNA分子具有核定位功能；
b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有核定位功能的DNA片段；
c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有核定位功能的DNA片段。
根据本发明的核定位序列DNA分子，所述DNA分子是下述A1)-A4)中的任一种DNA片段：
A1)核苷酸序列至少含有序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第85位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQID NO.1所示序列的5′端延长，得到长度为为57至141 bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
或者从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为57至1305 bp的任意一个可被3整除的DNA片段。
A2)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为141至1404 bp的任意一个可被3整除的DNA片段。
A3)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-345位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第345位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为345 至1404 bp的任意一个可被3整除的DNA片段。
A4)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-639位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第639位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为639 至1404 bp的任意一个可被3整除的DNA片段。
3.根据权利要求1-2中任一所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为下述1)-5)中任意一种：
1)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-141位核苷酸所示的DNA分子。
4)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-345位核苷酸所示的DNA分子。
5)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-639位核苷酸所示的DNA分子。
本发明提供了一个含有核定位序列的生物材料，为下述B1)至B13)中的任一种：
B1)含有上述定位序列DNA分子的表达盒；
B2)含有上述定位序列DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有上述定位序列DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有上述定位序列DNA分子的转基因动物细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B10)含有上述定位序列DNA分子的转基因动物组织；
B11)含有B1)所述表达盒的转基因动物组织；
B12)含有上述定位序列DNA分子转基因动物器官；
B13)含有B1)所述表达盒的转基因动物器官。
本发明提供了一个核定位序列作为核定位中的应用，为下述M1-M4中任一种：
M1、含有上述定位序列DNA分子在作为核定位中的应用；
M2、含有上述定位序列DNA分子在作为细胞中核定位中的应用；
M3、含有上述定位序列DNA分子在作为转基因动物组织中核定位中的应用；
M4、含有上述定位序列DNA分子在作为转基因动物器官中核定位中的应用。
本发明提供了一个核定位序列作为导向片段介导目的基因进入核内的应用，为下述N1-N4中任一应用：
N1、含有上述定位序列DNA分子作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N2、含有上述定位序列DNA分子在细胞中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N3、含有上述定位序列DNA分子在转基因动物组织中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N4、含有上述定位序列DNA分子在转基因动物器官中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用。
本发明的提供了一个核定位序列在动物中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
进一步的，所述目的基因的导向具有细胞核特异性。
本发明通过构建含有NUP50基因以及其截断体的重组载体，探究其特定的核定位序列，明确了NUP50有效的核定位序列，进一步可将它作为导向片段，在需要转运入核、但不能被核转运蛋白有效特异性识别的大分子蛋白上，人为添加该特定的序列，提高相应靶分子转运入核的效率，调控相关基因表达和分子的信号转导，进而将为某些疾病的病理机制研究和有效治疗手段提供方向。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明根据SEQ ID NO.1所示序列，设计一个特异性定位核的基因序列，并且构建一个含有上述定位序列的重组载体，本发明的序列可以成功地标记细胞核，使用者可以直接用该序列定位核，本发明构建的核定位DNA序列为广大科研工作者提供了一种有效定位核的工具。此外，将本发明构建的DNA序列作为导向片段介导目的基因进入核内，对于特异性作用于核内提供了一个有效的技术手段。
附图说明
图1显示了核定位序列的载体结构。
图2显示了不同长度有效的核定位序列。
图3显示了不同长度的核定位序列在核内的定位情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明的保护范围并不限于此｡
实施例1:构建含有核定位序列的重组载体（核内点状分布）
一、设计细胞中的核定位序列（核内点状分布）
全基因合成人源NUP50基因CDS序列（SEQ ID NO.1）的第100-141位核苷酸序列，并且在5′端加入酶切位点Xho I (CTCGAG)，3′端加入酶切位点EcoR I（GAATTC）。
二、构建含有上述核定位序列的重组载体
将上述正向和反向寡核苷酸序列混合，变性退火，连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I和EcoR I之间。pLVX-ZsGreen1-C1载体含有CMV-ZsGreen1表达框，提供了标记目标蛋白的表达框架；此外，该载体含有PGK-PuroR表达框，能够进行嘌呤霉素筛选。
三、将含有核定位序列的重组载体转染入Hela细胞中，观察核定位。
具体的实施方案如下:
1、合成核定位序列：
正向序列 Forward(5′-3′)（斜体下划线部分为SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸序列）
tcgagct gtcttgaagaatagagccataaagaaagcaaagcgcagaaat tgag（SEQ ID NO.2）
反向序列Reverse (5′-3′)（斜体下划线部分是SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸序列的反向互补序列）
aattctca atttctgcgctttgctttctttatggctctattcttcaagac agc（SEQ ID NO.3）
2、形成含有定位序列的DNA双链：具体20 μl反应体系，上述序列Forward\Reverse (10μM)各取10 μl混合，95℃ 30 s；72℃ 2 min；37℃ 2 min；25℃ 2 min。
3、构建重组载体：将上述获得的核定位序列连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I和EcoR I之间，构建含有核定位序列的载体，其模式参见图1｡
4、转化：1）将感受态细菌置于冰上，待其融化；2）超净工作台中，将连接产物10 μl 加入100 μl 感受态细胞；3）轻混匀，冰浴30 min；4）热击水浴42℃，45 s，冰浴1 min；5）加900μl LB培养基，摇菌150 rpm，37℃，1 h；6）浓缩离心13000 rpm，1 min，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100 μl ）；7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16 h。
5、菌落PCR：以PrimerSTAR MAX Premix(2 X)酶（Takara公司）30 μl体系配制PCR体系：2dH2O 13 μl，引物2 μl (10 μM)，Premix 15 μl，灭菌10 μl枪头挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板上划板，每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16 h。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号。
6、测序：1）摇菌：（1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌；（2）15 ml离心管中分装3 ml LB抗性液体培养基；（3）用10 μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中；（4）37℃ 250 rpm摇菌12-16 h；2）送样每瓶取1 ml箘液，送上海桑尼生物公司测序；3）比对：将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功。
7、质粒抽提：菌种对比成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒，试剂盒：AXYGENaxyprep plasmid miniprep kit (50-prep),操作步骤：
1）取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000 g 离心1 min，弃尽上清；
2）加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；
3）加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5 min；
4）加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000 g离心10 min；
5）吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12000 g离心1 min，弃滤液；
6）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12000 g离心1 min，弃滤液；
7）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12000 g离心1 min，弃滤液；以同样的方法 再用700 μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；
8）将制备管置回2 ml离心管中，12000 g离心1 min；
9）将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μlEluent或去离子水，室温静置1 min，12000 g离心1 min。
10）提取的质粒-20℃保存备用。
8、细胞转染与免疫荧光染色：将上述含有核定位序列的过表达重组载体用lipo3000 转染试剂转染到 Hela细胞中，载体转染浓度1 μg/ml，转染后培养 48 h。9、免疫荧光染色：用4％多聚甲醛固定细胞，含0.5% Triton X-100的PBS通透， DAPI染核，然后利用荧光显微镜进行观察，并利用ImageJ软件进行荧光强度计算和统计分析。结果见图3,NUP50:100-141 bp。
10、结果表明，上述含有核定位序列的过表达重组载体特异性定位于核内。
实施例2:构建含有核定位序列的重组载体（核内均匀分布）
一、设计细胞中的核定位序列（核内均匀分布）
全基因合成人源NUP50基因CDS序列（SEQ ID NO.1），使用特异性的引物，扩增人源NUP50基因CDS序列的第1-345位核苷酸序列。
二、构建含有上述核定位序列的重组载体
采用人源NUP50基因CDS序列（SEQ ID NO.1）为模板，特异的正向和反向引物，扩增出人源NUP50基因CDS序列的第1-345位核苷酸序列，连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间。pLVX-ZsGreen1-C1载体含有CMV-ZsGreen1表达框，提供了标记目标蛋白的表达框架；此外，该载体含有PGK-PuroR表达框，能够进行嘌呤霉素筛选。
三、将含有核定位序列的重组载体转染入Hela细胞中，观察其核定位情况。
具体的实施方案如下:
1、扩增人源NUP50基因CDS序列的第1-345位核苷酸序列,使用重组酶法连接到pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间，采用的引物如下：
正向引物Forward (5′-3′)
cctccggactcagatctcgagctatggccaaaagaaatgccg（SEQ ID NO.4）
反向引物Reverse (5′-3′)
gtaccgtcgactgcagaattcttaagaaccaaaggctaccttggg（SEQ ID NO.5）
2、形成含有定位序列的DNA双链：具体50 μl反应体系，上述引物Forward\Reverse(10μM),分别用量10-15 pmol(终浓度0.2-0.3 μM)，质粒DNA（10 pg-1 ng）, PrimerSTAR MAXPremix(2 X)（TaKaRa公司）25 μl ，蒸馏水加至50 μl混合。PCR条件：98℃ 10 s, 55℃ 5s,72℃ 5 s/kb 30循环。
3、构建重组载体：将上述获得的核定位序列连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I和EcoR I之间，构建含有核定位序列的载体，其模式参见图1｡
4、转化：1）将感受态细菌置于冰上，待其融化；2）超净工作台中，将连接产物10 μl 加入100 μl 感受态细胞；3）轻混匀，冰浴30 min；4）热击水浴42℃，45 s，冰浴1 min；5）加900μl LB培养基，摇菌150 rpm，37℃，1 h；6）浓缩离心13000 rpm，1 min，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100 μl ）；7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16 h。
5、菌落PCR：以PrimerSTAR MAX Premix(2 X)酶（Takara公司）30 μl体系配制PCR体系：2dH2O 13 μl，引物2 μl (10 μM)，Premix 15 μl，灭菌10 μl枪头挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板上划板，每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16 h。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号。
6、测序：1）摇菌：（1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌；（2）15 ml离心管中分装3 ml LB抗性液体培养基；（3）用10 μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中；（4）37℃ 250 rpm摇菌12-16 h；2）送样每瓶取1 ml箘液，送上海桑尼生物公司测序；3）比对：将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功。
7、质粒抽提：菌种对比成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒，试剂盒：AXYGENaxyprep plasmid miniprep kit (50-prep),操作步骤：
1）取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000 g 离心1 min，弃尽上清；
2）加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；
3）加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5 min；
4）加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000 g离心10 min；
5）吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12000 g离心1 min，弃滤液；
6）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12000 g离心1 min，弃滤液；
7）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12000 g离心1 min，弃滤液；以同样的方法 再用700 μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；
8）将制备管置回2 ml离心管中，12000 g离心1 min；
9）将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μlEluent或去离子水，室温静置1 min，12000 g离心1 min。
10）提取的质粒-20℃保存备用。
8、细胞转染与免疫荧光染色：将上述含有核定位序列的过表达重组载体用lipo3000 转染试剂转染到 Hela 细胞中，载体转染浓度1 μg/ml，转染后培养 48 h。
9、免疫荧光染色：用4％多聚甲醛固定细胞，含0.5% Triton X-100的PBS通透，DAPI染核，然后利用荧光显微镜进行观察，并利用ImageJ软件进行荧光强度计算和统计分析。结果见图3,NUP50:1-345 bp。
10、结果表明，上述含有核定位序列的过表达重组载体特异性定位于核。
实施例3:构建含有核定位序列的重组载体（序列分析）
一、设计细胞中的核定位序列
对于较长片段（大于100 bp），如NUP50全长（1-1404 bp），NUP50:346-639 bp，和NUP50:142-345 bp，全基因合成人源NUP50基因CDS序列（SEQ ID NO.1），使用特异性的引物，扩增人源NUP50基因CDS序列的相应片段；
对于短片段（小于100 bp),如NUP50:85-141 bp和NUP50:85-99 bp，基因合成相应的NUP50的序列的正向链和反向链。
二、构建含有上述核定位序列的重组载体
对于较长片段，采用人源NUP50基因CDS序列（SEQ ID NO.1）为模板，特异的正向和反向引物，扩增出相应的NUP50序列（NUP50全长1-1404 bp，NUP50:346-639 bp和NUP50:142-345bp），分别连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间。
对于短片段，如NUP50:85-141 bp和NUP50:85-99 bp，合成相应的寡核苷酸双链，将合成的正向链和反向链混合，变性退火，连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间。
pLVX-ZsGreen1-C1载体含有CMV-ZsGreen1表达框，提供了标记目标蛋白的表达框架；此外，该载体含有PGK-PuroR表达框，能够进行嘌呤霉素筛选。
三、将含有核定位序列的重组载体转染入Hela细胞中，观察其核定位情况。
具体的实施方案如下:
1、对于长片段，扩增NUP50基因相应的核苷酸序列,使用重组酶法连接到pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间，采用的引物如下：
NUP50全长：1-1404 bp：
正向引物Forward (5′-3′)
cctccggactcagatctcgagctatggccaaaagaaatgccg（SEQ ID NO.6）
反向引物Reverse (5′-3′)
gtaccgtcgactgcagaattctcaggcatcctttttctccagt（SEQ ID NO.7）
NUP50:346-639 bp：
正向引物Forward (5′-3′)
cctccggactcagatctcgagctcttgctgcaaatggccctac（SEQ ID NO.8）
反向引物Reverse (5′-3′)
gtaccgtcgactgcagaattctcagttagattcactttcagaattcctg（SEQ ID NO.9）
NUP50:142-345 bp：
正向引物Forward (5′-3′)
cctccggactcagatctcgagctgttggatttgaatctgacactgga（SEQ ID NO.10）
反向引物Reverse (5′-3′)
gtaccgtcgactgcagaattctcaagaaccaaaggctaccttgg（SEQ ID NO.11）
2、对于短片段，将合成的正向链和反向链混合，变性退火，采用酶连法连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I 和EcoR I之间，采用的寡核苷酸序列为：
NUP50:85-141 bp：
正向链Forward (5′-3′)（斜体下划线部分为SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸序列）
tcgagct atggccagtgaggaagtcttgaagaatagagccataaagaaagcaaagcgcagaaat tgag（SEQID NO.12）
反向链Reverse (5′-3′)（斜体下划线部分是SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸序列的反向互补序列）
aattctca atttctgcgctttgctttctttatggctctattcttcaagacttcctcactggccat agc
（SEQ ID NO.13）
NUP50:85-99 bp：
正向链Forward (5′-3′)（斜体下划线部分为SEQ ID NO.1所示序列的第85-99位核苷酸序列）
tcgagct atggccagtgaggaa tgag（SEQ ID NO.14）
反向链Reverse (5′-3′)（斜体下划线部分是SEQ ID NO.1所示序列的第85-99位核苷酸序列的反向互补序列）
aattctca ttcctcactggccat agc（SEQ ID NO.15）
3、形成含有定位序列的DNA双链：
对于长片段：50 μl反应体系，上述引物Forward\Reverse(10 μM),分别用量10-15pmol(终浓度0.2-0.3 μM)，质粒DNA（10 pg-1 ng）, PrimerSTAR MAX Premix(2 X)（TaKaRa公司）25 μl，蒸馏水加至50 μl混合。PCR条件：98℃ 10 s, 55℃ 5 s,72℃ 5 s/kb 30循环。
对于短片段：20 μl反应体系，上述序列Forward\Reverse (10 μM)各取10 μl混合，95℃ 30 s；72℃ 2 min；37℃ 2 min；25℃ 2 min。
4、构建重组载体：将上述获得的核定位序列连入pLVX-ZsGreen1-C1载体的Xho I和EcoR I之间，构建含有核定位序列的载体，其模式参见图1｡
5、转化：1）将感受态细菌置于冰上，待其融化；2）超净工作台中，将连接产物10 μl 加入100 μl 感受态细胞；3）轻混匀，冰浴30 min；4）热击水浴42℃，45 s，冰浴1 min；5）加900μl LB培养基，摇菌150 rpm，37℃，1 h；6）浓缩离心13000 rpm，1 min，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100 μl ）；7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16 h。
6、菌落PCR：以PrimerSTAR MAX Premix(2 X)酶（Takara公司）30 μl体系配制PCR体系：2dH2O 13 μl，引物2 μl (10 μM)，Premix 15 μl，灭菌10 μl枪头挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板上划板，每板挑10个菌。新划的板37℃倒置培养12-16 h。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号。
7、测序：1）摇菌：（1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌；（2）15 ml离心管中分装3 ml LB抗性液体培养基；（3）用10 μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中；（4）37℃ 250 rpm摇菌12-16 h；2）送样每瓶取1 ml箘液，送上海桑尼生物公司测序；3）比对：将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功。
8、质粒抽提：菌种对比成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒，试剂盒：AXYGENaxyprep plasmid miniprep kit (50-prep),操作步骤：
1）取1-4 ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000 g 离心1 min，弃尽上清；
2）加250 μl Buffer S1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；
3）加250 μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，此步骤不宜超过5 min；
4）加350 μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，12000 g离心10 min；
5）吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2 ml离心管（试剂盒内提供）中），12000 g离心1 min，弃滤液；
6）将制备管置回离心管，加500 μl Buffer W1，12000 g离心1 min，弃滤液；
7）将制备管置回离心管，加700 μl Buffer W2，12000 g离心1 min，弃滤液；以同样的方法 再用700 μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；
8）将制备管置回2 ml离心管中，12000 g离心1 min；
9）将制备管移入新的1.5 ml离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加60-80 μlEluent或去离子水，室温静置1 min，12000 g离心1 min。
10）提取的质粒-20℃保存备用。
9、细胞转染与免疫荧光染色：将上述含有核定位序列的过表达重组载体用lipo3000 转染试剂转染到 Hela 细胞中，载体转染浓度1 μg/ml，转染后培养 48 h。
10、免疫荧光染色：用4％多聚甲醛固定细胞，含0.5% Triton X-100的PBS通透，DAPI染核，然后利用荧光显微镜进行观察，并利用ImageJ软件进行荧光强度计算和统计分析。结果见图3。
11、结果表明，上述NUP50全长（1-1404 bp）和NUP50:85-141 bp含有核定位序列的过表达重组载体特异性定位于核；而不含有核定位序列的NUP50:346-639 bp，NUP50:142-345 bp和NUP50:85-99 bp不能特异的靶向细胞核，在细胞中弥漫分布。
序列表
<110> 上海市东方医院
<120> 一种靶向细胞核的序列及其应用
<141> 2018-02-01
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccaaaa gaaatgccga gaaggaactg acagatagga attgggatca agaagatgaa 60
gctgaagagg tgggaacatt ctccatggcc agtgaggaag tcttgaagaa tagagccata 120
aagaaagcaa agcgcagaaa tgttggattt gaatctgaca ctggaggagc ctttaaaggt 180
tttaaaggtt tggtggtacc ttctggagga ggacgctttt ctggatttgg tagtggcgct 240
ggagggaagc ctttggaagg actgtcgaat ggaaacaaca taaccagtgc ccctcccttc 300
gccagtgcaa aggcagcggc agatcccaag gtagcctttg gttctcttgc tgcaaatggc 360
cctaccacct tggttgataa agtttcaaat cccaaaacta atggggacag tcagcagccc 420
tcctcctctg gccttgcttc cagtaaagct tgtgtcggaa atgcctatca caagcagttg 480
gccgccttga actgctccgt gcgggattgg atagtgaagc acgtgaatac aaaccccctc 540
tgtgatctga cacctatctt taaagactat gagaaatatt tagcaaacat tgaacagcaa 600
cacgggaaca gtggcaggaa ttctgaaagt gaatctaaca aagtggcagc tgaaacacag 660
tctccttccc tttttggctc aacaaaatta cagcaagagt caacgttttt gtttcatggc 720
aacaaaactg aagatacacc tgacaagaag atggaggtgg catctgaaaa gaaaacggac 780
ccatcatcac taggagcgac aagtgcctca tttaatttcg gcaagaaagt tgatagctct 840
gttttgggct cattaagctc tgtccccctg actggatttt ctttctcccc tggaaactcc 900
agtttatttg gcaaagatac tacccagagt aaaccagtct cttcaccatt tcccactaaa 960
ccattggagg gccaagcaga aggtgacagt ggtgaatgca aaggtggaga tgaagaagag 1020
aatgatgagc cacccaaagt agtagttacc gaagtaaaag aagaagatgc tttttactcc 1080
aaaaagtgta aactgtttta caagaaagac aatgagttta aagagaaagg cataggtact 1140
ctgcatttaa aacctacagc aaatcagaag acacagcttt tggtgcgggc agacaccaat 1200
ttaggcaaca tattgctgaa cgttctgatt ccacccaata tgccatgtac gcgaacaggg 1260
aagaataacg ttcttatcgt ctgtgttcca aatccaccaa ttgacgagaa gaatgccacc 1320
atgccagtca ccatgttgat tcgggtaaaa accagcgagg atgcagacga gttgcacaaa 1380
attttactgg agaaaaagga tgcctga 1407
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgagctgtc ttgaagaata gagccataaa gaaagcaaag cgcagaaatt gag 53
<210> 3
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattctcaat ttctgcgctt tgctttcttt atggctctat tcttcaagac agc 53
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctccggact cagatctcga gctatggcca aaagaaatgc cg 42
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaccgtcga ctgcagaatt cttaagaacc aaaggctacc ttggg 45
<210> 6
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctccggact cagatctcga gctatggcca aaagaaatgc cg 42
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtaccgtcga ctgcagaatt ctcaggcatc ctttttctcc agt 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctccggact cagatctcga gctcttgctg caaatggccc tac 43
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtaccgtcga ctgcagaatt ctcagttaga ttcactttca gaattcctg 49
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctccggact cagatctcga gctgttggat ttgaatctga cactgga 47
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtaccgtcga ctgcagaatt ctcaagaacc aaaggctacc ttgg 44
<210> 12
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgagctatg gccagtgagg aagtcttgaa gaatagagcc ataaagaaag caaagcgcag 60
aaattgag 68
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcgagctatg gccagtgagg aatgag 26
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aattctcatt cctcactggc catagc 26

Claims (8)

1.一种细胞中的核定位序列，其特征在于：是下述a)或b)或c)的DNA片段中的任意一种：
a)至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第100位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的5′端延长，得到长度为42至141bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
或者从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为42至1305bp的任意一个可被3整除的DNA片段；所述DNA片段具有核定位功能；
b)与a)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有核定位功能的DNA片段；
c)在严格条件下与a)或b)限定的核苷酸序列杂交，且具有核定位功能的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是下述A1)-A4)中的任一种DNA片段：
A1)核苷酸序列至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸序列，并且从SEQID NO.1所示序列的第85位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的5′端延长，得到长度为57至141bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
或者从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQ ID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为57至1305bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
A2)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-141位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第141位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为141至1404bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
A3)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-345位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第345位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为345至1404bp的任意一个可被3整除的DNA片段；
A4)核苷酸序列的5′端至少含有SEQ ID NO.1所示序列的第1-639位核苷酸序列，并且从SEQ ID NO.1所示序列的第639位开始、按照SEQ ID NO.1所示序列的核苷酸序列向SEQID NO.1所示序列的3′端延长，得到长度为639至1404bp的任意一个可被3整除的DNA片段。
3.根据权利要求1-2中任一所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为下述1)-5)中任意一种：
1)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第100-141位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第85-141位核苷酸所示的DNA分子；
3)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-141位核苷酸所示的DNA分子；
4)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-345位核苷酸所示的DNA分子；
5)序列表中SEQ ID NO.1所示序列的第1-639位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的生物材料，其特征在于：为下述B1)至B13)中的任一种：
B1)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的表达盒；
B2)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的重组载体；
B3)含有B1)所述表达盒的重组载体；
B4)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的重组微生物；
B5)含有B1)所述表达盒的重组微生物；
B6)含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的转基因动物细胞系；
B9)含有B1)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B10)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的转基因动物组织；
B11)含有B1)所述表达盒的转基因动物组织；
B12)含有权利要求1-3中任一所述DNA分子的转基因动物器官；
B13)含有B1)所述表达盒的转基因动物器官。
5.下述M1-M4中任一应用：
M1、权利要求1-3中任一所述DNA分子在作为核定位中的应用；
M2、权利要求1-3中任一所述DNA分子在作为细胞中核定位中的应用；
M3、权利要求1-3中任一所述DNA分子在作为转基因动物组织中核定位中的应用；
M4、权利要求1-3中任一所述DNA分子在作为转基因动物器官中核定位中的应用。
6.下述N1-N4中任一应用：
N1、权利要求1-3中任一所述DNA分子作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N2、权利要求1-3中任一所述DNA分子在细胞中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N3、权利要求1-3中任一所述DNA分子在转基因动物组织中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用；
N4、权利要求1-3中任一所述DNA分子在转基因动物器官中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用。
7.权利要求1-3中任一所述DNA分子在动物中作为导向片段介导目的基因进入细胞核中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述目的基因的导向具有细胞核特异性。
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